Methodenartikel

3D generatie van menselijk myocardweefsel met behulp van smeltelektrospinning schrijven van polycaprolactonsteigers en hiPSC-afgeleide hartcellen

DOI:

10.3791/67847

⸱

28 maart 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Program, Enabling Technologies Division, CIMA Universidad de Navarra, and Instituto de Investigación Sanitaria de Navarra (IdiSNA), 2Department of Cardiology, Clínica Universidad de Navarra and Instituto de Investigación Sanitaria de Navarra (IdiSNA), 3Hematology and Cell Therapy Area, Clínica Universidad de Navarra and Instituto de Investigación Sanitaria de Navarra (IdiSNA), 4Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC) CB16/12/00489, 5Hemato-Oncology Program, Cancer Division, CIMA Universidad de Navarra

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er wordt een reproduceerbare methode gepresenteerd om 3D-myocardiale weefsels te genereren die smelt-elektrospinnende schrijf- (MEW), polycaprolacton (PCL)-steigers en fibrinehydrogels combineren met hiPSC-afgeleide cardiomyocyten en fibroblasten. Deze techniek biedt nauwkeurige controle over de steigerarchitectuur en kan worden toegepast bij preklinische geneesmiddelentests en modellering van hartaandoeningen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwikkeling van functioneel menselijk hartweefsel is veelbelovend voor het bevorderen van toepassingen in geneesmiddelenscreening, ziektemodellering en regeneratieve geneeskunde. Dit protocol beschrijft de stapsgewijze fabricage van 3D-myocardiale weefsels met geavanceerde nabootsing van de natuurlijke hartstructuur door smeltelektrospinning schrijven (MEW) polycaprolacton (PCL) steigers te combineren met fibrinehydrogels en door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC)-afgeleide hartcellen. Het proces omvat het inbedden van een mengsel van cardiomyocyten (hiPSC-CM's) en cardiale fibroblasten (hiPSC-CF's) in een fibrinematrix om miniweefsels te creëren, met structurele ondersteuning door MEW-gegenereerde steigers. Deze fibrillaire steigers worden gefabriceerd op micro- tot nanoschaal, waardoor nauwkeurige controle over de vezelarchitectuur mogelijk is, die een sleutelrol speelt bij het organiseren van celdistributie en -uitlijning. Ondertussen bevordert de fibrinematrix de levensvatbaarheid van cellen en bootst het de extracellulaire omgeving na. Karakterisering van de gegenereerde weefsels onthult goed georganiseerde sarcomeren in hiPSC-CM's, samen met stabiele contractiele activiteit. De weefsels vertonen al twee dagen na het zaaien een consistente spontane klopping, met aanhoudende functionaliteit in de loop van de tijd. De combinatie van hiPSC-CF's met hiPSC-CM's verbetert de structurele integriteit van de weefsels en ondersteunt tegelijkertijd de levensvatbaarheid van de cellen op lange termijn. Deze aanpak biedt een reproduceerbare, aanpasbare en schaalbare methode voor het maken van biomimetische hartweefselmodellen, en biedt een veelzijdig platform voor preklinische geneesmiddelentests, mechanistische studies van hartaandoeningen en mogelijke regeneratieve therapieën.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De fabricage van functionele, menselijke, door het hart gemanipuleerde weefsels is veelbelovend voor toepassingen met een hoge impact. Deze variëren van de ontwikkeling van het modelleren van cardiotoxiciteit van geneesmiddelen en hartaandoeningen bij de mens tot het genereren van therapeutische weefsels van relevante groottes1. Hoewel er de afgelopen 15 jaar aanzienlijke vooruitgang is geboekt op dit gebied, wordt de fabricage van zeer mimetisch menselijk myocardium momenteel gedwarsboomd door moeilijkheden bij het reproduceren van de complexe structurele en mechanische organisatie van zijn natuurlijke tegenhanger2.

Aan de biologische kant opende de revolutionaire celherprogrammeringstechnologie de mogelijkheid om patiëntspecifieke therapeutische cellen te ontwikkelen. Momenteel zijn humaan geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) de enige bron van menselijke cardiomyocyten in een gepersonaliseerde context. Een hoge opbrengst aan cardiomyocyten kan worden verkregen volgens robuuste differentiatieprotocollen 3,4. Een belangrijk probleem is de mate van rijping, aangezien menselijke hiPSC-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM's) die momenteel worden gebruikt, een onrijp fenotype vertonen onder conventionele 2D-differentiatieomstandigheden5. Dit houdt verband met het feit dat de structurele organisatie van het hartweefsel zeer complex is, absoluut anders dan conventionele 2D-culturen. Het myocardium bestaat ook uit verschillende cardiovasculaire cellen, waaronder niet-myocyten zoals cardiale fibroblasten, gladde spieren en endotheelcellen, geordend gerangschikt door een specifieke 3D-structuur, waardoor efficiënt bloed kan worden rondgepompt 6,7. Er zijn dus zeer gestructureerde menselijke cardiale miniweefsels nodig die zijn samengesteld uit alle belangrijke celtypen om fysiologisch relevante biomimetische weefsels te genereren.

De toepassing van nieuwe benaderingen van biofabricage kan deze impasse doorbreken. Onder deze, smeltelektrospinnen schrijven (MEW), een geavanceerde 3D-printtechnologie die in staat is om hoge precisie en resolutie te leveren. In MEW wordt een elektrisch veld gebruikt om een gesmolten polymeer in de vorm van vezels in het groottebereik van de cel af te zetten, een orde van grootte kleiner dan conventioneel fused deposition modeling (FDM) 3D-printen, wat resulteert in sterk gedefinieerde steigerstructuren 8,9. MEW is in staat gebleken om een complex in silico-ontwerp te vertalen naar een geprinte matrix en fysische eigenschappen in 3D af te stemmen op die van hartweefsel10. Met behulp van de MEW-technologie is het mogelijk om polymere mazen met verschillende vormen en structuren te printen die, in combinatie met zachte celvriendelijke hydrogels, samengestelde weefsels genereren die de micro- en macromechanische omgeving van het inheemse volwassen myocardium nabootsen11,12. Het is aangetoond dat het aanpassen van het ontwerp van de 3D-steiger in de MEW de resulterende functionaliteit (calciumtransiënten)10 verandert, wat de basis legt voor het begrijpen van de vorm-functierelatie op dit veelbelovende 3D-engineered systeem.

Hier wordt een gedetailleerd protocol opgesteld voor de fabricage van contractiele menselijke cardiale miniweefsels uit hiPSC-CM's en menselijke iPSC-afgeleide cardiale fibroblasten (hiPSC-CF's) en hun combinatie in een fibrinehydrogel versterkt met 3D-MEW-geprinte structuren. De toevoeging van fibroblasten is op grote schaal gebruikt in verschillende 3D-engineered systemen om de overleving van hiPSC-CM's te verbeteren en de weefselstructuur te behouden, maar het gebruik ervan in 3D-MEW-systemen is nog niet onderzocht13. De hier beschreven technologie biedt een veelzijdig platform voor onderzoekers die nauwkeurige hartweefselmodellen willen ontwikkelen met toepassingen zoals het begrijpen van ziektemechanismen, preklinische toxicologie en screening van geneesmiddelen. Dit model is geschikt voor het beoordelen van de cardiotoxiciteit van gevestigde geneesmiddelen zoals anthracyclines (bijv. doxorubicine), tyrosinekinaseremmers en opkomende therapieën zoals chimere antigeenreceptor T (CAR-T)-cellen, die in verband zijn gebracht met hartdisfunctie14. Bovendien heeft het model een aanzienlijk potentieel voor het bevorderen van regeneratieve geneeskunde door het testen van biomaterialen, bio-inkten en celgebaseerde therapieën mogelijk te maken die gericht zijn op het verbeteren van de hartfunctie en het herstellen van myocardweefsel bij aandoeningen zoals een myocardinfarct.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Installatie van media en reagens

