Methodenartikel

High-throughput flowcytometriemeting van cellulair mechanotype op basis van ruptuur en afgifte van DNA-spanningssondes in cellen

DOI:

10.3791/67852

⸱

13 juni 2025

 , 
1College of Biological Sciences, University of Minnesota

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze methode meet de neiging van een cel om ligand-presenterende geïmmobiliseerde DNA-duplexen te scheuren om relatieve cellulaire trekkrachten te rapporteren. Gescheurde fluorescerende oligo's worden in de cel afgeleverd en geanalyseerd door middel van flowcytometrie, waarbij de mechanische geschiedenis van de cel wordt vastgelegd. Dit maakt het mogelijk om met hoge doorvoer de productie van cellulaire kracht te meten in de context van cellulaire mechanofotypering.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mechanische krachten leiden veel kritieke cellulaire processen, en het cellulaire mechanische fenotype, of mechanotype, is bij veel ziekten verstoord. De meest gebruikte methode om cellulaire krachten te kwantificeren is tractiekrachtmicroscopie, die traditioneel de krachten vastlegt die cellen op hun omgeving uitoefenen door microscopie met hoge resolutie van cellen die elastische substraten met fluorescerende kralen vervormen, microposten afbuigen of de conformatie van geïmmobiliseerde moleculaire spanningssensoren veranderen. We presenteren hier een high-throughput-methode om relatieve cellulaire trekkrachten te meten met behulp van gevestigde DNA-spanningssondes en gekwantificeerd via flowcytometrie. Er zijn vijf algemene stappen betrokken bij deze methode die hieronder wordt beschreven. Ten eerste, expressie en zuivering van het integrine-ligand echistatine met hoge affiniteit gefuseerd met een DNA-koppelende HUH-tag; ten tweede, voorbereiding van de DNA-duplexsondes met reporters en ligand; ten derde, oppervlaktevoorbereiding en immobilisatie van sondes; ten vierde, uitvoering van het "Rupture and Deliver" tension-gauge-tether-experiment en flow-uitlezing. Ten slotte beschrijven we de data-analyse en interpretatie van experimentele resultaten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mechanische krachten begeleiden veel kritieke cellulaire processen, van migratie1 tot stamceldifferentiatie2 tot het vermogen van een T-cel om te binden aan en te worden geactiveerd door de juiste antigeenpresenterende cel3. Mechanische variabelen zijn ontregeld bij de ziekte, wat resulteert in meetbare verschillen in cellulair mechanisch fenotype, of mechanotype, van cellen 4,5. Mechanotype is een overkoepelende term voor de mechanische eigenschappen van cellen en weefsels en kan parameters omvatten zoals contractiliteit, migratie, adhesie en vervormbaarheid. Cel- of weefselstijfheid is het meest voorkomende aspect van mechanotype, gemeten omdat het kan worden gemeten bij hoge doorvoer. Kankercellen zijn bijvoorbeeld vaak stijver dan normale cellen, terwijl uitgezaaide cellen vaak meer meegaand zijn 6,7. Krachtgeneratie door cellen is een belangrijk aspect van mechanotype dat verandert bij ziekte8 omdat het specifieke interacties tussen cel en omgeving onderzoekt. Tractiekrachtmicroscopie is de meest gebruikelijke methode om de opbouw van cellulaire kracht te meten en omvat het plateren van cellen op vervormbare elastische substraten ingebed met fluorescerende kralen of op reeksen microposten en het volgen van veranderingen in de beweging van de kraal of de afbuiging van de post om de krachten te berekenen die door cellen worden uitgeoefend. Moleculaire spanningssensoren zijn ook gebruikt om trekkrachten te meten en bieden het voordeel van gevoeligheid voor kleinere krachtgroottes en het meten van krachten die worden gegenereerd door specifieke ligand-receptorparen 9,10. Het meten van cellulaire krachten met traditionele TFM- en moleculaire spanningssensoren is echter afhankelijk van beeldvorming met hoge resolutie, waardoor de doorvoer van metingen wordt beperkt.

