Dit protocol schetst de kweek van vers verkregen (passage 0) keratinocyten voor gebruik in beeldvorming van levende cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Genereren van primaire culturen voor beeldvorming van levende cellen van keratinocyten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het volgen van stamcellen en toegewijd voorlopergedrag op eencellig niveau in de menselijke huid was zowel in vivo als in vitro een uitdaging. Beeldvorming van levende cellen heeft geleid tot aanzienlijke vooruitgang in het vermogen om verschillen tussen keratinocytstamcellen en toegewijd voorlopergedrag te identificeren. Beeldvorming van levende cellen is een evoluerende en enigszins uitdagende methode om het gedrag van keratinocyten in vitro te bestuderen. Dit protocol is ontwikkeld om keratinocyten te kweken met een lage zaaidichtheid, waardoor relatief langdurige time-lapse-fotografie en monitoring van het gedrag van individuele cellen mogelijk zijn. Passage 0-keratinocyten worden gekweekt met een klonale dichtheid en time-lapse-fotografie maakt documentatie mogelijk van individuele celdelingen en het tijdstip waarop ze voorkomen. Voor maximale biologische relevantie worden vers geïsoleerde menselijke keratinocyten in vitro geplaatst. Deze benadering richt zich op proliferatie. Dit protocol kan echter worden aangepast voor gebruik in andere toepassingen voor live celbeeldvorming die het gedrag van individuele cellen meten, zoals het meten van celmigratie, wondgenezing en beweeglijkheid.
Inleiding
Het doel van dit protocol is om de mogelijkheid te bieden om individuele keratinocyten in cultuur over een relatief lange periode (enkele weken) te volgen, mogelijk gemaakt door lage zaaidichtheden en time-lapse-fotografie. Live celbeeldvorming bij lage dichtheid biedt onderzoekers de mogelijkheid om celgedrag in vitro op celniveau te visualiseren. Hoewel dit niet mogelijk is in conventionele celcultuur, maakt beeldvorming van levende cellen het mogelijk om afstammingsbomen in realtime te ontwikkelen, zonder het gebruik van etikettering, waaruit men informatie kan afleiden over de delingkinetiek, zoals de duur van de celcyclus en het aandeel van proliferatie en differentiatiedelingen in een kolonie. Het maakt ook de studie van celmigratie en beweeglijkheid mogelijk. Het kan technisch uitdagend zijn, met aspecten die geoptimaliseerd moeten worden, afhankelijk van het celtype en van de data die vastgelegd moet worden. Andere laboratoria hebben neonatale keratinocyten en/of gepassageerde keratinocyten gebruikt die gemakkelijker te kweken zijn1.
Cellijnen die herhaaldelijk worden gepasseerd, verschillen echter significant in gedrag en morfologie van hun in vivo toestand2. Voor de grootste biologische relevantie om het in vivo gedrag het dichtst in de buurt te krijgen, worden passage 0-cellen gebruikt. In keratinocytenpopulaties is het mogelijk om onderscheid te maken tussen de stamcel en de toegewijde voorloper zonder sortering of labels, omdat er duidelijke verschillen zijn in delingsgedrag die kunnen worden waargenomen via beeldvorming van levende cellen3.
We gebruiken beeldvorming van levende cellen om de kinetiek van de proliferatie van keratinocyten te bestuderen. Een vergelijkbare benadering is gebruikt om de beweeglijkheid te bestuderen van cutane melanoomcellen die zijn gecocultureerd met keratinocyten4, adherente celmigratie van scratch-assays5 en hoe ROCK-remmers de proliferatie van keratinocyten beïnvloeden6. Dit protocol is speciaal ontworpen voor het kweken van cellen om het traceren van afstammingslijnen te vergemakkelijken door middel van beeldvorming van levende cellen, hoewel het kan worden aangepast voor andere doeleinden.
