Hier bieden we een methode voor live celbeeldvormingsanalyse die kan worden gebruikt om de afstamming van passage 0 keratinocyten handmatig te volgen en die het mogelijk maakt om proliferatiemetrieken te verzamelen, waaronder het lot van de celdeling en de duur van de celcyclus.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Live celbeeldvorming met time-lapse-fotografie om de epidermale keratinocytenproliferatiekinetiek te bestuderen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Beeldvorming van levende cellen is een evoluerende en enigszins uitdagende methode om het gedrag van keratinocyten in vitro te bestuderen. Historisch gezien werd het gedrag van keratinocytendeling onderzocht via methoden zoals klonale analyse, immunokleuring en celcyclusanalyse. Geen van deze methoden maakt het mogelijk om het gedrag van keratinocyten op het niveau van één cel in realtime te analyseren. In het afgelopen decennium hebben groepen beeldvorming van levende cellen gebruikt om keratinocytstamcellen en toegewijde voorlopers te identificeren zonder dat labeling nodig was. Er zijn verschillen geïdentificeerd in het delingsgedrag van elke respectievelijke groep, de snelheid van terminale differentiatie en de duur van de celcyclus. Hier wordt een methode beschreven voor beeldvorming van levende cellen van keratinocyten met time-lapse-fotografie en de analyse ervan. Het gebruik van niet-gepasseerde keratinocyten wordt aanbevolen om voor deze methode het meest in vivo gedrag na te bootsen. Live celbeeldvorming biedt een unieke mogelijkheid om stamcel- en toegewijd voorlopergedrag op celniveau te bestuderen en om het lot van de deling, de duur van de celcyclus en andere proliferatiestatistieken te bepalen.
Inleiding
De mogelijkheid om celpopulaties in vitro in realtime te visualiseren terwijl ze zich gedurende langere tijd uitbreiden, is een uniek voordeel van beeldvorming van levende cellen. Met live celbeeldvorming kunnen celmotiliteit, migratie en proliferatie op eencellig niveau worden beoordeeld. Het doel van dit protocol is om de visualisatie van keratinocytenculturen te optimaliseren via time-lapse-fotografie, waarbij video's worden geproduceerd die vervolgens handmatig kunnen worden gevolgd om gedetailleerde gegevens over cellulair gedrag te verkrijgen.
Onze focus ligt op proliferatiekinetiek. Uit de analyse van de live video's van celbeeldvorming kunnen afstammingsbomen worden opgehelderd en kan de tijd tussen delingen (een proxy voor de duur van de celcyclus), evenals de verhoudingen van delingen die leiden tot verdere deling versus differentiatie van de dochtercellen worden beoordeeld.
Er is een aanzienlijke variabiliteit tussen donoren bij het omgaan met primaire keratinocyten en frequente mislukte pogingen tot celvoortplanting. Daarom kiezen veel onderzoekers ervoor om zeer proliferatieve keratinocyten te gebruiken, zoals HaCaT-cellen of neonatale keratinocyten, vaak nadat ze in vitro meerdere passages hebben ondergaan1. Het kweken van primaire keratinocyten van een volwassen of oude huid met het oog op het traceren van de afstamming kan een uitdaging zijn. Er zijn echter problemen met het gebruik van gepassageerde cellen uit cellijnen of uit de mannelijke voorhuid. Herhaald passeren resulteert in cellen die significant verschillen van hun in vivo toestand2. Bovendien is aangetoond dat HaCaT-cellen anders reageren dan primaire keratinocyten in meerdere testen 3,4,5. Om cellen te gebruiken die het meest lijken op hun in vivo tegenhangers, worden passage 0 keratinocyten van volwassen menselijke donoren gebruikt. Keratinocytstamcellen en toegewijde voorlopercellen vertonen duidelijke verschillen in gedrag, waardoor kolonies van beide populaties kunnen worden onderscheiden via beeldvorming van levende cellen6. Dit relatief nieuwe vermogen om het gedrag van afzonderlijke keratinocyten op de lange termijn te visualiseren, is slechts in enkele eerdere onderzoeken gebruikt met behulp van vergelijkbare technieken 6,7,8. Dit protocol schetst live celbeeldvorming van primaire keratinocyten met behulp van het IncuCyte S3 Live-Cell Analysis System. Aan de hand van de afstammingsbomen die worden geconstrueerd, kan het kolonietype worden bepaald (stamcel versus toegewijde voorloper), evenals de duur van de celcyclus en het aandeel differentiatiedelingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Al het menselijk weefsel werd verkregen na goedkeuring door de institutionele beoordelingsraad (IRB) van de Universiteit van Californië, San Francisco (UCSF) en er werd toestemming verkregen voor al het gebruikte weefsel.
