Methodenartikel

Gebruikmaken van virtual reality voor meeslepende segmentatie en analyse van cryo-elektronentomografiegegevens

DOI:

10.3791/67849

⸱

24 januari 2025

 ,  ,  ,  , 
1Stony Brook University, 2Simons Electron Microscopy Center, New York Structural Biology Center, 3Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryo-elektronentomografie (cryo-ET) maakt 3D-visualisatie van cellulaire ultrastructuur met nanometerresolutie mogelijk, maar handmatige segmentatie blijft tijdrovend en complex. We presenteren een nieuwe workflow die geavanceerde virtual reality-software integreert voor het segmenteren van cryo-ET-tomogrammen, waarbij de effectiviteit ervan wordt aangetoond door de segmentatie van mitochondriën in zoogdiercellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryo-elektronentomografie (cryo-ET) is een krachtige techniek voor het visualiseren van de ultrastructuur van cellen in drie dimensies (3D) met een resolutie van nanometer. De handmatige segmentatie van cellulaire componenten in cryo-ET-gegevens blijft echter een belangrijk knelpunt vanwege de complexiteit en het tijdrovende karakter ervan. In dit werk presenteren we een nieuwe segmentatieworkflow die geavanceerde virtual reality (VR)-software integreert om zowel de efficiëntie als de nauwkeurigheid van het segmenteren van cryo-ET-datasets te verbeteren. Deze workflow maakt gebruik van een meeslepende VR-tool met intuïtieve 3D-interactie, waardoor gebruikers kunnen navigeren en annoteren bij complexe cellulaire structuren in een meer natuurlijke en interactieve omgeving. Om de effectiviteit van de workflow te evalueren, hebben we deze toegepast op de segmentatie van mitochondriën in retinale pigmentepitheel (RPE1) cellen. Mitochondriën, essentieel voor de productie en signalering van cellulaire energie, vertonen dynamische morfologische veranderingen, waardoor ze een ideaal testmonster zijn. De VR-software maakte een nauwkeurige afbakening van mitochondriale membranen en interne structuren mogelijk, waardoor stroomafwaartse analyse van de gesegmenteerde membraanstructuren mogelijk was. We tonen aan dat deze VR-gebaseerde segmentatieworkflow de gebruikerservaring aanzienlijk verbetert, terwijl de nauwkeurige segmentatie van ingewikkelde cellulaire structuren in cryo-ET-gegevens behouden blijft. Deze aanpak is veelbelovend voor brede toepassingen in structurele celbiologie en wetenschappelijk onderwijs, en biedt een transformatief hulpmiddel voor onderzoekers die zich bezighouden met gedetailleerde cellulaire analyse.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryo-elektronentomografie (cryo-ET) heeft een revolutie teweeggebracht in ons vermogen om cellulaire componenten in hun bijna-oorspronkelijke staat te visualiseren met hoge resolutie 1,2. Deze krachtige techniek stelt onderzoekers in staat om cellulaire ultrastructuur te karakteriseren, wat ongekende inzichten oplevert in cellulaire architectuur en functie. Cryo-ET is echter niet zonder beperkingen, de belangrijkste daarvan is de vereiste dat monsters dun genoeg zijn om elektronentransparant te zijn (meestal <0,5 μm) voor beeldvorming in standaard cryo-compatibele transmissie-elektronenmicroscopen. Recente ontwikkelingen in cryo-gefocusseerd ionenbundelfrezen hebben het dunner maken van dikke monsters voor cryo-ET-analysemogelijk gemaakt 3,4.

Typische cryo-ET-workflows beginnen met het verzamelen van een tilt-serie, waarbij het monster onder verschillende hoeken wordt afgebeeld, variërend van +60° tot -60°. Deze afbeeldingen worden vervolgens computationeel uitgelijnd en teruggeprojecteerd om een driedimensionaal (3D) volume of tomogram 5,6,7 te creëren. Dit tomogram dient als een gedetailleerde 3D-kaart van het cellulaire landschap en biedt zowel ruimtelijke als temporele informatie over cellulaire structuren. Verdere verfijning door middel van subtomogramgemiddelden, waarbij meerdere kopieën van dezelfde structuur worden uitgelijnd en gemiddeld, kan de resolutielimieten nog verder verleggen, soms met een resolutie van minder dan nanometer 7,8,9,10.