We hebben onlangs DNA-duplex spanningssondes aangepast in een high-throughput uitlezing van cellulaire krachtgeneratie in de context van cellulaire mechanofonotypering11 (Figuur 1). In het kort worden DNA-duplexen die zijn aangepast aan de veelgebruikte TGT-sondes (TGT)12 geïmmobiliseerd in de putjes van platen met 96 putjes via biotine-neutravidinechemie van de "anker" -streng13. De vereiste breukkracht van de TGT-duplexen kan worden afgestemd door de positie van de biotine op de ankerstreng te variëren, waardoor de geometrie van de duplex verandert, wat resulteert in een conformatie met een lage breukkracht (Figuur 2A) of een conformatie met hoge breukkracht (Figuur 2B). De ankerstreng bevat biotine en een fluorescentie-quencher, terwijl de "ligand" -streng van DNA een fluorescerende sonde en een ligand bevat die een celoppervlakreceptor herkent die betrokken is bij mechanosensing, zoals een integrine. De ligand is covalent gekoppeld aan het DNA (Figuur 3) via het gebruik van een DNA-koppelende fusietag, een HUH-tag genaamd, gefuseerd met de ligand14,15. HUH-tags zijn kleine HUH-endonucleasedomeinen die betrokken zijn bij virale replicatie en andere processen die een 9 bp-sequentie/structuur van enkelstrengs DNA herkennen, insnijden en een covalent fosfotyrosine-adduct vormen aan het 5'-uiteinde van het ingekeepte DNA.

Cellen die bovenop deze sondes zijn geplateerd, binden zich aan het ligand en scheuren een percentage van de sondes dat evenredig is met de krachten die ze genereren. De fluorescerende ligandstreng die aan zijn receptor is gebonden, wordt vervolgens in de cel afgeleverd. De mechanische geschiedenis van de cellen wordt dus vastgelegd in de cellen van belang via de grootte van hun fluorescentie. De fluorescentie kan worden gekwantificeerd met behulp van flowcytometrie. Deze methode noemen we Rupture and Deliver-TGTS of RAD-TGT's. Deze methode meet niet alleen de fluorescentie en dus de relatieve kracht die door duizenden cellen tegelijk wordt gegenereerd, maar ook de uitlezing van de flowcytometrie biedt het potentieel om de cellen te sorteren op hun mechanotype, waardoor downstream -omics-uitlezingen mogelijk zijn, evenals CRISPR-KO of medicijnschermen die genen of geneesmiddelen kunnen identificeren die het cellulaire mechanotype veranderen.

In onderstaand protocol laten we zien hoe je een RAD-TGT-experiment voorbereidt en uitvoert. We zullen de expressie en zuivering benadrukken van een type HUH dat bekend staat als WDV (van het tarwedwergvirus) op zichzelf om te dienen als een negatieve controle en gefuseerd met echistatine, een ligand dat een familie van adhesiereceptoren stevig bindt die kracht transduceren tussen cel en omgeving die bekend staat als RGD-bindende integrines, om als een experimentele conditie te dienen. Hieruit zullen we laten zien hoe RAD-TGT's kunnen worden voorbereid voor experimenteel gebruik. We leggen uit hoe u verder gaat met experimenten en hoe u de resulterende gegevens kunt analyseren. We zullen ook een toepassing van RAD-TGT's belichten door te meten hoe een ROCK-remmer de integrine-gemedieerde krachten in CHO-K1-cellen verandert (Figuur 4). Samenvattend hopen we dat dit protocol dient als een toegang tot mechanobiologie, ongeacht eerdere ervaring; Het vakgebied staat nog in de kinderschoenen en alle achtergronden zijn essentieel voor een beter begrip.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HUH-expressie en zuivering

