Methodenartikel

Ontwikkeling en beoordeling van intracellulaire infectiemodellen voor Staphylococcus aureus

DOI:

10.3791/67834

⸱

17 januari 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Research Institute, Southwest University, 2National Engineering Research Center of Immunological Products, Third Military Medical University, 3School of Pharmacy, University of South China

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Staphylococcus aureus (S. aureus) heeft het vermogen om zich door het lichaam te verspreiden en aanhoudende en terugkerende infecties te veroorzaken. Om deze processen beter te begrijpen, stelt deze studie een intracellulair infectiemodel op voor S. aureus. Dit model zal een cruciale basis vormen voor het onderzoeken van de mechanismen achter intracellulaire infecties.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus kan gastheercellen binnendringen en blijven bestaan, inclusief immuuncellen, waardoor het immuundetectie en -klaring kan ontwijken. Deze intracellulaire persistentie draagt bij aan chronische en terugkerende infecties, wat de behandeling bemoeilijkt en de ziekte verlengt. Daarom is er een kritieke behoefte aan een intracellulair infectiemodel om infecties veroorzaakt door S. aureus beter te begrijpen, te voorkomen en te behandelen. Deze studie gaf aan dat antibiotica extracellulaire bacteriën effectief elimineerden, maar de bacteriën die de cellen waren binnengedrongen niet konden uitroeien. Zo werd een stabiele intracellulaire infectie in vitro vastgesteld door RAW264.7 te infecteren met S. aureus en deze samen te kweken met antibiotica. Vervolgens werd een intracellulair infectiemodel bij muizen opgesteld door peritoneale macrofagen te injecteren die de intracellulaire infectie bevatten. Vancomycine ruimde effectief de bacteriële belasting op bij muizen die werden uitgedaagd met planktonische S. aureus; Het was echter niet effectief tegen muizen die waren geïnfecteerd met gelijke of lagere niveaus van intracellulaire bacteriën in de peritoneale macrofagen. Dit geeft aan dat het intracellulaire infectiemodel van S. aureus met succes is vastgesteld en potentiële inzichten biedt voor de preventie en behandeling van intracellulaire infecties.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus is een zeer besmettelijke ziekteverwekker die een reeks infecties kan veroorzaken, waaronder huid- en weke deleninfecties, sepsis, meningitis, longontsteking en endocarditis1. Het klinische misbruik van antibiotica heeft geleid tot een verhoogde resistentie bij S. aureus en de opkomst van methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA), die in veel landen een aanzienlijke bedreiging voor de volksgezondheid vormt2.

Hoewel S. aureus traditioneel niet wordt geclassificeerd als een intracellulaire ziekteverwekker, suggereert opkomend bewijs dat het na invasie aanhoudend gastheercellen kan koloniseren3. Het vermogen van S. aureus om intracellulair te overleven in gastfagocyten wordt steeds meer erkend als een mechanisme dat metastatische infectie en verspreiding door de gastheer vergemakkelijkt 4,5,6. S. aureus scheidt verschillende virulentiefactoren af, die een immuunomgeving creëren die zijn overleving bevordert en het vermogen van de gastheer om het volledig te elimineren bemoeilijkt7. De accessoire genregulator (agr) en Staphylococcus helper-elementen (Sae) zijn twee belangrijke virulentieregulatoren die nauw verwant zijn aan de overleving van Staphylococcus aureus in fagocyten 8,9. Het agr-systeem is een quorum-sensing-mechanisme dat de expressie van talrijke virulentiefactoren in S. aureus regelt. Het controleert de productie van gifstoffen en andere factoren die de overleving en verspreiding van bacteriën vergemakkelijken. Tijdens intracellulaire infectie speelt het agr-systeem een cruciale rol bij de regulatie van virulentiefactoren die essentieel zijn voor het vermogen van de bacterie om immuunresponsen van de gastheer te ontwijken en te overleven in gastheercellen. Studies hebben aangetoond dat het agr-systeem invloed heeft op het vermogen van de bacterie om uit fagosomen te ontsnappen en in macrofagen te blijven bestaan. De afwezigheid van agr kan leiden tot verminderde bacteriële overleving in gastheercellen en verminderde virulentie10,11. Het Sae-systeem is een tweecomponenten regulatiesysteem dat de expressie van verschillende virulentiefactoren in S. aureus regelt. Het is betrokken bij de regulatie van toxines en enzymen die bijdragen aan het vermogen van de bacterie om gastheerweefsels binnen te dringen en te beschadigen. Het Sae-systeem speelt ook een cruciale rol bij de intracellulaire overleving van S. aureus. Het beïnvloedt het vermogen van de bacterie om weerstand te bieden aan het doden door gastfagocyten en autofagische afbraak te ontwijken12,13.