  1. Voorcoaten van celkweekplaten
    1. Bereid Matrigel Growth Factor Reduced (MGFr) voorraad aliquots voor. Ontdooi een injectieflacon MGFr een nacht in de koelkast op ijs. Maak in een steriele kap, met behulp van gekoelde tips en houd de bouillon en buizen te allen tijde op ijs, aliquots van geschikt volume door de bouillon 1:1 te verdunnen in koud RPMI 1640 L-glutamine (RPMI).
      OPMERKING: Voor hiPSC-kweek en het zaaien van hiPSC-cardiomyocyten (hiPSC-CM's) worden verschillende verdunningen van MGFr gebruikt. De verdunning van de MGFr-coating voor hiPSC's varieert afhankelijk van de specifieke cellijn. Zodra het stadium van cardiomyocyten echter is bereikt, wordt een verdunning van 1:80 gebruikt, ongeacht de cellijn.
    2. Voor het coaten van celkweekplaten ontdooit u langzaam het vereiste aantal MGFr-aliquots op ijs en verdunt u ze verder in koud RPMI, 1:180 voor hiPSC-cultuur (100 μL MGFr in 9 ml RPMI) en 1:80 voor hiPSC-CM's replating (100 μL MGFr in 4 ml RPMI).
      1. Voeg onmiddellijk de verdunde MGFr toe in een volume van 1 ml per putje voor platen met 6 putjes (hiPSC-onderhoud) en 0,5 ml per putje voor platen met 12 putjes (hiPSC-CM's replating). Bewaar de platen voor gebruik bij 4 °C (maximaal 1 week).
        OPMERKING: MGFr-gecoate platen moeten 30 minuten worden verwarmd tot 37 °C voordat de cellen worden gezaaid. Voordat u de cellen plateert, zuigt u de vloeistof op van de MGFr-gecoate plaat.
    3. Voor hiPSC-CFs-cultuur moet de T75- of T175-kolven vóór gebruik gedurende ten minste 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) worden ingesmeerd met 0,1% gelatine, met een volume van 5 ml voor T75 of 10 ml voor T175-kolven. Zuig de vloeistof na incubatie op voordat de cel wordt uitgezaaid.
  2. Celkweek media
    1. Gebruik voor hiPSC-cultuur Complete Essential 8 Medium (E8 medium) door Essential 8 Supplement (50x) toe te voegen aan Essential 8 Basal Medium.
    2. Bereid voor cardiomyocytendifferentiatie voor:
      1. RPMI/B27 zonder insuline (-INS medium): Meng 500 ml RPMI en 10 ml B27 zonder insulinesupplement; RPMI/B27 (B27 medium): Meng 500 ml RPMI en 10 ml B27-supplement.
    3. Voeg voor de zuivering van cardiomyocyten (lactaatmedium) 2 ml 1 M lactaat toe aan 500 ml glucosevrij RPMI 1640. Het medium kan maximaal 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
    4. Voor het replateren van cardiomyocyten (Replating Medium), supplement B27 medium met 10% Knock-out serumvervanging (KSR) en 10 μM Y27.
      OPMERKING: KSR is een gedefinieerde, serumvrije formulering die FBS vervangt in ESC- en iPSC-kweekprotocollen.
    5. Voor fibroblastdifferentiatie en -onderhoud (vanaf dag 11) bereidt u het volledige fibroblastgroeimedium 3 (FGM3) voor zoals gespecificeerd door de fabrikant. Voeg het supplementenpakket (0,1 ml/ml foetaal kalfsserum, 5 μg/ml recombinante humane insuline en 1 ng/ml humane basische fibroblastgroeifactor, FGF2) toe aan het FGM3 basale medium.
      OPMERKING: Om de proliferatie van fibroblasten te bevorderen, wordt aanbevolen de FGF2-concentratie te verhogen tot 10 ng/ml.
    6. Voor het genereren en onderhouden van 3D-hartweefsel, bereidt u het volgende voor:
      1. Tissue Generation Medium: Vul B27 medium aan met 1% penicilline/streptomycine (P/S), 10% KSR en 10 μM Y27. Weefselonderhoudsmedium: Bereid B27-medium met 1% P/S en aprotinine (0,1% (wt/vol); 33 μg/ml).
        OPMERKING: Aprotinine zorgt voor de integriteit van fibrinegel gedurende de tijd in cultuur, waardoor de afbraak wordt voorkomen en de cellen in de hydrogel behouden blijven. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen om het aan het medium toe te voegen op dezelfde dag dat het weefsel wordt gegenereerd.
  3. Oplossingen voor kleine moleculen en groeifactoren
    1. CHIR-99021 (CHIR): Bereid voor de GSK3-remmer en Wnt-signaleringsactivator een stockoplossing van 10 mM door deze op te lossen in DMSO. Bewaar aliquots maximaal 6 maanden bij -20 °C.
      OPMERKING: De hiPSC-lijnen kunnen anders reageren op CHIR-behandeling. Optimalisatie van de CHIR-concentratie kan nodig zijn. 6-10 μM CHIR-testen worden aanbevolen.
    2. C59, Wnt-remmer: Bereid een stockoplossing van 10 mM door deze op te lossen in DMSO. Bewaar aliquots maximaal 6 maanden bij -20 °C.
    3. Y-27632, ROCK-remmer (Y27): Bereid een voorraad van 10 mM voor door deze op te lossen in DMSO. Bewaar aliquots maximaal 1 maand bij -20 °C. De uiteindelijke concentratie is afhankelijk van het doelceltype. Gebruik 2 μM (1/5000) voor hiPSC's en 10 μM (1/1000) voor hiPSC-CM's, hiPSC-CF's en weefselgeneratie.
      OPMERKING: Y27 bevordert de overleving van cellen door celdood in suspensie tijdens loslating te onderdrukken. Gebruik het bij het oogsten om overmatige celdood te voorkomen.
    4. Retinoïnezuur: Bereid een stockoplossing van 30 mM door deze op te lossen in chloroform. Bewaar de aliquots maximaal 2 jaar bij -20 °C.
    5. FGF2 (Recombinant Human Fibroblast Growth Factor, ook FGF-b, bevordert de proliferatie van fibroblasten): Bereid een stockoplossing van 50 μg/ml door deze op te lossen in steriel water. Bewaar de aliquots maximaal 6 maanden bij -20 °C.
    6. SB431542 (SB), TGFß1-signaleremmer: Bereid een stockoplossing van 10 mM door deze op te lossen in DMSO. Bewaar de aliquots maximaal 6 maanden bij -20 °C.
      OPMERKING: Voeg het toe aan het fibroblastmedium om de toestand van CF te behouden en de overgang van myofibroblasten (het pathologische fenotype dat optreedt tijdens fibrose) in 2D-cultuur te voorkomen.
  4. Voorraadoplossingen voor fibrine hydrogel
    1. Fibrinogeen: Bereid een stockoplossing van 200 mg/ml. Maal eerst de klontjes fibrinogeen tot een fijn poeder met behulp van steriel gereedschap in een celkap. Voeg warme 0,9% (wt/vol) NaCl-oplossing toe en houd deze op 37 °C tot deze volledig is opgelost. Bewaar de aliquots tot een jaar bij -80 °C; bij 4 °C gedurende 1 week.
      OPMERKING: Vanwege de viscositeit bij 4 °C, ontdooit u het en houdt u het enige tijd voor de weefselgeneratiestap op RT, zodat het nauwkeurig kan worden gepipetteerd. Als een aliquot bij hergebruik niet gemakkelijk kan worden gepipetteerd, wordt aanbevolen het weg te gooien en een nieuw te gebruiken.
    2. Trombine: Bereid een stockoplossing van 100 E/ml voor door trombine op te lossen in steriel 60% PBS + 40% water. Bewaar de aliquots maximaal een jaar bij -20 °C bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden.
      OPMERKING: Ontdooi het voor gebruik en bewaar het op ijs totdat de weefselgeneratiestap is voltooid.
    3. Aprotinine: Bereid een stockoplossing van 33 mg/ml door aprotinine op te lossen in steriel water (100 mg poeder in 3,04 ml water). Bewaar de aliquots maximaal een jaar bij -20 °C.
  5. Oplossingen voor analyse
    1. FACS-buffer (celcytometrie): Bereid een PBS-oplossing (Mg2+ en Ca2+-vrij) plus 2,5 mM EDTA en 5% (v/v) FBS.