Dit protocol schetst de isolatie van passage 0 keratinocyten met het oog op beeldvorming van levende cellen, bespreekt complicaties die kunnen optreden en geeft overwegingen die mogelijk wijzigingen in het protocol vereisen (Figuur 1).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Voor het gebruik van menselijk weefsel is goedkeuring vereist van het Comité voor menselijk onderzoek van de instelling. Menselijke monsters voor onderzoek worden vaak verkregen uit commerciële bronnen (bijvoorbeeld ATCC, Lifeline cell technology en Zen-Bio). Onze onderzoeken maken gebruik van weggegooid weefsel op het moment van operaties of huidbiopsiemonsters die speciaal voor studiedoeleinden zijn genomen. Deze situaties vereisen verschillende goedkeuringen en toestemmingsprocedures. Alle weefsels worden verkregen na goedkeuring van de UCSF Committee on Human Research, met behulp van schriftelijke geïnformeerde toestemming en volgens de principes van de Verklaring van Helsinki.
1. Scheiding van de epidermis van de dermis
- Zorg ervoor dat de juiste goedkeuringen worden verkregen om menselijk weefsel voor het onderzoek te gebruiken.
- Verkrijg een huidmonster en transporteer het in een geïsoleerde container met een ijspak. Plaats het monster in verzamelmedia met een concentratie van 5x penicilline, streptomycine en amfotericine.
OPMERKING: De benodigde hoeveelheid is afhankelijk van de toepassing. Onze ervaring is dat ongeveer 1.000.000 keratinocyten per cm2 worden verkregen uit de volwassen en oude huid. Dit kan echter per monster aanzienlijk verschillen.- Plaats neonatale voorhuiden in celkweekmedia en start de isolatieprocedure voor keratinocyten niet langer dan 48 uur na de besnijdenis om celdood te minimaliseren. Bewaar het weefsel tot verwerking bij 4 °C. De verwerking van monsters van volwassenen en ouderen begint doorgaans binnen een paar uur na verzameling.
- Krijg toegang tot een bioveiligheidskast met apparatuur op BS2-niveau die is ontworpen voor het werken met agentia die ziekten veroorzaken door inslikken, slijmvlies of percutane blootstelling7. Zorg ervoor dat de bioveiligheidskast gedurende ten minste 15 minuten UV-gesteriliseerd is en dat alle oppervlakken voor gebruik met 70% alcohol worden besproeid.
- Trek handschoenen aan, spuit de opvangbak in met 70% alcohol en plaats de opvangbak in de zuurkast. Plaats een koelkussen onder het weefsel om te voorkomen dat het opwarmt tot kamertemperatuur en om zijn integriteit te behouden. Als het weefsel extreem groot is, snijd dan een deel af voor verwerking en houd de rest vochtig in de opvangcontainer.
OPMERKING: Aangezien veel van de oude exemplaren grote buik- of borsthuid zijn van operaties, kost het tijd om het weefsel te snijden en te verwerken. Weefsel mag nooit direct op het kussen worden geplaatst, omdat het door de extreme kou kan bevriezen. In plaats daarvan moet het op een tussenliggende ondergrond worden geplaatst, zoals een marmeren plaat. - Plaats twee petrischaaltjes van 100 mm x 15 mm en een steriel #23 chirurgisch scalpel in de kap.
- Open de petrischaaltjes en plaats ze op het oppervlak van de kast zodat de binnenkant van elk schaaltje naar boven wijst. Voeg 10 ml 10% chloorhexidinegluconaat toe aan een van de petrischaaltjes. Voeg 10 ml 5x penicilline/streptomycine/amfotericine/gentamycine in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS; 5x) toe aan 2 andere petrischaalhelften (zie materiaaltabel).
- Bereid een bord met 6 putjes voor op de stap Dispase. Gebruik voor neonataal weefsel 3 ml Dispase per putje. Gebruik voor verouderde weefselmonsters 4 ml. Het gebruik van onvoldoende hoeveelheden Dispase voor het weefselvolume kan leiden tot problemen bij het scheiden van epidermis van dermis.
- Gebruik een scalpel om het weefsel in kleinere stukjes te snijden, zodat het beter wordt gepenetreerd door Dispase. Dispase dringt slechts tot 5 mm van de randen van het weefsel door, dus knip lange stroken weefsel van 0,5-1 cm breed. Als het niet klein genoeg wordt gesneden, zal er geen scheiding van de epidermis van de dermis optreden.
