Karakterisering van pH-afhankelijke omkeerbare zelfassemblage van amyloïde bèta-1-40-gecoate goudcolloïden

Samenvatting

Hier presenteren we een systematische methode die de quasi-omkeerbare zelfassemblage van de amyloïde bèta 1-40 (Aβ _1-40)-gecoate 20 nm goudaggregaten beschrijft. Het nano-grootte-afhankelijke quasi-omkeerbare netwerk tussen peptiden was gecorreleerd met specifieke aminozuren of secties van het Aβ _{1-40-monomeer}.

Samenvatting

De karakterisering van Aβ _1-40 gecoat over de nano-goud colloïdale deeltjesoppervlakken werd uitgevoerd met behulp van oppervlakteplasmonresonantie (SPR) spectroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). De waargenomen pH-afhankelijke verschuiving van de SPR-band van Aβ _1-40-gecoate 20 nm gouddeeltjes was gecorreleerd met afwisseling van aggregatie en desaggregatie waargenomen in de TEM-beelden. Een pH van ~4 induceerde een ongevouwen conformatie en een pH van ~10 induceerde een gevouwen conformatie van Aβ _1-40 op het goudoppervlak. Dit omkeerbare aggregatieproces werd waargenomen door Raman-beeldvorming toen de pH geleidelijk werd gewijzigd van pH 4 naar pH 10. We zagen een pH-afhankelijke morfologische verandering in Aβ _1-40 op het goudoppervlak, waar heldere aggregaten werden waargenomen bij pH 4. We hebben echter zeer subtiele verschillen waargenomen in het spectrum van oppervlakte-versterkte Raman-spectroscopie (SERS) tussen pH 4- en pH 10-omstandigheden, met als meest opvallende verschil de spectrale dichtheid in het gebied van 250 ^cm-1 en 1750 ^cm-1. In het bijzonder gaf de modusanalyse van de omkeerbare aggregatie aan dat de aggregaten werden gevormd door de ongevouwen conformatie van Aβ _1-40, waarbij de benzeenringsectie van tyrosine en fenylalanine betrokken was. Omgekeerd werd de demontage van de aggregaten geassocieerd met conformationele veranderingen in de eiwitvouwing van Aβ _1-40 waarbij histidine, glutamine, methionine en asparaginezuur betrokken waren.

Inleiding

De fibrillogenese van amyloïde bèta 1-40 (Aβ _1-40) of 1-42 (Aβ _1-42) peptiden is uitgebreid onderzocht als een cruciaal onderdeel bij de vorming van amyloïde plaques die een oorzaak zijn van de ziekte van Alzheimer 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ^,11. Het sleutelmechanisme bij fibrillogenese is een oligomerisatie van Aβ _1-40 of Aβ _1-42 peptiden om een neurotoxisch eiwitaggregaat te vormen, en er is uitgebreid onderzoek gedaan om de mechanismen te begrijpen van hoe monomeren de oligomeren vormen 12,13,14. We hebben een benadering gevolgd om amyloïdogene peptiden te onderzoeken die aggregaten vormen over een nano-goudoppervlak en factoren te identificeren die verantwoordelijk zijn voor het netwerken tussen peptiden die zich buiten het goudoppervlak bevinden 15,16,17,18,19,20,21,22.

Aβ _1-40 nemen een ongevouwen conformatie (A) aan onder zure omstandigheden (pH ~4) en een gevouwen conformatie (B) onder basische omstandigheden (pH ~10). We zagen gedispergeerde Aβ _1-40-gecoate goudcolloïde deeltjes bij pH ~10 en grote Aβ _1-40-gecoate goudcolloïde aggregaten bij pH~4 (Figuur 1)^23,24. De ongevouwen conformatie van Aβ _1-40, bij zure omstandigheden, bevordert peptidenetwerken tussen de Aβ _{1-40-monomeren} over het oppervlak van goud-nanodeeltjes, wat resulteert in de vorming van goudcolloïde aggregaten (zie A in figuur 1). Wanneer het Aβ _{1-40-monomeer} de gevouwen conformatie op een basische of neutrale pH, Aβ _1-40, houdt, netwerken de monomeren niet in aggregaten en blijven de gecoate gouden nanodeeltjes over als individuele verspreide deeltjes (zie B in figuur 1). We kunnen daarom het proces ondervragen van hoe Aβ _{1-40-peptiden} conformationele veranderingen ondergaan in netwerken en aggregaten vormen door de SPR-bandverschuiving te meten over een reeks pH-omstandigheden 25,26,27,28,29,30,31.

