Methodenartikel

Driedimensionale beeldvorming van tumordragend weefsel met behulp van de iteratieve bleking breidt de multiplexiteitsbenadering uit

DOI:

10.3791/67869

⸱

25 april 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Surgical Oncology Program, NCI, NIH, 2Instrumentation Development and Engineering Application Solutions (IDEAS), NIBIB, NIH, 3Center for Immuno-Oncology, NCI, NIH

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een protocol voor multiplex-immunofluorescentie dat is geoptimaliseerd om de driedimensionale architectuur van peritoneale metastasen te karakteriseren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ruimtelijke heterogeniteit van de tumormicro-omgeving (TME) is een cruciale bepalende factor voor de therapeutische respons, met name voor immuun-oncologische middelen, waarbij het succes afhangt van de verdeling van specifieke subpopulaties van immuuncellen. In het afgelopen decennium zijn er meerdere geavanceerde technologieën geïntroduceerd om een gedetailleerde resolutie van de TME te bereiken met behulp van tweedimensionale secties van formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) of gefixeerde ingevroren weefsels. Hoewel deze dunne secties gemakkelijker te verkrijgen en te analyseren zijn, missen ze de driedimensionale architectuur die nodig is om een tumor betrouwbaar en volledig te karakteriseren. Om deze beperking aan te pakken, werd een weefselmontage- en beeldvormingstechniek ontwikkeld om de driedimensionale analyse van tumorlaesies in hun oorspronkelijke in vivo toestand mogelijk te maken. Dit protocol schetst de verkrijging van menselijk tumorweefsel, het monteren van monsters op op maat gemaakte platforms en kleuringsprocedures voor monsters na fixatie. De gemultiplexte immunofluorescentietechniek, IBEX (Iterative Bleaching Extend Multiplexity), werd aangepast om de driedimensionale TME te karakteriseren met maximaal 15 markers voor tumor-, immuun- en stromale cellen met behulp van in de handel verkrijgbare antilichamen. Beeldvormingsdieptes tot 100 μm werden bereikt met behulp van een omgekeerd witlicht laserconfocale microscoop met een op maat gemaakte beeldvormingsadapter en in de handel gebrachte schalen met glazen bodem om een optimale weefseloriëntatie te garanderen. Dit protocol benadrukt het potentieel van de IBEX-methode om gemultiplexte immunofluorescentiestudies uit te breiden, waardoor een beter begrip van de TME-samenstelling wordt verkregen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Solide tumoren zijn zeer variabel, met een ingewikkelde samenstelling van celtypen (kwaadaardig en niet-kwaadaardig), extracellulaire matrixeiwitten en oplosbare factoren 1,2. Uiteindelijk bepaalt deze zeer complexe, heterogene tumormicro-omgeving (TME) de gevoeligheid voor behandelingen zoals immunotherapie 3,4. Als zodanig zijn technologieën zoals sterk gemultiplexte immunofluorescentie 5,6 en ruimtelijke transcriptomics7 toegepast om de complexiteit van de TME in cellaagdikke (~4 μM) secties te karakteriseren.

In tegenstelling tot celdispersiebenaderingen zoals single-cell sequencing en flowcytometrie 8,9,10, behouden deze technieken ruimtelijke relaties om kritische informatie bij te dragen over cellulaire overspraak en kunnen ze worden gebruikt om potentiële biomarkers te identificeren voor het voorspellen van de respons op de behandeling 11,12,13. Tumorlaesies zijn echter inherent driedimensionale (3D) structuren, en 2D-benaderingen zoals hierboven vermeld leggen het complexe cellulaire landschap niet adequaat vast. Het belang van 3D-biologie is in het veld gewaardeerd, zoals blijkt uit het brede gebruik van van patiënten afgeleide tumororganoïdeculturen14. Organoïden behouden echter niet de cellulaire complexiteit van de oorspronkelijke in vivo TME, wat de toepasbaarheid beperkt voor gebruik met immunomodulerende geneesmiddelen of voor karakterisering van de diverse TME-celpopulaties.

