Methodenartikel

Isolatie en identificatie van bacteriestammen uit de huid van terrestrische amfibieën

DOI:

10.3791/67862

⸱

17 juni 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life, Health, and Environmental Sciences (MeSVA), University of L'Aquila

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit is een methode voor het bemonsteren en isoleren van kweekbare bacteriën uit de huidmicrobiota van Europese plethodontide salamanders (geslacht Speleomantes). Hier presenteren we een protocol voor het bemonsteren van salamanderhuid met wattenstaafjes en het verwerken ervan met behulp van kweekbare benaderingen. We beschrijven bemonstering, isolatie en vestiging van axenische cultuur met karakterisering van bacteriestammen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De microbiota is een essentieel element van hogere organismen, waarbij de huidmicrobiota aanzienlijk bijdraagt aan de afweer van het organisme tegen externe factoren. Er is geen standaardmethode om de microbiële gemeenschappen van Speleomantes (Amphibia: Plethodontidae) te bemonsteren voor de microbiële kweekbenadering. Om dit aan te pakken, hebben we een praktisch protocol ontwikkeld voor het isoleren van bacteriën uit de huid van individuen en een best practice voor het hanteren en bewaren van monsters. De stappen zijn eenvoudig: wattenstaafjes worden bij bemonstering bewaard in een fysiologische zoutoplossing aangevuld met glycerol. Eenmaal overgebracht in het laboratorium, kunnen wattenstaafjes maximaal 10 dagen bij +4 °C worden bewaard om de integriteit van de microbiële gemeenschap te waarborgen. Deze studie biedt interessante inzichten in het cutane microbiota-onderzoek van terrestrische amfibieënsoorten, zoals die behoren tot het geslacht Speleomantes. Deze aanpak draagt bij aan het implementeren, monitoren en behouden van maatregelen voor bedreigde diersoorten en kan de kennis van de functie van microbiota in de gezondheid en ecologie van amfibieën verbeteren. Dit protocol kan ook een bredere betekenis hebben voor microbioomonderzoek in veel scenario's voor natuurbehoud.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle organismen herbergen een verscheidenheid aan microbiële symbionten op hun epitheeloppervlakken, weefsels en organen1. De huid is de primaire interface tussen de gastheer en zijn omgeving en biedt een habitat voor diverse micro-organismen2. De huid is het grootste orgaan van gewervelde dieren en fungeert als een barrière tegen mechanische, chemische en microbiële agressies3. Deze brede blootstelling van de huid aan omgevingsomstandigheden maakt het echter waarschijnlijk de meest kritieke ecologische grens die de interactie van het organisme met externe biotische en abiotische factoren bemiddelt4.

De huidmicrobiota van amfibieën is de afgelopen tien jaar intensief bestudeerd en de relatie tussen deze microbiële gemeenschap en haar gastheer is diepgaand onderzocht 5,6,7,8,9,10. De biodiversiteit van de huidmicrobiota wordt grotendeels bepaald door het type gastheer (d.w.z. soortspecifieke gemeenschap), maar andere omgevingsfactoren kunnen een hogere interspecifieke diversiteit bevorderen11. De huidmicrobiota van amfibieën heeft een kenmerkende samenstelling ten opzichte van andere dieren. Het is bekend dat van amfibieën is aangetoond dat ze een mutualistische relatie hebben met hun huidmicroben, in staat zijn om antimicrobiële verbindingen te biosynthetiseren of hun gastheer te beschermen tegen opkomende infectieziekten12.