1. Time-lapse fotografie van passage 0 menselijke keratinocyten
OPMERKING: Dit protocol is specifiek voor de IncuCyte S3 en SX5.
- Zorg ervoor dat de juiste goedkeuringen van de commissie voor menselijk onderzoek van de instelling zijn verkregen om menselijk weefsel voor het onderzoek te gebruiken.
- Isoleer de keratinocyten van een verse huid zoals eerder beschreven9.
- Bepaal de zaaidichtheid voor de test. Voer pilotstudies uit met monsters in meerdere verdunningen van verschillende donoren om inzicht te krijgen in de dichtheid van cellen die nodig zijn om voldoende kolonies voor studie te garanderen, maar om overmatige kolonies te voorkomen die resulteren in overlapping van kolonies tijdens de observatieperiode. Voer deze pilots uit onder identieke experimentele omstandigheden (dezelfde platen, reagentia, enz.), omdat deze factoren de resultaten kunnen veranderen.
OPMERKING: Een te lage zaaidichtheid resulteert in onvoldoende groei, terwijl een te hoge zaaidichtheid resulteert in het onvermogen om cellen nauwkeurig te volgen vanwege de opeenhoping van cellen in het veld.- Voor Passage 0 keratinocyten van neonatale voorhuiden jonger dan 48 uur uit een verzameling die bij 4 °C in verzamelmedia is bewaard, moet de zaaidichtheid 1000-5000/cm2 zijn. Gebruik voor P1-keratinocyten 500-2000 cellen/cm2. Hoe verder de doorgang, hoe lager de zaaidichtheid.
- Plaatcellen op de geselecteerde plaatgrootte.
OPMERKING: 96 putplaten en microplaten hebben een meniscuseffect, wat resulteert in een niet-uniforme celverdeling, waarbij een groot deel van de groei buiten het veld van de imager plaatsvindt. Platen met grotere putten (bijvoorbeeld platen met 24 putjes) maken het mogelijk om meer gegevens vast te leggen. Platen met 24 putjes maken visualisatie van maximaal 36 velden mogelijk, terwijl platen met 96 putjes visualisatie van maximaal 5 velden mogelijk maken. Het aantal velden dat op een instrument wordt vastgelegd, is echter eindig en meer velden zullen meer van de capaciteit van de imager gebruiken. Meestal wordt een plaat met 24 putjes gebruikt.- Om een gelijkmatige verdeling van cellen op de plaat te bereiken, kunnen verschillende technieken worden gebruikt. Ten eerste, in plaats van elke put afzonderlijk te zaaien, verdeelt u de totale media die nodig zijn voor alle putjes bij een specifieke verdunning in een microbuisje. Piket vervolgens het totale aantal cellen dat nodig is om het aliquot de gewenste dichtheid te laten bereiken en keer het buisje voorzichtig om om de cellen homogeen te verdelen.
- Verplaats de plaat na het plateren drie keer in een kruispatroon (omhoog-omlaag, links-rechts) en breng deze vervolgens voorzichtig over naar de broedmachine.
