Methodenartikel

Isolatie en kweek van primaire adipocyten van muizen van magere en zwaarlijvige muizen

4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67846

⸱

24 januari 2025

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

De grootte en kwetsbaarheid van rijpe vetcellen hebben de technieken en hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor hun studie en isolatie beperkt. Hier wordt een protocol beschreven voor de isolatie van rijpe muizenadipocyten, dat gemakkelijk kan worden aangepast voor verschillende vetdepots en muizendiëten.

Samenvatting

Vetweefsel bestaat voornamelijk uit rijpe, met lipiden beladen vetcellen in volume. Deze postmitotische cellen spelen een cruciale rol bij de opslag en mobilisatie van energie, thermoregulatie en de afscheiding van endocriene factoren. De uitzetting van wit vetweefsel als gevolg van een onbalans in de calorieën resulteert in zowel de vergroting van bestaande vetcellen als de aanmaak van extra vetcellen uit adipocytvoorlopercellen. Door obesitas veroorzaakte veranderingen in wit vetweefsel, inclusief die van de adipocyten, worden in verband gebracht met tal van comorbiditeiten, zoals diabetes type 2 en 13 soorten kanker. Een belangrijke barrière om te bestuderen hoe vetcellen bijdragen aan ziekte, is het onvermogen om rijpe vetcellen gemakkelijk te isoleren en te kweken. Dit artikel beschrijft een protocol om magere en zwaarlijvige vetcellen van muizen te isoleren uit de onderhuidse en viscerale vetdepots van mannelijke en vrouwelijke C57BL/6-muizen. Het protocol beschrijft hoe geïsoleerde primaire vetcellen gedurende maximaal 2 weken kunnen worden gekweekt in een membraanadipocyt-aggregaatsysteem, waardoor hun functionele analyse in co-cultuurexperimenten, lipolyse-assays of door het verzamelen van geconditioneerde media die door adipocyten uitgescheiden factoren bevatten, wordt vergemakkelijkt. Daarnaast schetst het protocol methoden voor het kweken van explantaten van vetweefsel in basaalmembraanmatrixkoepels en het in beeld brengen van primaire geïsoleerde vetcellen. Belangrijk is dat deze benadering kan worden geïntegreerd met bestaande protocollen voor de isolatie van adipocyt-voorlopercellen in vetweefsel met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Samen bieden deze protocollen onderzoekers hulpmiddelen om adipocyten, adipocyt-voorlopercellen en volledig vetweefsel van magere en zwaarlijvige, mannelijke en vrouwelijke muizen functioneel te bestuderen.

Inleiding

Verwacht wordt dat de prevalentie van obesitas bij volwassenen in de Verenigde Staten tegen 2030 50% zal bereiken1, waardoor het absoluut noodzakelijk is om de cellulaire en fysiologische effecten van obesitas beter te begrijpen. Obesitas wordt gekenmerkt door een onbalans in de calorieën, wat resulteert in de uitzetting van wit vetweefsel als gevolg van een verhoogde opslag van energie als vet. Uitzetting van vetweefsel kan zowel optreden door de aanmaak van nieuwe vetcellen (hyperplasie) als door een toename van de grootte van bestaande vetcellen (hypertrofie). Hoewel beide processen resulteren in de uitzetting van vetweefsel, valt hypertrofische expansie samen met een verminderde metabole gezondheid en een hogere incidentie van metabole stoornissen 2,3. Een beter begrip van de complexiteit van vetweefsel zal inzicht verschaffen in de moleculaire mechanismen die metabole stoornissen en andere aan obesitas gerelateerde comorbiditeiten, waaronder diabetes type 2 en kanker, reguleren.

Vetweefsel wordt al lang gewaardeerd om zijn rol bij energieopslag en thermoregulatie. Meer recentelijk is vetweefsel echter naar voren gekomen als een belangrijk metabolisch signaalweefsel, verantwoordelijk voor de afscheiding van metabolieten, lipiden en peptiden 4,5. Deze van vetweefsel afgeleide moleculen, adipokines genaamd, signaleren lokaal en systemisch en kunnen de energiehomeostase, immuunfunctie, vasculaire dynamiek en meer reguleren 5,6,7. Rijpe vetcellen vormen ongeveer 50% van de cellen in vetweefsel en vertegenwoordigen de overgrote meerderheid van vetweefselvolume8. Belangrijk is dat studies hebben aangetoond dat vetcellen uit vele subpopulaties bestaan 9,10. Als zodanig genereren voorlopercellen van adipocyten verschillende populaties van rijpe vetcellen op basis van factoren zoals geslacht en vetweefseldepot. Deze rijpe vetcellen kunnen verder worden gemoduleerd door veranderingen in voeding en obesitas, waardoor subpopulaties van vetcellen ontstaan die transcriptioneel verschillend zijn en verschillende paracriene handtekeningen tot expressie brengen 9,11,12,13,14,15,16 . Ondanks hun complexiteit en fysiologisch belang, blijft het vermogen om rijpe vetcellen te isoleren en te kweken een duidelijke barrière voor het bestuderen van deze cellen.