De isolatie van bacteriën van de huid wordt meestal bereikt na het voltooien van verschillende stappen. De eerste stap omvat het verkrijgen van een representatieve monsterafname door middel van wattenstaafjes en het vermijden van externe besmetting. De microbiële monsters worden gesuspendeerd in steriele zoutoplossing of buffer. Het aanvullen van suspensievloeistoffen met beschermingsmiddelen (bijv. glycerol) kan de integriteit van de bacteriële gemeenschap tijdens laboratoriumoverdracht verbeteren13,14. Eenmaal overgebracht naar het laboratorium, kunnen monsters onmiddellijk of na korte tijd worden verwerkt om de integriteit van de microbiële gemeenschap te behouden. De klassieke microbiële benadering omvat monsterverwerking door seriële verdunning om de microbiële dichtheid te verminderen en te zorgen voor een betere scheiding van kolonies op de petripplaten. Monster- en seriële verdunningen worden vervolgens gestreept op niet-specifieke, niet-selectieve media zoals agar Luria-Bertani (LBA)15, tryptische soja (TSA)16, tryptongistextract agar (TYEA)17,18,19 of voedingsstof (NA)20 die de groei van een breed scala aan bacteriën ondersteunen. Niet-selectieve verrijkingen tijdens bemonstering en verwerking worden gebruikt, omdat het nodig is om een breed scala aan microben te kweken. De streak- of spreadplate-methoden verdelen de microbiële suspensie gelijkmatig over het agaroppervlak21. Door de gelijkmatige verdeling kunnen verschillende microbiële soorten die in het monster aanwezig zijn, verschillende kolonies vormen. Na incubatie bij 20-37 °C gedurende 2-7 dagen worden de microbiële kolonies geteld en onderscheiden op basis van morfologie. Morfologische karakterisering van de bacteriekolonie werd uitgevoerd op basis van pigmentatie, vorm, elevatie, marge, opaciteit en oppervlak. Goed geïsoleerde kolonies op de hoogste verdunningen worden ondergekweekt tot verse agarplaten om microbiële culturen te zuiveren. De zuiverheid van de kolonies wordt verzekerd op basis van celuniformiteit en affiniteit voor Gram-kleuring. Er kunnen ook verschillende biochemische of moleculaire tests worden uitgevoerd om de zuiverheid van kolonies te controleren22. De zuivere culturen van geïsoleerde stammen kunnen worden bewaard op agarhellingen bij 4 °C voor kortdurend gebruik of langdurig worden bewaard bij -80°C in cryoprotectiven (bijv. een glycerol-tot-mediumverhouding van 20:80 of 50:50)23.

In dit protocol rapporteren we de best practice-aanpak voor het isoleren van bacteriën uit de huidmicrobiota van Speleomantes-grotsalamanders , strikt terrestrische amfibieën die zowel in bovengrondse als ondergrondse omgevingen kunnen leven24. Gezien het ontbreken van universeel toegepaste protocollen in de literatuur, was deze studie gericht op het ontwikkelen van een best practice voor het bemonsteren en bewaren van cutane microbiota-monsters van deze terrestrische amfibieën. Om dit protocol te testen, gebruikten we de Italiaanse grottensalamander (Speleomantes italicus) als model, waarbij we 12 individuen bemonsterden uit een grotpopulatie in Abruzzo (Italië). Individuen werden met de hand verzameld en herhaaldelijk (minstens 5 keer) afgeveegd op hun dorsale, ventrale zijden en flanken. De gebruikte wattenstaafjes werden gedrenkt in steriel gedestilleerd water. Wattenstaafjes werden vervolgens ondergedompeld in een fysiologische 0,9% zoutoplossing met en zonder glycerolsuppletie. Bij overdracht naar het laboratorium werd de conservering van het monster getest onder verschillende omstandigheden: ongecontroleerde kamertemperatuur, 4 °C en -20 °C gedurende 10 dagen. Kweekbare microbiële gemeenschappen werden vergeleken met behulp van op cultuur gebaseerde methoden op generieke en semi-selectieve media (LBA, TSYEA, TSA, NA).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol presenteert de beste praktijken voor het verkrijgen en hanteren van Speleomantes-huidmonsters voor een microbiologisch kweekbare benadering om bacteriestammen te isoleren. Het materiaal dat in de volgende stappen nuttig is, wordt vermeld in de Materiaaltabel. Het protocol volgt de richtlijnen voor dierenverzorging van artikel 11 van DPR 357/97 met toestemming van het Italiaanse ministerie van Milieu (PNM 74554 van 22/04/2024).