Wanneer ziekteverwekkers binnendringen, hebben macrofagen fagocytische functies, die vreemde ziekteverwekkers kunnen overspoelen en doden en de adaptieve immuunrespons kunnen activeren14. De meeste binnendringende bacteriën worden gefagocyteerd door macrofagen, die vervolgens verschillende dodingsmechanismen activeren om ze te elimineren. Sommige S. aureus-bacteriën kunnen echter overleven in macrofagen, wat leidt tot aanhoudende infectie van de gastheer. Naast bacteriële eiwitten heeft de gastheer ook invloed op de overleving en proliferatie van S. aureus in macrofagen door cytokines af te scheiden 15,16,17. Sommige studies geven aan dat S. aureus degradatie kan ontwijken door in autofagosomen te verblijven, waardoor een intracellulaire niche ontstaat die de verspreiding bevordert18. S. aureus ontsnapt aan autofagische degradatie door autofagieflux te blokkeren (bijv. LC3-II, p62) en de pH in autolysosomen te verhogen na invasie van macrofagen19. Deze immuunontwijking wordt bereikt door de regulatie van S. aureus-virulentiefactoren en autofagie, wat leidt tot aanhoudende, verborgen infecties.

Het opruimen van intracellulaire infecties van S. aureus is cruciaal voor de behandeling van aanhoudende en latente infecties in de klinische praktijk. Momenteel zijn antibiotica de primaire behandeling voor S. aureus-infecties, waarbij vancomycine dient als de laatste verdedigingslinie voor MRSA-infecties20,21. Talrijke onderzoeken hebben echter aangetoond dat bestaande antibiotica niet effectief zijn bij het elimineren van intracellulaire S. aureus, zowel invivo als in vitro 22,23,24.

Er is momenteel geen uniforme standaard voor de verschillende intracellulaire infectiemodellen van S. aureus 25,26,27, aangezien de omstandigheden van elk model aanzienlijk verschillen. Bijgevolg kunnen dezelfde criteria niet worden toegepast om de doeltreffendheid van deze modellen te beoordelen. In deze studie hebben we een universeel intracellulair infectiemodel van Staphylococcus aureus opgesteld door de experimentele omstandigheden te optimaliseren. Dit model biedt meer gemak in vergelijking met andere, omdat het de eerste infectie van bacteriën in cellen in vitro mogelijk maakt, gevolgd door de afgifte van deze geïnfecteerde cellen in het lichaam.

Om de mechanismen van intracellulaire S. aureus-infectie beter te begrijpen en verwante geneesmiddelen te ontwikkelen, hebben we zowel in vitro als in vivo modellen opgesteld. Een stabiel intracellulair infectiemodel werd met succes in vitro gecreëerd door RAW264.7 te infecteren en samen te kweken met antibiotica. Vervolgens werden peritoneale macrofagen geëxtraheerd en gevormd tot intracellulaire infecties. Een intracellulair infectiemodel bij muizen werd opgesteld door deze peritoneale macrofagen te injecteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proefdieren, 6-8 weken oude specifieke pathogeenvrije (SPF) vrouwelijke BALB/c-muizen, werden gekocht van de Beijing HFK Bioscience Co., Ltd (Beijing, China). Alle dierstudies zijn goedgekeurd door de Laboratorium Dierenwelzijn en Ethische Commissie van de Derde Militaire Medische Universiteit en zijn uitgevoerd in overeenstemming met het institutionele en nationale beleid en de richtlijnen voor het gebruik van proefdieren. De muizen werden gehouden en gevaccineerd in SPF-faciliteiten en kregen gratis toegang tot steriel voedsel en water. De dieren werden willekeurig in groepen verdeeld en kregen voor het begin van de experimenten een aanpassingstijd van ten minste 7 dagen.