2. Menselijke iPSC-cultuur en -passage

OPMERKING: De hier gerapporteerde procedures zijn uitgevoerd met verschillende hiPSC-lijnen, waaronder UCSFi001-A (mannelijk, vriendelijk geschenk van professor Bruce Conklin, David J. Gladstone Institutes), ESi044-A (mannelijk), ESi007-A (vrouwelijk) en ESi044-C (vrouwelijk) gezonde lijnen en ESi107-A (cardiale amyloïdose vrouwelijke zieke lijn) met kleine aanpassingen met betrekking tot hiPSC-kweekmedium, passaging-verdunning en CHIR-concentratie. Het protocol hiervan bevat de details die specifiek zijn voor het gebruik van UCSFi001-A. Alle celkweekincubaties in dit protocol worden uitgevoerd bij 37 °C, 5% CO2 en 96% vochtigheid.

  1. Cultuur hiPSC-lijn op 1:180 MGFr voorgecoate platen met 6 putjes. Houd ze op het E8-medium om pluripotentie te garanderen.
    OPMERKING: Om spontane differentiatie te voorkomen, is het van cruciaal belang om overgroei van culturen te voorkomen. Voer daarom hiPSC-passage uit wanneer de cellen voor 80%-90% samenvloeien.
  2. Zuig voor celpassage het oude medium op, was de putjes twee keer met 1 ml 0,5 mM EDTA-oplossing verdund in PBS (Mg2+- en Ca2+-vrij) per putje, en incubeer gedurende 7 minuten in EDTA/PBS bij RT om intercellulaire verklevingen te verstoren.
  3. Zuig de EDTA/PBS op en oogst de cellen, maak ze los door krachtig te pipetteren met een micropipet van 1000 μL met 1 ml E8-medium over het oppervlak van de put totdat de cellen zijn losgemaakt. Verzamel ze in een steriele centrifugebuis.
    OPMERKING: Vermijd pipetteren meer dan 10-15 keer, omdat dit de hiPSC-sterfte verhoogt.
  4. Maak van dit volume verdunningen van 1:15-1:20 en zaai de cellen op MGF-gecoate platen met 6 putjes in E8-medium + 2 μM Y27. Houd Y27 alleen de eerste 24 uur na het zaaien aan om toxiciteit door overmatige blootstelling te voorkomen.
    OPMERKING: Pas de splitsingsverhouding aan voor andere hiPSC-lijnen om de cellen gedurende 4-5 dagen ongedifferentieerd en op een gezonde morfologie te houden.
  5. Zuig na 24 uur oud medium op en voeg verse kamertemperatuur E8 medium genoeg toe voor twee dagen (meestal 3-4 ml). Verander daarna het medium elke dag gedurende 3-4 dagen.
    OPMERKING: De doorgangsfrequentie is afhankelijk van elke cellijn; Vermijd het bereiken van 100% van de samenvloeiing. hiPSC's zouden moeten groeien in grote, platte en compacte kolonies met veelhoekige geometrie, afgevlakte randen en een hoge kern/cytoplasma-verhouding.

3. Differentiatie van menselijke cardiomyocyten

OPMERKING: Voor het genereren van cardiomyocyten uit hiPSC's (hiPSC-CM's) is het beschreven protocol gebaseerd op de monolaagdifferentiatiemethodologie die wordt gebruikt door Lian et al.3,15 en Burridge et al.4. Met voldoende onderhoud kan hiPSC worden gedifferentieerd over 30 opeenvolgende passages met een hoge differentiatie-efficiëntie. Tekenen van abnormaal gedrag worden gedetecteerd door spontane differentiatie of opeenvolgend falen van meer dan 4 differentiaties. Regelmatige controles, waaronder mycoplasmatesten, worden aanbevolen.

  1. Om hartdifferentiatie te starten, oogst u hiPSC's met 80%-90% samenvloeiing zoals beschreven in de celpassagestap hierboven (stap 2). Zaadcellen in 1:180 MGFr-gecoate platen met 12 putjes passen de gesplitste verdunningen aan om compacte celmonolagen te verkrijgen met 90% van de confluentie na 48-72 uur zaaien. Maak voor deze cellijn verdunningen van 1:10 en de cellen zullen confluentie bereiken om 72 uur. Vervang het E8-medium dagelijks.
    OPMERKING: in dit protocol zijn de verdunningen aangepast op basis van het volume, niet op basis van het aantal cellen, om gebruikersafhankelijke variabiliteit te voorkomen. Als de monolaagtoestand niet binnen 72 uur na het plateren wordt bereikt, is het zeer waarschijnlijk dat het differentiatieproces niet zal slagen. In een dergelijk geval is het raadzaam om de poging te staken en opnieuw te starten, wat zorgt voor een optimale passage-efficiëntie.
  2. Wanneer monolagen zijn gestabiliseerd, begint het differentiatieproces, dat voortaan als dag 0 wordt beschouwd. Verander vervolgens het medium in -INS-medium aangevuld met 8 μM CHIR, de Wnt-signaleringsactivator, en incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 °C (1 ml per putje).
    OPMERKING: Titreer de CHIR-concentratie tussen 6-12 μM voor elke iPSC-lijn voor efficiënte mesoderminductie. In deze stap wordt een hoge mate van celdood verwacht, wat een teken is van een optimaal proces.
  3. Dag 1: Zuig de volgende dag het medium uit elk putje op en was de cellen met RPMI zonder supplementen (0,5 ml per putje). Voeg vervolgens 1,5 ml vers -INS-medium toe en incubeer de cellen gedurende 2 dagen.
    OPMERKING: Tijdens alle mediawisselingen worden wasstappen uitgevoerd om vuil, dode cellen en supplementresten te verwijderen.
  4. Dag 3: Om specificatie van de hartafstamming te induceren, vervangt u het medium door 1,5 ml -INS-medium aangevuld met 5 μM Wnt-remmer C59 gedurende 48 uur.
    OPMERKING: Hier wordt het GSK3-complex gevormd en wordt ß-catenine afgebroken, wat leidt tot cardiale mesodermale afstamming. Na deze stap is ook enige celdood waarneembaar.
  5. Dag 5: Wassen en vervangen door vers -INS medium gedurende 48 uur met een volume van 1,5 ml per putje, om de expansie van de hartvoorlopers te bevorderen.
  6. Dag 7: Vanaf deze dag worden de cellen in het B27-medium bijgehouden, waarbij de media elke 2-3 dagen worden vervangen.
    OPMERKING: Pas de mediahoeveelheden aan naar 2.5 ml per putje om het verversen van het medium in het weekend over te slaan, maar pas als deze toestand is bereikt. Normaal gesproken beginnen hiPSC-CM's spontaan te kloppen op dag 7-9. Eerst zal contractie worden waargenomen als geïsoleerde en ongecoördineerde clusters, maar binnen een paar dagen zouden culturen met een hoge zuiverheid een uniforme kloppende monolaag moeten vormen.
  7. Eenmaal verkregen, worden deze contractiele monolagen (meestal op dag 10) onderworpen aan een metabolisch selectieproces dat bestaat uit 2 cycli van 72 uur in lactaatmedium, gescheiden door een replating-stap om niet-cardiomyocytcellen te elimineren en de zuiverheid van de cultuur te verrijken.
  8. Dag 10, eerste zuiveringsstap (1st lactaat): Was de kloppende cellen met lactaatmedium (0,5 ml per putje) en incubeer ze met 1 ml lactaatmedium per putje lactaatmedium gedurende 72 uur.
    OPMERKING: De wasstap moet worden gedaan met lactaatmedium of het basale glucosevrije RPMI 1640 om alle sporen van het vorige glucosemedium (B27) volledig te verwijderen.
  9. Dag 13: Was en laat de cellen herstellen van de eerste zuiveringsronde met 1,5 ml per putje B27 medium gedurende 2 dagen.
  10. Dag 15 (stap van het opnieuw plateren): Tussen de twee zuiveringscycli wordt de monolagen gedissocieerd door te wassen met EDTA/PBS en gedurende 10 minuten te incuberen met TrypLE bij 37 °C (0,5 ml per putje).
    OPMERKING: De incubatietijd is afhankelijk van elke cellijn.
  11. Maak de cellen los met een micropipet van 1000 μL en win ze terug met 0,5 ml per putje B27-medium aangevuld met 10% KSR (v/v) in een steriele centrifugebuis.
    OPMERKING: Cardiomyocyten zijn gevoelig voor schuifspanning en sterk pipetteren, dus probeer herhaalde pipetteerstappen te vermijden. Andere opties voor een hiPSC-CM-dissociatie met een lagere schade kunnen het gebruik van TrypLE 10x of collagenase met DNase zijn. Optimaliseer de incubatietijd om ervoor te zorgen dat deze voldoende is voor celloslating zonder cellulaire schade te veroorzaken of overmatig pipetteren te vereisen, wat de celintegriteit in gevaar zou kunnen brengen.
  12. Centrifugeer 10 minuten bij 100 x g bij RT en herplaat ze in 1:80 MGFr-gecoate 12-wells platen met Replating Medium. Zaai ze in 1 ml per kuiltje.
    OPMERKING: Hiermee worden overtollige dode cellen en matrix verwijderd die tijdens de differentiatie zijn afgezet, omdat deze later een negatieve invloed kunnen hebben op de weefselgeneratie.
  13. Dag 16: Verwijder na 24 uur replateren Y27 en KSR en bewaar de cellen in het B27-medium voor de volgende zuiveringsstap (meestal 48-72 uur).
  14. Dag 18: Tweede zuiveringsstap (2e lactaat). Net als bij de eerste cyclus, wast en incubeert u de cellen gedurende 72 uur (1 ml per putje) met lactaatmedium.
    OPMERKING: Zuiveringscycli kunnen de zuiverheid van de cultuur tot 30% verbeteren, zoals waargenomen door flowcytometrie-analyse van de cardiomyocytmarker cTNT (cardiaal troponine T) (niet afgebeeld). Dit proces vermindert voornamelijk fibroblasten en resterende hiPSC-besmetting. Hoewel het minimaal aanvaardbare zuiverheidsniveau dat nodig is om door te gaan met weefselgeneratie zonder de opbrengst in gevaar te brengen, niet is vastgesteld, wordt aanbevolen om culturen te gebruiken met een zuiverheid van ten minste 85%-90%. Dit niveau van zuiverheid ondersteunt een verbeterde hechting van cardiomyocyten, verbetert de contractiele kracht van het uiteindelijke weefsel en ondersteunt de reproduceerbaarheid tussen experimenten.
  15. Dag 21: Wanneer de lactaatzuivering is voltooid, moet de gezuiverde cardiomyocyten in het B27-medium worden gehouden tot gebruik, met frequente mediawisselingen (elke 2-3 dagen).
    OPMERKING: Vertraging in het gebruik zal de celopbrengst verminderen omdat ze moeilijker los te koppelen zijn. Daarom is het raadzaam om ze te gebruiken tussen de dag waarop de tweede lactaatzuivering is voltooid en minder dan een extra week.