Een cruciale stap bij het extraheren van zinvolle biologische informatie uit deze tomogrammen is segmentatie. Dit proces omvat het annoteren van specifieke cellulaire structuren, zoals membranen, binnen het 3D-volume. Segmentatie maakt geavanceerde analyses mogelijk, waaronder de berekening van intermembraanafstanden en membraankromming, wat waardevolle inzichten oplevert in cellulaire processen11,12. Hoewel er verschillende softwarepakketten beschikbaar zijn voor deze taak, waaronder Dragonfly, Amira, MemBrain, EMAN2 en tomomemsegtv 13,14,15,16,17, blijft het segmentatieproces een belangrijk knelpunt in cryo-ET-data-analyse. Het is vaak een arbeidsintensief en tijdrovend handmatig proces, dat weken tot maanden in beslag kan nemen. Veel van deze pakketten bieden automatische segmentatiefuncties, maar vereisen vaak uitgebreide handmatige correctie om valse positieven te verwijderen, een proces dat omslachtig en niet-intuïtief kan zijn wanneer het plakje voor plakje of in 3D wordt uitgevoerd.

We stellen een alternatieve aanpak voor door gebruik te maken van virtual reality (VR)-technologie om deze uitdagingen aan te gaan. VR biedt een meeslepende en interactieve methode voor gegevensvisualisatie, waardoor gebruikers door het tomografische volume kunnen navigeren alsof ze zich in de cellulaire omgeving zelf bevinden. Deze aanpak biedt ook een waardevol platform voor wetenschappelijk onderwijs en wetenschappelijke verkenning en ontdekking van in situ cryo-ET-gegevens door een meeslepende en uniek boeiende ervaring te bieden. In dit werk presenteren we een protocol voor cryo-ET-gegevenssegmentatie met behulp van syGlass18, VR-software die is ontworpen voor wetenschappelijke visualisatie. Deze software biedt een uitgebreide toolkit voor cryo-ET-gegevensanalyse, inclusief handmatige segmentatie, verfijning van automatisch gegenereerde segmentaties en zelfs deeltjespicking binnen tomogrammen. Onze studie toont de levensvatbaarheid van VR aan als een krachtig hulpmiddel voor het opschonen van segmentaties, het plukken van deeltjes en handmatige segmentatie in cryo-ET-data-analyse.

Om het nut van de VR-software voor cryo-ET-segmentatie te illustreren, richten we ons op de analyse van mitochondriale morfologie in retinale pigmentepitheelcellen (RPE1). Mitochondriën dienen als een uitstekende testcase voor segmentatie vanwege hun complexe structuur en de aanwezigheid van gemakkelijk kwantificeerbare kenmerken, zoals de afstand tussen de buitenste en binnenste mitochondriale membranen. Deze kenmerken kunnen nauwkeurig worden gemeten met behulp van analysetools voor oppervlaktemorfometrie12, die robuuste statistieken bieden voor het beoordelen van de segmentatiekwaliteit. Dit protocol biedt stapsgewijze instructies voor het segmenteren van cryo-ET-gegevens met behulp van syGlass, waarmee het nut ervan binnen de cryo-ET-segmentatiepijplijn wordt aangetoond. Door VR-gebaseerde segmentatie op te nemen in de cryo-ET-workflow, willen we zowel de efficiëntie als de nauwkeurigheid van handmatige structurele analyse in de cellulaire biologie verbeteren.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cryo-ET-gegevens voorbereiden voor segmentatie