1. Preparaat voor S. aureus

  1. Stamherstel: Verkrijg een tube bevroren MRSA252, schroei de inoculatiering dicht en koel af om een ring met bacteriële oplossing te verkrijgen, inoculeer de bacteriën op tryptische soja-agar (TSA)-platen (zie materiaaltabel) volgens de streakplaatmethode28 en kweek een nacht bij 37 °C.
  2. Bacteriële activering: Neem de volgende dag een schudkolf van 50 ml en voeg 20 ml tryptische sojabouillon (TSB) medium toe (zie materiaaltabel). Pak een enkele kolonie met een pipetpunt van 10 μL en voeg deze toe aan de shaker. Incubeer de kolonies een nacht bij 220 tpm, 37 °C.
  3. Secundaire activering: Neem de volgende dag een schudkolf van 50 ml met 15 ml TSB-medium. Verwijder 200 μl bacteriële oplossing uit de schudder met de eerste geactiveerde bacteriën, voeg toe aan een nieuwe kolf met 20 ml TSB-medium en incubeer gedurende 4 uur bij 220 tpm bij 37 °C.
  4. Verzamel de secundair geactiveerde bacteriële oplossing in een centrifugebuis van 50 ml, centrifugeer gedurende 10 minuten bij 3.000 x g en gooi het bovenstaande weg.
  5. Resuspendeer de neergeslagen bacteriën in 10 ml zoutoplossing en centrifugeer gedurende 10 minuten op 3.000 x g . Herhaal deze stap 2X.
  6. Meet de OD600-waarde van de bacteriële oplossing en stel deze in op 1.0 met zoutoplossing. Op dat moment was de bacteriële hoeveelheid MRSA252 in dit experiment 1,0 x 109 CFU/ml.
    OPMERKING: De bacteriële oplossing wordt toegevoegd aan een medium zonder antibiotica en verdund tot de gewenste concentratie; Alle bacteriën die in dit experiment zijn gebruikt, zijn volgens de bovenstaande methode bereid.