De momenteel beschikbare methoden die worden gebruikt om rijpe vetcellen te isoleren, maken gebruik van differentiatie van adipocytvoorlopercellen (APC's), fluorescerende geactiveerde celsortering en op centrifugatie gebaseerde technieken, hoewel deze allemaal hun eigen nadelen hebben. In vitro of ex vivo differentiatie van APC's tot rijpe vetcellen wordt veel gebruikt om rijpe vetcellen te ontwikkelen. Deze kunstmatig gedifferentieerde cellen zijn echter multiloculair en bevatten veel kleine lipidedruppeltjes, in plaats van het uniloculaire fenotype van rijpe vetcellen in vivo, die één grote lipidedruppel bevatten17. Bovendien hebben studies aangetoond dat in vitro gedifferentieerde cellen transcriptioneel verschillen van geïsoleerde rijpe vetcellen die in vivo worden aangetroffen 17. Belangrijk is dat in vitro differentiatie niet in staat is om het verschil tussen magere en obese vetcellen vast te leggen. Fluorescerend-geactiveerde celsortering (FACS) wordt vaak gebruikt om specifieke celpopulaties uit weefsel te isoleren; rijpe vetcellen kunnen echter gemakkelijk barsten onder FACS-omstandigheden vanwege hun grote omvang en fragiele membranen, waardoor dit een inefficiënte methode is voor de isolatie van rijpe vetcellen. Andere bestaande protocollen resulteren in de ophoping van grote hoeveelheden vrije lipiden, die na verloop van tijd giftig kunnen zijn voor rijpe vetcellen in cultuur.

Hier beschrijven we een protocol voor de isolatie van rijpe vetcellen van muizen uit wit vetweefsel. Dit protocol is een aanpassing van het protocol voor volwassen adipocytenaggregaatculturen dat oorspronkelijk was opgesteld door Harms et al.17; De hier beschreven op centrifugatie gebaseerde benadering maakt echter gebruik van gangbare laboratoriumapparatuur en is in staat om adipocyten efficiënt te isoleren uit kleine hoeveelheden (~0,5 g) vetweefsel. Dit is een gemakkelijk aan te passen systeem en aanpassingen voor het isoleren van rijpe muizenvetcellen van mannelijke en vrouwelijke muizen, viscerale en onderhuidse vetdepots en verschillende dieetomstandigheden zijn inbegrepen.

Protocol

Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door de Commissie voor het gebruik en de verzorging van dieren van de Universiteit van Utah. Dit protocol is geoptimaliseerd voor de isolatie van rijpe vetcellen van C57BL/6 mannelijke en vrouwelijke muizen in de leeftijd van 8-16 weken, met een lichaamsgewicht variërend van 20-45 g. Details van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn te vinden in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van de oplossing

  1. Bereid collagenasebuffer voor. Voeg 100 mg collagenasepoeder, 1 ml 1 M HEPES-buffer, 500 μl 100x P188, 50 μl 1 M CaCl2, 0,05 g BSA en 48,45 ml Medium 199 toe. Filtreer de oplossing steriel, aliquot en bewaar bij -20 °C.
  2. Maak celkweekmedia. Combineer 500 ml DMEM, 50 ml FBS, 5 ml penicilline-streptomycine en 5 ml L-glutaminesupplement.

2. Verzameling van witte vetweefseldepots van muizen

  1. Maak een bord van 1 x 10 cm met 200 μL HBSS klaar voor elk afzonderlijk depot en conditioneer indien nodig en plaats het op ijs.
  2. Haal de dieren uit het dierenverblijf en euthanaseer de muizen in overeenstemming met de richtlijnen van de Commissie Dierenverzorging en Gebruik van de instelling. Hier werden dieren geëuthanaseerd door cervicale dislocatie onder diepe anesthesie.
  3. Weeg en noteer indien nodig het gewicht van elke muis.
  4. Steriliseer de muis door 70% ethanol te spuiten om de buitenkant te coaten.
  5. Oogst de juiste vetkussentjes van de muis 18,19.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de lymfeklieren uit het onderhuidse depot verwijdert voordat u het weefsel in de schaal plaatst.
  6. Weeg elk vet en noteer het gewicht.
  7. Leg het vetkussentje in het voorbereide bord van 10 cm op ijs.

3. Bereiding van explantaten van wit vetweefsel

OPMERKING: Deze stap is optioneel.

  1. Ontdooi ten minste 12 uur voor het begin van de dissectie de basaalmembraanmatrix (Matrigel) bij 4 °C op ijs en koel een doos steriele pipetpunten van 200 μl af bij 4 °C.
  2. Piket met behulp van gekoelde pipetpunten 80 μL basaalmembraanmatrix in het midden van elk putje van een kweekplaat met 24 putjes om een koepel te creëren (Figuur 1A). Plaats de plaat 30 minuten in de broedmachine (37 °C, 5% CO2) om de matrix gedeeltelijk te laten stollen.
  3. Bereid weefsel voor: Weeg met een steriele dissectieschaar 0,1 g weefsel van elk monster af en plaats het in PBS op ijs.
  4. Met een steriele tang wordt voorgewogen weefsel ingebed in de gedeeltelijk gestolde matrixkoepel. Voeg 30 μL basaalmembraanmatrix toe aan het ingebedde weefsel. Plaats de plaat 30 minuten terug in de broedmachine om het weefsel in de basaalmembraanmatrix te plaatsen.
    OPMERKING: Het inbedden van weefsel in de basaalmembraanmatrix is cruciaal om ervoor te zorgen dat weefsel in cultuur blijft in plaats van te drijven. Dit behoudt de gezondheid en kwaliteit van het weefsel (Figuur 1B).
  5. Voeg 1 ml groeimedia (DMEM met 10% FBS) toe aan elk putje en keer terug naar de incubator.