- Snijd dikker weefsel in kleinere stukjes. Snijd de neonatale voorhuiden in 3 of 4 stukken (~5 mm x 7 mm). Gebruik maximaal twee hele voorhuiden per putje Dispase. Oppervlakkige buikflappen zijn meestal veel dunner, met minimaal tot geen onderhuids weefsel, snijd deze in langere (~ 5 mm x 15 mm stroken).
- Plaats maximaal vier stroken per putje Dispase. Als er veel onderhuids vet aan het verkregen weefsel is gehecht, snijdt u het onderhuidse weefsel af om Dispase volledig in het weefsel te laten doordringen. Als het weefsel te klein wordt gesneden, kan een ontleedmicroscoop nodig zijn om te bepalen welke kant epidermaal is en welke kant huids is tijdens het afpellen van de epidermis. Aan de verkeerde kant van de huid trekken kan leiden tot extra weefseltrauma.
- Plaats het weefsel met de epidermale kant naar beneden in het eerste petrischaaltje dat in stap 1.6 is bereid, met 10% chloorhexidinegluconaat, gedurende 10-20 s Breng vervolgens het weefsel epidermale kant naar beneden over naar het tweede petrischaaltje, dat 5x penicilline/streptomycine/amfotericine (PSA) met HBSS bevat, en schud gedurende 10-20 s. Breng het weefsel epidermale kant naar beneden over naar de derde petrischaal, die opnieuw 5x PSA met HBSS bevat, en schud nog eens 10 s. Het verwerken van meerdere monsters met dezelfde oplossing is acceptabel.
- Breng het weefsel epidermaal over naar de Dispase-plaat met 6 putjes die in stap 1.7 is voorbereid.
OPMERKING: We raden de epidermale kant naar beneden aan volgens onze conventie. Andere protocollen bevelen dermis down8 aan. Niet alle Dispase is even effectief. Het vervellen van de opperhuid van een verouderde huid bleek bij bepaalde producten een uitdaging, zelfs bij concentraties tot 4x het door de fabrikant aanbevolen niveau. Dit resulteerde in het verlies van tijd en preparaten. Bedrijven gebruiken niet-gestandaardiseerde eenheden voor Dispase, waardoor het moeilijk is om vast te stellen hoe concentraties tussen merken verschillen. Vanwege deze uitdagingen wordt het gebruik van een van de Depase-merken die in de materiaaltabel staan, ten zeerste aanbevolen. - Etiketteer de 6-wells plaat met de Dispase en monsters en breng over naar 4 °C. Incubeer neonatale monsters gedurende 16-18 uur in Dispase en volwassen/oudere monsters gedurende 24 uur.
OPMERKING: Er is een alternatief 2-uursprotocol dat kan worden gebruikt voor monsters, waarbij het monster gedurende 2 uur in Dispase bij 37 °C wordt geplaatst en vervolgens de opperhuid wordt geschild. Helaas werkt dit niet altijd en kan de integriteit van het weefsel na incubatie in het gedrang komen, wat resulteert in een verloren exemplaar. Waar mogelijk wordt de voorkeur gegeven aan nachtelijke incubatie.
2. Isolatie van keratinocyten
- Breng 0,05% trypsine-EDTA (of trypLE), trypsine-neutraliserende oplossing en keratinocytmedia 20 minuten voor aanvang van de volgende reeks stappen in een waterbad van 37 °C
- Verwijder een plaat met 6 putjes van 4 °C, besproei deze met 70% ethanol en plaats deze in een voorbereide bioveiligheidskast (zie stap 1.3).
- Plaats de steriele getande pincet en de niet-getande pincet in een conische buis van 50 ml met 20 ml 70% ethanol. Als u zich in eerste instantie buiten de kap bevindt, spuit u de tang in met 70% ethanol voordat u deze in de kap plaatst.