LET OP: Als u een microplaat gebruikt, vermijd dan de buitenste rijen en kolommen van putjes, aangezien de time-lapse-microscoop warmte genereert bij het maken van beeldvorming en verdamping van de media in die putjes kan veroorzaken. De experimentele putjes moeten in het midden van de plaat worden gegroepeerd en worden omgeven door putjes die PBS of andere steriele vloeistof met maximale capaciteit bevatten om verdamping/randeffecten te verminderen.
- Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 om ze aan te houden.
- Wissel van media na 24 uur.
OPMERKING: Verstoor de groeiende monolaag niet tijdens het afzuigen. Gebruik altijd opgewarmde media (37 °C) en laat de media voorzichtig met behulp van de zijwand in de putten stromen. Het medium dat hier wordt gebruikt is Epilife/Supplement S7/Primocin. Het gebruik van antibiotica in media voor langdurige beeldvorming van levende cellen wordt aanbevolen voor deze toepassing. Uitgebreide kweek in een machine die wordt gebruikt voor meerdere gelijktijdige experimenten loopt een hoog risico op besmetting. Penicilline en streptomycine worden vaak gebruikt. - Open de broedmachine door op de grote driehoekige knop linksonder te drukken om het bakje te openen als het lampje groen is. Zet het vat in een open baai. Sluit vervolgens de lade met dezelfde knop linksonder. Open de lade nooit als de knop om te openen rood is, want dat betekent dat deze actief aan het scannen is en dat de scan wordt onderbroken.
LET OP: Zorg ervoor dat er geen scans zijn die beginnen met het kijken naar het scherm op de controllermodule. Het geeft de tijd aan tot de volgende scan en de lengte van de scan. Als het scannen is gestart, wordt aangegeven hoe lang het duurt voordat de scan is voltooid. - Open de applicatie op de computer en log in met de juiste gebruikers-ID en wachtwoord. Selecteer Plannen.
- Druk op de + knop in de linkerbovenhoek onder het rooster om de plaat aan het rooster toe te voegen.
- Selecteer Scannen op schema en klik vervolgens op Volgende.
- Selecteer Nieuw en klik vervolgens op Volgende.
OPMERKING: Als deze plaat identiek is aan een eerder of lopend experiment, kan Vorige kopiëren of Stroom kopiëren worden gebruikt om het opmaken van het experiment te versnellen. - Selecteer Standaard voor scantype en klik vervolgens op Volgende.
OPMERKING: Image Lock is een gepatenteerde plaat met 96 putjes die helpt het optreden van verlies van focus/beeldverspringen te minimaliseren, wat handig kan zijn als deze problemen zich voordoen. De andere scantypen zijn niet bijzonder nuttig voor het traceren van de afstamming. - Selecteer voor scaninstellingen Cel voor cel vasthouden met behulp van het fasekanaal bij 10x-objectief en klik vervolgens op Volgende.
OPMERKING: Zolang het fasekanaal is gekozen, hoeft er op dit punt geen analyseoptie te worden geselecteerd, omdat de analyse kan worden gestart nadat de gegevens zijn vastgelegd. - Selecteer het vaartuig en klik op Volgende. De meeste gangbare vaten zijn compatibel met de machine, hoewel niet-microplaten mogelijk speciale hulpstukken nodig hebben om in de bays van de time-lapse-microscoop te passen.
- Selecteer een lege baai om het schip te plaatsen en klik vervolgens op Volgende.
- Selecteer de putjes die moeten worden gescand en de afbeeldingen per putje en klik vervolgens op Volgende. De geschatte scanduur wordt linksonder in het scherm weergegeven.
- Geef het experiment een naam met behulp van de gewenste naamgevingsconventie. Maak een plaatkaart van het experiment voor toekomstig gebruik en druk vervolgens op OK. Klik ten slotte op Volgende.
- Stel de analyse uit tot na het verzamelen van de gegevens, aangezien de cel-voor-cel analyse moet worden gestart nadat het scannen is voltooid. Klik op Volgende.