4. Collagenase behandeling

  1. Bereken de benodigde hoeveelheid collagenaseoplossing. Zie tabel 1.
  2. Bereid collagenase-oplossing met DNase. Voeg 0,00017 g DNase toe per 1 ml collagenaseoplossing. Draaikolk om te mengen.
  3. Hak met een scheermesje het geïsoleerde vetweefsel fijn totdat het weefsel homogeen lijkt (Figuur 2A). Breng het gehakte weefsel over in een steriele conische buis van 50 ml.
    OPMERKING: Niet te lang hakken. Het hakken is voltooid wanneer het weefsel homogeen en pasta-achtig lijkt. Ondergehakt weefsel ziet er dik en heterogeen uit, en te veel gehakt weefsel zal resulteren in het vrijkomen van vrije lipiden (Figuur 2B).
  4. Voeg bereid collageenase en DNase-oplossing toe aan het gehakte vetweefsel met behulp van de in stap 4.1 berekende hoeveelheden. Vortex op maximale snelheid gedurende 7-10 s om grondig te combineren. Plaats de conische buizen van 50 ml horizontaal in een schudder die is ingesteld op 220 tpm, 37 °C.
  5. Incubeer het schudden gedurende 10 minuten, draai dan gedurende 5 s en controleer de monsters. Volledig verteerde monsters zien er homogeen uit zonder zichtbare klonten of weefselstukjes. Als de monsters niet volledig zijn verteerd, ga dan verder met de spijsvertering in de shaker en controleer elke 2 minuten (Figuur 2C).
    OPMERKING: Niet te veel verteren. Overmatige tijd in collagenaseoplossing kan leiden tot de afbraak van vetcellen en het vrijkomen van lipiden.
  6. Gebruik een serologische pipet om het verteerde weefsel door een zeef in een nieuwe kegelvormige van 50 ml te leiden. Voeg een volume FBS toe dat gelijk is aan het volume weefsel + collagenaseoplossing door de zeef in een conische om collagenase te neutraliseren.
    OPMERKING: Na het filteren blijft er een kleine hoeveelheid weefsel in de zeef achter.

5. Het wassen van de tissue

OPMERKING: Voltooi alle volgende stappen in een steriele weefselkweekkap.

  1. Bereid 1 tube van 15 ml voor met 10 ml warme kweekmedia voor elke toestand.
  2. Centrifugeer de buizen uit stap 4.6 op 300 x g gedurende 3 minuten op de temperatuur aangegeven in tabel 1.
    OPMERKING: De temperatuur voor centrifugatie moet worden aangepast op basis van het geslacht van de muizen waaruit het vetweefsel is geïsoleerd; deze temperaturen worden weergegeven in tabel 1.
  3. Zorg ervoor dat het weefsel na het centrifugeren in vier lagen uiteenvalt (Figuur 3A).
    OPMERKING: De bovenste laag is de vrije lipiden, de tweede laag is de rijpe adipocytenlaag, de derde laag is de collagenase en FBS, en de vierde laag is de stromale vasculaire fractie (SVF) die pellets naar de onderste20,21.
  4. Gooi de bovenste laag vrije lipiden voorzichtig weg met een pipet van 200 μL.
  5. Gebruik na het verwijderen van de bovenste laag een p1000-pipet met de onderste afgesneden om de rijpe vetcellen over te brengen naar de voorbereide buis van 15 ml met 10 ml groeimedia (Figuur 3B).
    1. Optioneel: Om de primaire adipocyt-voorlopercellen (APC's) te isoleren, draait u de buisjes opnieuw op 300 x g gedurende 10 minuten. Ga dan verder met de isolatie van de adipocyt-voorlopercellen door Liu et al.22, Cho et al.23 of iets dergelijks.
  6. Keer de buisjes van 15 ml met de rijpe vetcellen voorzichtig 3-5 keer om totdat de witte laag zich over de media heeft verspreid.
  7. Laat de buisjes 10 minuten rechtop staan bij de temperatuur aangegeven in tabel 1 om scheiding van de adipocyt- en medialagen mogelijk te maken.
  8. Draai de tubes na de 10 minuten rust 1 minuut op 100 x g bij kamertemperatuur om de scheiding van de lagen verder te bevorderen. Na het centrifugeren worden de monsters weer in vier lagen gescheiden, zoals weergegeven in figuur 3A.
  9. Verwijder de bovenste laag vrije lipiden en gooi deze weg met een pipet.
  10. Schuif met een naald van 21 G die is bevestigd aan een spuit van 5 ml langs de rand van de buis naar beneden totdat de onderkant van de naald vrij is van de rijpe adipocytenlaag (Figuur 3C). Zorg ervoor dat de bovenkant van de naald en de onderkant van de spuit de rijpe adipocytenlaag niet verstoren.
  11. Trek de spuit langzaam omhoog om de kweekmedia en eventuele celresten te verwijderen.
    OPMERKING: Terwijl de media worden verwijderd, moet u ervoor zorgen dat de naaldpunt vrij is van de rijpe adipocytenlaag.
  12. Voeg voorzichtig 10 ml kweekmedia toe aan elke buis.
  13. Herhaal stap 5.6-5.11. Voeg niet meer cultuurmedia toe.
  14. Schuif met behulp van de pipetpunten met gellading de pipetpunt langs de rand van de buis naar beneden om de resterende media onder de rijpe adipocytenlaag te verwijderen.

6. Inpakken

  1. Centrifugeer de cellen gedurende 1 minuut bij 100 x g bij de in tabel 1 aangegeven temperatuur. Verwijder vrije lipiden (heldere olielaag bovenop de cellen) met behulp van een pipet. Verwijder de kweekmedia onder de vetcellen met behulp van een gellaadtip. Zorg ervoor dat de adipocytenlaag zo min mogelijk wordt verstoord (Figuur 4).
  2. Herhaal stap 6.1 totdat alle kweekmedia en vrije lipiden zijn verwijderd (meestal 3-5 keer). Het cellenpakket moet wit van kleur zijn en er moeten geen zichtbare vrije lipiden boven de cellen of media onder de cellen zijn (Figuur 4).