2. Opstelling van een intracellulair infectiemodel in vitro

  1. Bereiding van RAW264.7-cellen
    OPMERKING: De cellijnen die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn verkregen van ATCC. Alle cellijnen testten negatief op mycoplasma-besmetting. Alle experimenten werden uitgevoerd op cellen in de logaritmische groeifase.
    1. Haal de cellen uit de vloeibare stikstof en ontdooi ze in een waterbad van 37 °C.
    2. Doe de RAW264.7-cellen in een centrifugebuis van 15 ml, voeg 2 ml gemodificeerd adelaarsmedium (DMEM) van Dulbecco toe, aangevuld met 10% foetaal runderserum (zie materiaaltabel), penicilline (100 eenheden/ml) en streptomycine (100 μg/ml; zie materiaaltabel; volledig medium) bij 37 °C in 5% CO2. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 min.
    3. Zaai 3 x 106 RAW264.7 cellen in schaaltjes van 100 mm met 10 ml compleet medium. Bewaar gedurende 12 uur in een celkweekincubator bij 37 °C in 5% CO2 zodat de samenvloeiing van de cellen tussen 50% en 60% ligt.
  2. In vitro intracellulaire infectie
    1. Neem 10 μL celsuspensie en voeg deze toe aan de celteller om de celconcentratie te berekenen. Tel en zaai 2 x 105 RAW264.7-cellen in een plaat met 24 putjes (zie materiaaltabel) met 1 ml volledig medium voor elk putje en bewaar het 10-12 uur in een celkweekincubator.
    2. Verwijder het bovenstaande en voeg 1 ml volledig medium met 2 x 106 CFU bacteriële oplossing (stap 1.6) toe aan elk putje. Plaats het 2 uur in de celkweekincubator. De MRSA252 geïnfecteerde veelvoud van infectie
      (MOI) is 10. (Om de correlatie tussen verschillende multiplicities of infection (MOI)-waarden en de fagocytose van bacteriën door cellen te verifiëren, hebben we experimentele groepen opgericht met MOI-waarden van 20, 30, 40 en 50.).
      OPMERKING: Het volledige medium dat wordt gebruikt bij het infecteren van cellen bevat geen penicilline en streptomycine.
    3. Verwijder het bovenstaande en was de cellen 2x met PBS (zie materiaaltabel). Voeg 800 μL DMEM met 100 μg/ml gentamycine per putje toe (zie Materiaaltabel) en plaats in de celincubator bij 37 °C in 5% CO2 gedurende 2 uur.
  3. Evaluatie van in vitro intracellulair infectiemodel
    1. Intracellulaire S. aureus dodingstest
      1. Verzamel de RAW264.7-cellen (stappen 2.2.2 en 2.2.3) afzonderlijk in centrifugebuisjes. Was de cellen 2x met PBS, voeg 0,1% Triton X-100 (zie Materiaaltabel) oplossing toe aan elke buis gedurende 5 minuten en vang het lysaat op in de centrifugebuisjes.
      2. Gebruik PBS om het lysaat serieel te verdunnen. Neem 20 μl lysaat en voeg dit toe aan een microcentrifugebuisje met 180 μl PBS en meng vervolgens grondig door te pipetteren. Verdun stap voor stap volgens deze procedure. Spot elke verdunning van het lysaat op TSA-platen en incubeer een nacht bij 37 °C. Tel de kolonies op de TSA-platen voor lysaat (Figuur 1A).
        OPMERKING: Verder hebben we de optimale experimentele omstandigheden onderzocht voor intracellulaire infectie van MRSA252 in peritoneale macrofagen. De bacteriële belasting in peritoneale macrofagen die zijn geïnfecteerd met MRSA252 en behandeld zijn met variërende concentraties gentamicine wordt weergegeven in figuur 1B, terwijl de bacteriële belasting na behandeling met 100 μg/ml gentamicine gedurende verschillende duur wordt weergegeven in figuur 1C.
      3. Verdun het bovenstaande en lysaat serieel met PBS zoals beschreven in paragraaf 2.3.1.2 en observeer de kolonies op de TSA-platen voor het bovenstaande en het lysaat (figuur 2A).
    2. Confocale laserscanmicroscoop (CLSM)
      1. Verdun RAW264.7-cellen (stap 2.2) tot 2 x 105 cellen/ml op een confocale petrischaal (zie materiaaltabel) en plaats ze in een celincubator voor hechting 's nachts bij 37 °C in 5% CO2. Voeg 1 ml compleet medium met 2 x 106 CFU en 4 x 106 bacteriële oplossing (stap 1.6) toe aan elke confocale petrischaal en plaats deze 2 uur in de celincubator, waardoor het MOI respectievelijk 10 en 20 wordt.
      2. Verwijder het bovenstaande en was de cellen 3x met PBS, voeg 100 μg/ml gentamycine DMEM toe gedurende 2 uur en verwijder de extracellulaire bacteriën. Verwijder vervolgens het bovenstaande en was de cellen 2x met PBS, voeg DIL-werkvloeistof toe (zie materiaaltabel) en incubeer 5 minuten in het donker bij 37 °C.
      3. Verwijder DIL-werkvloeistof en was 3x keer met PBS en fixeer met 4% paraformaldehyde-oplossing (zie materiaaltabel) gedurende 20 minuten.
      4. Verwijder de paraformaldehyde-oplossing en was 3x met PBS, voeg DAPI-kleurstof toe (zie materiaaltabel) en incubeer 5 minuten in het donker. Verwijder de DAPI-kleurstofoplossing en was 5x met PBS. Gebruik CLSM om cellen te observeren (Figuur 2B).
        OPMERKING: Dit werk werd gebruikt MRSA252 geconstrueerd met een groen fluorescerend eiwit (GFP), dat werd geconstrueerd met behulp van de homologe recombinatiemethode29.