- Pak met een chemisch gesteriliseerde tang een stuk weefsel vast en leg het op een steriel oppervlak met de epidermale kant naar boven (gebruik een petrischaaltje of de binnenkant van de bovenste helft van de plaat met 6 putjes). Houd het dermale deel van het weefsel vast met een getande tang met behulp van de niet-dominante hand en pak tegelijkertijd de opperhuid stevig vast met de niet-getande tang en trek deze van rand tot rand af. Het moet soepel als één stuk loskomen.
- Plaats de opperhuid aan de binnenkant van de lip van een conische buis van 15 ml. Elke conische buis van 15 ml moet een epidermis hebben van maximaal twee voorhuiden.
- Werk efficiënt; Als het weefsel uitdroogt, komt de opbrengst in het gedrang. Als de dispase niet op de juiste manier in het weefsel is doorgedrongen, kan het moeilijk zijn om de opperhuid af te pellen. Trek/schraap in zo'n geval de epidermis van de onderliggende dermis. Dit resulteert ook in een veel lagere opbrengst en is niet aan te raden.
- Voeg 4 ml 0,05% trypsine-EDTA toe aan de conische tube van 15 ml, sluit en keer de tube vervolgens om en zorg ervoor dat alle epidermis in de trypsine hangt en niet aan de zijkant van de tube/het deksel blijft plakken. Plaats gedurende 10 minuten in een waterbad van 37 °C. Schud de cellen elke 2 minuten met de hand.
OPMERKING: Trypsiniseren gedurende meer dan 10 minuten kan resulteren in een lagere celopbrengst. Als de integriteit van eiwitten op het celoppervlak een probleem is, gebruik dan TrypLE, omdat het specifieker is voor de splitsingsplaats, wat resulteert in minder schade aan cellen en het is aangetoond dat het de expressie van oppervlakteantigeenen niet significant vermindert in vergelijking met Trypsine-EDTA9. Verder is het waterbad een veel voorkomende bron van vervuiling, zorg er dus voor dat het regelmatig wordt schoongemaakt. Ververs het water regelmatig met gedeïoniseerd water dat aquaguard-2-oplossing bevat. - Plaats een conische buis van 50 ml in de bioveiligheidskast. Schroef het deksel los en plaats een celzeef van 100 μm op de opening van de conische buis.
- Haal de conische buis van 15 ml met het verteerde monster uit het waterbad, droog grondig af en spuit af met 70% alcohol voordat u het terug in de bioveiligheidskast plaatst. Tik de conische buis 3x tegen het oppervlak van de zuurkast en keer vervolgens 6x om. Herhaal de tik-inversiecyclus 3x.
- Voeg 6 ml trypsine-neutraliserende oplossing toe aan de conische buis. Giet de celzeef in de conische buis van 50 ml uit stap 2.7.
- Spoel de conische buis van 15 ml met het monster met 5 ml trypsine-neutraliserende oplossingen (TNS). Giet door een celzeef in de conische buis van 50 ml. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 min.
- Haal het bovenstaande onmiddellijk uit de centrifuge en pipetteer om celverlies in het medium te voorkomen. Er zou alleen de pellet over moeten zijn met een kleine verzameling vloeistof. Het kan moeilijk zijn om de pellet te zien van kleinere weefselmonsters.
OPMERKING: Er is trypsine aanwezig in het supernatant, dus het is het beste om zoveel mogelijk te verwijderen zonder de pellet te verliezen. - Resuspendeer de keratinocytkorrel in 2 ml keratinocytmedia.