7. Beplating en functionele testen

  1. Plateren van de rijpe vetcellen voor celcultuur
    1. Verwijder de celkweekinzetstukken van een met weefselkweek behandelde plaat met 24 putjes en plaats ze met de membraankant naar boven op het oppervlak van de kap.
    2. Vul afwisselend putjes van de plaat met 1 ml warme kweekmedia.
    3. Plaats met behulp van een afgeknipte p200-pipetpunt 30 μL verpakte rijpe vetcellen uit stap 6.2 op de bovenkant van een transwell-inzetstuk (Figuur 5A,B).
    4. Pak het inzetstuk van de transwell voorzichtig op, keer het om en plaats het in een voorgevulde put in de plaat met 24 putjes (Figuur 5A). Plaats de plaat voorzichtig in de broedmachine die is ingesteld op 37 °C met 5% CO2.
      OPMERKING: Goed verpakte vetcellen zouden van bovenaf gezien een ondoorzichtige laag moeten vormen zonder zichtbare, heldere, vrije lipidedruppels (Figuur 5C).
    5. Vervang de media op de rijpe vetcellen elke 2-7 dagen gedurende maximaal 14 dagen.
      1. Om de media uit de putjes te verwijderen, houdt u de transwell op zijn plaats en gebruikt u een p200-pipet om de media voorzichtig door de kleine openingen aan de zijkant van de transwell-insert te verwijderen (Figuur 5D).
      2. Nadat de media zijn verwijderd, terwijl de transwell nog steeds op zijn plaats blijft, voegt u heel langzaam 1 ml media toe aan de zijwand van de put.
        OPMERKING: Zorg ervoor dat u media heel langzaam toevoegt en verwijdert. Vetcellen kunnen gemakkelijk losraken van het membraan als de media snel worden vervangen.
  2. Lipolyse-test
    1. Explantaten van vetweefsel in de plaat zoals beschreven in stap 3.4 of rijpe vetcellen zoals beschreven in stap 7.1.
      OPMERKING: Cellen of weefsel moeten gedurende ten minste 24 uur worden gekweekt in fenolroodvrije media voordat een lipolysetest wordt uitgevoerd.
    2. Bereiding van de oplossing: Bereid een oplossing van 5% BSA in DMEM (geen fenolrood) door 5 g BSA op te lossen in 100 ml DMEM. Keer voorzichtig om om te combineren totdat BSA volledig is opgelost.
      1. Bereid werkende oplossingen voor controle- en stimulatiemedia voor. Combineer voor controlemedia 5% BSA DMEM-media met het voertuig. Combineer voor stimulatiemedia 5% BSA DMEM-media met 5 μM CL-316,243. Verwarm de controle- en stimulatiemedia voor gebruik tot 37 °C.
    3. Verwijder het medium uit de putjes en was het met 1 ml warme DPBS. Vul de putjes met 500 μL per putje met controle- of stimulatiemedia. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2.
    4. Verzamel 1 uur, 2 uur, 4 uur en 24 uur na het starten van de lipolysetest 100 μL media van elke put in een microcentrifugebuis en vervang deze door 100 μL van de juiste controle- of stimulatiemedia.
      OPMERKING: Monsters kunnen op dit punt bij -20 °C worden bewaard.
    5. Voer een colorimetrische glyceroltest uit met behulp van een in de handel verkrijgbare gratis glycerolkit (zie materiaaltabel) of iets dergelijks.
      1. Bereid de reagentia voor zoals aangegeven in de set.
      2. Ontdooi de monsters en meng voorzichtig door te pipetteren.
      3. Bereid een standaardcurve voor met een zevenpunts, 2-voudige seriële verdunning met behulp van de standaardglyceroloplossing.
      4. Breng 25 μL monster of standaard over naar elk putje van een plaat met 96 putjes met heldere bodem.
      5. Voeg 100 μL vrij glycerolanalysereagens toe aan elk putje met monster of standaardoplossing.
      6. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en lees vervolgens de extinctie af bij 540 nm (figuur 6A-D).
  3. Beeldvorming
    1. Bereid de beelddia's voor. Om dia's voor te bereiden, verwijdert u de laag rugpapier van elke beeldafstandhouder en plaatst u deze op de dia. Op elke dia kunnen twee beeldafstandhouders naast elkaar worden geplaatst.
    2. Breng met behulp van een gesneden pipetpunt van 200 μl 30 μl verpakte vetcellen uit stap 6.2 over in een microcentrifugebuis.
    3. Bereid het kleurmengsel voor. Bereid 200 μl per monster plasmamembraankleuringsoplossing voor bij 5 μg/ml en Hoechst bij 4,5 μg/ml in PBS. Voeg vlekkenmix toe aan de monsters en schud voorzichtig.
    4. Kleur de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Bescherm de monsters tegen licht.
    5. Nadat de kleuring is voltooid, wast u de monsters. Voeg 500 μL PBS toe aan elk monster en schud voorzichtig om te combineren. Laat 5 minuten staan. Draai gedurende 1 minuut op 100 x g en verwijder vervolgens het medium onder de cellen vandaan met een pipetpunt met gel laden.
    6. Bereid de dia's voor. Verwijder de doorzichtige plastic folie van de bovenkant van de beeldafstandhouders om de plakkerige laag bloot te leggen.
    7. Voeg 500 μL PBS toe aan de tube met gekleurde vetcellen en meng voorzichtig.
    8. Om de rijpe vetcellen geen tijd te geven om naar de oppervlakte te stijgen, gebruikt u snel een afgeknipte p200-pipetpunt om 35 μL van de vetcellen in het afstandsstuk op de beeldvormingsdia te plaatsen.
    9. Plaats een afdekglaasje op het afstandsstuk.
    10. Ga onmiddellijk over tot beeldvorming (Figuur 6C). Een vertraging in de beeldvorming kan leiden tot bloeding van de membraanmarker.