3. Opstelling van een in vivo intracellulair infectiemodel

  1. Verwerving van peritoneale macrofagen bij muizen
    1. Bereid 6% zetmeelbouillon voor. Volgens de massaverhouding 3:10:5 (w/w) voeg je achtereenvolgens drie soorten hulpstoffen toe (runderextractpoeder, trypton, natriumchloride; zie materiaaltabel) in de glazen container. Voeg 1 L ddH2O toe aan een glazen container, roer om te smelten en verwarm in de magnetron. Voeg oplosbaar zetmeel toe (zie materiaaltabel) met een massaverhouding van 6, roer om te smelten en zorg ervoor dat de glazen container gedurende 30 minuten op 121 °C wordt geautoclaveerd. Bewaar in de koelkast bij 4 °C tot het een pasta wordt.
    2. Verzamel peritoneale macrofagen van muizen volgens de onderstaande stappen.
      1. Kies twee Balb/c muizen. Gebruik de linkerhand om de nek van de muis vast te pakken en de staart te besturen. Draai de muis om en laat het hoofd naar beneden en de buik omhoog (Figuur 3A). Dien intraperitoneale injectie toe van 6% zetmeelbouillon, 3 ml per muis (Figuur 3B).
        OPMERKING: Door de zwaartekracht vallen de organen in de buikholte naar achteren naar de borstkas, waardoor wordt voorkomen dat de spuit andere organen verwondt.
      2. Verdoof de muizen na 72 uur met 3% isofluraan en offer ze vervolgens op door cervicale dislocatie. Desinfecteer ze met 75% ethylalcohol. Gebruik een oogheelkundige schaar om de buik van de muis open te snijden om het buikvlies volledig bloot te leggen (Figuur 4A-C).
      3. Injecteer 10 ml DMEM-medium in de muizen om de buikholte te spoelen door middel van intraperitoneale injectie (Figuur 4D). Nadat DMEM in de buikholte van de muizen is geïnjecteerd, wrijft u ongeveer 1 minuut zachtjes over de buik van de muizen om de buik grondiger te spoelen. Gebruik een spuit om spoelvloeistof op te vangen in een centrifugebuis van 50 ml (Figuur 4E).
      4. Centrifugeer de spoelvloeistof gedurende 5 minuten op 300 x g en gooi het bovenstaande weg.
      5. Gebruik 10 ml DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum, penicilline (100 eenheden/ml) en streptomycine (100 μg/ml; volledig medium) om de verzamelde cellen te blazen en op te zuigen, ze te tellen en de celconcentratie te verdunnen tot 2 x 106/ml en plank op platen met 6 putjes (zie materiaaltabel), 1 ml per putje.
      6. Plaats de plaat met 6 putjes op 37 °C in 5% CO2, incubeer gedurende 4 uur en verwijder dan het supernatant. Cellen 2x wassen met steriel PBS en 's nachts kweken met 1 ml DMEM per putje bij 37 °C in 5% CO2.
  2. Preparaat van intracellulaire bacteriën
    1. Incubeer de peritoneale macrofagen (stap 3.1.2) met MRSA252 gedurende 2 uur. Verwijder het bovenstaande en was de cellen 2x met PBS. Voeg DMEM volledig medium toe met 100 μg/ml gentamycine (1 ml per putje) en incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C in 5% CO2.
    2. Verwijder het bovenstaande en was de cellen 3x met PBS. Gebruik een celschraper om peritoneale macrofagen van muizen te verzamelen in centrifugebuisjes van 50 ml, centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g . De intracellulaire bacteriën van MRSA252 werden met succes bereid in peritoneale macrofagen.