  1. Converteer ruwe Cryo-ET-tomogrammen naar een gegevensformaat dat compatibel is met syGlass, zoals TIFF-stacks. Stel het signaal zo in dat de deeltjes wit op zwart zijn en voer histogramvereffening uit met ImageJ19.
    OPMERKING: Om de signaal-ruisverhouding te verbeteren, wordt aanbevolen om de tomogrammen te denoisen met software zoals Warp20, Topaz Denoise21, cryoCARE22,23 of IsoNet24 voordat ze in de software worden geïmporteerd.
  2. Start de VR-software op de computer. Navigeer naar het menu Bestand en selecteer Project maken.
  3. Klik op Nieuw project maken | Bestanden toevoegen. Navigeer naar de locatie waar de TIFF-bestanden zijn opgeslagen en importeer ze in de software.
  4. Wanneer u wordt gevraagd om te bevestigen of de bestanden een tijdreeks zijn, klikt u op Nee.
  5. Geef het project een naam en klik vervolgens op Opslaan om een nieuw project te maken onder de projectlijst.
  6. Dubbelklik op het project om het tomogram te openen en laad het in de interactieve virtual reality-omgeving van de software.

2. Virtual reality (VR) instellen

  1. Sluit de VR-headset en handcontrollers aan op de computer.
  2. Volg de instructies op het scherm om de VR-omgeving te kalibreren.
    OPMERKING: Kalibratie verwijst naar de driedimensionale ruimte waar de segmentatie zal worden uitgevoerd. De parameters (lengte, breedte en hoogte) van de werkruimte moeten worden gedefinieerd voordat de VR-projectie wordt weergegeven. De VR-projectie is alleen zichtbaar in deze parameters.
  3. Segmentatie vindt alleen plaats binnen de gedefinieerde driedimensionale werkruimte. Zorg ervoor dat het gezichtsveld het gebied bevat waaraan in de VR-omgeving moet worden gewerkt.

3. 3D-visualisatie optimaliseren

  1. Klik op de knop Visualisatie in de software-interface. Pas verschillende visualisatie-opties aan, zoals schuifregelaars voor contrast, vensters, helderheid en drempelwaarden om het signaal te verbeteren en ruis te minimaliseren.
  2. Gebruik de handcontrollers om het tomogram dichterbij te trekken of weg te duwen als dat nodig is.
  3. Activeer het gereedschap Snijden met de linkercontroller om verschillende plakjes in het tomogram visueel te inspecteren.

4. Segmentatie proces

  1. Navigeer door het tomogram naar het gewenste segment waar de segmentatie begint.
  2. Activeer de optie Interessegebied (ROI) onder het annotatiemenu met behulp van de handcontrollers. Er verschijnt een groen vak in het tomogram.
  3. Pas de grootte en positie van het groene vak aan en verplaats het naar het gebied dat moet worden gesegmenteerd.
  4. Vergrendel de ROI met de linkercontroller en start segmentatie. Na het vergrendelen van de ROI schakelt de tool automatisch over naar een verfmodus die segmentatie van de volumetrische gegevens mogelijk maakt.
  5. Zoom in of uit op het tomogram voor nauwkeurige segmentatie.
  6. Pas de grootte van het penseel aan door met de klok mee of tegen de klok in te draaien voor optimale controle.
  7. Segmenteer de ROI (bijv. mitochondriale membranen) zorgvuldig binnen het geselecteerde 3D-gebied. Als er een fout optreedt tijdens segmentatie, houdt u de trigger van de secundaire controller ingedrukt om de wismodus in te schakelen en wis u de fout vervolgens met dezelfde beweging als bij segmenteren.
  8. Herhaal dit proces regio voor regio totdat het hele tomogram is gesegmenteerd.

5. Gesegmenteerde gegevens en analyses exporteren

  1. Nadat u de segmentatie hebt voltooid, selecteert u het project door erop te klikken om ervoor te zorgen dat het wordt gemarkeerd.
  2. Klik op het tabblad Projecten in de linkerbovenhoek en selecteer vervolgens ROI's.
  3. Kies ervoor om het hele volume of een specifieke ROI te exporteren. Geef de exportlocatie op voor de gesegmenteerde gegevens.
  4. Laad en analyseer de gesegmenteerde gegevens met behulp van de software van uw keuze en genereer cijfers voor publicatie.