4. Differentiatie van menselijke cardiale fibroblasten

OPMERKING: Om menselijke cardiale fibroblasten (hiPSC-CF's) uit hiPSC's te verkrijgen, is het volgende protocol gebaseerd op de tweefasenmethodologie die wordt gebruikt door Zhang et al.16. De eerste stap is het verkrijgen van epicardiale cellen (hiPSC-EpiC's) door de Wnt-signaleringsroute te reactiveren na cardiogene mesoderm-inductie. Vervolgens worden hiPSC-EpiC's blootgesteld aan vasculaire ontwikkelingsremmers en FGF2 om cardiale fibroblasten in 18 dagen te verkrijgen.

  1. Zorg voor hiPSC-onderhoud, oogst en zaaidichtheid zoals beschreven in het hiPSC-CMs-differentiatieprotocol. Kweek hiPSC's op 1:180 MGFr-gecoate platen met 12 putjes om de differentiatie te starten.
  2. Wanneer compacte hiPSC-monolagen zijn bereikt (dag 0), voeg dan -INS-medium toe aangevuld met 5 μM CHIR (1,5 ml per putje) gedurende 48 uur.
    OPMERKING: Titreer de CHIR-concentratie voor elke hiPSC-lijn voor efficiënte inductie van mesoderm.
  3. Dag 2: Zuig het medium op en gooi het weg, was de cellen met RPMI en vervang het door 1,5 ml vers -INS medium gedurende 24 uur.
    OPMERKING: Net als in het hiPSC-CMs-protocol, spoelt u de cellen tijdens elke mediawissel; Gebruik afhankelijk van elke stap het corresponderende niet-gesupplementeerde basale medium.
  4. Dag 3: Incubeer cellen met -INS-medium dat 5 μM C59 (Wnt-remmer) bevat gedurende 48 uur (1,5 ml per putje).
  5. Dag 5: Voor het herplateren van de mesodermale cellen van het hart, worden de cellen losgemaakt door ze te wassen met EDTA/PBS en gedurende 5 minuten te incuberen met TrypLE bij 37 °C (0,5 ml per putje). Verzamel de cellen in 0,5 ml per putje Advance DMEM basaal medium (ADMEM) en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g bij RT.
  6. Zaai ze in 1:180 MGFr voorgecoate platen met 12 putjes (1 ml per putje) met een dichtheid van 20.000 cellen/cm2. Gebruik voor het replateren ADMEM aangevuld met 5 μM CHIR, 2 μM retinoïnezuur, 10% KSR (v/v) en 10 μM Y27.
  7. Dag 6: Ververs 24 uur na het opnieuw plateren het medium om Y27 te verwijderen en verminder KSR tot 2%. Houd dezelfde CHIR- en retinoïnezuurconcentraties nog 48 uur aan om de ontwikkeling van een epicardiaal fenotype te bereiken.
  8. Dag 8: Kweekcellen met ADMEM aangevuld plus 2% KSR gedurende 72 uur om de vorming van epicardiale monolagen te bevorderen.
    OPMERKING: hiPSC-EpiC's lijken platte of kubusvormige grote cellen te zijn die zijn gegroepeerd in enkele kolonies. Op dit tijdstip, bij het uitvoeren van de eerste differentiatierondes, kunnen typische epicardiale celmarkers zoals WT1 (nucleair antigeen), ZO1 (cytoplasmatisch membraanantigeen) en TCF21 (cytoplasmatisch antigeen) worden geanalyseerd door FACS (flowcelcytometrie) of IF (immunofluorescentiekleuring) (niet getoond).
  9. Dag 11: Voor het replateren van epicardiale cellen, dissocieer hiPSC-EpiCs wassen met EDTA/PBS en incubeer met TrypLE gedurende 5 minuten bij 37 °C (0,5 ml per putje). Verzamel de cellen in FGM3-medium (0,5 ml per putje) en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g bij RT.
  10. Herplaat hiPSC-EpiC's in 0,1% met gelatine beklede platen met 12 putjes bij een celdichtheid van 10.000 cellen/cm2. Gebruik FGM3-medium aangevuld met 10 μM SB (een TGFß1-signaleringsremmer om myofibroblastovergang te voorkomen, meestal tijdens on-plastic cultuur) en 10 μM Y27 (alleen gedurende de eerste 24 uur).
  11. Ververs de volgende dag het fibroblastmedium (FGM3 + 10 μM SB) om de 2 dagen totdat hiPSC-CF's zijn verkregen, wat een totaal van ongeveer 18 dagen voor het hele proces oplevert.
    OPMERKING: hiPSC-CF's moeten een spoelvormige morfologie vertonen. Hier moet de expressie van de fibroblastmarker DDR2 worden geanalyseerd met behulp van FACS- en IF-technieken (zie stappen 7.1-7.2).
  12. Zodra de hiPSC-CFs-cultuur confluent is, voert u 1:3 celpassages uit in met gelatine voorgecoate T75- of T175-kolven. Cellen bereiken 90% samenvloeiing in ongeveer 4-6 dagen. Om hiPSC-CF's los te koppelen, gebruikt u het TrypLE-oogstprotocol dat is beschreven voor het herplateren van hiPSC-EpiCs; hier is Y27 niet vereist voor doorgang.
  13. Handhaaf hiPSC-CF's in FGM3-medium + 10 μM SB tot gebruik of vries ze in bij lage doorgang bij een celdichtheid van 1-3 miljoen cellen per cryobuis.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om hiPSC-CF's maximaal 6 passages te behouden voordat nieuwe cellen worden ontdooid, omdat wanneer ze langdurig in plastic kolven worden gekweekt, de cellen beginnen te differentiëren tot een meer contractiel myofibroblastfenotype.