Hoewel het mogelijk is om analyses uit te voeren op seriële 2D-secties en de afbeeldingen computationeel aan elkaar te "naaien" voor een 3D-rendering, is deze techniek onbetaalbaar en uitdagend om te bereiken met high-fidelity15. Om 3D-weefsels (bijv. tumoren) op een reproduceerbare manier kosteneffectief te karakteriseren, werd een unieke methode voor de bereiding en multiplex immunofluorescentiekleuring/analyse ontwikkeld en gedemonstreerd met behulp van peritoneale tumorlaesies van een patiënt met primaire peritoneale kanker.

Gebaseerd op een aanpassing van de gevestigde IBEX-techniek (Iterative Bleaching Extend Multiplexity)16,17, beschrijft dit protocol het 3D-printen van een weefselhouder en beeldvormingsadapter, het verkrijgen en monteren van peritoneaal weefsel, meerdere cycli van kleuring met verschillende tumor- en celtypemarkers, en confocale 3D-beeldvorming met hoge resolutie.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De studie werd uitgevoerd met goedkeuring van de National Institutes of Health Institutional Review Board volgens protocol NCT01915225. Menselijk weefsel werd verkregen met schriftelijke geïnformeerde toestemming op het moment van diagnostische laparoscopie. Al het weefsel was tumordragend, zoals vastgesteld door zichtbare inspectie en bevestigd door definitief histopathologisch onderzoek. Details van alle gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel. Een schematische illustratie van de gehele workflow is te vinden in Figuur 1.

1. Afdrukplatforms, beeldvormingsadapter en incubatieplaat

  1. Slicing/3D-printen/nabewerkingsprocedures voor het platform en plaatonderdelen met 9 putjes (beschreven in figuur 2A-C)
    1. Slicing: Open de slicing-software en importeer de ontwerpbestanden in . STL-formaat (aanvullend bestand 1 en aanvullend bestand 2). Oriënteer de modellen voor een optimale afdruk en voeg steunen toe. Selecteer de printer van medische kwaliteit, selecteer de heldere hars en de laaghoogte van 50 μm . Controleer de afdrukbaarheid en stuur de taak naar de printer.
    2. 3D-printen: Controleer of de printer klaar is (juiste harscartridge, tank en platform op hun plaats). Selecteer op het touchscreen van de printer de geüploade taak uit de slicersoftware om het afdrukken te starten. Zodra het afdrukken is voltooid, gebruikt u het verwijderingsgereedschap om het geprinte onderdeel van het platform los te maken.
    3. Nabewerking: Spoel het onderdeel in de wasunit gevuld met 99% isopropylalcohol (IPA) gedurende 15 minuten. Verwijder onderdelen uit de wasunit en laat 5 minuten weken in verse IPA.
    4. Laat het onderdeel 60 minuten uitharden bij 60 °C. Verwijder de steunen met behulp van een verzonken frezen. Schuur eventuele steunplekken indien nodig weg met schuurpapier met fijne korrel.
  2. Slicing/3D-printen/nabewerkingsprocedures voor hoogteverstelling en buitendeksel (beschreven in afbeelding 2A-C)
    1. Slicing: Open de printsoftware en importeer de ontwerpbestanden in . STL-formaat (aanvullend bestand 3 en aanvullend bestand 4). Oriënteer de modellen en wijs materialen toe. Selecteer de gewenste afdrukmodus (Hoge mix, hoge snelheid) en stel de modelinstellingen in om af te werken op Matt. Controleer de afdrukbaarheid en stuur de taak naar de printer.
    2. 3D-printen: Zorg ervoor dat de printer de juiste materialen heeft geladen en dat de bouwbak schoon is. Selecteer op de monitorinterface van de printer de geüploade taak om het afdrukken te starten. Zodra het afdrukken is voltooid, gebruikt u het schrapergereedschap om het geprinte onderdeel voorzichtig uit de bouwlade te verwijderen.
    3. Nabewerking: Plaats de bedrukte stukken in een waterstraalreiniger of een roerreinigingssysteem om het ondersteuningsmateriaal te verwijderen. Voer indien nodig eventuele handmatige verwijdering van de ondersteuning uit met behulp van gereedschap zoals een pincet of tang.
  3. Lasersnijden van de platformschuif (weergegeven in figuur 2A,C)
    1. Het ontwerp voorbereiden: Importeer de *. DWG-ontwerpbestand in de vectorsoftware (aanvullend bestand 5). Stel de lijnkleuren in op rood (RGB) voor vectorsnijden. Stuur de taak naar de lasersnijder.
    2. De lasersnijder instellen: Open de lasersnijdersoftware en importeer het ontwerpbestand. Selecteer het materiaaltype en pas de instellingen aan voor vermogen, snelheid en resolutie voor 1/32" dik acryl. Plaats het materiaal op het laserbed, zorg ervoor dat het goed is uitgelijnd en stel de laser scherp.
    3. Lasersnijden: Start het lasersnijproces en controleer of het materiaal correct wordt gesneden.