Resultaten

Zoals te zien is in Figuur 2, zijn een goede hakmolen (Figuur 2B) en spijsvertering (Figuur 2C) belangrijk voor de isolatie van intacte rijpe vetcellen. Onderverminking en ondervertering kunnen resulteren in een lage opbrengst van rijpe vetcellen als gevolg van onvoldoende scheiding van het bindweefsel. Visueel kan dit worden waargenomen met vezelig weefsel dat achterblijft na het hakken en zichtbare klonten in collagenaseoplossing. Bovendien resulteren te veel hakken en te veel verteren ook in een lage opbrengst als gevolg van het barsten van de rijpe vetcellen. Visueel resulteert dit in het verlies van de witte ondoorzichtige laag en een ophoping van een grote, heldere, vrije lipidelaag. Ongepaste niveaus van hakken of verteren zullen resulteren in een slechte isolatie van adipocyten.

Een goede voorbereiding en vertering van vetweefsel zal resulteren in de scheiding van het weefsel in vier verschillende lagen, zoals te zien is in figuur 3. Enige uitbarsting van de vetcellen, wat resulteert in het vrijkomen van vrije lipiden is onvermijdelijk; Een goede hak- en spijsvertering zorgt echter voor een minimale ruptuur van de adipocyten. De resterende vrije lipidelaag en media worden verwijderd tijdens het inpakken van de vetcellen (Figuur 4). De juiste pakking van de vetcellen is essentieel voor de efficiënte isolatie van rijpe vetcellen. Alle resterende vrije lipiden of media zullen resulteren in een slechte isolatie en een negatieve invloed hebben op stroomafwaartse functionele testen, zoals plating, lipolyse en celbeeldvorming.

Dit protocol genereert een schone voorbereiding van rijpe vetcellen. Celbeeldvorming en lipolysetests kunnen worden uitgevoerd om de cellulaire functie te beoordelen en aan te tonen dat de rijpe vetcellen hun functie behouden na isolatie en na kweek gedurende maximaal twee weken. De lipolysetest geeft aan dat de rijpe vetcellen het vermogen behouden om te reageren op cellulaire signalering door de afgifte van vrije glycerol bij stimulatie van de β-3-adrenerge receptor (Figuur 6A,B). Dit vermogen blijft zelfs na 2 weken in cultuur behouden en is sterk vergelijkbaar met de lipolyse-activiteit van vetweefselexplantaten die gedurende 24 uur worden gekweekt (Figuur 6C,D). Vetcellen van slechte kwaliteit zullen verzwakte lipolyse vertonen. De celbeeldvorming van geïsoleerde vetcellen toont ronde en intacte uniloculaire rijpe vetcellen die een enkele grote lipidedruppel bevatten. Adipocytenisolaties van slechte kwaliteit zullen voornamelijk grote, extracellulaire oliedruppels vertonen die wijzen op gebarsten vetcellen.

figure-results-1
Figuur 1: Inbedding van explantaten van vetweefsel. (A) Afbeelding van gedeeltelijk gestolde koepel van de basaalmembraanmatrix voorafgaand aan de inbedding van het weefsel. (B) Representatieve beelden van onjuiste en juiste weefselinbedding. Onjuiste inbedding is zichtbaar omdat het weefsel gedeeltelijk of volledig boven de koepel lijkt te zweven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Schema voor het correct hakken en verteren van vetweefsel. (A) Schematische weergave van de stappen weefselhakken en verteren 4.2-4.6. (B) Representatieve beelden van onder, optimaal en over-gehakt weefsel. Ondergehakt weefsel heeft grote brokken die hun oorspronkelijke vorm behouden. Te veel gehakt weefsel resulteert in een zichtbare toename van de vrije lipiden rond het weefsel, die er helder en vettig uitzien. (C) Representatieve beelden van onder, optimaal en oververteerd weefsel. Onderverteerd weefsel bevat stukjes heel weefsel die in de oplossing achterblijven. Oververteerd weefsel vertoont een grote vrije lipidelaag die zich snel losmaakt van de oplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Scheiding van lagen verteerd vetweefsel. (A) Schematisch en representatief beeld van de lagen die aanwezig zijn volgens stap 5.3. (B) Gebruik van een gesneden pipetpunt om de rijpe adipocytenlaag uit de conische buis van 50 ml te verwijderen. (C) Juiste techniek en plaatsing van de naald en spuit om de kweekmedia onder de rijpe adipocytenlaag te verwijderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Sequentiële pakking van rijpe vetcellen. Sequentiële beelden van het inpakken van de rijpe vetcellen. Lagen vrije lipiden, adipocyten en media zijn gelabeld. Na elke draaibeurt worden vrije lipiden en media verwijderd. Dit wordt herhaald totdat er na een centrifuge geen media of vrije lipiden meer van de vetcellen scheiden. Het uiteindelijke beeld is representatief voor goed opeengepakte rijpe vetcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Uitplating en kweek van rijpe vetcellen. (A) Schema van de uitplating van rijpe vetcellen. Met behulp van een afgesneden p200 pipetpunt worden verpakte vetcellen op het membraan van een celkweekinsert geplaatst. Het inzetstuk wordt vervolgens omgekeerd in vooraf gevulde putjes met cultuurmedia. (B) Een representatieve afbeelding van het uitplateren van rijpe vetcellen met een afbeelding van een gesneden pipetpunt die vetcellen afzet op het inzetstuk van de transwell. (C) Schema's en representatieve afbeeldingen van goed ingepakte en slecht verpakte vetcellen bedekt met transwells, gezien van boven de putjes. Goed verpakte vetcellen zien er wit en ondoorzichtig uit, terwijl slecht opeengepakte vetcellen resulteren in de vorming van heldere lipidedruppels. (D) Schema van de techniek die is gebruikt om kweekmedia te veranderen. Een p200 pipetpunt wordt gebruikt om de media voorzichtig door de openingen in de zijwand van de transwell-inzet te verwijderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Beeldvorming van rijpe vetcellen en lipolysetest. (een, b) Glycerolafgifte uit subcutane (A) en viscerale (B) rijpe adipocyten. Adipocyten werden geïsoleerd uit 16 weken oude C57BL/6 mannelijke muizen die een normaal chow-dieet kregen. 30 μL vetcellen werden geplateerd zoals beschreven in stap 7.1 en gedurende 1 of 10 dagen gekweekt. Vetcellen werden behandeld met 5 μM CL-316.243 gedurende 1 uur, 2 uur en 4 uur, en supernatanten werden verzameld en geanalyseerd op vrije glycerol. (C,D) Glycerolafgifte uit subcutane (C) en viscerale (D) vetweefselexplantaten. Vetweefsel werd geïsoleerd van 18 weken oude C57BL/6 vrouwelijke muizen die een normaal chow-dieet kregen. 0,1 g explantaten van vetweefsel werd geplateerd zoals beschreven in stap 3.1-3.4 en gedurende 24 uur gekweekt. Vetcellen werden behandeld met 5 μM CL-316.243 gedurende 1 uur, 2 uur en 4 uur, en supernatanten werden verzameld en geanalyseerd op vrije glycerol. N = 3 technische replicaten voor A-D. Alle gegevens zijn gemiddelde ± standaarddeviatie. (E) Representatieve beelden van geïsoleerde onderhuidse en viscerale rijpe vetcellen. Vetcellen werden geïsoleerd uit 16 weken oude C57BL/6J mannelijke muizen die een normaal chow-dieet kregen. Vetcellen werden gekleurd met plasmamembraankleuring (rood) en Hoechst-kernkleuring (blauw). Schaal staven: 50 μm; vergroting: 60x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