6. Binair masker importeren in de software voor opschoning

  1. Voer de stappen 1.1-1.6 uit.
  2. Klik met de rechtermuisknop op het project en klik op Maskergegevens toevoegen. Navigeer vervolgens naar de plaats waar de eerste segmentatie is opgeslagen en importeer deze onder hetzelfde project.
  3. Schakel ROI-annotatie in om wijzigingen aan te brengen in de eerste segmentatie.
  4. Segmentatie toevoegen/wissen om de initiële segmentatie op te schonen.
  5. Pas de ROI's van maskers aan onder de optie ROI op het tabblad Maskers . Als u de ROI van het masker van de ene naar de andere wilt wijzigen, schakelt u de enige optie voor het overschrijven van het masker in en gaat u naar de verfmodus met de handcontroller. In deze modus worden alleen maskergegevens overschreven die zichtbaar zijn.
  6. Exporteer de aangepaste masker-ROI's met behulp van de stappen die worden beschreven in de stappen 5.1-5.3.

7. Deeltjescoördinaten plukken met behulp van de VR-software

  1. Maak een project met behulp van een tomogram (TIFF-stack) met behulp van de stappen die worden beschreven in sectie 1.
  2. Klik op Annotatie | Tellen, waarmee een venster wordt geopend met handmatige of geautomatiseerde opties.
    1. Kies voor de handmatige optie een kleur voor de tellingen en begin met het markeren van coördinaten.
    2. Kies voor de geautomatiseerde optie een celgrootte en voer de resolutie in. Klik op Automatisch tellen uitvoeren, bewerk de tellingen (behoud goede keuzes en gooi slechte weg) en sla de voortgang op.
  3. Exporteer de telcoördinaten door op het projecttabblad | annotaties te klikken.
    1. Kies voor de oorsprong van de annotatie de optie Linkerbenedenhoek en voor Annotatie-eenheden de optie Voxels.
    2. Klik op de cel met telpunten om de cel te markeren.
    3. Klik op Geselecteerde exporteren om de coördinaten van de selectie op te slaan in een .csv bestand.
      OPMERKING: Dit bestand kan worden gebruikt om subtomogrammen uit het tomogram te extraheren voor het middelen van subtomogrammen

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie hebben we tomogrammen met mitochondriën en extra vliezige organellen (bijv. blaasjes, endoplasmatisch reticulum) gesegmenteerd met behulp van syGlass. Tomogrammen werden aanvankelijk gereconstrueerd in Warp met behulp van weighted-back projectie bij 16,00 Å/pixel en werden onderworpen aan missing wedge correction en denoising met behulp van de software IsoNet. De volgende tomogrammen werden onderworpen aan aanvullende verwerking voor import, zoals weergegeven in figuur 1A (zie ook Aanvullende video S1, Aanvullende video S2, Aanvullende video S3 en Aanvullende video S4).

Na voorbewerking werden tomogrammen in MRC-formaat geconverteerd naar TIFF-stacks met behulp van ImageJ, waarbij contrastinversie werd toegepast om membranen wit te laten lijken op een zwarte achtergrond. Vervolgens werd histogramvereffening uitgevoerd om het contrast verder te verbeteren; Dit zorgt ook voor een effectievere drempelbepaling. De TIFF-stacks werden geïmporteerd en in 3D gevisualiseerd in een meeslepende VR-omgeving, die een gedetailleerde inspectie van vliezige structuren mogelijk maakte met behulp van de cut-tool in de software die wordt getoond in Figuur 1B.

Handmatige segmentatie werd uitgevoerd in de software, waarbij de vensters werden ingesteld op automatisch en de helderheid/drempel werd aangepast om de zichtbaarheid van mobiele functies te optimaliseren. ROI's rond mitochondriën en andere structuren werden gedefinieerd met behulp van de VR-controllers. De segmentatietool maakte een nauwkeurige afbakening van membraangrenzen mogelijk, waarbij fouten werden gecorrigeerd met behulp van de wisfunctie. Slice-by-slice navigatie of in 3D met behulp van de ROI-tool om regio's in het tomogram in te kaderen, gecombineerd met de verstelbare penseel , zorgde voor een nauwkeurige segmentatie van de mitochondriale membranen en andere organellen, zoals weergegeven in figuur 1C.