- Stel ten slotte de beeldfrequentie in. Om mitoses, die meer dan 30 minuten duren, betrouwbaar te volgen, scant u met tussenpozen van 20 minuten op keratinocyten. Druk op Volgende en bevestig de instellingen om het experiment te starten.
OPMERKING: Scantijden kunnen elkaar niet overlappen en de fabrikanten raden aan om het apparaat tijdens het scannen in rust te houden. Met intervallen van 20 minuten betekent dit dat er maximaal 10 minuten moet worden besteed aan scannen. Als er 12 putjes van een plaat met 24 putjes worden afgebeeld met 36 weergaven per put, duurt het 7 minuten voordat de scan is voltooid, dus houd bij het plannen altijd rekening met de middelen die beschikbaar zijn voor het experiment.- Er is een melding als er onvoldoende tijd is om de machine te laten rusten, en als de scantijden elkaar overlappen, kan het schip niet aan het schema worden toegevoegd. Als het schip niet op een regelmatig interval in het schema past, klikt u op Locatie van lade reserveren en klikt u op Volgende.
- Dubbelklik op het schema bovenaan het scherm en selecteer het schip in reserve en klik vervolgens handmatig om afbeeldingen toe te voegen aan open tijdvakken. U kunt ook met de rechtermuisknop klikken zodra het schema is geopend om alle geplande scantijden te verwijderen en met de rechtermuisknop klikken om nieuwe scantijden voor een scangroep met een regelmatig interval in te stellen.
OPMERKING: Hiermee worden alle experimenten die momenteel op de machine worden uitgevoerd, onderbroken totdat er nieuwe tijden zijn ingesteld. Vergeet niet op het diskettepictogram te drukken om op te slaan of op de rode X om wijzigingen in het schema te annuleren. Het selecteren van de gewenste putten of aanzichten is een eenvoudig proces, omdat de machine onmiddellijk de geschatte scantijd geeft bij het selecteren van de parameter. De scanduur is afhankelijk van het type en merk van de geselecteerde plaat, evenals het aantal putjes of aanzichten dat moet worden gescand. Hierdoor kunnen gebruikers de scanparameters aanpassen aan de capaciteit van de machine.
- Vervang voor keratinocyten elke 48 uur de media. Om zeker te zijn van de juiste plaatoriëntatie, wacht u elke keer dat een vat in de machine wordt geplaatst tot de eerste scan is voltooid (als de tijd het toelaat). Het is een simpele fout om te maken. Plaats de plaat zo in de machine dat de letters die de rijen aanduiden zich aan de linkerkant van de baai bevinden.
- Als u scans wilt weergeven, drukt u op de knop Weergave met het oogpictogram en dubbelklikt u vervolgens op het experiment. Overweeg om de media vroegtijdig te veranderen als er een plotselinge verandering in de kleur van de media optreedt (fenolroodhoudende media worden geel door verzuring), als er overtollige dode cellen aanwezig zijn (kan de proliferatie van levende kolonies verstoren), of als er een abnormale morfologie wordt waargenomen.
- Zodra alle putten in rust zijn geworden of samenvloeien, exporteert u het experiment. Volg volwassen kolonies gedurende ~2 weken en neonataal gedurende ~10 dagen, waarna crowding leidt tot afnemende opbrengsten voor de analyses.
- Als u wilt exporteren, klikt u op het tabblad Weergave en dubbelklikt u op het experiment onder de lijst met recente scans (standaard worden ze geordend vanaf de meest recente achteruit). Klik op het pictogram Landschap met de pijl en wacht tot de exporttool wordt gestart.
- Klik op Zoals weergegeven en klik vervolgens op Volgende.
- Klik handmatig op elk veld dat u wilt exporteren en klik vervolgens op Volgende.
- Selecteer of een film of reeks afbeeldingen gewenst is en selecteer vervolgens de scantijden die u wilt exporteren. Gebruik voor het traceren van de afstamming van keratinocyten de filmoptie en selecteer alle scans (er is een snel pictogram Alles selecteren met een stippellijn om dit te versnellen). Klik op Volgende.