2. Weefselmontage op bedrukte platforms

  1. Voorbereiding van oogstmedium en voorbereidingstafel
    1. Vul 100 ml DMEM (lage glucose) aan met Anti-Anti en plaats in een incubator van 37 °C tot het nodig is (oogstmedium).
    2. Zet een "voorbereidingstafel" op in de operatiekamer met de volgende items: geautoclaveerde 3D-geprinte platforms, pakket van 2-0 zijden hechtbanden, verwarmingsplaat, monsterbeker met 50 ml voorverwarmd oogstmedium, 15 cm kweekplaat met 30 ml voorverwarmd oogstmedium en een plaat met 24 putjes met elk 1,5 ml oogstmedium (plaats alles op een verwarmingsplaat), 1 pincet en 1 chirurgische schaar.
  2. Weefselresectie en montage
    OPMERKING: Weefsel wordt verkregen uit de operatiekamer. Gebieden van het peritoneum met tumorhaarden van minder dan 0,5 mm dik en diameter worden geïdentificeerd bij visuele inspectie (Figuur 2D). Merk op dat ~ 2 cm2 weefsel (peritoneum) nodig is om één platform voor te bereiden.
    1. Scheid het tumordragende peritoneum voorzichtig van de onderliggende buikwandspieren en fascia (uitgevoerd door de chirurg). Breng de resulterende tissuevellen over naar een monsterbeker met warm oogstmedium en plaats ze op een verwarmingsplaat (voorbereidingstabel).
    2. Monteer het weefsel op plateaus in de plaat van 15 cm met het oogstmedium. Drapeer het tumordragende weefsel (mesotheliale kant naar boven) voorzichtig over de kleine openingszijde van het platform en zet het op zijn plaats vast met een 2-0 zijden hechtdraad. Plaats het voorbereide weefselplatform omgekeerd (ondergedompeld) in een plaat met 24 putjes met oogstmedium (Figuur 2E-G).
      OPMERKING: Monteer het weefsel voldoende om vouwen op het platformoppervlak te voorkomen, maar genereer geen spanning, omdat dit ongewenste biomechanische en fysiologische veranderingen zal veroorzaken.

3. Procedure voor fixatie/kleuring/bleken

OPMERKING: Wijzigingen ten opzichte van het oorspronkelijke protocol die zijn afgestemd op 4 μm dunne FFPE of vaste bevroren secties worden beschreven in figuur 3. Tabel 1 geeft een lijst van antilichamen (met verdunningen) die zijn gebruikt voor IBEX-rondes 1-6.