5. Vervaardiging van smelt electrospinning schrijven (MEW) steigers

OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van ε poly-caprolacton (PCL) homopolymeer van medische kwaliteit om fibrillaire steigers te printen, met behulp van een MEW-printer die speciaal voor dit doel is ontworpen door QUT, Queensland University of Technology10.

  1. Bereid een PCL-polymeerpapier voor om af te drukken. Laad PCL-korrels in een plastic Luer-lock-spuit van 3 ml die is bevestigd aan een naald van 23 G en smelt ze gedurende 2 uur in de oven bij 80 °C, waarbij u voorzichtig op de zuiger drukt om eventuele luchtbellen te verwijderen terwijl het polymeer wordt gesmolten. Bereid verschillende spuiten voor en bewaar ze bij RT, omdat PCL snel stolt.
  2. Breng op de dag van afdrukken de spuit in de verwarmingskamer en sluit deze aan op een onder druk staande N 2-toevoerleiding. Zet de MEW-apparatuur aan, stel de temperatuurregelaars in op 80/65 °C (kamer/mondstuk) en houd de spuit 30 minuten om ervoor te zorgen dat het polymeer goed smelt.
  3. Onder de spuit bevindt zich de collectorplaat, gemotoriseerd en beweegbaar in de XY-richtingen door compatibele (Mach3) software. Verplaats de collectorplaat (computercursorbesturing) totdat de printkop op een rand van de plaat of op een gewenste locatie is geplaatst, en stel de afstand tussen de verwarmingskamer en de collectorplaat (collectorafstand) handmatig in op 10 mm (Z-vlak).
    OPMERKING: Deze afstand moet experimenteel worden getest om een bepaalde vezeldiameter te bereiken. Hoe korter de collectorafstand, hoe dikker de vezel en vice versa.
  4. Sluit de deur van de apparatuur, die automatisch de elektrische veldvoeding verbindt. Stel de spanning in op 7 kV en de druk van N2 op 2 bar, zodat deze tijdens het printen door de 23 G-punt kan extruderen.
    OPMERKING: Door het leveren van een hoge spanning ontstaat er een potentiaalverschil tussen de punt van de spuit en de opvangplaat (gemaakt van roestvrij staal). Vervolgens wordt de druppel die zich door de toegevoerde druk bij het mondstuk heeft opgehoopt, elektrostatisch geladen, waardoor de Taylor-conus ontstaat, die naar de collectorplaat rijdt. Spanning en druk kunnen worden afgestemd om de uiteindelijke vezelafmetingen te wijzigen. Hogedrukparameters zullen dikkere vezels extruderen, waardoor een verhoogde spanning nodig is om de vezel te stabiliseren. De software is gebaseerd op numerieke computerbesturing (CNC), dus steigergeometrieën worden geschreven als een G-code en naar het programma gevoerd, dat de X-Y-beweging en de snelheid van de plaatmotor van de collector regelt. Daarom is het aan te raden om, voordat u de definitieve steigers afdrukt, een G-code af te drukken als een eerdere stap om een stabiele straal te krijgen die gedefinieerde vezels opbouwt zonder enig opgerold of zweepslagen. Optimaliseer daarvoor de parameters door elke keer kleine wijzigingen aan te brengen, d.w.z. 0,1 bar voor luchtdruk, 0,1 kV voor spanning en 60-100 mm/min voor collectorsnelheid; dit zorgt voor een Taylor-conusgedrag van de jet.
  5. Selecteer de ontworpen G-code in de software om steigers te printen met een vierkante patroongeometrie. Dit voorbeeld G-code print 15-laags vierkante mazen van 6 cm x 6 cm met vierkante poriën van 0,5 mm x 0,5 mm.
  6. Als u nauwkeurig afgezette vezels (d.w.z. overlappende vezels) wilt printen, stelt u de collectorsnelheid in op 1080 mm/min.
    NOTITIE: Pas de voltage, druk, collectorsnelheid en collectorafstandsparameters op elke MEW-apparatuur aan om nauwkeurige vezeldiameters (μm) te definiëren. Naast de invloed van de eerder genoemde parameters, resulteert het verhogen van de collectorsnelheid in dunnere vezels, terwijl het verlagen ervan dikkere vezels produceert. De parameterinstellingen in dit protocol maken het printen van vezels met een diameter van 10-15 micron mogelijk.
  7. Druk op de START-knop in de software om het afdrukken te starten. Verwijder de steiger voorzichtig uit de opvangbak nadat het afdrukken is voltooid.
    OPMERKING: Om de steiger na het printen gemakkelijker te kunnen hanteren, wordt aanbevolen om deze af te drukken op een stuk glas dat groter is dan de steiger en met plakband aan de collectorbasis is bevestigd.
  8. Snijd het bedrukte gaas met een pons met een diameter van 6 mm om de uiteindelijke steigers voor weefselfabricage te krijgen.
  9. Aangezien PCL-mazen zeer hydrofoob zijn, moet u ze gedurende 5 minuten behandelen met O2/Argon-plasma om hun hydrofiliciteit te verhogen en de interactie met fibrine en cellen te bevorderen.
    OPMERKING: Optioneel werkt een 0,1 N NaOH-behandeling gedurende 15 minuten, gevolgd door uitgebreide PBS-wasbeurten.
  10. Steriliseer de mazen door ze 30 minuten onder te dompelen in 70% ethanol, 30 minuten uitgebreid te wassen met steriel gedestilleerd water en te laten drogen.
    OPMERKING: Voer dit proces uit in een steriel petrischaaltje en in een steriele kap. Droog de mazen pas volledig uit als ze zijn gebruikt om te voorkomen dat ze aan de plaat hechten en de daaruit voortvloeiende vervorming veroorzaken.

6. Fibrine mini-weefselgeneratie en -onderhoud

OPMERKING: Het genereren van menselijke myocardiale 3D-miniweefsels is gebaseerd op de inkapseling van hiPSC-afgeleide hartcellen in fibrinehydrogels in combinatie met MEW-steigers die fibrillaire ondersteuning bieden. Het volgende protocol is aangepast van de technische ontwerpbenaderingen die worden gebruikt door Breckwoldt et al.17 en Ronaldson-Bouchard et al.18.