We hebben verschillende groottes gouden nanodeeltjes getest en ontdekten dat het 20 nm gouden colloïde het meest prominente omkeerbare zelfassemblageproces van Aβ _{1-40-monomeren} vertoonde als reactie op een externe verandering in pH (Figuur 2). Dit is een duidelijke indicatie van een omkeerbare verandering in peptideconformatie, waarbij zure omstandigheden (A) een ongevouwen conformatie induceren, waardoor de netwerking wordt versterkt en leidt tot de aggregatie van goudcolloïden. De basisvoorwaarde (B) bleek een gevouwen conformatie van monomeren 26,27,28,29,30,31 te induceren.

Protocol

1. Preparaat van Aβ _1-40 gecoate gouden nanodeeltjes

1. Voeg een volume van 1 ml gedestilleerd gedeïoniseerd water toe aan 1 mg gevriesdroogd Aβ _1-40 (MW: 4,2 kDa, 98% HPLC-zuiverheid) met behulp van een injectiespuitnaald. Meng de oplossing met een vortexmixer gedurende ongeveer 30 s en zorg ervoor dat er bij kamertemperatuur (RT; ~20 °C) geen vaste deeltjes in de oplossing worden waargenomen.
   1. Bereid alle voorraadoplossingen met gedeïoniseerd en gedestilleerd water (~18 MΩ·cm).
   2. Identificeer spectroscopisch de concentratie met behulp van tyrosine-absorptie bij 275 nm³², die een moleculaire extinctiecoëfficiënt ε₂₇₅ van 1390 ^cm-1· heeft ^M-1.
   3. Bewaar voorraadoplossingen van Aβ _1-40 bij -80 °C. (Zie tabel van materialen voor de handelsproducten van Aβ _1-40.)
2. Ontdooi de peptidevoorraadoplossing ongeveer 5 minuten voor het verzamelen van de gegevens. Meng een volume van 8 μl van de peptideoplossing met 800 μl gouden colloïdale deeltjes in een centrifugebuis van 15 ml. Voeg een volume van 4,2 ml gedeïoniseerd gedestilleerd water toe en draai het monster vervolgens gedurende 10 s 30,31,33,34.
3. Stel de concentratie van Aβ _1-40 peptiden vast op 1,8 nmol en bereik de verhouding van Aβ _1-40 peptiden. Het aantal goudcolloïden varieerde van ~500:1 tot ~2000:1²⁵.