OPMERKING: Er zijn hier twee overwegingen. Ten eerste, welke media te gebruiken. Voor dit doel wordt serumvrije media zonder collageen aanbevolen. Historisch gezien was de standaard voor keratinocytcelcultuur Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) +10% Fetal Bovine Serum (FBS) +Ham's F-12 op een fibroblastvoederlaag (3t3-J2s)10. Met de komst van serumvrije media en de beschikbaarheid van collageen blijven er echter meerdere andere mogelijkheden haalbaar (zie discussie)11. De tweede overweging is of het gebruik van antibiotica in het kweekmedium geschikt is voor beeldvorming van levende cellen. Dit is afhankelijk van de beeldvormingstijd, de duur en de ervaring met het beeldvormingssysteem. Kolonies worden gedurende meerdere weken in beeld gebracht met behulp van een gedeeld beeldvormingssysteem, waardoor het gebruik van antibiotica een voorkeursbenadering is, ondanks de mogelijke impact op culturen (zie discussie). Penicilline, streptomycine, amfotericine B en gentamicine-bevattend keratinocytenmedium worden gebruikt tijdens de resuspensie, gevolgd door een overschakeling op penicilline/streptomycine-bevattende media na de eerste mediaverandering. Deze methode heeft contaminatie tijdens uitgebreide beeldvorming van levende cellen effectief voorkomen. - Tel cellen en zaai de plaat (zie discussie voor opmerkingen over het selecteren van zaaidichtheid). Om een gelijkmatige verdeling van het zaaien te garanderen, suspendeert u vóór het plateren de keratinocytencellen in de totale hoeveelheid medium die moet worden geplateerd. Na zachte agitatie door inversie, wervel licht gedurende 1-2 s en plaat. Verplaats vervolgens de microplaat in een kruisachtig patroon (omhoog-omlaag, links-rechts) 3x in de couveuse.
- Plaats de plaat na 24 uur in de incubator van het live cell imaging systeem. Voer live celbeeldvorming uit op 10x met beelden die elke 20 minuten worden gemaakt. Plaats de monsters bij 37 °C en 5% CO2 in de incubator die aan de microscoop is bevestigd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Gezien de meerdere variabelen die in deze methode kunnen worden gemanipuleerd en die uiteindelijk tot een verscheidenheid aan uitkomsten leiden, schetsen we hier veelvoorkomende misstappen en de daaruit voortvloeiende uitkomsten, en geven we voorbeeldige uitkomsten en de omstandigheden erachter.
Zoals bij elke celkweektechniek is besmetting een mogelijkheid (aanvullende video 1). Overweeg naast zorgvuldige steriele technieken om antibiotica in...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier hebben we een methode beschreven voor de primaire cultuur van menselijke keratinocyten met het oog op beeldvorming van levende cellen. Deze methode past bestaande celkweektechnieken aan met behulp van plating met lage dichtheid en langetermijncultuur om succesvolle beeldvormingsstudies met levende cellen mogelijk te maken. De voorkeursmethode voor dissociatie van dit celtype omvat een enzymatische vertering in twee stappen, waarvan is aangetoond dat het resulteert in keratinocyten, ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Speciale dank aan T. Richard Parenteau, MD/PhD, en Alexandra Charruyer, PharmD/PhD, voor het leren kweken van keratinocyten. Met dank aan Merisa Piper MD voor het verstrekken van monsters om keratinocyten uit te isoleren. Laatste dank aan Michael Rosenblum MD voor het verlenen van toegang tot zijn live celbeeldvormingssysteem om de experimenten te voltooien.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| .05% Trypsin-EDTA (1X), 100 mL | Gibco | 25300-054 | |
| 100 um celfilter | Corning | 352360 | |
| 15 cc Falcon | Corning | 352096 | |
| 50 cc conische Falcon | Corning | 352070 | |
| 6 well microplaat | Corning | 3516 | |
| 70% reagensalcohol, 4 L | VWR Chemicals | BDH1164-4LP | Kan eventueel zelf verdunnen |
| Amphotericin B, 50 ml | Corning | 30-003-CF | Verdun tot 5X (50 ug/mL) |
| Dipase, 100 ml | Corning | 354235 | Verdun 1:1 met HBSS, voeg 1x gentamycin toe, filter steriliseer |
| Epilife, 50 mL | Gibco | MEP1500CA | Voeg HKGS toe, overweeg antibiotica |
| Fetal Bovine Serum Value Heat Inactivated FBS, 500 ml | Gibco | A52568-01 | FBS |
| Pincetten | |||
| Gentamicine, 10 ml | Gibco | 15750-060 | Verdun tot 50 ug/ml voor 5X |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X), 500 ml | Gibco | 14170-112 | (HBSS) |
| HBSS 5X PSAG | Dit is HBSS + 5X concentraties van Pen/Strep/Ampho/Gent | ||
| Hibiclens, Gallon | Molnlycke | 57591 | Verdun tot 10% met gedeioniseerd H2O |
| Human Keratinocyte Growth Serum, 5 mL | Gibco | S-001-5 | Toegevoegd aan epilife |
| Penicilline/Streptomycine, 100 ml | Corning | 30-002-Cl | Verdun tot 5X (wordt geleverd in 100x voorraad) voor 5X PSA - 1X voor mediaverversingen |
| Petrischaal 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Scalpelmes NO 23 | VWR | 76457-480 | |
| TrypLE | Gibco | 12604021 | Een minder kaustisch alternatief voor regulier Trypsine |
| Trypsine Neutraliserende Oplossing | (TNS), dit is HBSS met 10% FBS (sommigen gebruiken minder serum, 5%) |
Referenties
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. Int J Mol Med. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Handl, J., Čapek, J., Majtnerová, P., Báčová, J., Roušar, T. The effect of repeated passaging on the susceptibility of human proximal tubular HK-2 cells to toxic compounds. Phy Res Aca Sci Boh. 69 (4), 731-738 (2020).