De gesegmenteerde gegevens werden gevisualiseerd door een mesh te genereren met behulp van de oppervlakte-optie van de ROI-tool, waarbij iteraties voor vloeiend worden ingesteld op 12 en het resolutieniveau is ingesteld op 3. De uiteindelijke 3D-weergaven tonen duidelijk mitochondriale structuren, inclusief de buitenste en binnenste membranen, cristae en calciumfosfaatafzettingen, zoals weergegeven in figuur 1D (zie ook aanvullende video S5, aanvullende video S6, aanvullende video S7 en aanvullende video S8).

figure-results-1
Figuur 1: Workflow van tomogramvisualisatie, segmentatie en 3D-rendering met behulp van syglass. (A) Tomografische plakjes van RPE1-cellen met dunne randen. IsoNet-gecorrigeerde tomogrammen gereconstrueerd in Warp en gebruikt voor segmentatie met syGlass, gevisualiseerd met IMOD25. De tomogrammen werden verzameld op een 300 keV Titan-Krios-microscoop uitgerust met een K3-detector en gericht op de dunne randen van retinale epitheelcellen. Elk tomogram bevat ten minste één mitochondrion samen met verschillende andere membraangebonden organellen. Deze afbeeldingen zijn stilstaande beelden van video's die worden getoond in Supplemental Video S1, Supplemental Video S2, Supplemental Video S3 en Supplemental Video S4. (B) Bijbehorende tomogrammen gevisualiseerd in de software. Tomografische plak gemaakt met behulp van het snijgereedschap in de VR-software na het optimaliseren van drempelwaarden, helderheid en vensters, waardoor verschillende cellulaire structuren worden onthuld. (C) Tomogrammen gevisualiseerd in de software met gesegmenteerde membranen. Tomografische plak gemaakt met het snijgereedschap in VR-software, bedekt met de bijbehorende segmentatie. Calciumfosfaatafzettingen worden weergegeven in geel, mitochondriale membranen in cyaan en andere membranen zoals blaasjes en het plasmamembraan in paars. (D) 3D-rendering van de gesegmenteerde membranen in syGlass. De mitochondriale membranen, inclusief de cristae, buitenste en binnenste mitochondriale membranen, worden weergegeven in cyaan. Calciumfosfaatafzettingen zijn geel of groen, blaasjes en het plasmamembraan zijn paars en het endoplasmatisch reticulum is bruin. Deze afbeeldingen zijn stilstaande beelden van video's die worden getoond in Aanvullende video's S5, Aanvullende Video S6, Aanvullende Video S7 en Aanvullende Video S8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende video S1: Tomogram van monster RPE-1_1 gebruikt voor segmentatie in dit onderzoek. Dit tomogram wordt gereconstrueerd op 16 Å/pixel met behulp van Warp, vervolgens gedenoise en gecorrigeerd voor de ontbrekende wig met IsoNet. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video S2: Tomogram van monster RPE-1_2 gebruikt voor segmentatie in dit onderzoek. Dit tomogram wordt gereconstrueerd op 16 Å/pixel met behulp van Warp, vervolgens gedenoise en gecorrigeerd voor de ontbrekende wig met IsoNet. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video S3: Tomogram van monster RPE-1_3 gebruikt voor segmentatie in dit onderzoek. Dit tomogram wordt gereconstrueerd op 16 Å/pixel met behulp van Warp, vervolgens gedenoise en gecorrigeerd voor de ontbrekende wig met IsoNet. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video S4: Tomogram van monster RPE-1_4 gebruikt voor segmentatie in dit onderzoek. Dit tomogram wordt gereconstrueerd op 16 Å/pixel met behulp van Warp, vervolgens gedenoise en gecorrigeerd voor de ontbrekende wig met IsoNet. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video S5: De resulterende segmentatie van monster RPE-1_1 na het genereren van oppervlakken. De mitochondriale membranen zijn weergegeven in cyaan; calciumfosfaten in de mitochondriën zijn geel weergegeven; het endoplasmatisch reticulum is bruin weergegeven; en andere membranen zijn in paars weergegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video S6: De resulterende segmentatie van monster RPE-1_2 na het genereren van oppervlakken. De mitochondriale membranen zijn weergegeven in cyaan; calciumfosfaten in de mitochondriën zijn geel weergegeven; het endoplasmatisch reticulum is bruin weergegeven; en andere membranen zijn in paars weergegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video S7: De resulterende segmentatie van monster RPE-1_3 na het genereren van oppervlakken. De mitochondriale membranen zijn weergegeven in cyaan; calciumfosfaten in de mitochondriën zijn geel weergegeven; het endoplasmatisch reticulum is bruin weergegeven; en andere membranen zijn in paars weergegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video S8: De resulterende segmentatie van monster RPE-1_4 na het genereren van oppervlakken. De mitochondriale membranen zijn weergegeven in cyaan; calciumfosfaten in de mitochondriën zijn geel weergegeven; het endoplasmatisch reticulum is bruin weergegeven; en andere membranen zijn in paars weergegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit werk hebben we aangetoond hoe VR, met name met behulp van syGlass, kan worden geïntegreerd in de cryo-ET-pijplijn om cellulaire structuren effectief te segmenteren. Hoewel onze focus voornamelijk op membranen lag, is er geen inherente beperking die de segmentatie van andere cellulaire structuren, zoals filamenten of ribosomen, verhindert, aangezien men de vorm en grootte van het penseel kan aanpassen, en drempels om ervoor te zorgen dat alleen voxels die overeenkomen met de gewenste cellulaire objecten worden gemarkeerd. Een van de grote voordelen van VR bij segmentatie is de intuïtieve, hands-on interactie met de gegevens, waardoor gebruikers volumes kunnen visualiseren en manipuleren alsof ze er fysiek in zitten. Traditionele methoden voor handmatige segmentatie of het opschonen van initiële segmentatiemaskers omvatten meestal het rechtstreeks werken op een computer, die minder meeslepend en langzamer kan zijn om te annoteren.