2. Iteratieve pH-verandering en monitoring van de bijbehorende SPR-bandverschuiving

1. Stel de temperatuur van de oplossing in op een bepaalde waarde (bv. 25 °C) met behulp van de temperatuurregeleenheid van de ultraviolet-zichtbare-nabij-infrarood (UV-Vis-NIR) spectrofotometer.
2. Controleer de initiële pH van de monsteroplossing met behulp van een pH-meter en stel deze in op iets onder pH 7. Verzamel het absorptiespectrum in het bereik tussen 400 nm en 1000 nm.
3. Verander de pH van het monster in ~pH 4 (d.w.z. pH 4.0 ± 0.3) door 10 μL-volumes van 0.1 M HCl toe te voegen en verzamel het absorptiespectrum tussen 400 nm en 1000 nm.
4. Verander de pH van het monster in ~pH 10 (d.w.z. pH 10 ± 0,3) door 10 μL volumes van 0,1 M NaOH toe te voegen en verzamel het absorptiespectrum tussen 400 nm en 1000 nm.
5. Verander de pH tussen pH 4 en pH 10 met HCl en NaOH 10 keer en verzamel het absorptiespectrum continu bij 25 ± 0,2 °C^29,30.
   OPMERKING: Voor alle monsteroplossingen werd de optische dichtheid van de piek van de SPR-band rond de 0,2 gehouden. Er wordt een buffereffect verwacht als gevolg van de resterende bufferoplossing in een oplossing. De uiteindelijke pH-waarde werd dus bepaald nadat het evenwicht was bevestigd. De pH-waarde werd direct gemeten in een monstercuvettencel met behulp van een micro-pH-elektrode, die een nauwkeurigheid heeft van ±0,005 pH.
6. Verkrijg de Amerikaanse standaardcode voor informatie-uitwisseling (ASCII) dataset van golflengten als functie van absorptie. Extraheer de gemiddelde positie van bandpieken met behulp van het Peak Fit-programma .
   1. Plot de gegevensset om de optische dichtheid weer te geven als een functie van de golflengte (nm) met behulp van de functie Plot .
   2. Markeer de initiële piekgolflengten λ₁, λ₂ en λ₃ door hun geschatte posities in de geplotte gegevens te selecteren en de gegevens aan te passen met behulp van de RUN-functie .
   3. Verkrijg de grafiek met de centrale piek van elke (λ_i), XC_i, met de oppervlakte van elke band (A_i).
7. Exporteer de geëxtraheerde piekposities en -gebieden naar een spreadsheetprogramma en bereken de gemiddelde piekpositie bij een bepaalde pH.
   1. Bepaal de wegingsfactor a_i van elk piekcentrum λ_i door de oppervlakte van de band (A_i) te vergelijken met de totale oppervlakte van de hele banden als: .
   2. Extraheer de gemiddelde piekpositie, (pH) met behulp van Eqn. (1).
      (1)
8. Genereer een omkeerbaarheidsgrafiek met behulp van het volgende proces:
   1. Maak een tabel van de gemiddelde piekposities, , als functie van elk "bewerking"-getal, n als vs. n. Maak het werkingsgetal, n, 1 voor het monster vóór de toevoeging van zuur bij ~pH 7. Verhoog het werkingsgetal elke keer met 1 en verander de pH in ~pH4 met HCl of pH in ~pH 10 met NaOH. Zorg ervoor dat n gelijk is in een zure toestand (d.w.z. ~pH 4) en oneven als een basische toestand (d.w.z. pH 10).
   2. Analyseer de piekpositie op elke n, (n) = λ(n), met behulp van de formule³⁰
      (2)
      OPMERKING: Vertegenwoordig een initiële gemiddelde piekpositie op n = 1 door A. Druk de parameters B en C uit als de n-afhankelijke piekpositieverschuiving. Maak de parameter D als een amplitude van de dempingsfactor, E, van herhaling. Gebruik de sinusfunctie om de golving van de piekpositie weer te geven als een functie van n.
   3. Transporteer de dataset van (x, y) naar de Origin-software en plot.
   4. Vorm de aangepaste functie gegeven in Eqn. (2) onder Niet-lineaire curve-aanpassingsfunctie van analyse. Typ de initiële A-, B-, C-, D- en E-waarden en klik op UITVOEREN om de aanpassing te voltooien.
9. TEM-beeldvorming
   1. Maak de TEM-monsters van de Aβ _1-40-gecoate 20 nm goudcolloïden met Formvar-gecoate koperen roosters. Onderzoek de monsters met een TEM die werkt op 80 kV.
   2. Verzamel afbeeldingen met een nominale vergroting van 28.000x of 71.000x op een model XR-40 4-megapixel CCD digitale camera (AMT). Verzamel de TEM-beelden voor Aβ _1-40-gecoat 20 nm goud bij elk bewerkingsnummer n = 1 (~pH 7), n = 2, 4, 6, 8 en 10 (pH 4) en n = 3, 5, 7 en 9 (pH 10).