    3. Voor de berekening van intracellulaire bacteriën wordt aan de peritoneale macrofagen die zijn geïnfecteerd met intracellulaire MRSA252 lysozym (10 μg/ml, zie materiaaltabel) bij 37 °C gedurende 10 minuten toegevoegd en vervolgens 2x met PBS gewassen. Voeg vervolgens 1 ml PBS toe om de cellen opnieuw te suspenderen. Lyseer de cellen door gedurende 5 minuten 0,1% Triton X-100 toe te voegen.
    4. Verdun de lysis met serieverdunningen en laat het op een TSA-plaat vallen. Cultuur 's nachts bij 37 °C. Bereken de intracellulaire bacteriën van MRSA252 in peritoneale macrofagen, die 1,8 x 106 CFU per muis waren, door de bacteriekolonies te tellen.
      OPMERKING: Wanneer de celschraper cellen verzamelt, moet de actie voorzichtig zijn. De cellen worden in één richting afgeschraapt om celbreuk te voorkomen, wat het daaropvolgende experiment zou kunnen beïnvloeden.
  3. Intracellulaire bacteriële infectie bij muizen
    1. Verdeel willekeurig 20 Balb/c-muizen in vier groepen (n=5, Figuur 5A).
    2. Injecteer voor groep I 3 x 106 CFU planktonische MRSA252 per muis door middel van intraveneuze injectie. Injecteer voor groep II 3 x 106 KBU planktonische MRSA252 en vancomycine (110 mg/kg; zie materiaaltabel) per muis door middel van intraveneuze injectie. Injecteer voor groep III de intracellulaire bacteriën (bereid in stap 3.2) door middel van intraveneuze injectie. Injecteer voor groep IV de intracellulaire bacteriën (bereid in stap 3.2) en vancomycine (110 mg/kg) per muis door middel van intraveneuze injectie.
    3. Plaats de muizen onder de infrarood fysiotherapielamp totdat hun staartaders verwijd zijn.
    4. Injecteer intraveneus 3 x 106 CFU planktonische MRSA252 per muis van Groep I en Groep II. Injecteer de intracellulaire bacteriën (bereid in stap 3.2) intraveneus per muis van Groep III en Groep IV.
      OPMERKING: Wanneer u een spuit gebruikt om vloeistof op te vangen die intracellulaire bacteriën bevat, wordt aanbevolen om de vloeistof eerst voorzichtig gelijkmatig met een pipet te mengen om consistente infectieniveaus bij alle muizen te garanderen.
    5. Injecteer na 30 minuten intraveneus vancomycine in Groep II en Groep IV per muis.
  4. Evaluatie van in vivo intracellulair infectiemodel
    1. Evalueer het intracellulaire infectiemodel van muizen door de kolonisatie van bacteriën in de nieren te tellen. Verdoof de muizen na 24 uur injectie met 3% isofluraan en offer ze op door cervicale dislocatie. Desinfecteer ze in 75% ethylalcohol.
    2. Immobiliseer de muizen, til de buikhuid op met een pincet met één hand, knip de buikhuid van de muis met een oogheelkundige schaar met de andere hand, zoek de nieren in de buikholte en strip de nieren volledig. Zet ze in PBS.
    3. Voeg 1 ml PBS toe aan de weefselmaalbuis. Breng de nieren van elke muis over in afzonderlijke maalbuizen en maal totdat er geen vast weefsel meer over is. Giet het gehomogeniseerde weefsel in individuele EP-buisjes en label elk buisje met de bijbehorende muisidentificatie.