  1. Transformeer Escherichia coli met WDV (± echistatine) plasmide, ongeveer 1,5 μL van ~50 ng/μL plasmide per transformatie, en groei op ampicilline-agarplaten.
  2. Inoculeer 5 ml LB met een enkele kolonie en kweek 's nachts bij 37 °C.
  3. Inoculeer 1 L LB met de nachtcultuur en groei tot OD600 ~0,8 bereikt.
  4. Verlaag de temperatuur tot 18 °C, induceer met 500 μM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en incubeer een nacht.
  5. Pellet de cellen door centrifugeren bij 3.750 × g gedurende 30 minuten. Resuspendeer de pellet met 40 ml lysisbuffer (300 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA).
  6. Lyseer de cellen met 3 x 90 s sonicatie op ijs bij 70% inschakelduur, vermogen 7. Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 24.000 × g bij 4 °C en giet het bovenstaande in een nieuwe tube van 50 ml.
  7. Doe Ni-NTA-harssuspensie in een conische buis van 15 ml (1 ml kralensuspensie/L cultuur), centrifugeer gedurende 2 minuten op 700 × g en verwijder het supernatant.
  8. Voeg 6 ml water toe aan de hars en herhaal het wasproces in stap 1.7.
  9. Herhaal de wasbeurt twee keer met wasbuffer (300 mM NaCl, 50 mM Tris [pH 7,5], 1 mM EDTA, 20 mM Imidazool) in plaats van water. Resuspendeer de kralen in 5 ml wasbuffer.
  10. Voeg de kralenbrij (stap 1.9) toe aan de gelyseerde cellen (stap 1.6) en meng grondig. Draai de gelyseerde cellen en kralen gedurende ten minste 1 uur bij 4 °C.
    OPMERKING: Laat de hars voor de rest van dit protocol nooit opdrogen en verzamel alle monsters die door de kolom stromen.
  11. Giet het mengsel op een kolom van 20 ml en vang de doorstroming op. Was de zuil met 4 x 25 ml wasbuffer.
  12. Elueer met 1 x 10 ml elutiebuffer (300 mM NaCl, 50 mM Tris [pH 7,5], 1 mM EDTA, 250 mM imidazool) in een verse buis van 15 ml, waarbij vroege en late elutie afzonderlijk worden verzameld (vroege elutie is de eerste 1 ml, late elutie is de laatste 1 ml).
  13. Analyseer alle verzamelde fracties via natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) om er zeker van te zijn dat de HUH tijdens de elutie is verzameld (zie aanvullende figuur S1). Voor het beste resultaat laadt u een gel van 4-20% en laat u deze 45 minuten draaien op 35 W en 200 V.
  14. Voeg het geëlueerde eiwit toe aan de dialyseslang en incubeer een nacht in de dialysebuffer (hetzelfde als de lysisbuffer) bij 4 °C. Om de HIS-tag te verwijderen, voegt u ULP1 zonder reductiemiddel rechtstreeks toe aan het geëlueerde eiwit voordat u het eiwit in de dialyseslang doet.
  15. Bereid de volgende ochtend Ni-NTA-hars zoals beschreven in de stappen 1.7-1.9 en incubeer met het gedialyseerde eiwit. Giet het mengsel van het eiwit en de Ni-NTA-hars in een kolom en vang de doorstroming op. Was de kolom met 10 ml dialysebuffer en vang eventuele doorstroming op.
  16. Beoordeel de verzamelde fractie op SDS-PAGE aan de hand van de bovenstaande instellingen om er zeker van te zijn dat het eiwit aanwezig is, en concentreer tot de gewenste concentratie met behulp van een ultracentrifugaalfilter van 15 ml met een grenswaarde van 10 kDa moleculair gewicht (zie aanvullende figuur S1).
    OPMERKING: De ideale uiteindelijke eiwitconcentratie ligt tussen 40 μM en 100 μM.

2. RAD-TGT voorbereiding

  1. Monteer duplexen in een molaire verhouding van 1,1:1 van ankerstreng (met quencher) tot ligandstreng (met fluorofoor) bij een eindconcentratie van 40 μM ligandstreng in een oplossing van 10 mM Tris (pH 7,5), 50 mM NaCl en 1 mM EDTA.
  2. Gloeien door incubatie bij 98 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door afkoelen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur; Beschermen tegen licht.
    OPMERKING: Monsters met een laag volume verdampen gemakkelijk en kunnen moeilijk volledig te herstellen zijn. Bereid een groter volume voor dan nodig is.
  3. Reageer de gegloeide duplexen met HUH (met behulp van de concentratie van de minst overvloedige streng bij het gloeien; in dit geval de ligandstreng) in een molaire verhouding van 1:2 bij een eindconcentratie van 10 μM duplex en 20 μM HUH in een oplossing die 1 mM MnCl2, 50 mM HEPES (pH 8), 50 mM NaCl bevat.
  4. Incubeer de reactie gedurende 30 minuten bij 37°C in een thermische cycler of een lichtbeschermd warmteblok. Haal na de incubatie van het vuur en gebruik een minifuge op een werkblad om de nu gemonteerde TGT's leeg te draaien. Plaats de TGT's onmiddellijk of bewaar ze in het donker bij 4 °C.