3. Raman-beeldvorming en onderzoek van de omkeerbare aggregatie

1. Breng voor elk monster 100 μl oplossing aan op een micaschijf (diameter van 1 cm) met bewerkingsnummer n. Droog de monsters een nacht voor de meting.
2. Verzamel witlichtbeelden bij elk bewerkingsnummer n. Bereid het afzonderlijke monster op een micaschijf, aangezien de pH continu werd gewijzigd tussen ~pH 4 en ~pH 10 voor elk bewerkingsnummer n (Figuur 3).
3. Verzamel het Raman-beeld bij elk operatienummer n met een laser met een golflengte van λ = 633 nm bij 0,5 ± 0,05 mW vermogen met een ruimtelijke resolutie van ~0,43 μm in een raster bestaande uit 100 × 100 pixels met een integratietijd van 500 ms/spectrum voor het gebied tussen ~200 ^cm-1 en ~2.800 ^cm-1 (Figuur 4).
4. Zet het representatieve spectrum voor elke uitgelijnde n uit als een functie van n en construeer het driedimensionale SERS-spectrum als een functie van n voor Aβ_1-40 gecoat 20 nm goud (Figuur 5A). Gebruik het bovenaanzicht van het driedimensionale SERS-spectrum als contourkaart (Figuur 5B) om de specifieke modi te extraheren die verband houden met een bepaalde pH-conditie (d.w.z. ~pH 4 en ~pH 10). Extraheer alle spectrale kenmerken die zijn verbeterd voor ofwel bij slechts n_even of bij slechts n_oneven.

Resultaten

Met de aanhechting van Aβ _1-40 op het oppervlak van gouden nano-colloïdale deeltjes, verschoof de SPR-band rond het absorptiemaximum van 530 nm aanzienlijk naar de piekpositie van ~650 nm toen de oplossing zuurder werd gemaakt (pH 4)³⁵. Samen met TEM-beelden hebben we vastgesteld dat spectroscopische kenmerken waargenomen bij pH 4 overeenkomen met de vorming van de goudcolloïde aggregaten met plausibel ontvouwde conformatie en netwerken met de omringende ongevouwen Aβ _1-40 monomeren die over het goudoppervlak³⁰ zijn geadsorbeerd. We zagen dat de Aβ _1-40 monomeren onder basische (pH 10) omstandigheden terugkeren naar de gevouwen conformatie, wat resulteert in een vervorming van de aggregaten op een quasi-omkeerbare manier. Dit quasi-omkeerbare proces bleek uit de afwisseling van de gemiddelde bandpiek ((n)), die verschoof tussen een kortere en langere golflengte, en de gedispergeerde vs. geaggregeerde morfologie in TEM-beelden tussen basische (pH = 10) en zure (pH = 4) omstandigheden. Eerder is waargenomen dat een deel van het Aβ _{1-40-monomeer} ongevouwen blijft, zelfs nadat de oplossing was teruggebracht naar basisomstandigheden³⁶. Video 1 toont de pH-afhankelijke kleurverandering van Aβ _1-40 en 20 nm blank goudcolloïde.

Ter vergelijking werd het pH-hoponderzoek van 20 nm blank goudcolloïde uitgevoerd (Figuur 5C en D). Naarmate de pH-verandering vorderde, toonde het de groei van de clusterisatie van de goudcolloïden in SPR band shoft, TEM-beelden en witlichtbeelden. Interessant genoeg waren er verschillende SERS-spectraallijnen, afhankelijk van n_oneven en n_even. Bijvoorbeeld, bij n_even (pH ~4), werd de lijn op 275 ^cm-1, die werd toegewezen als de modus geassocieerd met Au_n (n = 5, 6, 12, 16, 20, 58)³⁷ of modus van Au-Cl-ligand³⁸, intensief geobserveerd. Aan de andere kant, voor n_even, op 1008 ^cm-1 C-N str werd waargenomen³⁹ en CH₂ wag³⁹, CH₂ vervorming⁴⁰ werd uitgebreid waargenomen op 1291 ^cm-1.