Door VR op te nemen in de cryo-ET-workflow, kunnen gebruikers niet alleen snel communiceren met segmentatiemaskers die door andere software zijn gegenereerd, maar ook VR gebruiken om de segmentatie van gedeeltelijk gesegmenteerde structuren te begeleiden en valse positieven efficiënt op te ruimen. Momenteel is handmatige segmentatie nog steeds vereist voor de meeste gebruiksscenario's voor annotaties, en de gepresenteerde workflow stelt gebruikers in staat om met meer gemak en snelheid segmentaties te genereren die geschikt zijn voor downstreamanalyse. Voor dit onderzoek hebben we de HTC Vive VR-headset gebruikt, maar de software is compatibel met apparaten die SteamVR- of OculusVR-ondersteuning hebben.

Voor een optimale toepassing van dit protocol moeten de cryo-ET-gegevens voldoen aan specifieke criteria, zoals hoogwaardige tomogrammen met een hoge signaal-ruisverhouding (SNR). De SNR is een essentiële parameter, aangezien de duidelijkheid van structurele kenmerken rechtstreeks van invloed is op de effectiviteit van handmatige segmentatie in VR. Voorbewerkingsstappen zoals ontbrekende wigcorrectie en ruisonderdrukking zijn belangrijke onderdelen van de workflow; in dit protocol hebben we IsoNet voor deze doeleinden gebruikt. De tomogrammen moeten worden gereconstrueerd met een geschikte resolutie - met behulp van een voxelgrootte die voldoende structurele details en voldoende scheiding tussen cellulaire structuren biedt om effectieve segmentatie tussen de structuren mogelijk te maken, terwijl de beheersbare gegevensgroottes voor VR-visualisatie verder behouden blijven. Bovendien moet een omgekeerd contrast met cellulaire structuren die wit lijken op een zwarte achtergrond en histogram-egalisatie worden toegepast om de zichtbaarheid van membranen en andere structuren in de syGlass-omgeving te verbeteren.