3. Voorbereiding van het oppervlak

  1. Bedek onmiddellijk na het openen van een glazen bodemplaat met 96 putjes alle putjes met zelfklevende PCR-plaatfolie om ongebruikte putjes te bewaren voor later gebruik. Gebruik een scheermesje om de folie over de betreffende putjes uit te snijden (bij voorkeur niet-randputjes) en voeg 100 μL koude PBS toe aan de gewenste putjes.
    OPMERKING: Zodra vloeistof aan putjes is toegevoegd, laat de putjes dan niet uitdrogen. Als er uitdroging optreedt, zal niet-specifieke adsorptie van biomoleculen aan het oppervlak een negatieve invloed hebben op de gegevens. Houd 100 μL overtollig volume continu in het putje om uitdroging te voorkomen.
  2. Voeg 200 μL koude PBS toe aan putjes, pipetteer, meng voorzichtig 2-5x en verwijder 200 μL PBS. Herhaal dit voor in totaal drie wasbeurten.
    OPMERKING: Houd bij het toevoegen en verwijderen van vloeistof uit de putjes de pipetpunt op de rand van de put in een hoek van 45° om te voorkomen dat het oppervlak wordt verstoord. Doe dit voor alle handelingen van de plaat, behalve bij het plateren van cellen.
  3. Bereid voor experimentele putjes een oplossing van 0,1 mg/ml gebiotinyleerd-BSA in PBS en voeg 80 μL van de oplossing toe aan de gewenste putjes. Bereid voor controleputjes dezelfde oplossing met toevoeging van 18,75 μg/ml fibronectine en voeg 80 μl toe aan de respectieve putjes. Piket voorzichtig alle gebruikte putjes, plaats het deksel op het bord en dek af met folie. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  4. Verwijder 80 μL volume uit de putjes en was de putjes door stap 3.2 te herhalen. Voeg 80 μl 0,1 mg/ml neutravidine toe aan PBS-oplossing op dezelfde manier als in stap 3.3.
  5. Verwijder na de incubatie 80 μL volume uit de putjes en herhaal stap 3.2. Verdun de geassembleerde TGT's (RAD-TGT-bereiding stap 2) tot 0,1 μM in PBS en 80 μL oplossing tot de putjes op dezelfde manier als stap 3.3. Dek de putjes af met plakfolie en bewaar ze in het donker bij 4 °C of bescherm ze tegen licht en incubeer ze 1 uur bij kamertemperatuur voordat u verder gaat met experimenten.
    OPMERKING: We raden aan om stap 3.5 als een stoppunt te behandelen en te wachten tot de volgende dag om door te gaan met experimenten.