- Xiao, T., et al. Short cell cycle duration is a phenotype of human epidermal stem cells. Stem Cell Res The. 15 (1), 76(2024).
- Noujarède, J., et al. Sphingolipid paracrine signaling impairs keratinocyte adhesion to promote melanoma invasion. Cell Rep. 42 (12), 113586(2023).
- Sun, M., et al. An image-based dynamic high-throughput analysis of adherent cell migration. Bio-prol. 11 (6), e3957(2021).
- Chapman, S., McDermott, D. H., Shen, K., Jang, M. K., McBride, A. A. The effect of Rho kinase inhibition on long-term keratinocyte proliferation is rapid and conditional. Stem Cell Res The. 5 (2), 60(2014).
- U.S. Department of Health and Human Services. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , 6th edition, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. USA. (2020).
- Poumay, Y., Roland, I. H., Leclercq-Smekens, M., Leloup, R. Basal detachment of the epidermis using dispase: tissue spatial organization and fate of integrin alpha 6 beta 4 and hemidesmosomes. J Inv Der. 102 (1), 111-117 (1994).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. CellTra. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6 (3), 331-343 (1975).
- Boisseau, A. M., et al. Production of epidermal sheets in a serum free culture system: a further appraisal of the role of extracellular calcium. J Der Sci. 3 (2), 111-120 (1992).
- Roshan, A., et al. Human keratinocytes have two interconvertible modes of proliferation. Nat Cell Bio. 18 (2), 145-156 (2016).
- Nanba, D., et al. EGFR-mediated epidermal stem cell motility drives skin regeneration through COL17A1 proteolysis. J Cell Bio. 220 (11), e202012073(2021).
- Ścieżyńska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Exp Der. 28 (2), 107-112 (2019).
- Guo, A., Jahoda, C. A. B. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Exp Derm. 18 (8), 720-726 (2009).
- Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Bio Rep. 3 (3), 304-308 (2015).
- Usta, S. N., Scharer, C. D., Xu, J., Frey, T. K., Nash, R. J. Chemically defined serum-free and xeno-free media for multiple cell lineages. Ann of tra med. 2 (10), 97(2014).
- Lenihan, C., Rogers, C., Metcalfe, A. D., Martin, Y. H. The effect of isolation and culture methods on epithelial stem cell populations and their progeny-toward an improved cell expansion protocol for clinical application. Cyt. 16 (12), 1750-1759 (2014).
- Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (12), 695-705 (1986).
- Ponce, L., et al. Isolation and cultivation of primary keratinocytes from piglet skin for compartmentalized co-culture with dorsal root ganglion neurons. J Cell Bio. 2 (2), 93-115 (2017).
- Nygaard, U. H., et al. Antibiotics in cell culture: friend or foe? Suppression of keratinocyte growth and differentiation in monolayer cultures and 3D skin models. Exp Der. 24 (12), 964-965 (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