Om het succes van dit protocol te garanderen, moeten verschillende kritieke punten in overweging worden genomen. Ten eerste is tijdens de voorverwerking van gegevens een nauwkeurige toepassing van contrastinversie en histogram-egalisatie van vitaal belang; onjuiste aanpassingen kunnen leiden tot suboptimale visualisatie in VR, waardoor segmentatie een uitdaging wordt. Ten tweede zijn binnen de VR-software de juiste aanpassingen van vensters, helderheid en drempelinstellingen essentieel voor een optimale visualisatie van structuren. Gebruikers moeten met deze instellingen experimenteren om de beste resultaten te bereiken voor hun specifieke datasets en VR-opstellingen.

Als het gaat om het oplossen van problemen, kunnen gebruikers problemen tegenkomen zoals prestatiebeperkingen van het VR-systeem, vooral bij het verwerken van grote tomogramdatasets. Als de VR-omgeving traag wordt of niet meer reageert, kunt u overwegen de gegevens te downsamplen of het tomogram in kleinere secties te segmenteren door het begrenzingsvak in de ROI-tools in syGlass aan te passen en langs het tomogram te verplaatsen terwijl de segmentatie wordt uitgevoerd. De prestatieschuifregelaar in het visualisatiemenu kan ook worden aangepast om vertragingen tijdens het segmentatieproces te verminderen. Om bewegingsziekte te verminderen, kunnen gebruikers bovendien VR-instellingen aanpassen om bewegingseffecten te verminderen of regelmatig pauzes nemen tijdens segmentatiesessies.

Ons VR-gebaseerde segmentatieprotocol biedt aanzienlijke voordelen voor de huidige cryo-ET-segmentatieworkflows. Conventionele handmatige segmentatiemethoden omvatten vaak 2D-annotatie op individuele segmenten, wat tijdrovend kan zijn en mogelijk de driedimensionale continuïteit niet volledig weergeeft13. Bovendien introduceert VR-gebaseerde segmentatie een veel meeslepender beeld van de cellulaire structuren, wat helpt bij visualisatie. Geautomatiseerde machine-learningsegmentaties zijn in opkomst als een krachtige methode om segmentaties te verkrijgen van cellulaire tomogrammen 14,16,17, hoewel de hoge ruisniveaus en complexe structuren die aanwezig zijn in cryo-ET-gegevens leiden tot hiaten en valse positieven die handmatige interventie vereisen. Dit protocol biedt een alternatieve benadering voor het handmatig segmenteren van cryo-elektronentomogrammen, om initiële segmentaties te genereren die mogelijk kunnen worden gebruikt als trainingsgegevens voor andere neurale netwerksoftware, of om initiële segmentaties op te schonen die zijn gegenereerd door andere geautomatiseerde benaderingen.

Concluderend benadrukt deze studie VR-gebaseerde segmentatie als een veelbelovend hulpmiddel voor cryo-ET-data-analyse en -onderwijs, dat verbeterde efficiëntie en een meer meeslepende gebruikerservaring biedt. Met verdere ontwikkeling heeft VR-technologie het potentieel om een revolutie teweeg te brengen in de manier waarop we wetenschappelijke ontdekkingen van complexe cellulaire structuren in cryo-ET-datasets interpreteren en verspreiden, en een waardevol alternatief bieden voor traditionele segmentatie- en onderwijsmethoden.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd uitgevoerd in het National Center for CryoEM Access and Training (NCCAT) en het Simons Electron Microscopy Center in het New York Structural Biology Center, ondersteund door NIH (Common Fund U24GM129539, U24GM139171 en NIGMS R24GM154192), de Simons Foundation (SF349247) en NY State Assembly.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CryoET DataFormaat:TIFF-stack, TIFF
HTC VIVE CosmosHTC99HARL000-00https://www.vive.com/sea/product/vive-cosmos/features/
Intel(R) Core(TM) i7-10870H CPU @ 2.20 GHz 2.21 GHzIntelhttps://ark.intel.com/content/www/us/en/ark/products/208018/intel-core-i7-10870h-processor-16m-cache-up-to-5-00-ghz.html
NVIDIA GeForce RTX 3070 Laptop GPUNVIDIAhttps://www.nvidia.com/en-us/geforce/laptops/compare/30-series/
syGlass SoftwaresyGlasssyGlass Software geïnstalleerd op een compatibele Windows-pc
VIVE Cosmos Hand ControllersHTC99HAFR001-00https://www.vive.com/us/accessory/cosmos-controller-right/
Windows 11 HomeMicrosoftMicrosoft Windows 11 Home