- Exporteer met 1 frame per seconde op maximale kwaliteit (stel dit in met behulp van de balk naast kwaliteit). Klik op Volgende.
- Kies de doelmap en het bestandstype. Geef het bestand een naam en klik vervolgens op Exporteren.
OPMERKING: Het kan lang duren, afhankelijk van de snelheid van de internetverbinding en de betrokken computer, om video's te exporteren. Wees bereid om meerdere dagen te wachten om alle videobestanden te exporteren voor grotere experimenten. De mogelijkheid om op afstand in te loggen op de time-lapse-microscoop is uiterst handig.
2. Time-lapse-beeldvorming gebruiken om stambomen te construeren en gegevensbladen te genereren
- Open het videobestand met behulp van een mediaspeler. VLC-mediaspeler wordt aanbevolen.
- Blader door de video's en identificeer groeiende kolonies. Gebruik met VLC de pijltoets om frames vooruit en achteruit over te slaan. Maak een screenshot van de kolonie die gevolgd moet worden en label de kolonie.
- Identificeer een interessante kolonie aan het einde van of na enkele dagen video-opname, spoel de video vervolgens terug en identificeer de kolonievormende cel.
OPMERKING: Dit is waar het belangrijk is om de juiste zaaidichtheid te hebben. Als er te veel kolonies naast elkaar ontstaan, breiden ze zich uit en versmelten ze met elkaar, waardoor het onmogelijk wordt om celdelingen nauwkeurig te volgen. - Wanneer een cel op het punt staat zich te delen, lijkt deze te condenseren (Figuur 1). Pauzeer de video wanneer de splitsing optreedt. Noteer de tijd van de deling (een tijdstempel staat in de linkerbenedenhoek). Maak een screenshot van deze eerste deling en geef het hetzelfde label als de kolonie. Noteer de verdelingen in een met de hand getekend afstammingsdiagram (zie Representatieve resultaten). Ga door met het volgen en documenteren van zoveel mogelijk generaties.
OPMERKING: Geautomatiseerde celtracering is/wordt ontwikkeld om dit proces te versnellenen cellen 7 nauwkeuriger te volgen. Zelfs in kweekomstandigheden met weinig calcium en minimale differentiatie missen machine learning-modellen momenteel de gevoeligheid om keratinocytdelingen nauwkeurig te volgen. - Transcribeer handmatige afstammingsboom in gegevensbladen - zogenaamde "groene vellen" vanwege de kleur in de spreadsheet (aanvullend bestand 1).
- Gebruik de groene bladen om de verhoudingen van proliferatieve en differentiatiedelingen te berekenen, stamcel- en toegewijde voorloperkolonies en de duur van de celcyclus te identificeren (zie representatieve resultaten).