1. Voorbereiding van de media

  1. Bereken en weeg de hoeveelheid ingrediënten poeder (zie de instructies van de fabrikant voor de hoeveelheid poeder die wordt gebruikt voor LBA, TSYEA, TSA, NA of andere media).
  2. Volg de instructies van de fabrikant om de ingrediënten op te lossen in gedestilleerd water. Afhankelijk van het medium en het gekochte product kunnen kookstappen nodig zijn.
  3. Breng het medium op het uiteindelijke volume wanneer de ingrediënten volledig zijn opgelost en controleer de pH. Als de waarde hoger of lager is dan verwacht, pas deze dan aan met behulp van de oplossingen die worden voorgesteld in de instructies van de fabrikant. HCl- en NaOH-oplossingen worden vaak gebruikt om de pH respectievelijk te verlagen en te verhogen.
  4. Voeg agar toe (2% w/v), verwarm tot 95 °C en kook ongeveer 1 minuut om de agar op te lossen voordat u autoclavatie uitvoert.
  5. Steriliseer het medium door te autoclaveren, volgens de instructies van de fabrikant. Gebruikelijke autoclaafprocessen zijn 121-134 °C voor een behandeling van 15-30 minuten.
  6. Koel het agarmedium na het autoclaveren af tot ongeveer 45-50°C en giet het in steriele petrischaaltjes onder een eerder gesteriliseerde laminaire afzuigkap
  7. Label de platen na het stollen op basis van het mediumtype en de bereidingsdatum.

2. Afname van monsters

  1. Spoel de huid van de salamander (geslacht Speleomantes) af in steriel gedestilleerd water om de voorbijgaande microbiële gemeenschappen te verwijderen.
  2. Verzamel huiduitstrijkjes van amfibieën met behulp van steriele wattenstaafjes in een reageerbuisje. Wrijf de wattenstaafjes voorzichtig over het huidoppervlak om microbiële monsters te verzamelen zonder het individu te schaden.
    1. Geef vijf keer (vijf heen en weer) een wattenstaafje gedrenkt in steriel gedestilleerd water aan elke kant van het hele lichaam, inclusief alle ledematen, om de individuen te bemonsteren.
      OPMERKING: Suppletie met additieven wordt niet aanbevolen, omdat dit schadelijk kan zijn voor individuen.
    2. Plaats de wattenstaafjes in buisjes met fysiologische zoutoplossing (0,9% NaCl) aangevuld met glycerol (20%).
  3. Meng het monster met de oplossing, duw het wattenstaafje in de richting van de buiswanden terwijl u in het buisje knijpt en draai het wattenstaafje grondig (10 keer met de klok mee en 10 keer tegen de klok in).
  4. Sluit na het mengen het wattenstaafje in de buis en breng de microbiologische monsters over naar het laboratorium, waarbij u het monster op 4 °C houdt tot de microbiële analyse.
    OPMERKING: Alle stappen worden uitgevoerd met nieuw steriel materiaal en handschoenen voor elk individu om besmetting en blootstelling van de bediener aan biologische en chemische verontreinigingen te voorkomen.

3. Inenting en incubatie

  1. Meng het microbiologische monster grondig voor verwerking.
  2. Bereid seriële verdunningen van het huidmonster met een zoutoplossing (0,9% NaCl), variërend van 10-1 tot 10-6.
  3. Inoculeer 100 μl as-is monster en seriële verdunningen op de voorbereide agarplaten. Gebruik een steriele L-vormige lus om het monster over het oppervlak van het agarmedium te halen en verdeel het gelijkmatig zonder overmatige druk uit te oefenen om beschadiging van de agar te voorkomen.
  4. Keer de geënte platen 3-5 dagen om in een incubator bij 20-25 °C. Dit temperatuurbereik is gunstig voor het kweken van veel mesofiele en psychotrope bacteriën in de omgeving die in de huid van amfibieën leven.
    OPMERKING: Alle stappen worden uitgevoerd met behulp van steriel materiaal onder een eerder gesteriliseerde laminaire kap. Voor elke experimentele eenheid worden vijf onafhankelijke replicaten gemaakt. Aangezien de startdichtheid onbekend en onvoorspelbaar is, is het altijd nuttig om een breed scala aan verdunningen op te nemen.