GeslachtDieetDepotMoeilijkheidsgraad hakkenCollagenase: WeefselverhoudingAanbevolen verteringstijd (min)Centrifuge temperatuur.Wassen temperatuur.
VrouwelijkNormale chowOnderhuidsHard2:112RT37 °C
VisceraalGemiddeld1:18RT37 °C
Vetrijk dieetOnderhuidsGemakkelijk1:18RT37 °C
VisceraalGemakkelijk1:18RT37 °C
MannelijkNormale chowOnderhuidsHard2:1144 °CRT
VisceraalGemiddeld1:1104 °CRT
Vetrijk dieetOnderhuidsGemakkelijk1:1104 °CRT
VisceraalGemakkelijk1:1104 °CRT

Tabel 1: Seks-, depot- en dieetspecifieke aanpassingen. De moeilijkheidsgraad van het hakken van elk weefsel, beschreven als "Gemakkelijk", "Gemiddeld" of "Moeilijk" in relatie tot andere depots. Houd er rekening mee dat de werkelijke haktijd varieert, afhankelijk van de onderzoeker en het weefsel. Collagenase: Weefselverhouding vermeld als volume (ml) van collagenase + DNase-oplossing bereid in stap 4.1 tot het gewicht van het weefsel (g). De verteringstijd is een geschatte schatting, maar de werkelijke verteringstijd is afhankelijk van het gehakt en het weefsel. Onderzoekers moeten de spijsvertering beoordelen zoals beschreven in het protocol. De centrifugetemperatuur en wastemperatuur verschillen tussen mannelijke en vrouwelijke muizen. RT geeft kamertemperatuur aan.

Discussie

Primaire vetcellen zijn notoir moeilijk te isoleren en te kweken omdat ze gemakkelijk scheuren, en hun grote omvang sluit het gebruik van gebruikelijke primaire celisolatie-instrumenten zoals flowcytometrie uit. Het hier beschreven protocol levert schone en functionele rijpe vetcellen op, die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan downstream-toepassingen. Belangrijk is dat dit protocol de scheiding van de rijpe vetcellen van ander cellulair afval en de vrije lipidenlaag mogelijk maakt, waardoor effectieve beeldvorming, kweek en lipolyse-tests mogelijk zijn. Het protocol kan gemakkelijk worden gecombineerd met gepubliceerde protocollen22,23 voor de isolatie van de stromale vasculaire fractie en APC's. Dit protocol beschrijft ook een procedure voor de bereiding en kweek van explantaten van hele weefsels uit vetweefsel, die kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse toepassingen zoals lipolysetests en het verzamelen van uitgescheiden factoren uit volledig vetweefsel.