4. Experimenteel protocol van RAD-TGT

  1. Nadat TGT's voldoende tijd hebben gehad om te hechten, wast u de putjes (zie stap 3.2) 3x met PBS, gevolgd door twee wasbeurten met serumvrije media. Laat de media na de laatste wasbeurt in de putjes zitten. Voeg 200 μL PBS toe aan de perifere wells om eventuele randeffecten te verminderen en breng de plaat over naar een incubator van 37 °C om de plaat voor te verwarmen.
  2. Haal de cellen van belang op met ~80% confluentie en aspireer de media op, gevolgd door de toevoeging en aspiratie van PBS om de cellen te wassen. Voeg een geschikte hoeveelheid trypsine toe en plaats de plaat in een celkweekincubator van 37 °C totdat de cellen dissociëren (~5-10 min).
  3. Zodra de cellen zijn gedissocieerd, voegt u het oorspronkelijke volume van de volledige celmedia die worden gebruikt om de cellen te onderhouden toe aan de plaat en suspendeert u opnieuw met een serologische pipet. Voeg de celsuspensie toe aan een conische buis van 15 ml.
  4. Centrifugeer de cellen bij 300 × g gedurende 4 minuten, zuig de media op en suspendeer de pellet opnieuw in PBS. Herhaal de centrifugatie en aspiratie, suspendeer vervolgens in 5 ml serumvrije media en herhaal de centrifugatie en aspiratie. Resuspendeer de cellen in ~2 ml serumvrije media.
  5. Bepaal de dichtheid van de geresuspendeerde cellen en pas de concentratie naar wens aan.
    OPMERKING: We streven ernaar om ~15.000 cellen per putje te plaatsen, dus we bereiden de cellen voor op een concentratie van 150.000 cellen/ml, waardoor 15.000 cellen kunnen worden geplateerd met 100 μL geresuspendeerde cellen.
    1. Optioneel: Als het effect van medicijnen of andere farmacologische middelen moet worden getest, voeg dan de juiste concentratie van het medicijn toe aan de cellen en breng de cellen terug naar de incubator. Zorg voor voldoende pre-incubatietijd voordat u doorgaat naar de volgende stap.
  6. Haal de plaat uit de broedmachine (stap 4.1) en verwijder de hoeveelheid media die nog over is van de was uit de experimentele putjes in de voorverwarmde plaat. Was een keer met het gewenste medium. Piketneer voorzichtig 100 μL van de geresuspendeerde cellen in de gewenste putjes. Breng de geplateerde cellen 90 minuten over naar de broedmachine.
    OPMERKING: Pipetteer de cellen voorzichtig in het midden van de putjes en probeer de pipet verticaal te houden.
  7. Verwijder na de incubatie ~125-170 μL volume uit de putjes. Was de cellen indien nodig voorzichtig met 200 μL verwarmde PBS. Voeg 50 μL trypsine toe aan elk putje en breng de plaat terug naar de broedmachine totdat de cellen beginnen te dissociëren (5-10 min).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de put nooit uitdroogt en dat er geen overtrypsinisatie optreedt.
  8. Voeg 160 μL vers bereide stroombuffer (1 mM EDTA, 2% w/v runderserumalbumine, in koude PBS) toe aan de putjes. Pineer voorzichtig op en neer om de cellen te dissociëren, voeg 196 μL van deze celsuspensie toe aan PCR-buisjes gevolgd door 4 μL propidiumjodide en meng voorzichtig. Bereid één controlemonster voor zonder propidiumjodide om te dienen als controle voor levensvatbaarheid.
  9. Plaats de buisjes in een ijsemmer waarvan het deksel het licht blokkeert en ga verder met het meten van de fluorescentie-intensiteit met een flowcytometer.