In tegenstelling tot de duidelijke pH-afhankelijke en omkeerbare aggregatiemorfologie die wordt waargenomen door witlichtbeeldvorming, waren er relatief subtiele verschillen in de spectrale kenmerken in het SERS-spectrum tussen n_oneven en_{n even}. Als een eerste benadering was de spectraallijndichtheid in het gebied tussen 250 ^cm-1 en 1750 ^cm-1 hoger voor n_oneven dan_{n even}. De spectraallijnen in het vingerafdrukgebied, 1250 cm-1 en 1750 ^cm-1 (Amide I-, II- en ^III-banden) voor n_oneven, vertoonden minder opgeloste spectrale kenmerken, wat een verbreding of toename van de spectrale dichtheden impliceert. In Figuur 6 werd een contourkaart gegeven in Figuur 5B (Figuur 6B) georganiseerd met de SERS-signalen op 761 ^cm-1 (rood) en 1395 ^cm-1 (blauw), die de accenten op respectievelijk n_oneven en n_even vertegenwoordigen (Figuur 6C). Als een representatief SERS-spectrum voor n_oneven en n_even, wordt het SERS-spectrum op n = 7 (rood) en n = 4 (blauw) bovenaan weergegeven (Figuur 6A). Om de overeenkomst met de SPR-bandverschuiving voor Aβ_1-40 gecoat 20 nm goud weer te geven, wordt de bandverschuivingsgrafiek in Figuur 3 aan de zijkant weergegeven (Figuur 6D).

Hoewel we voorlopige gegevens hebben over de volledige toewijzing van het waargenomen SERS-spectrum, merken we hier verschillende opmerkelijke Raman-verschuivingskenmerken op. De spectraallijnen en (plausibele toewijzingen) versterkt in n_oneven bevinden zich voornamelijk in het gebied lager dan 1000 ^cm-1: 394 ^cm-1 (Trp)41,42,43, 761 ^cm-1 (His, Ala)39,44,45,46,47, 875 ^cm-1 (indool NH-verplaatsing, C-C rekking van Met)³⁹, 974 ^cm-1 (Glu, C-COO^- uitrekken van Asp, modus geassocieerd met citraat)39,48,49. De Raman-verschuiving versterkt bij n vertoonde_zelfs significante spectroscopische kenmerken in het vingerafdrukgebied (Amide I, II en III): 1166 ^cm-1 (N-H⁺ vervorming van Tyr)^39,41, 1227 ^cm-1 (Ala-Pro-Gly, Amide III)39,50,51, 1395 ^cm-1 (COO^- symmetrische rekking of CH₂- CH₃- knippen van Glu)^39,48, 1585 ^cm-1 (ring CC uitrekking van Phe, asymmetrische uitrekking van carboxylaat -Au, COO^- uitrekking van citraat, vervorming van benzeenring)39,41,45,46,47,49,52, 1592 ^cm-1 (Phe, Tyr, C = C uitrekking van Tyr, CC uitrekking van ring in Phe, uitrekking van benzeenring en COO- uitrekking in Phe en Tyr, en asymmetrische rekking van OH)39,41,48,50,51 en 1628 ^cm-1 (Amide I subpiek onderscheidend voor intermoleculaire β-sheet structuren⁵³, C=O en de gekoppelde CN/NH vibrationele modi van de eiwitruggengraat afkomstig van parallelle β-sheet type structuren, accumulatie van geaggregeerde Aβ⁵⁴, willekeurige spoelen, β-bochten, β-haarspeldbochten⁴⁸. De reeksen die verschijnen voor n_oneven of n_even worden weergegeven in Figuur 7. Over het algemeen waren voor n,_zelfs overeenkomend met de omkeerbare aggregatie of ongevouwen conformatie van Aβ _1-40, Phe/Tyr bevattende benzeenring, symmetrische rekking van COO^-, CH₂- CH₃- schaarmodus van Glu en -NH⁺ vervorming van Tyr significant betrokken bij de conformatieverandering van het peptide. Tijdens de demontage van de aggregatie die werd waargenomen wanneer peptiden de gevouwen conformatie aannamen die overeenkwam met de modi die prominent aanwezig waren bij n_oneven, bleken Glu, Asp, Met, His en Ala betrokken te zijn.