  1. Maak hiPSC-CM's los zoals hierboven beschreven in de replating-stap (3.10-3.11) van het hiPSC-CMs-differentiatieprotocol (trypLE-oogst). Resuspendeer de celpellet in het weefselgeneratiemedium om de cellen in de Neubauer-kamer te tellen.
  2. Maak hiPSC-CF's los zoals in de hiPSC-CMs-oogststap met TrypLE. Gebruik 3 ml TrypLE voor T75, 5 ml voor T175-kolven en hetzelfde volume voor het inactiveren van TrypLE-incubatie. Resuspendeer ten slotte de celpellet in Tissue Generation Medium, zoals bij CM's, omdat ze in dezelfde media zullen worden gemengd en gekweekt.
  3. Tel de cellen in een Neubauer-kamer. Bereken het exacte totale aantal cellen dat nodig is om alle weefsels te zaaien.
    OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van 1 miljoen cellen per weefsel, bestaande uit 80% CM's en 20% CF's, d.w.z. 800.000 CM's en 200.000 CF's. Andere hoeveelheden, zoals totalen van 1,5 en 3 miljoen per weefsel, zijn ook haalbaar met oefening.
  4. Meng en pellet het benodigde totaal aantal cellen in een nieuwe tube (Cell Mix), 5 minuten bij 300 x g bij RT. Zorg ervoor dat de pellet volledig droog is en bewaar deze op ijs tot het zaaien. Bereken het totale volume hydrogel dat nodig is voor het zaaien van alle weefsels.
    OPMERKING: Dit protocol vereist 35 μL per weefsel (voor een steigergrootte van 6 mm in diameter) tot een uiteindelijke dichtheid van bijna 30 miljoen cellen/ml, maar deze kan worden verhoogd, zoals reeds vermeld in stap 6.4 hierboven. Elke fibrinehydrogel bestaat uit 6 mg/ml fibrinogeen plus 5 E/ml trombine samen met het Tissue Generation Medium, waarin cellen worden geresuspendeerd. Voor een hydrogel van 35 μL is de Fibrinogeen/Trombineverhouding 1,05 μL/1,8 μL. Een extra eindvolume hydrogel van 10% wordt aanbevolen om volumeverlies als gevolg van pipetteerfouten te voorkomen. Voorbeeld: suspendeer voor 10 weefsels de cellen in 350 μL + 10%, d.w.z. 385 μL als totaal eindvolume.
  5. Resuspendeer het cellenmengsel in het vereiste volume weefselgeneratiemedium. Meng voorzichtig en vermijd de vorming van bubbels.
    OPMERKING: Resuspendeer voor 10 weefsels 10 miljoen cellen (80 CM: 20 CF's) in 374,5 μL Tissue Generation Medium (totaal volume hydrogels minus de totale hoeveelheid fibrinogeen die nodig is voor het totale aantal weefsels, d.w.z. 10,5 μL).
  6. Voeg de benodigde hoeveelheid fibrinogeen toe en meng voorzichtig. Voeg voor 10 weefsels 10,5 μL fibrinogeen toe aan de Cell Mix, waardoor de Hydrogel Mix ontstaat. Houd het bij RT.
    OPMERKING: Het is essentieel om overmatig herhaald pipetteren te vermijden, zodat schuifkrachten de levensvatbaarheid van hiPSC-CM niet beïnvloeden. Het wordt aanbevolen om met een steriel scalpel een stuk van de punt van de pipetpunt af te snijden en vervolgens de Hydrogel Mix ermee opnieuw te suspenderen om afschuifschade te verminderen.
  7. Om te voorkomen dat fibrine aan de plaat hecht, zaait u Hydrogel Mix op een oppervlak van polytetrafluorethyleen (PTFE). Pipetteer de helft van het volume van een weefsel (17,5 μL), dat als een druppel overblijft, en doe dit voor het totale aantal weefsels.
    OPMERKING: Maak niet meer dan 10 tissues per keer, omdat deze kunnen uitdrogen.
  8. Plaats een PCL-steiger op elke druppel en voeg het resterende volume (17,5 μL) toe. Zorg ervoor dat de steiger volledig is afgezonken.
    OPMERKING: Wees voorbereid op pipetteren met beide handen, aangezien de reactie zeer snel is. Eén weefsel per keer.
  9. Voeg de benodigde hoeveelheid trombine (1,8 μl) toe met uw niet-dominante hand en meng de hydrogel snel met de dominante hand (pipetter minimaal 2-3 keer).
    OPMERKING: Meng bij voorkeur door minder dan het totale volume te pipetteren, om luchtbelvorming te voorkomen (30 μL). Als er een luchtbel wordt gevormd, prik er dan snel in met een naald.
  10. Herhaal de vorige stap voor elk weefsel.
    OPMERKING: Het is raadzaam om deze techniek zonder cellen te beoefenen totdat een goede behandeling is gegarandeerd.
  11. Incubeer de weefsels gedurende 1 uur bij 37 °C om de fibrinepolymerisatie te voltooien.
  12. Pak elk weefsel voorzichtig bij de rand op met een steriel pincet en plaats ze in platen met 12 putjes met 2 ml per putje van het weefselgeneratiemedium aangevuld met 33 μg/ml aprotinine. Plaats één tissue per putje.
    OPMERKING: Pak ze niet op bij het midden van de hydrogel, zodat cellen door mechanische kracht kunnen worden beschadigd. Gebruik indien nodig een spatel.
  13. Incubeer de weefsels gedurende 24 uur bij 37 °C.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang om aprotinine vanaf de dag van generatie in het weefselkweekmedium te houden, aangezien is waargenomen dat het weglaten van aprotinine gedurende de eerste 24 uur, zelfs als het later wordt toegevoegd, leidt tot gedeeltelijke celloslating van het gaas en de hydrogel. Dit brengt de volledige celdekking in gevaar die nodig is voor de integriteit van het uiteindelijke weefsel.
  14. Ververs het medium de volgende dag met 2 ml van het tissueonderhoudsmedium en verwijder KSR- en Y27-residuen. Verander het medium vanaf dat moment om de dag.