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Plitzko, J. M., Schuler, B., Selenko, P. Structural biology outside the box-inside the cell. Curr Opin Struct Biol. 46, 110-121 (2017).
  2. Beck, M., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: can it reveal the molecular sociology of cells in atomic detail. Trends Cell Biol. 26 (11), 825-837 (2016).
  3. Lam, V., Villa, E. Practical approaches for cryo-FIB milling and applications for cellular cryo-electron tomography. Methods Mol Biol. 2215, 49-82 (2021).
  4. Berger, C., et al. Cryo-electron tomography on focused ion beam lamellae transforms structural cell biology. Nat Methods. 20 (4), 499-511 (2023).
  5. Watson, A. J. I., Bartesaghi, A. Advances in cryo-ET data processing: meeting the demands of visual proteomics. Curr Opin Struct Biol. 87, 102861(2024).
  6. Pyle, E., Zanetti, G. Current data processing strategies for cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Biochem J. 478 (10), 1827-1845 (2021).
  7. Wan, W., Briggs, J. A. G. Cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Methods Enzymol. 579, 329-367 (2016).
  8. Ni, T., Liu, K., Zhang, J., Atanasov, I., Mladenov, M. G., Jiang, W. High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity. Nat Protoc. 17 (2), 421-444 (2022).
  9. Obr, M., et al. Exploring high-resolution cryo-ET and subtomogram averaging capabilities of contemporary DEDs. J Struct Biol. 214 (2), 107852(2021).
  10. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nat Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
  11. Salfer, M., Collado, J. F., Baumeister, W., Fernández-Busnadiego, R., Martínez-Sánchez, A. Reliable estimation of membrane curvature for cryo-electron tomography. PLoS Comput Biol. 16 (8), e1007962(2020).
  12. Barad, B. A., et al. Quantifying organellar ultrastructure in cryo-electron tomography using a surface morphometrics pipeline. J Cell Biol. 222 (2), e202204093(2023).
  13. Martinez-Sanchez, A., Garcia, I., Asano, S., Lucic, V., Fernandez, J. J. Robust membrane detection based on tensor voting for electron tomography. J Struct Biol. 186 (1), 49-61 (2014).
  14. Heebner, J. E., et al. Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms. J Vis Exp. (189), e64435(2022).
  15. Garza-López, E., Robles-Flores, M. Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira. Cells. 11 (1), 65(2021).
  16. Chen, M., et al. Convolutional neural networks for automated annotation of cellular cryo-electron tomograms. Nat Methods. 14 (10), 983-985 (2017).
  17. Lamm, L., et al. MemBrain v2: an end-to-end tool for the analysis of membranes in cryo-electron tomography. bioRxiv. , (2024).
  18. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality head-mounted displays. arXiv. , (2018).
  19. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  20. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  21. Bepler, T., Kelley, K., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nat Commun. 11, 5208(2020).
  22. Buchholz, T. -O., Berninger, L., Maurer, M., Jug, F. Cryo-CARE: content-aware image restoration for cryo-transmission electron microscopy data. Proc IEEE Int Symp Biomed Imaging. 16, 502-506 (2019).
  23. Buchholz, T. -O., Jordan, M., Pigino, G., Jug, F. Content-aware image restoration for electron microscopy. Methods Cell Biol. 152, 277-289 (2019).
  24. Liu, Y. -T., et al. Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning. Nat Commun. 13, 6482(2022).
  25. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cryo Electron TomographyVirtual Reality SegmentationImmersive Data AnalysisMitochondrial Membranes3D Cell UltrastructureManual SegmentationRetinal Pigment EpitheliumROI AnnotationHistogram EqualizationMembrane Visualization

Gerelateerde artikelen