Kritieke aspecten zijn onder meer het juiste hakken, de spijsvertering en de verwijdering van de vrije lipidenlaag. Om een goede hakmolen te garanderen, is het belangrijk om het uiterlijk van het weefsel tijdens het hele proces nauwlettend in de gaten te houden. De tijd en moeite die nodig zijn om een optimaal gehakt van het weefsel te bereiken, is afhankelijk van het vetdepot, dieetinterventies (zoals een vetrijk dieet) en de onderzoeker. Andere gereedschappen voor het hakken, zoals scharen, kunnen indien nodig worden opgenomen, maar dit is hier niet onderzocht. Merk op dat overmatig hakken moet worden vermeden, omdat het vetcellen zal scheuren, wat niet alleen de onmiddellijke opbrengst vermindert, maar ook de totale opbrengst en de kwaliteit van de vetcellen vermindert vanwege het schadelijke effect dat de vrije lipidenlaag heeft op de resterende vetcellen. Een goede spijsvertering, vergelijkbaar met een goed gehakt, hangt af van het vetweefseldepot, dieetinterventies, leeftijd van muizen, enz. De toevoeging van DNase aan het collagenase helpt de aggregatie van de vetcellen tijdens de spijsvertering te voorkomen, die het gevolg kan zijn van cellulair afval. De verteringstijd voor weefsels is daarom zeer variabel. De gegeven schattingen voor de verteringstijden dienen als richtlijn, die te vinden zijn in tabel 1. De beste manier om ervoor te zorgen dat de weefsels goed worden verteerd, is door het weefsel tijdens het hele proces en zoals beschreven in het protocol visueel te inspecteren. De verschillende centrifugatie- en wastemperaturen die in tabel 1 worden beschreven, voorgesteld op basis van geslacht, zijn essentieel voor de juiste scheiding van de rijpe vetcellen van zowel de vrije lipidenlaag als de andere cellulaire resten en SVF; Het gebruik van alternatieve temperaturen kan leiden tot het verlies van de rijpe vetcellen als gevolg van aggregatie en het barsten van de vetcellen.

Het verwijderen van de vrije lipidelaag bij elke stap is van cruciaal belang, en als dit niet gebeurt, zullen stroomafwaartse complicaties optreden voor plating, beeldvorming en de lipolysetest. Verder zal de aanhoudende aanwezigheid van de vrije lipidenlaag tijdens de procedure resulteren in extra sterfte van adipocyten als gevolg van lipotoxiciteit, wat een dramatische invloed heeft op de algehele opbrengst en kwaliteit. Hoewel het maximaliseren van de efficiëntie van de isolatie van rijpe vetcellen over het algemeen gewenst is, zal het verwijderen van de vrije lipidelaag, zelfs ten koste van sommige van de rijpe vetcellen, resulteren in een algehele toename van de opbrengst van rijpe vetcellen aan het einde van het protocol.

Beperkingen van de procedure zijn onder meer het aantal monsters. Vanwege de nauwkeurigheid en tijd die nodig is voor het verwijderen van media en de vrije lipidelaag, is de procedure over het algemeen beperkt tot zes monsters tegelijk. Het verwerken van aanzienlijk meer monsters zal ertoe leiden dat primaire vetcellen te lang worden blootgesteld aan vrije lipiden en de totale opbrengst verminderen. Extra personeel kan echter een toename van het aantal monsters mogelijk maken. De tijd van het hakken tot de functionele test is van cruciaal belang, aangezien buitensporige vertragingen bij het verwijderen van media en de vrije lipidelaag resulteren in extra barsten van rijpe vetcellen. Het protocol is verder beperkt in het vermogen om subpopulaties van rijpe vetcellen te scheiden.

De huidige methoden om rijpe vetcellen te bestuderen zijn voornamelijk gebaseerd op de isolatie van APC's en de daaropvolgende ex vivo differentiatie van deze cellen. Er wordt begonnen met de ontwikkeling van aanvullende methoden, waaronder het organ-on-a-chip-model en transwell-coculturen,18,24. Er is echter aangetoond dat deze ex vivo gedifferentieerde vetcellen transcriptioneel en morfologisch verschillen van de rijpe vetcellen in het vetweefsel17. Morfologisch gezien zijn ex vivo gedifferentieerde vetcellen multiloculair, terwijl in vivo geïsoleerde vetcellen uniloculair zijn. Dit protocol is gewijzigd en geoptimaliseerd ten opzichte van eerdere rapporten17,25 om met succes rijpe vetcellen te isoleren en te kweken uit slechts 0,5 g vetweefsel in vergelijking met andere protocollen die ten minste 5 g vetweefsel vereisen25 . Ten slotte was deze studie bedoeld om de succesvolle voltooiing van de belangrijkste stappen in het protocol visueel te illustreren in plaats van concrete tijden, centrifugatietemperaturen en collagenasehoeveelheden, hoewel richtlijnen zijn opgenomen in tabel 1. Deze parameters moeten worden aangepast aan factoren zoals het vetweefseldepot, het geslacht en de adipositas van het dier, die allemaal van invloed kunnen zijn op de efficiëntie van de spijsvertering en schone scheiding van rijpe vetcellen in dit protocol.