5. Gegevensverzameling en -analyse

  1. Analyseer elk monster met een flowcytometer. Streef ernaar om ten minste 2.000 levende afzonderlijke cellen per monster te verzamelen.
    NOTITIE: Minimaliseer de blootstelling aan licht voor monsters die nog niet zijn geanalyseerd en bewaar ze op ijs.
  2. Zodra alle gegevens zijn verzameld, brengt u de bestanden over naar de software van uw keuze en poort u de cellen.
    1. Poort voor cellen op basis van voorwaarts verstrooiingsgebied (FSC-A) versus zijwaarts verstrooiingsgebied (SSC-A).
    2. Poort voor singlets binnen de celpopulatie door FSC-A versus voorwaartse verstrooiingshoogte (FSC-H).
    3. Poort voor levende cellen van de singletpopulatie door een verticale poort in te stellen op het histogram van de intensiteit van het propidiumjodidegebied op de hoogste waarde voor de in stap 4.8 voorbereide controle zonder propidiumjodide. Alle gebeurtenissen die de poort niet overschrijden, zijn actieve cellen
    4. Stel een verticale poort in op een histogram van de intensiteit van het Cy5-gebied (Cy5-A) van de singlets om niet-fluorescerende gebeurtenissen op het Cy5-A-kanaal veroorzaakt door celresten te verwijderen. Zorg ervoor dat deze verticale poort een waarde heeft die lager is dan de geanalyseerde niet-gelabelde cellen, maar groter is dan 0 fluorescerende intensiteit.
    5. Om celpopulaties te analyseren, stelt u een bisectorale poort in op het 99epercentiel van elke respectieve negatieve controle.
    6. Pas een poort toe met dezelfde intensiteit als de overeenkomstige experimentele omstandigheden en verzamel het percentage cellen dat de negatieve controlepoort voor elke toestand overschrijdt.
      OPMERKING: Percentages kunnen direct worden vergeleken tussen biologische replicaten via de juiste statistische analyse; Zie representatieve gegevens.
  3. Analyseer de gegevens met behulp van mediane Cy5-fluorescentie, waarbij de mediane intensiteit van ligand-WDV alleen wordt gedeeld door de mediaan van de WDV en vergelijk deze waarden tussen replicaten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om het nut en het gebruiksgemak van RAD-TGT's aan te tonen, analyseerden we de effecten van Rho Kinase (ROCK)-remmers op het mechanotype van CHO-K1-cellen. De ROCK-route is betrokken bij de organisatie van actine en de activering van myosine. Eerdere studies met TGT's hebben aangetoond dat ROCK-remming de breuk van afschuiving TGT's vermindert 16,17,18. Shearing of high-force TGT's rapporteren o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben protocollen opgesteld voor het opzetten en uitvoeren van RAD-TGT-experimenten met als doel wetenschappers in de biowetenschappen aan te moedigen mechanotypering in hun workflow op te nemen. Een belangrijk voordeel van RAD-TGT's, met name voor mensen met eiwitproductiecapaciteiten, is het gebruik van HUH-endonucleasen om liganden met hoge betrouwbaarheid aan DNA-duplexen te ligate zonder enige chemische verknoping en/of zuivering. HUH-endonucleasen omvatten een familie van nucle...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W.R.G. erkent financiering van de NIH R35GM119483. Biorender werd gebruikt om figuurschema's te maken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL Conical TubeSarstedt62.554.205
96 well glass bottom plateCellvisP96-1.5H-N
Adhesive PCR plate foilThermo Fisher ScientificAB-0626
AmpicillinApex Bioresearch Products25-530
Bio-Rad 20 mL columnBio-Rad7321010
Biotinylated BSAThermo Fisher Scientific29130
BL21 (DE3) Competent E. coliNew England BiolabsC2527H
Bovine Serum AlbuminThermo Fisher ScientificBP9703100
Cell Culture IncubatorThermo Fisher Scientific51030284
CentrifugeThermo Fisher Scientific75009521
CHO-K1ATCCCCL-61
Dialysis TubingThermo Fisher ScientificPI88242
DMSOThermo Fisher ScientificD12345
EDTAThermo Fisher ScientificS311-100
Flow CytometerBDAccuri C6 Plus
FlowJoBDFlowJo v10.10
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-1
ImidazoleThermo Fisher ScientificO3196-500
IPTGIBI ScientificIB02125
LB agarFisher ScientificBP1425-500
Ligand StandIntegrated DNA technologiesuser designed oligoGCT ATA AAC TCA CCG TAA TTT TTT GGC CCG CAG CGA CCA CCC TTT /3Cy5Sp/
Lysogeny Broth (LB)Thermo Fisher ScientificBP1426-500
MnCl2Thermo Fisher ScientificM87-100
NaClThermo Fisher ScientificBP358-212
NeutrAvidin ProteinThermo Fisher Scientific31000
Nickel-NTA resinThermo Fisher Scientific88222
PBSCorning21-031-CV
Petri DishVWR25384-342
Propidium Iodide SolutionCayman Chemicals10008351
SDS-PAGE gelBio-Rad4561096
Serum Free MediaThermo Fisher ScientificA4124801Gibco Optimem Used, alternative serum free medias are fine to use