4. Zuivering en identificatie van stammen

  1. Selecteer bacteriekolonies met verschillende morfologieën voor verdere analyse na incubatie.
    1. Kies eerst goed geïsoleerde kolonies om besmetting of overlapping te voorkomen en vermijd drukke gebieden waar kolonies zouden kunnen samensmelten. Kies bovendien kolonies met een verschillend uiterlijk (bijv. kleur, grootte, vorm, rand, oppervlak of textuur) om ervoor te zorgen dat mogelijk verschillende soorten of stammen worden bemonsterd.
      OPMERKING: Deze stap is cruciaal voor het selecteren van de verschillende kweekbare bacteriestammen van de huidmicrobiota.
  2. Subcultuur de geselecteerde koloniën.
    1. Breng een goed geïsoleerde kolonie van de oorspronkelijke agarplaat aseptisch over op een verse agarplaat met behulp van een inoculatielus. Streak de kolonie uit om deze te isoleren en vervolgens op de juiste manier uit te broeden.
    2. Herhaal deze stap meerdere keren op verse agarplaten om zuivere culturen te verkrijgen van elk bacterie-isolaat totdat de geïsoleerde kolonies op elkaar lijken. Herhaal de subcultuur met behulp van selectieve en generieke media.
      OPMERKING: De combinatie van aseptische behandeling, visueel en microscopisch onderzoek en moleculaire identificatie zorgt voor een contaminatievrije belasting.
  3. Controleer de zuiverheid van de microbiële culturen door middel van microscopische waarnemingen (van 5x tot 100x objectieven), Gram-kleuringsaffiniteit (fixatie, kleur en observatie van kolonies) en biochemische tests (bijv. catalase-, oxidase-, urease- en suikerfermentatietest)21,25.
    OPMERKING: Zuivere culturen moeten een uniforme koloniemorfologie, consistente microscopische kenmerken en biochemische eigenschappen vertonen.
  4. Voer moleculaire identificatie uit.
    1. Extraheer DNA uit gezuiverde bacteriekolonies en voer 16S rRNA-gensequencing uit om de bacteriesoorten te identificeren. Voer PCR-amplificatie van het 16S rRNA-gen uit met behulp van bacteriële universele primers, gevolgd door sequencing en vergelijking met bekende sequenties in databases zoals GenBank26.
  5. Vestig biobankculturen.
    1. Test axenische (of zuivere) culturen op steriliteit door ze in een niet-selectief medium te inoculeren en te controleren op de afwezigheid van groei van contaminanten. Bewaar axenische culturen voor gebruik op middellange en lange termijn.
      OPMERKING: De standaardmethoden omvatten het strippen van kolonies op agarhellingen van het selectieve medium en opslag op kamertemperatuur, het suspenderen van de cultuur in voorraadoplossingen bereid met een mengsel van het selectieve medium en glycerol (20:80 of 50:50), of het lyofiliseren van de bouilloncultuur (vriesdrogen) en invriezen bij -80 °C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De workflow van de experimentele aanpak wordt geïllustreerd in figuur 1.