    4. Gebruik PBS om het weefselhomogenaat serieel te verdunnen. Spot elke verdunning op afzonderlijke TSA-platen en incubeer een nacht bij 37 °C. Tel de kolonies en analyseer de gegevens (Figuur 5B).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intracellulaire infectiemodellen van S. aureus werden zowel in vitro als in vivo met succes vastgesteld. Door de experimentele omstandigheden voor fagocytose te optimaliseren en zowel de concentratie als de duur van de antibioticabehandeling te verlengen, overleefde sommige S. aureus in de macrofagen (Figuur 1). Om de antibioticaresistentie van S. aureus verder te beoordelen, werde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus, als een facultatieve intracellulaire ziekteverwekker, kan verschillende celtypen binnendringen en overleven, waarbij dit vermogen wordt gebruikt om antibiotica en immuunresponsen tijdens infectie te ontwijken30. Deze studie stelde een intracellulair infectiemodel van S. aureusin vivo vast om een basis te leggen voor het onderzoeken van de intracellulaire infectiemechanismen van de ziekteverwekker. Door de impact van verschillende MOI-w...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant No.32300779, NO.32270989), Natural Science Foundation of Chongqing (CSTB2022NSCQ-MSX0156), Science and Technology Research Project van Chongqing Education Commission (KJQN202312802) en China Postdoctoral Science Foundation (2024M754250).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24-well plateCorning Incorporated, USA3524
4 % paraformaldehyde solutioneBBI, UKE672002-0500
6-well plateCorning Incorporated, USA3516
Beef extract powderBBI, UKA600114-0500
Biohazard safety equipmentHeal force, ChinaVS-1300L-u
Cell incubatorESCO, SingaporeCCL-170B-8
Cell scraperNest710001
Centrifuge M1416RRWD, ChinaM1416R
Centrifuge tubeGuanghou Labselect, ChinaCT-002-50A
Confocal laser scanning microscope (CLSM)Zeiss, Germany880
Confocal petri dishBiosharp, ChinaBS-20-GJM
DAPI dyeShanghai Beyotime, China C1006
DIL working fluidShanghai Beyotime, China C1991S
Dulbecco’s Modified Eagle MediumThermo Gibco, USAC11995500BT
Fetal Bovine SerumHycloneSV30208.02
GentamycinShanghai Sangon, ChinaB540724-0010
IncubatorShanghai Hengzi, ChinaHDPF-150
LysozymeBeijing Solarbio, ChinaL9070
MRSA252Third Military Medical University, Chinanull
MRSA252(GPF)Third Military Medical University, Chinanull
Penicillin and StreptomycinShanghai Beyotime, China C0222
Phosphate Buffer SolutionShanghai Beyotime, China ST476
SalineSichuan Kelun, Chinanull
Sodium chlorideShanghai Macklin, ChinaS805275
Starch solubleShanghai Sangon, ChinaA500904-0500
Triton X-100Shanghai Beyotime, China P0096-100ml
Tryptic Soy Agar (TSA) platesBeijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China02-130
Tryptic Soy Broth (TSB) mediumBeijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China02-102K
TryptoneOXOID, UKLP0042B
VancomycinShanghai Beyotime, China ST2807-250mg
RAW264.7 cellUSA, ATCCnull