7. Systematische analyse van het cardiale differentiatiepotentieel van hiPSC en de miniweefselfunctie

  1. Analyse van flowcytometrie
    OPMERKING: Cellen worden geanalyseerd met behulp van de cytometriemodaliteit "Fluorescence-activated Cell Sorting" (FACS) om de efficiëntie van hiPSC-differentiatie te bepalen. Alle stappen worden uitgevoerd onder kamertemperatuur.
    1. Dissocieer celculturen in eencellige suspensie (TrypLE-oogst), zowel hiPSC-CM's als CF's afzonderlijk.
    2. Resuspendeer de pellet bij 250.000 cellen/ml in FACS-buffer en doseer ten minste 1 ml per buis. Incubeer gedurende 30 minuten om niet-specifieke antilichaambinding te voorkomen.
    3. Centrifugeer de cellen bij 300 x g bij RT gedurende 5 minuten en gooi de supernatant weg.
      OPMERKING: Alle centrifugatiestappen worden onder deze omstandigheden uitgevoerd.
    4. Om intracellulaire antigenen te detecteren, fixeert en permeabiliseert u celmembranen met een celpermeabilisatiekit. Incubeer eerst de cellen met Reactief A (Fix) gedurende 30 minuten en centrifugeer (zoals in stap 7.1.3).
    5. Incubeer vervolgens cellen met reactief B (Perm) plus het primaire antilichaam gedurende 30 minuten. Gebruik 100 μL reactief per buis.
      1. Gebruik voor hiPSC-CM's cTNT-antilichaam van muizen (cardiaal T-troponine, marker van CM) in een verdunning van 1/200. Gebruik voor hiPSC-CF's DDR2-antilichaam van muizen (collageenreceptor, marker van CF) in een verdunning van 1/500.
        OPMERKING: Om alle reacties te stoppen, voegt u vóór het centrifugeren 1 ml FACS-buffer toe aan elke buis.
    6. Incubeer gedurende 15 minuten met anti-muis Alexa-Fluor 488 secundair antilichaam verdund 1/100 in FACS-buffer.
    7. Was 3 keer met PBS, centrifugeer tussen de wasbeurten door (onder dezelfde omstandigheden als in stap 7.1.3) en suspendeer ten slotte de celpellet opnieuw in 400 μl PBS. Analyseer in een cytometer of een soortgelijk apparaat.
  2. Analyse van immunofluorescentiekleuring (IF)
    1. Voor 2D-hartcelculturen worden beide celtypen afzonderlijk gezaaid op een 1:80 MGFr of 0,1% gelatine voorgecoat kweekkamerputsysteem op basis van dia's. Plaat ongeveer 80.000 cellen/cm2 om voldoende celconfluentie te bereiken voor de analyse. Voor 3D-minitissues brengt u ze voorzichtig met een pincet over in een microcentrifugebuisje van 2 ml.
    2. Gooi het celmedium weg en was cellen of weefsels twee keer met PBS. Fixeer de monsters met 10% formaline (v/v) bij RT; 15 minuten voor de glijkamer en 1 uur voor de minitissues.
      LET OP: Formaline is gevaarlijk bij inademing en moet in een zuurkast worden gehanteerd.
    3. Gooi de fixatiebuffer weg en was driemaal 5 minuten met PBS. Bewaar de monsters bij 4 °C in PBS tot gebruik.
    4. Om het celmembraan te permeabiliseren, incubeer de cellen met 0,1% Triton X-100 (v/v) gedurende 10 minuten of 3D-weefsels met 1% Tween-20 gedurende 15 minuten bij RT. Was vervolgens driemaal 5 minuten met PBS.
    5. Om niet-specifieke antilichaambindingen te verminderen, worden de monsters gedurende 30 minuten bij RT behandeld met een 3% (v/v) runderserumalbumine (BSA)-oplossing.
    6. Bereid primaire antilichaamoplossingen in PBS plus 1% BSA om niet-specifieke bindingen te blokkeren en incubeer ze een nacht bij 4 °C.
      1. Gebruik voor 2D hiPSC-CM's 1/400 verdunning van anti-cardiaal α-ACTN (sarcomeer actinine) muizenantilichaam. Gebruik voor 2D hiPSC-CF's 1/500 verdunning van anti-DDR2-muizenantilichaam. Combineer voor 3D-weefsels de twee CM- en CF-specifieke antilichamen.
    7. Zuig de volgende dag de antilichaamoplossing op en voer 3 wasbeurten uit met PBS bij RT, elk 5 minuten.
    8. Verdun de secundaire antilichamen (Alexa-Fluor 488 en Alexa-Fluor 594) bij 1/200 en incubeer gedurende 1 uur bij RT in het donker om respectievelijk primaire antilichamen van muizen en konijnen te identificeren. Herhaal de PBS-wasbeurt drie keer.
    9. Om de kernen tegen te gaan, incuberen monsters met 1/500 verdunning van 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) gedurende 20 minuten bij RT in het donker. Herhaal de PBS-wasbeurt drie keer en bewaar de monsters bij 4 °C in PBS.
    10. Onderzoek de monsters met een confocale microscoop, verkrijg afbeeldingen en verwerk ze met geschikte software zoals Fiji.
    11. Voor 3D-minitissues brengt u ze voorzichtig met PBS over tussen twee glazen dekglaasjes om een goede beeldvorming mogelijk te maken.
      OPMERKING: Een onderdompeling in olie of hoger doel wordt aanbevolen om Z-stack-beelden met een hoge resolutie te verkrijgen.
  3. Analyse van de levensvatbaarheid van cellen
    OPMERKING: Alamar Blue-assay (AB) wordt gebruikt om de metabolische activiteit van cellen te meten, die direct verband houdt met de levensvatbaarheid van cellen in 3D-cardiale miniweefsels. Voer het hele proces uit om monsters te beschermen tegen licht en onder steriele omstandigheden.
    1. Bereid 10% (v/v) AB-oplossing in RPMI 1640-medium zonder fenolrood (omdat dit de colorimetrische meting kan verstoren).
    2. Breng de cardiale miniweefsels voorzichtig over naar een plaat met 48 putjes met een steriel pincet. Incubeer constructies met 300 μl AB-oplossing per weefsel gedurende 1 uur en 30 minuten (pas de tijd experimenteel aan) bij 37 °C.
      OPMERKING: Aangezien cellen resazurine verminderen door de werking van metabole enzymen, zal er een kleurverandering in het kweekmedium worden gegenereerd, die zal worden gemeten door middel van spectrofotometrie bij 570 nm en 600 nm.
    3. Verzamel voor meting 100 μL per weefsel van de gemetaboliseerde AB-oplossing in een plaat met 96 putjes en lees de extincties af.
      OPMERKING: Monsters kunnen na deze analyse worden gekweekt door het medium opnieuw te veranderen in Tissue Maintenance Medium.
  4. Krimp analyse
    OPMERKING: Cardiale miniweefsels beginnen spontaan te kloppen, meestal 1-2 dagen na weefselgeneratie.
    1. Meet handmatig de klopfrequentie door de weefsels onder de optische microscoop te observeren (slagen/min). Als er veel weefsels tegelijk worden gemeten, houd de platen dan warm voor elke meting.
      OPMERKING: Naarmate de temperatuur daalt, begint ook de klopsnelheid af te nemen.
    2. Verkrijg voor een uitgebreide beoordeling van de cardiale contractiliteit optische microscopievideo's van de kloppende weefsels. Op 4x om een groter vlak vast te leggen of op 10x uit verschillende weefselgebieden. Neem ongeveer 30 s per video op (minimaal 3 beats).
    3. Gebruik een framesnelheid van minimaal 30 frames/s en sla de video op in .AVI formaat.
      OPMERKING: Hier zijn video's geanalyseerd met een op maat gemaakt tracking point-algoritme dat is ontwikkeld voor MATLAB10. Met deze methode kunnen voor elke video de samentrekkingssnelheid, de maximale contractieverplaatsing (amplitude) en de samentrekkingsrichting worden verkregen.
    4. Voer het algoritme rechtstreeks uit in MATLAB voor de video's in de analysemap. Het levert automatisch een Excel-document met resultaten met de waarden van krimpsnelheid per frame, samentrekkingsamplitude per frame, krimphoek (richting) en de respectievelijke standaarddeviaties10.
    5. Vermenigvuldig de 'Contractiesnelheid per frame' met de cameraresolutie (μm/pixel) en met de framesnelheid van de camera (frames/s). Dit geeft de contractiesnelheid de eindwaarde (μm/s).
    6. Vermenigvuldig 'Samentrekkingsamplitude per frame' met de cameraresolutie (μm/pixel), en dit geeft de uiteindelijke waarde van de samentrekkingsamplitude (μm).
      OPMERKING: Het zou mogelijk zijn om de contractiekinetiek diepgaander te analyseren met behulp van software zoals MUSCLEMOTION, zoals elders besproken 19,20. De beeldvormingsopstelling moet ten minste 60 frames/s vastleggen voor analyse met de software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karakterisering van 2D hiPSC-afgeleide hartcellen
Om multifenotypisch hartweefsel te genereren, worden hiPSC-CM's en hiPSC-CF's onafhankelijk gedifferentieerd en in vitro gekarakteriseerd. Met de juiste optimalisatie en strikt onderhoud zal het volgende protocol resulteren in een hiPSC-CMs-opbrengst van meer dan 80% rond dag 9 van differentiatie, wat aanleiding geeft tot spontaan kloppende cellen (Figuur 1A). Bovendien elimineert...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om een 3D samengesteld cardiaal miniweefselmodel te genereren dat de oorspronkelijke kenmerken van het menselijk myocardium repliceert, moeten verschillende essentiële factoren in overweging worden genomen. Deze kunnen worden gegroepeerd in drie hoofdpunten: (1) het optimaliseren van de opbrengst en zuiverheid van de cellen voor weefselfabricage, (2) het printen van de fibrillaire steiger om de 3D-mechanologie-omgeving na te bootsen, en (3) het integreren van de fibrine-hydrogel in het f...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gefinancierd door het H2020 onderzoeks- en innovatieprogramma onder subsidieovereenkomsten nr. 874827 (BRAVfigure-acknowledgements-1); Ministerio de Ciencia y Universidades (Spanje) via de projecten PLEC2021-008127 (CARDIOPRINT), PID2022-142562OB-I00 (VOLVAD) en PID2022-142807OA-I00 (INVESTTRA) gefinancierd door MICIU/AEI /10.13039/501100011033 en door de Europese Unie NextGenerationEU/PRTR; Gobierno de Navarra Proyectos Estratégicos IMPRIMED (0011-1411-2021-000096) en BIOHEART (0011-1411-2022-000071); Gobierno de Navarra, Proyectos Colaborativos, BIOGEN (PC020-021-022) en Gobierno de Navarra, Salud GN32/2023. Figuur 1A, Figuur 2A en Figuur 4A zijn gemaakt met BioRender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