figure-results-1
Figuur 1: Workflow van de bemonstering, behandeling en verwerking van de huidmonsters van amfibieën.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We ontwikkelden een best practice protocol om kweekbare bacteriegemeenschap te verkrijgen uit de huidmicrobiota van amfibieën en demonstreerden dit op Speleomantes italicus. Zoals aangetoond in de bovenstaande toepassing, moeten verschillende stappen worden genomen om een succesvolle microbiële isolatie van de huid van amfibieën te garanderen. Verzameling, met behulp van een zachte wattenstaaftechniek en steriele materialen, is erg belangrijk om voldoende microbieel mat...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We erkennen de financiële steun van de Universiteit van L'Aquila in het kader van de projecten "Progetti di Ateneo per la Ricerca di base 2024 UNIVAQ: Ecotoxicology of the endangered European cave salamanders" en "Analisi delle divergenze inter- e intraspecifiche del microbiota dei pletodontidi europei - FFORIC24.35" van Biodiversa+, het European Biodiversity Partnership, in het kader van het Sub-BioMon - Ontwikkeling en testen van benaderingen om de ondergrondse biodiversiteit in karstprojecten te monitoren in het kader van de 2022-2023 BiodivMon gezamenlijke oproep, en het Nationaal Herstel- en Veerkrachtplan (NRRP), Missie 4, Component 2, Investering 1.1, Aanbesteding nr. 1409 gepubliceerd op 14.9.2022 door het Italiaanse Ministerie van Universiteit en Onderzoek (MUR), gefinancierd door de Europese Unie - NextGenerationEU - Projectcode: P2022CYF9L, Projecttitel Zijn facultatieve grotsoorten aanjagers van metaalverontreinigingen in ondergrondse omgevingen? (METALCAVE) - BEKER E53D23015380001.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Lauria-Bertani agarMerk MilliporeL3027
Tryptic Soy AgarMerk Millipore22091
Tryptone Soy Yeast extract AgarMerk Millipore17221
Nutrient AgarMerk Millipore70148
Glycerol solutionMerk Millipore49781