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sutton, J. A. F., et al. Staphylococcus aureus cell wall structure and dynamics during host-pathogen interaction. PLoS Pathog. 17 (3), e1009468(2021).
  2. Yang, H., et al. Lateral flow assay of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using bacteriophage cellular wall-binding domain as recognition agent. Biosens Bioelectron. 182, 113189(2021).
  3. Howden, B. P., et al. Staphylococcus aureus host interactions and adaptation. Nat Rev Microbiol. 21 (6), 380-395 (2023).
  4. Guo, H., et al. Biofilm and small colony variants-an update on Staphylococcus aureus strategies toward drug resistance. Int J Mol Sci. 23 (3), 1241(2022).
  5. Huitema, L., et al. Intracellular escape strategies of Staphylococcus aureus in persistent cutaneous infections. Exp Dermatol. 30 (10), 1428-1439 (2021).
  6. Pidwill, G. R., et al. Clonal population expansion of Staphylococcus aureus occurs due to escape from a finite number of intraphagocyte niches. Sci Rep. 13 (1), 1188(2023).
  7. Wang, M., et al. Autophagy in Staphylococcus aureus infection. Front Cell Infect Microbiol. 11, 750222(2021).
  8. Arya, R., et al. Identification of an antivirulence agent targeting the master regulator of virulence genes in Staphylococcus aureus. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1268044(2023).
  9. Münzenmayer, L., et al. Influence of sae-regulated and agr-regulated factors on the escape of Staphylococcus aureus from human macrophages. Cell Microbiol. 18 (8), 1172-1183 (2016).
  10. Chin, D., et al. Staphylococcus lugdunensis uses the agr regulatory system to resist killing by host innate immune effectors. Infect Immun. 90 (10), e0009922(2022).
  11. Podkowik, M., et al. Quorum-sensing agr system of Staphylococcus aureus primes gene expression for protection from lethal oxidative stress. Elife. 12, RP89098(2024).
  12. Purves, J., et al. Air pollution induces Staphylococcus aureus usa300 respiratory tract colonization mediated by specific bacterial genetic responses involving the global virulence gene regulators agr and sae. Environ Microbiol. 24 (9), 4449-4465 (2022).
  13. Wittekind, M. A., et al. The novel protein scra acts through the saers two-component system to regulate virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol Microbiol. 117 (5), 1196-1212 (2022).
  14. Pidwill, G. R., et al. The role of macrophages in Staphylococcus aureus infection. Front Immunol. 11, 620339(2020).
  15. Lang, J. C., et al. A photoconvertible reporter system for bacterial metabolic activity reveals that Staphylococcus aureus enters a dormant-like state to persist within macrophages. mBio. 13 (5), e0231622(2022).
  16. Li, M., et al. Interactions between macrophages and biofilm during Staphylococcus aureus-associated implant infection: Difficulties and solutions. J Innate Immun. 15 (1), 499-515 (2023).
  17. Sun, L., et al. Staphylococcal virulence factor hlgb targets the endoplasmic-reticulum-resident e3 ubiquitin ligase amfr to promote pneumonia. Nat Microbiol. 8 (1), 107-120 (2023).
  18. Mulcahy, M. E., et al. Manipulation of autophagy and apoptosis facilitates intracellular survival of Staphylococcus aureus in human neutrophils. Front Immunol. 11, 565545(2020).
  19. Cai, J., et al. Staphylococcus aureus facilitates its survival in bovine macrophages by blocking autophagic flux. J Cell Mol Med. 24 (6), 3460-3468 (2020).
  20. Ahmad-Mansour, N., et al. Staphylococcus aureus toxins: An update on their pathogenic properties and potential treatments. Toxins. 13 (10), 677(2021).
  21. Davis, J. S., et al. How I manage a patient with MRSA bacteremia. Clin Microbiol Infect. 28 (2), 190-194 (2022).
  22. Fait, A., et al. Staphylococcus aureus response and adaptation to vancomycin. Adv Microb Physiol. 85, 201-258 (2024).
  23. Kelly, J. J., et al. Measurement of accumulation of antibiotics to Staphylococcus aureus in phagosomes of live macrophages. Angew Chem Int Ed Engl. 63 (3), e202313870(2024).
  24. Rowe, S. E., et al. Recalcitrant Staphylococcus aureus infections: Obstacles and solutions. Infect Immun. 89 (4), e00694-e00720 (2021).
  25. Lehar, S. M., et al. Novel antibody-antibiotic conjugate eliminates intracellular S. aureus. Nature. 527 (7578), 323-328 (2015).
  26. Peyrusson, F., et al. Intracellular Staphylococcus aureus persisters upon antibiotic exposure. Nat Commun. 11 (1), 2200(2020).
  27. Pollitt, E. J. G., et al. Staphylococcus aureus infection dynamics. PLoS Pathog. 14 (6), e1007112(2018).
  28. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J Vis Exp. 11 (63), e3064(2012).
  29. Qin, L., et al. Antibody-antibiotic conjugate targeted therapy for orthopedic implant-associated intracellular S. aureus infections. J Adv Res. 65, 239-255 (2024).
  30. Andie, S. L., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Nat Rev Dis Primers. 31 (4), 18034(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Intracellulair infectiemodelperitoneale macrofagenantibioticabehandelingMRSA 252 infectiecelkweekmuisinfectiemodelbacteri le persistentiefagocytose assaykolonietelling

Gerelateerde artikelen