µ-Slide 8 Well kamer dekglas (IbiTreat)IBIDI80826
0,1% Gelatine oplossing (Embryomax)Merck MilliporeES-006-B
10% formalineSigma AldrichHT501128
12-wels platenCostar/Corning3513
6-wels platenCostar/Corning3506
Advanced DMEM 1x (ADMEM)Gibco12491015
Aprotinine uit runderlongSigma AldrichA1153
B-27 SUPLEMENT, PLUS INSULINE (50x) Life TechnologiesA317504044
B27 SUPPLEMENT, MINUS INSULINE (50x)Life TechnologiesA1895601
Biopsie punch (6 mm diameter)MedicalBP-60F
Runder Serum Albumine (BSA)Sigma AldrichA9647
CHIR-99021 AXON MEDCHEMAXON1386
Confocal Laser Scanning MicroscoopZeissLSM 800
Kweekfles 175 cmGreiner Bio-One660175
Kweekfles 75 cmFalcon353136
CytometerBeckman CoulterCytoFlex 
DAPI Sigma AldrichD9542
Ezel anti-Muis IgG (H+L) Sterk Geadsorbeerde Secundaire Antilichaam, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21202 
Ezel anti-Konijn IgG (H+L) Sterk Geadsorbeerde Secundaire Antilichaam, Alexa Fluor 594InvitrogenA-21207 
DPBS (Mg2+, Ca2+ vrij)GibcoA314190094
EDTA 0,5M pH 8,0Life TechnologiesAM9260G
ESSENTIAL 8 MEDIUM KITLife TechnologiesA1517001
FGF2 (Recombinant Human FGF-basic 154 a.a.)Peprotech100-18B
Fibrinogeen uit runderplasmaSigma AldrichF8630
Fibroblast Groei Medium 3 KIT (FGM3)PromoCellC-23130
Knockout Serum Replacement (KSR)Life Technologies10828028
Lactaat (Natrium L-lactaat)Sigma Aldrich71718
Matrigel Groei Factor Gereduceerd (MGFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-vrijCorning354230
MEW 23-G naaldNordson7018302
MEW printerQUT, Queensland University of Technology
MEW spuitNordson7012072
Muis Anti-Cardiac Troponin T Monoklonaal AntilichaamInvitrogenMA5-12960 
Muis Anti-DDR2 monoklonaal antilichaamSigma AldrichSAB5300116
Muis Anti-α-actinine (sarcomeer) Monoklonaal AntilichaamSigma AldrichA7811 
PENICILLINE - STREPTOMYCINLife Technologies15140122
Poly ε-caprolacton (PCL), medisch graadCorbionPURASORB® PC 12
Konijn Anti-Vimentin Recombinant Monoklonaal Antilichaam [EPR3776] - Cytoskelet MarkerAbcamAb29547 
Retinoic Zuur Sigma AldrichR2625
ROCK inhibitor Y-27632 (10mg)Fisher ScientificHB2297
RPMI 1640 (L-glutamine)Gibco21875034
RPMI 1640 (geen fenol rood)Gibco32404014
RPMI geen glucoseGibco11879020
SB431542SELLECK CHEMICALSS1067
Spectrofotometer BMG Labtech SPECTROstar Nano
Trombine (menselijke alfa trombine, Factor IIa)Enzyme Research LabHT 1002a
Triton X-100Sigma AldrichT8787
TrypLE ExpressLife Technologies12604021
Tween 20Sigma AldrichP2287
Wnt-C59AXON MEDCHEMAXON2287
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cho, S., et al. Challenges and opportunities for the next generation of cardiovascular tissue engineering. Nat Methods. 19 (9), 1064-1071 (2022).
  2. Garbern, J. C., Lee, R. T. Heart regeneration: 20 years of progress and renewed optimism. Dev Cell. 57 (4), 424-439 (2022).
  3. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  4. Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Curr Protoc Hum Genet. 87 (21), 21.3.1-21.3.15 (2015).
  5. Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Adv Drug Deliv Rev. 96, 110-134 (2016).
  6. Huang, S., Yang, Y., Yang, Q., Zhao, Q., Ye, X. Engineered circulatory scaffolds for building cardiac tissue. J Thorac Dis. 10 (Suppl 20), S2312-S2328 (2018).
  7. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circ Res. 118 (3), 400-409 (2016).
  8. Brown, T. D., Dalton, P. D., Hutmacher, D. W. Direct writing by way of melt electrospinning. Adv Mater. 23 (47), 5651-5657 (2011).
  9. Vernon, M. J., et al. Engineering heart valve interfaces using melt electrowriting: Biomimetic design strategies from multi-modal imaging. Adv Healthc Mater. 11 (24), 2201028(2022).
  10. Montero-Calle, P., et al. Fabrication of human myocardium using multidimensional modeling of engineered tissues. Biofabrication. 14 (4), 045017(2022).
  11. Castilho, M., et al. Melt electrospinning writing of poly-hydroxymethylglycolide-co-ε-caprolactone-based scaffolds for cardiac tissue engineering. Adv Healthc Mater. 6 (18), 1700311(2017).
  12. Castilho, M., et al. Melt electrowriting allows tailored microstructural and mechanical design of scaffolds to advance functional human myocardial tissue formation. Adv Funct Mater. 28 (40), 1803151(2018).
  13. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556, 239-243 (2018).
  14. Palaskas, N. L., Ali, H. J., Koutroumpakis, E., Ganatra, S., Deswal, A. Cardiovascular toxicity of immune therapies for cancer. BMJ. 385, e075859(2024).
  15. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8 (1), 162-175 (2012).
  16. Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circ Res. 125 (5), 552-566 (2019).
  17. Breckwoldt, K., et al. Differentiation of cardiomyocytes and generation of human-engineered heart tissue. Nat Protoc. 12 (6), 1177-1197 (2017).
  18. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556, 239(2018).
  19. Rivera-Arbeláez, J. M., et al. Automated assessment of human-engineered heart tissues using deep learning and template matching for segmentation and tracking. Bioeng Transl Med. 8 (3), e10513(2023).
  20. Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circ Res. 122 (3), e5-e16 (2018).
  21. Reyat, J. S., et al. Modeling the pathology and treatment of cardiac fibrosis in vascularised atrial and ventricular cardiac microtissues. Front Cardiovasc Med. 10, 1156759(2023).
  22. Park, J. H., et al. Materials and extracellular matrix rigidity highlighted in tissue damages and diseases: Implication for biomaterials design and therapeutic targets. Bioact Mater. 20, 381-403 (2023).
  23. Wunner, F. M., et al. Melt electrospinning writing of three-dimensional poly(ε-caprolactone) scaffolds with controllable morphologies for tissue engineering applications. J Vis Exp. 130, e55617(2017).
  24. Robinson, T. M., et al. The next frontier in melt electrospinning: Taming the jet. Adv Funct Mater. 29 (44), 1904664(2019).
  25. Kade, J. C., Dalton, P. D. Polymers for MELT electrowriting. Adv Healthc Mater. 10 (1), 2001232(2021).
  26. Inchingolo, M., et al. Polycaprolactone in bone tissue engineering: A comprehensive review of innovations in scaffold fabrication and surface modifications. J Funct Biomater. 15 (9), 243(2024).
  27. Mondadori, C., et al. Assessing the response of human primary macrophages to defined fibrous architectures fabricated by melt electrowriting. Bioact Mater. 21, 209-222 (2022).
  28. Xu, C., et al. Melt-electrowriting-enabled anisotropic scaffolds loaded with valve interstitial cells for heart valve tissue Engineering. J Nanobiotechnology. 22 (1), 378(2024).
  29. Ristovski, N., et al. Improved fabrication of melt electrospun tissue engineering scaffolds using direct writing and advanced electric field control. Biointerphases. 10 (1), 011006(2015).
  30. Puluca, N., et al. Bioprinting approaches to engineering vascularized 3D cardiac tissues. Curr Cardiol Rep. 21 (9), 1-11 (2019).
  31. Lu, T. Y., Xiang, Y., Tang, M., Chen, S. 3D printing approaches to engineer cardiac tissue. Curr Cardiol Rep. 25 (6), 505-514 (2023).
  32. Voges, H. K., et al. Vascular cells improve functionality of human cardiac organoids. Cell Rep. 42 (5), 112322(2023).
  33. Zhu, L., Liu, K., Feng, Q., Liao, Y. Cardiac organoids: A 3D technology for modeling heart development and disease. Stem Cell Rev Rep. 18 (8), 2593-2605 (2022).
  34. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nat Rev Cardiol. 17 (6), 341-359 (2020).
  35. Carlos-Oliveira, M., Lozano-Juan, F., Occhetta, P., Visone, R., Rasponi, M. Current strategies of mechanical stimulation for maturation of cardiac microtissues. Biophys Rev. 13 (5), 717(2021).
  36. Maihemuti, W., Murata, K., Abulaiti, M., Minatoya, K., Masumoto, H. Simultaneous electro-dynamic stimulation accelerates maturation of engineered cardiac tissues generated by human iPS cells. Biochem Biophys Res Commun. 733, 150605(2024).
  37. Wang, L., Serpooshan, V., Zhang, J. Engineering human cardiac muscle patch constructs for prevention of post-infarction LV remodeling. Front Cardiovasc Med. 8, 621781(2021).
  38. Matveeva, V. G., Khanova, M. U., Antonova, L. V., Barbarash, L. S. Fibrin – A promising material for vascular tissue engineering. Russ J Transplantol Artif Organs. 22 (1), 196-208 (2020).
  39. Sproul, E. P., Hannan, R. T., Brown, A. C. Controlling fibrin network morphology, polymerization, and degradation dynamics in fibrin gels for promoting tissue repair. Methods Mol Biol. 1758, 85-99 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

3D hartweefselpolycaprolacton steunstructuurhiPSC hartcellenfibrine hydrogelmodellering van hartaandoeningenweefseltechnologiehartfibroblastensarcomeerorganisatiedrugscreening

Gerelateerde artikelen