Figuur 1: De pH-afhankelijke absorptie en morfologie. Het absorptiespectrum bij pH 4 (A) en pH 10 (B) voor Aβ _1-40 gecoate gouden nanodeeltjes (20 nm), en de bijbehorende TEM-beelden, schetsen van aggregatie/gedispergeerde deeltjes en foto's van oplossingen in flesjes worden getoond. A is de ongevouwen conformatie van Aβ _1-40 monomeren onder zure omstandigheden, en B is de gevouwen conformatie onder basische omstandigheden. Diagrammen van Aβ _1-40 monomeren in elke conformatie en aggregatie/disperse morfologieën worden getoond naast de TEM-beelden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Omkeerbaarheid van nano-grootte en zelfassemblage. De verschuiving van de gemiddelde piekpositie van de SPR-band, , als functie van het werkingsnummer, n, voor alle geteste groottes van gouden colloïde deeltjes. De geschatte pH-waarden en het overeenkomstige stadium van de aggregaten in figuur 1 worden ook gegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: en TEM/witlichtbeelden bij elk bewerkingsnummer. De als functie van het operatienummer, n, werd samen uitgezet voor Aβ _1-40 gecoat 20 nm goud (gesloten cirkels) en 20 nm goudcolloïde (open cirkels) en wordt weergegeven met representatieve TEM (A en C)/witlichtbeelden (B en D) bij geselecteerde bewerkingsnummers (n = 1, 2, 3, 7 en 8 gemarkeerd met gedecodeerde pijlen) voor Aβ _1-40 gecoat 20 nm goud (A en B) en 20 nm goudcolloïde (C en D). Zwart lettertype geeft pH 7 aan, blauw lettertype geeft pH 4 aan en rood lettertype geeft pH 10 aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatief wit licht en Raman-beeld. Het witlichtbeeld, het Raman-beeld en het SERS-spectrum voor (A) n = 2 en (B) n = 3; i) witlichtbeeld in een breed gezichtsveld, ii) witlichtbeeld in het gebied waar het Raman-beeld is verzameld (aangeduid met een rood vierkant in i)), iii) het Raman-beeld van twee componenten gecombineerd, iv) Raman-beeld van component 1 en zijn v) SERS-spectrum van iv), vi) Raman-beeld van component 2, en vii) SERS-spectrum van vi). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Contourkaart van het SERS-spectrum voor n_oneven, n_even en n_allen. (A) De driedimensionale kaart van het SERS-spectrum in het gebied van 250 ^cm-1 en 1750 ^cm-1 als functie van n voor Aβ_1-40 gecoat 20 nm goud met een contourkaart weergegeven in (B) aan de bovenkant. (C) De driedimensionale kaart van het SERS-spectrum in het gebied van 250 ^cm-1 en 1750 ^cm-1 als functie van n voor 20 nm goud met een contourkaart weergegeven in (D) aan de bovenkant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Contourkaart van SERS Spectrum. De contourkaart van het SERS-spectrum als functie van n (1-10). (A) Absorptie bij 1395 ^cm-1 (blauw) en 761 ^cm-1 (rood). (B-D) Het onderste paneel toont het SERS-spectrum en het rechterpaneel toont de amplitude van de signaalintensiteitsverandering van SERS-signalen bij elke n. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Opmerkelijke sequenties van Aβ_1-40. De sequenties die zijn toegewezen om significante betrokkenheid te hebben bij n_oneven (overeenkomend met de vorming van gevouwen conformatie) worden aangegeven door neerwaartse rode pijlen, en die toegewezen om significante betrokkenheid te hebben bij n_even (overeenkomend met de vorming van ongevouwen conformatie) worden aangegeven door blauwe pijlen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1: pH-afhankelijke kleurverandering van Aβ_1-40 en 20 nm blank goudcolloïde. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussie

Een kritische overweging bij onderzoeken naar peptideconformatie is het onderhoud van monsters, aangezien monsters zullen verslechteren als ze niet op de juiste manier worden bewaard. De peptidemonsters werden ontvangen in een gevriesdroogde vorm en begonnen te denatureren zodra ze waren gerehydrateerd met gedestilleerd gedeïoniseerd water, zelfs als ze bij -80 °C werden bewaard. De zuiverheid van de goudcolloïden werd geverifieerd door middel van kwaliteitscontroleanalyse. Om de stabiliteit van de colloïden te behouden, werden ze bij 4 °C bewaard en niet ingevroren. De goudcolloïde-oplossingen werden voor elk experiment vers bereid omdat de zoutbufferoplossing het goudcolloïde zou destabiliseren. HCl- en NaOH-oplossingen werden voor elk experiment vers bereid.

De technische uitdagingen van het handmatig aflezen en registreren van de pH van de oplossing met delicate instrumenten terwijl de pH tussen 4 en 10 wordt gewijzigd, beperken de precisie van onze gerapporteerde resultaten. We hebben dus geen consistente resultaten waargenomen in de intensiteit van de SERS-signalen. Dit introduceerde waarschijnlijk een fout in de amplitude die werd gebruikt voor de contourgrafiek. Toekomstig werk om de modi geassocieerd met n_even of n_odd te verifiëren, zou mutaties kunnen introduceren om de aminozuren in de Aβ _{1-40-sequentie} te vervangen waarvan we melden dat ze betrokken zijn bij de conformationele verandering van het eiwit, zoals de enkele tyrosine- of asparagineresiduen.

"De interactie tussen Aβ_1-40 monomeer en het goudoppervlak wordt beschouwd als dipoolinteractie, en het niveau van waterstofbruggen werd verondersteld in werk van H. Schmidbauer et ^al.55. In een afzonderlijk werk hebben we SERS-spectroscopie onderzocht als functie van de hoeveelheid Aβ_1-40 onder de zure omstandigheden, het extraheerde de nanogrootte-afhankelijke adsorptieformatie⁵⁶. Voor 20 nm goud werd gespeculeerd dat C=C of -C-N binding van histidine (His) de adsorptie op gang zou brengen; voor 80 nm goud bereikte echter een benzeenringademhalingsmodus van fenylalanine (Phe) of tyrosine (Tyr) het goudoppervlak om de adsorptie op gang te brengen. Het adsorptieproces van Aβ_1-40 over het goudoppervlak onder neutrale of basische omstandigheden (pH ~10) werd geacht het Aβ_1-40 gecoate goudcolloïde als hydrofiel te behouden, aangezien er geen neerslag werd gevormd in de waterige toestand. De neerslag werd echter waargenomen bij pH 4, wat impliceert dat de aggregaten hydrofoob waren.

De TEM-beelden en witlichtbeelden tonen slechts indirect bewijs van de aggregatie. We hebben geprobeerd circulaire dichroïsme (CD) spectroscopie uit te voeren om de morfologie die is waargenomen in de omkeerbare aggregatie te correleren met de secundaire structuren. De verstrooiende basislijnen verhinderden ons echter om reproduceerbare CD-signalen te verkrijgen. In plaats daarvan gebruikten we daarom Raman-spectroscopie, waarbij we ons meer richtten op de modi die werden versterkt wanneer aggregatie (ongevouwen conformatie van Aβ_1-40) plaatsvond onder pH ~4 of wanneer desaggregatie (ongevouwen conformatie van Aβ_1-40) onder pH ~10. De beste speculatie voor het identificeren van de secundaire structuur in dit werk was dus beperkt tot het monitoren van de knooppunten die verband houden met de secundaire structuren. Dit werd aangetoond in de waarneming van de β-sheet op 1628 ^cm-1, vooral onder pH 4-conditie.