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Belkaid, Y., Tamoutounour, S. The influence of skin microorganisms on cutaneous immunity. Nat Rev Immunol. 16 (6), 353-366 (2016).
  3. Kligman, A. M. What is the 'true' function of skin. Exp Dermatol. 11 (2), 159-187 (2002).
  4. Ross, A. A., Rodrigues Hoffmann, A., Neufeld, J. D. The skin microbiome of vertebrates. Microbiome. 7 (1), 79(2019).
  5. Kueneman, J. G., et al. Community richness of amphibian skin bacteria correlates with bioclimate at the global scale. Nat Ecol Evol. 3 (3), 381-389 (2019).
  6. Rebollar, E. A., MartínezUgalde, E., Orta, A. H. The amphibian skin microbiome and its protective role against chytridiomycosis. Herpetologica. 76 (2), 167(2020).
  7. Wuerthner, V. P., HernándezGómez, O., Hua, J. Amphibian skin microbiota response to variable housing conditions and experimental treatment across space and time. J Herpetol. 53 (4), 324(2019).
  8. HernándezGómez, O., Wuerthner, V., Hua, J. Amphibian host and skin microbiota response to a common agricultural antimicrobial and internal parasite. Microb Ecol. 79 (1), 175-191 (2020).
  9. SotoCortés, E., et al. Host species and environment shape the skin microbiota of Mexican axolotls. Microb Ecol. 87 (1), 98(2024).
  10. Cramp, R. L., McPhee, R. K., Meyer, E. A., Ohmer, M. E., Franklin, C. E. First line of defence: the role of sloughing in the regulation of cutaneous microbes in frogs. Conserv Physiol. 2 (1), cou012-cou012 (2014).
  11. Colston, T. J., Jackson, C. R. Microbiome evolution along divergent branches of the vertebrate tree of life: what is known and unknown. Mol Ecol. 25 (16), 3776-3800 (2016).
  12. Rebollar, E. A., et al. The skin microbiome of the neotropical frog Craugastor fitzingeri: inferring potential bacterialhostpathogen interactions from metagenomic data. Front Microbiol. 9, 466(2018).
  13. Li, X., Ricke, S. C. Comparison of cryoprotectants for Escherichia coli lysine bioavailability assay culture. J Food Process Preserv. 28 (1), 39-50 (2004).
  14. Patra, J. K., Das, G., Das, S. K., Thatoi, H. Isolation, Culture, and Biochemical Characterization of Microbes. In A Practical Guide to Environmental Biotechnology. , Springer. Singapore. (2020).
  15. Bertani, G. Studies on lysogenesis i. J Bacteriol. 62 (3), 293-300 (1951).
  16. Forbes, B. A., Sahm, D. F., Weissfeld, A. S. Diagnostic Microbiology. , Mosby. St Louis. (2007).
  17. O'Reilly, T., Niven, D. F. Tryptoneyeast extract broth as a culture medium for Haemophilus pleuropneumoniae and Haemophilus parasuis to be used as challenge inocula. Can J Vet Res. 50 (3), 441(1986).
  18. O'Reilly, T., Rosendal, S., Niven, D. F. Porcine haemophili and actinobacilli: characterization by means of API test strips and possible taxonomic implications. Can J Microbiol. 30 (10), 1229-1238 (1984).
  19. Niven, D. F. The cytochrome complement of Haemophilus parasuis. Can J Microbiol. 30 (6), 763-773 (1984).
  20. Lapage, S., Shelton, J. E., Mitchell, T. Methods in Microbiology. , Academic Press. London. (1970).
  21. Smibert, R. M. General Characterization. Manual of Methods for General Bacteriology. , American Society for Microbiology. Washington, DC. (1981).
  22. Sharma, N., Sharma, N., Sharma, S., Sharma, P., Devi, B. Identification, Morphological, Biochemical, and Genetic Characterization of Microorganisms. Basic Biotechniques for Bioprocess and Bioentrepreneurship. , Elsevier, Academic Press. (2023).
  23. Hubálek, Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. Cryobiology. 46 (3), 205-229 (2003).
  24. Lanza, B., Pastorelli, C., Laghi, P., Cimmaruta, R. A review of systematics, taxonomy, genetics, biogeography and natural history of the genus Speleomantes Dubois, 1984 (amphibia caudata plethodontidae). Atti Museo Civ St Natl, Trieste. 52, 5-135 (1984).
  25. Cappuccino, J. G., Welsh, C. T. Microbiology: A Laboratory Manual, Global Edition. , Pearson Education Limited: Pearson. Essex, England. (2017).
  26. Farda, B., et al. The "Infernaccio" gorges: microbial diversity of black deposits and isolation of manganesesolubilizing bacteria. Biology (Basel). 11 (8), 1204(2022).
  27. Lunghi, E., et al. Thermal equilibrium and temperature differences among body regions in European plethodontid salamanders. J Therm Biol. 60, 79-85 (2016).
  28. Woodhams, D. C., et al. Hostassociated microbiomes are predicted by immune system complexity and climate. Genome Biol. 21 (1), 23(2020).
  29. Stolp, H., Starr, M. P. Principles of Isolation, Cultivation, and Conservation of Bacteria. The Prokaryotes. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1981).