In totaal duurt de procedure 3-4 uur, afhankelijk van het aantal gepoolde muizen en het aantal individuele vetweefselmonsters. Verwacht wordt dat het vermogen om de functionele rol van rijpe adipocyten te kweken en te beoordelen veel downstream-toepassingen mogelijk zal maken voor de studie van de biologie van adipocyten zelf (bijv. metabolisme, gebruik van voedingsstoffen en tracering) en de interactie van adipocyten met andere celtypen, zoals APC's, kankercellen en cellen van het immuunsysteem.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de subsidie van 5 For The Fight and Huntsman Cancer Institute (KIH), de V Foundation for Cancer Research (KIH) en DK133455 (KIH) erkennen. Schema's van het protocol gemaakt met Biorender. Daarnaast willen de auteurs Stephanie Giagnocavo en de Cell Imaging Core van de Universiteit van Utah bedanken voor hulp bij beeldvorming, en Mark Lee voor feedback op het manuscript.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100x Poloxamer 188 solutionSigmaP5556-100mL
15 mL conischCellstar188261
21 G naaldBD305165
5 mL spuitBD309646
50 mL conischCellstar227261
6,5 mm Transwell met 0,4 µm poreuze polycarbonaatmembraan inzetCorning3413
Bovine Serum Albumine (BSA)Sigma-AldrichA7906-100G
CaCl2SigmaC1016-500gm
CellMask Plasma Membraan KleurenThermo Fisher ScientificC10045
CL 316243 dinatriumzoutTocris1499
Collageenase PoederSigmaC6885
DMEMGibco11995-040
DMEM zonder fenolroodGibcoA14430-01
DNase ISigma-Aldrich10104159001
Foetaal Rund Serum (FBS)GibcoA56708-01
Fisherbrand Tissue Path Superfrost Plus Gold SlidesFisher scientific1518848
Gel Loading Pipet TipFisher scientific02-707-181
GlutaMAX SupplementGibco35050061
Glycerol Assay KitAbcamAB133130
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14025-092
HEPES BufferSigma83264-100ml-F
Heraeus Megafuge 16R CentrifugeThermo Scientific 75004271
Hoechst 33342 OplossingThermo Fisher Scientific62249
Incuberende Mini ShakerVWR12620-942
Medium 199Sigma-AldrichM4530
Microscoop DekglazenVWR16004-302
PBSGibco10010023
Penicilline-StreptomycineGibco15140-122
SecureSeal Imaging SpacersGrace Biolabs654006
Zeef (SteeL Fijnmazige Cocktail Zeef)OXO3112000https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html
```

Referenties

  1. Ward, Z. J., et al. Projected U.S. state-level prevalence of adult obesity and severe obesity. N Engl J Med. 381 (25), 2440-2450 (2019).
  2. Vishvanath, L., Gupta, R. K. Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity. J Clin Invest. 129 (10), 4022-4031 (2019).
  3. Longo, M., et al. Adipose tissue dysfunction as determinant of obesity-associated metabolic complications. Int J Mol Sci. 20 (9), 2358(2019).
  4. Funcke, J. B., Scherer, P. E. Beyond adiponectin and leptin: Adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication. J Lipid Res. 60 (10), 1648-1684 (2019).
  5. Johnston, E. K., Abbott, R. D. Adipose tissue paracrine-, autocrine-, and matrix-dependent signaling during the development and progression of obesity. Cells. 12 (3), 407(2023).
  6. Koenen, M., Hill, M. A., Cohen, P., Sowers, J. R. Obesity, adipose tissue and vascular dysfunction. Circ Res. 128 (7), 951-968 (2021).
  7. Liu, P., et al. Transcriptomic and lipidomic profiling of subcutaneous and visceral adipose tissues in 15 vertebrates. Sci Data. 10 (1), 453(2023).
  8. Wu, Y., Li, X., Li, Q., Cheng, C., Zheng, L. Adipose tissue-to-breast cancer crosstalk: Comprehensive insights. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (5), 188800(2022).
  9. Emont, M. P., et al. A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).
  10. Nahmgoong, H., et al. Distinct properties of adipose stem cell subpopulations determine fat depot-specific characteristics. Cell Metab. 34 (3), 458-472.e6 (2022).
  11. Hildreth, A. D., et al. Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity. Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).
  12. Maniyadath, B., Zhang, Q., Gupta, R. K., Mandrup, S. Adipose tissue at single-cell resolution. Cell Metab. 35 (3), 386-413 (2023).
  13. Gao, Y., et al. Adipocytes promote breast tumorigenesis through taz-dependent secretion of resistin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33295-33304 (2020).
  14. Cornide-Petronio, M. E., Jimenez-Castro, M. B., Gracia-Sancho, J., Peralta, C. New insights into the liver-visceral adipose axis during hepatic resection and liver transplantation. Cells. 8 (9), 1100(2019).
  15. Verma, S., et al. Zinc-alpha-2-glycoprotein secreted by triple-negative breast cancer promotes peritumoral fibrosis. Cancer Res Commun. 4 (7), 1655-1666 (2024).
  16. Min, S. Y., et al. Diverse repertoire of human adipocyte subtypes develops from transcriptionally distinct mesenchymal progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (36), 17970-17979 (2019).
  17. Harms, M. J., et al. Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes. Cell Rep. 27 (1), 213-225.e5 (2019).
  18. Chaurasiya, V., et al. Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication. Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).
  19. Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown pre-adipocytes from newborn mice. J Vis Exp. 167, e62005(2021).
  20. Farrar, J. S., Martin, R. K. Isolation of the stromal vascular fraction from adipose tissue and subsequent differentiation into white or beige adipocytes. Methods Mol Biol. 2455, 103-115 (2022).
  21. You, X., Gao, J., Yao, Y. Advanced methods to mechanically isolate stromal vascular fraction: A concise review. Regen Ther. 27, 120-125 (2024).
  22. Liu, Q., et al. Progenitor cell isolation from mouse epididymal adipose tissue and sequencing library construction. STAR Protoc. 4 (4), 102703(2023).
  23. Cho, D. S., Doles, J. D. Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues. J Vis Exp. 162, e61694(2020).
  24. Lauschke, V. M., Hagberg, C. E. Next-generation human adipose tissue culture methods. Curr Opin Genet Dev. 80, 102057(2023).
  25. Alexandersson, I., Harms, M. J., Boucher, J. Isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (MAAC). J Vis Exp. 156, e60485(2020).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van adipocytenadipocytenkweekslanke en obese muizenvetweefselverschillen tussen vetdepotscollagenaseverteringadipocytprogenitorcellenTranswell insertsgeconditioneerd medium

Gerelateerde artikelen