OPMERKING: De machine is in staat om gegevens te analyseren via zijn eigen basis- en cel-voor-cel analysatoren om meerdere andere tests uit te voeren (confluence, scratch). Dit valt echter buiten het bestek van dit protocol.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Primaire keratinocyten groeien op een stereotiepe manier, die kan worden gevolgd via live celbeeldvorming. VLC-mediaspeler wordt gebruikt om opnames te onderzoeken. De tijd tot de eerste deling is variabel en kan meerdere dagen zijn, afhankelijk van de kenmerken van de donor, zoals leeftijd, gezondheidstoestand of de groeifactoren die in vitro aanwezig zijn in de vitro-omgeving . Bij de eerste zaaiing hebben keratinocyten een klein, afgerond uiterlijk (Figuu...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Live cell imaging van keratinocyten is een labelvrije methode om het delingsgedrag van stamcellen en toegewijde voorlopercellen te volgen. Aangezien het onderhoud van de epidermis afhankelijk is van de proliferatiekinetiek van stamcellen en toegewijde voorlopercellen10, vergemakkelijkt een gedetailleerd begrip van de veranderingen in deze keratinocytenpopulaties en hoe ze worden beïnvloed onder verschillende aandoeningen de ontwikkeling van therapieën om ontdekte ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door Merit Review Award Number I01 CX001816 uit de Verenigde Staten (VS) Afdeling Veteranenzaken Klinische Wetenschappen R&D (CSRD) Service. De inhoud vertegenwoordigt niet de standpunten van het Amerikaanse ministerie van Veteranenzaken of de regering van de Verenigde Staten. We danken Dr. Michael Rosenblum voor het feit dat hij ons toegang heeft gegeven tot zijn time-lapse-microscoop om onze experimenten uit te voeren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 96 Well Imagelock plate | Sartorius | BA-04856 | Voorgestelde microplaat compatibel met machine bij gebruik van een 96-well plate. |
| 24 well plate | Corning | 3524 | Voorgestelde microplaat compatibel met machine bij gebruik van een 24-well plate. |
| Amphotericin B, 50 mL | Corning | 30-003-CF | Verdun tot 5x (wordt geleverd in 100x stock) voor 5x PSA - 1x voor media veranderingen |
| Epilife, 50 mL | Gibco | MEP1500CA | Voeg S7 toe, overweeg primocin |
| IncuCyte S3 | Sartorius | 4637 | Imager (Zoom/SX5 acceptabele alternatieven) |
| Penicillin/Streptomycin, 100 mL | Corning | 30-002-Cl | Verdun tot 5x (wordt geleverd in 100x stock) |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-05 | 1 mL per 500 mL media |
| Supplement S7 | Gibco | S0175 | Toegevoegd aan epilife |
Referenties
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. Int J Mol Med. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Handl, J., Čapek, J., Majtnerová, P., Báčová, J., Roušar, T. The effect of repeated passaging on the susceptibility of human proximal tubular HK-2 cells to toxic compounds. Physiol Res. 69 (4), 731-738 (2020).
- Moran, M. C., et al. Characterization of human keratinocyte cell lines for barrier studies. JID Innov. 1 (2), 100018(2021).
- Seo, M. -D., Kang, T. J., Lee, C. H., Lee, A. -Y., Noh, M. HaCaT keratinocytes and primary epidermal keratinocytes have different transcriptional profiles of cornified envelope-associated genes to T helper cell cytokines. Biomol Ther. 20 (2), 171-176 (2012).
- Jahn, M., et al. Different immortalized keratinocyte cell lines display distinct capabilities to differentiate and reconstitute an epidermis in vitro. Exp Dermatol. 33 (1), e14985(2024).
- Xiao, T., et al. Short cell cycle duration is a phenotype of human epidermal stem cells. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 76(2024).
- Hirose, T., Kotoku, J., Toki, F., Nishimura, E. K., Nanba, D. Label-free quality control and identification of human keratinocyte stem cells by deep learning-based automated cell tracking. Stem Cells. 39 (8), 1091-1100 (2021).
- Roshan, A., Murai, K., Fowler, J., Simons, B. D., Nikolaidou-Neokosmidou, V., Jones, P. H. Human keratinocytes have two interconvertible modes of proliferation. Nat Cell Biol. 18 (2), 145-156 (2016).
- Abegaze, B., Ijeh, N., Vittimberga, B., Ghadially, R. Generating primary cultures for the purpose of keratinocyte live cell imaging. J Vis Exp. , In Press (2024).
- Piedrafita, G., et al. A single-progenitor model as the unifying paradigm of epidermal and esophageal epithelial maintenance in mice. Nat Commun. 11 (1), 1429(2020).
- Ścieżyńska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).
- Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochem Biophys Rep. 26, 100987(2021).
- Malin-Mayor, C., et al. Automated reconstruction of whole-embryo cell lineages by learning from sparse annotations. Nat Biotechnol. 41 (1), 44-49 (2023).
- Waliman, M., et al. Automated cell lineage reconstruction using label-free 4D microscopy. Genetics. 228 (2), iyae135(2024).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