  30. El Baz, S., et al. Resistance to and accumulation of heavy metals by actinobacteria isolated from abandoned mining areas. Sci World J. 2015 (1), 761834(2015).
  31. Le Pioufle, O., Declerck, S. Reducing water availability impacts the development of the arbuscular mycorrhizal fungus Rhizophagus irregularis MUCL 41833 and its ability to take up and transport phosphorus under in vitro conditions. Front Microbiol. 9, 1254(2018).
  32. Freitas, F., Alves, V. D., Reis, M. A. M. Advances in bacterial exopolysaccharides: from production to biotechnological applications. Trends Biotechnol. 29 (8), 388-398 (2011).
  33. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J Vis Exp. (63), e3064(2012).
  34. De Paoli, P. Biobanking in microbiology: from sample collection to epidemiology, diagnosis and research. FEMS Microbiol Rev. 29 (5), 897-910 (2005).
  35. Dal Pizzol, M., et al. Antifungal efficacy and safety of cycloheximide as a supplement in OptisolGS. Drug Des Devel Ther. 15, 2091-2098 (2021).
  36. Overmann, J. Principles of Enrichment, Isolation, Cultivation, and Preservation of Prokaryotes. The Prokaryotes. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2013).
  37. Madhuri, R. J., et al. Recent Approaches in the Production of Novel Enzymes from Environmental Samples by Enrichment Culture and Metagenomic Approach. Recent Developments in Applied Microbiology and Biochemistry. , Elsevier, Academic Press. (2019).
  38. BaichmanKass, A., Song, T., Friedman, J. Competitive interactions between culturable bacteria are highly nonadditive. Elife. 12, e83398(2023).
  39. Cevallos, M. A., et al. Genomic characterization of antifungal Acinetobacter bacteria isolated from the skin of the frogs Agalychnis callidryas and Craugastor fitzingeri. FEMS Microbiol Ecol. 98 (12), fiac126(2022).
  40. Lauer, A., Simon, M. A., Banning, J. L., Lam, B. A., Harris, R. N. Diversity of cutaneous bacteria with antifungal activity isolated from female fourtoed salamanders. ISME J. 2 (2), 145-157 (2008).
  41. Niederle, M. V., et al. Skinassociated lactic acid bacteria from North American bullfrogs as potential control agents of Batrachochytrium dendrobatidis. PLoS One. 14 (9), e0223020(2019).
  42. MuletzWolz, C. R., et al. Antifungal bacteria on woodland salamander skin exhibit high taxonomic diversity and geographic variability. Appl Environ Microbiol. 83 (9), e00186-e00217 (2017).
  43. Woodhams, D. C., et al. Antifungal isolates database of amphibian skin-associated bacteria and function against emerging fungal pathogens. Ecology. 96 (2), 595-595 (2015).
  44. Woodhams, D. C., et al. Interacting symbionts and immunity in the amphibian skin mucosome predict disease risk and probiotic effectiveness. PLoS One. 9 (4), e96375(2014).
  45. Pessier, A. P. An overview of amphibian skin disease. Sem Avian Exot Pet Med. 11 (3), 162-174 (2002).
  46. HernándezGómez, O., Hua, J. From the organismal to biosphere levels: environmental impacts on the amphibian microbiota. FEMS Microbiol Rev. 47 (1), fuad002(2023).
  47. Stevens, E. J., Bates, K. A., King, K. C. Host microbiota can facilitate pathogen infection. PLoS Pathog. 17 (5), e1009514(2021).
  48. Kostanjšek, R., Prodan, Y., Stres, B., Trontelj, P. Composition of the cutaneous bacterial community of a cave amphibian, Proteus anguinus. FEMS Microbiol Ecol. 95 (3), fiz007(2019).
  49. Indriani, S., Karnjanapratum, S., Nirmal, N. P., Nalinanon, S. Amphibian skin and skin secretion: an exotic source of bioactive peptides and its application. Foods. 12 (6), 1282(2023).
  50. Gao, Y., et al. Targeted modification of a novel amphibian antimicrobial peptide from Phyllomedusa tarsius to enhance its activity against MRSA and microbial biofilm. Front Microbiol. 8, 628(2017).
  51. Wang, Y., Zhang, Y., Lee, W., Yang, X., Zhang, Y. Novel peptides from skins of amphibians showed broad-spectrum antimicrobial activities. Chem Biol Drug Des. 87 (3), 419-424 (2016).
  52. Barra, D., Simmaco, M. Amphibian skin: a promising resource for antimicrobial peptides. Trends Biotechnol. 13 (6), 205-209 (1995).
  53. RollinsSmith, L. A. The importance of antimicrobial peptides (AMPs) in amphibian skin defense. Dev Comp Immunol. 142, 104657(2023).
  54. RomeroContreras, Y. J., et al. Bacteria from the skin of amphibians promote growth of Arabidopsis thaliana and Solanum lycopersicum by modifying hormonerelated transcriptome response. Plant Mol Biol. 114 (3), 39(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Huidmicrobiota van amfibie nbacteri le isolatiemicrobi le gemeenschapseri le verdunningpetrischalenbewaring in zoute glyceroloplossingkoloniemorfologiemesofiele bacteri nmicrobi le levensvatbaarheidmicrobioom van wilde dieren

Gerelateerde artikelen