Deze studie observeerde alleen de verandering in peptideconformatie voor de goudcolloïden met een diameter van 20 nm en onderzocht alleen n tot 10. De conformatie- en aggregatie-eigenschappen van het Aβ _1-40-peptide kunnen worden gewijzigd door de grootte van het deeltje dat ze adsorberen tot⁵⁶. Daarom is er meer werk nodig om de eigenschappen van de peptiden te begrijpen die gebaseerd zijn op netwerken tussen monomeren en die welke worden beïnvloed door de fysische kenmerken van het adsorptieoppervlak. Onder de omstandigheden die we hebben getest, vertoonden alleen de gouden colloïden met een diameter van 20 nm omkeerbaarheid van de aggregatiemorfologie, en de mechanismen van hoe de colloïddiameter de omkeerbaarheid van deze eigenschap beïnvloedt, zijn niet bekend. Het verhogen van n tot 20 zou meer inzicht kunnen geven in de modusafhankelijke mate van de omkeerbaarheid van de aggregatiemorfologie. Dit onderzoek naar de invloed van de grootte van het goudcolloïde op de aggregatie van amyloïde bèta-peptiden zal belangrijke inzichten opleveren in de moleculaire mechanismen van de pathologie van de ziekte van Alzheimer.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Amyloid beta peptide 1-40 (Aβ1–40 peptide)	r-Peptide (Bogart, GA, USA)	A-1156-2
CCD digitale camera	AMT	XR-40 4-megapixel CCD
Gedestilleerd gedeioniseerd water uit Milli-Q- watersysteem	Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)	Milli-Q IQ 7000
Vrieskast -86 oC	Thermo Scientific	Revco Chilly Willy  RLE Series Unit ID 187004 Build Number 40.04
Goudcolloïd (10 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15703-20
Goudcolloïd (100 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15711-22
Goudcolloïd (15 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15704-20
Goudcolloïd (20 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15705-20
Goudcolloïd (30 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15706-21
Goudcolloïd (40 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15707-21
Goudcolloïd (50 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15708-21
Goudcolloïd (60 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15709-22
Goudcolloïd (80 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15710-22
Mica-schijven van de hoogste kwaliteit V1AFM 10 mm	Ted Pella Inc.	#50
Hydrochloorzuur standaardoplossing, 1.0 N	Fluka	Lot# SHBB4705V     318949-2L
Macro kwarts quvette Lichtpad 10 mm	Fire Fly Science	Type1-MC-Path10mm
Micro pH-elektrode	HORIBA	Model 9618S (MFG No. 9Y8E0050)
Peak Fit-programma	Origin (Northampton, MA, USA)	OriginPro2018b (64-bit) b9.5.5.409 (Academic)
pH 4.00 Bufferoplossing	VWR	Cat No. 34170-127
pH 7.00 Bufferoplossing	Fisher Chemical	SB107-4 Lot 191041
pH-meter	HORIBA	Model F-72G (MFG No. B27M0017)
Pipet tips   Maxi tips 1–5 mL	Fisher	02-707-467
Pipet tips 10 mL	Fisher	02-717-135
Pipet tips 1000 mL	Fisher	02-717-156
Pipet tips 1–200 mL	Fisher	02-717-143
Pipettor Fisher Brand Elite 0.5–5 mL	Fisher	QU05317
Pipettor Fisher Brand Elite 100–1000 mL	Fisher	QU01672
Pipettor Fisher Brand Elite 10–100 mL	Fisher	MU10985
Pipettor Fisher Brand Elite 1–10 mL	Fisher	MU08178
Natriumhydroxideoplossing 1.0 M	Fluka	Lot#05096BPV   319511-2L
TEM	FEI Co	Morgagni model 268
TempAssure PCR-buizen, platte doppen, natuurlijk	USA Scientific		polypropylene. 0.2 mL individuele dunne wandbuizen met aangehechte matte platte doppen
UV-Vis-NIR spectrofotometer	Varian	CARY 5000 UV1106M074
WI Tec alpha300R Confocal Raman-microscoop	WITec-Oxford Instrument	XMB3000-3001