Shearing Anchor StrandIntegrated DNA technologiesuser designed oligo/5IAbRQ//iBiodT/G GGT GGT CGC TGC GGG CC
SonicatorThermo Fisher Scientific15-345-139
Thermal CyclerBio-Rad1861096
TrisThermo Fisher ScientificBP152-500
TrypinThermo Fisher Scientific12605036
ultracentrifugal filter, 10 kDa cutoffAmikon
Unzipping Anchor StrandIntegrated DNA technologiesuser designed oligo/5IAbRQ/GG GTG GTC GCT GCG GGC C/3Bio/
WDV PlasmidAddGene226983
WDV-Echistatin PlasmidAddGene226985
Y-27632Selleck ChemicalsS1049Reconstituted in DMSO
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Puleo, J. I., et al. Mechanosensing during directed cell migration requires dynamic actin polymerization at focal adhesions. J Cell Biol. 218 (12), 4215-4235 (2019).
  2. He, L., Ahmad, M., Perrimon, N. Mechanosensitive channels and their functions in stem cell differentiation. Exp Cell Res. 374 (2), 259-265 (2019).
  3. Feng, Y., et al. Mechanosensing drives acuity of αβ T-cell recognition. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (39), E8204-E8213 (2017).
  4. Kai, F., Laklai, H., Weaver, V. M. Force matters: Biomechanical regulation of cell invasion and migration in disease. Trends Cell Biol. 26 (7), 486-497 (2016).
  5. Chapman, M., Rajagopal, V., Stewart, A., Collins, D. J. Critical review of single-cell mechanotyping approaches for biomedical applications. Lab Chip. 24 (12), 3036-3063 (2024).
  6. Swaminathan, V., et al. Mechanical stiffness grades metastatic potential in patient tumor cells and in cancer cell lines. Cancer Res. 71 (15), 5075-5080 (2011).
  7. Graybill, P. M., Bollineni, R. K., Sheng, Z., Davalos, R. V., Mirzaeifar, R. A constriction channel analysis of astrocytoma stiffness and disease progression. Biomicrofluidics. 15 (2), 024103(2021).
  8. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), e32572(2012).
  9. Yasunaga, A., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Phys Biol. 17 (1), 011001(2019).
  10. Liu, Y., Galior, K., Ma, V. P. -Y., Salaita, K. Molecular tension probes for imaging forces at the cell surface. Acc Chem Res. 50 (12), 2915-2924 (2017).
  11. Pawlak, M. R., et al. RAD-TGTs: high-throughput measurement of cellular mechanotype via rupture and delivery of DNA tension probes. Nat. Commun. 14 (1), 2468(2023).
  12. Wang, X., Ha, T. Defining single molecular forces required to activate integrin and notch signaling. Science. 340 (6135), 991-994 (2013).
  13. Jo, M. H., Cottle, W. T., Ha, T. Real-time measurement of molecular tension during cell adhesion and migration using multiplexed differential analysis of tension gauge tethers. ACS Biomater Sci Eng. 5 (8), 3856-3863 (2019).
  14. Tompkins, K. J., et al. Molecular underpinnings of ssDNA specificity by Rep HUH-endonucleases and implications for HUH-tag multiplexing and engineering. Nucleic Acids Res. 49 (2), 1046-1064 (2021).
  15. Lovendahl, K. N., Hayward, A. N., Gordon, W. R. Sequence-Directed Covalent Protein-DNA Linkages in a Single Step Using HUH-Tags. J Am Chem Soc. 139 (20), 7030-7035 (2017).
  16. Kim, K. A., Vellampatti, S., Hwang, S. H., Kim, B. C. DNA-based single molecule force sensor for characterization of α 5 β 1 integrin tension required for invadopodia formation and maturation in cancer cells. Adv Funct Mater. 32 (28), 2110637(2022).
  17. Wang, X., et al. Integrin molecular tension within motile focal adhesions. Biophys J. 109 (11), 2259-2267 (2015).
  18. Ma, R., et al. Molecular mechanocytometry using tension-activated cell tagging. Nat Methods. 20 (11), 1666-1671 (2023).
  19. Pal, K., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Ubiquitous membrane-bound DNase activity in podosomes and invadopodia. J Cell Biol. 220 (7), e202008079(2021).
  20. Kim, K. A., Vellampatti, S., Kim, B. C. Characterization of integrin molecular tension of human breast cancer cells on anisotropic nanopatterns. Front Mol Biosci. 9, 825970(2022).
  21. Wang, Y., Zhao, Y., Sarkar, A., Wang, X. Optical sensor revealed abnormal nuclease spatial activity on cancer cell membrane. J Biophotonics. 12 (5), e201800351(2019).
  22. Zhao, Y., Sarkar, A., Wang, X. Peptide nucleic acid based tension sensor for cellular force imaging with strong DNase resistance. Biosens Bioelectron. 150, 111959(2020).
  23. Rashid, S. A., et al. All-covalent nuclease-resistant and hydrogel-tethered DNA hairpin probes map pN cell traction forces. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (28), 33362-33372 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Traction Force MicroscopyTension Gauge TetherIntegrin Ligand EchistatinCell Mechanical ForcesHigh Throughput MeasurementCell IsolationFluorescence Intensity

Gerelateerde artikelen