  1. Fixatie
    1. Bereid 40 ml fixatiebuffer voor door 10 ml fixeerpapier toe te voegen aan een conische buis van 50 ml met 30 ml koude 1x PBS.
    2. Breng het op platforms gemonteerde weefsel met een tang over op de fixatiebuffer en incubeer gedurende 24 uur bij 4 °C.
    3. Decanteer het fixeermiddel en vervang het door 40 ml koude 1x PBS en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  2. Kleuring
    1. Voeg 1 ml blokkeerbuffer (1% BSA, 0,3% Triton-X-100, 1% Fc-blok in 1x PBS gefilterd met 0,22 μm spuitfilter) toe aan elk putje en breng weefselplatforms in. Blokkeer gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur op een tuimelschakelaar die op lage snelheid (30 tpm) is ingesteld.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de inkeping op het platform en de groef in de put op één lijn liggen. Deze stap is niet tijdgevoelig en kan 's nachts bij 4 °C worden uitgevoerd.
    2. Bereid 0,8 ml antilichaam/kleurstofoplossing in een microcentrifugebuisje en centrifugeer op 10.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng 0,75 ml over naar een schoon putje van de incubatieplaat met 9 putjes en plaats een gewassen platform.
    3. Wikkel de plaat in aluminiumfolie en incubeer gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur op een tuimelschakelaar die op lage snelheid (30 tpm) is ingesteld.
    4. Was het plateau in een conische tube van 50 ml met 40 ml 1x PBS gedurende 10 minuten op 4 °C. Het platform is nu klaar om in de beeldverwerkingsadapter te worden geplaatst.
  3. Bleken
    1. Bleekt de fluoroforen na elke kleurings- en beeldvormingsronde met behulp van het esterreductiemiddel lithiumborohydride (LiBH4). Deze behandeling elimineert fluorescentiesignalen van Alexa Fluor (AF)488, AF647 en AF750, maar niet van AF594 en de nucleaire kleurstof Hoechst.
      LET OP: Lithiumboorhydride is extreem reactief met water. Ontvlambare waterstofgassen komen vrij bij contact met water; Gebruikt lithiumboorhydride en met lithiumboorhydride verontreinigde wegwerpartikelen moeten als gevaarlijk afval worden afgevoerd.
    2. Bereid 5 ml 1,5 mg/ml LiBH4-oplossing in gedestilleerd water (in een chemisch kapje) en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: LiBH4-oplossing verliest zijn verminderende/blekende effectiviteit wanneer het >4 uur voor gebruik wordt bereid.
    3. Breng 1 ml LiBH4-oplossing over in een schoon putje van de incubatieplaat met 9 putjes en plaats het gewassen plateau gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Was het platform kort in 20 ml 1x PBS in een conische buis en controleer op het resterende fluorescentiesignaal met behulp van de hoogste laserinstelling voor Z-compensatie in de voorgaande beeldvormingsronde voordat u overgaat tot de volgende kleuringsrondes.
    5. Herhaal het blokkeren van het monster gedurende 2 uur bij kamertemperatuur voordat u overgaat tot de volgende antilichaamincubatiestap.

4. Beeldvorming procedure

  1. Assemblage van beeldvormingsadapters/-platforms
    1. Voeg 0,1 ml 1x PBS toe aan het midden van de glazen bodem van een beeldschaaltje van 3,5 cm en zet apart. Schroef de hoogteverstelring losjes met de klok mee in het buitendeksel en monteer het platform in de binnenste plastic houder (uitlijning van inkepingen en groeven). Zet het platform vast met de schuifregelaar.
    2. Plaats de gemonteerde beeldvormingsadapter op de glazen bodemschaal en laat de hoogteverstelring voorzichtig zakken totdat het weefsel de buffer raakt. Vermijd het draaien van het platform op de glazen bodem.
    3. Zodra de optimale afstand tot het glas is bereikt, voegt u 0,2 ml 1x PBS toe aan het weefsel (nu de onderkant naar boven) om uitdroging van het weefsel tijdens de beeldvorming te voorkomen.
  2. Confocale beeldvorming
    1. Schakel alle onderdelen van de omgekeerde confocale microscoop in, inclusief de computer, microscoop, laser en LED-lichtbron voor gebruik op het oculair. Start de software voor het verzamelen van afbeeldingen .
    2. Selecteer het juiste doel (bijv. 20x of 40x) en voeg het juiste onderdompelingsmedium toe. Zo wordt in dit onderzoek gebruik gemaakt van een 20x waterobjectief; ~200 μL water wordt aan het objectief toegevoegd om uitdroging tijdens lange beeldacquisities te voorkomen.
    3. Plaats de gemonteerde beeldvormingsschaal in de monsterhouder op de microscooptafel en zorg ervoor dat het monster goed vastzit (niet beweegt).
      NOTITIE: Wanneer u het geassembleerde monster op de microscooptafel plaatst, let dan op de positie van de inkeping en gebruik dezelfde positie voor iteratieve cycli om de uitlijning van het beeld te vergemakkelijken. Het is belangrijk om de beeldmateriaaladapter gedurende opeenvolgende rondes op de optimale hoogte-instelling te houden.
    4. Centreer het preparaat met behulp van de X-Y-regelaar en breng het objectief tot aan het dekglas. Door het oculair te kijken en het Hoechst-signaal als referentie te gebruiken, beweegt u het objectief om een fijne scherpstelling op het weefsel te verkrijgen.
    5. Selecteer de juiste laserlijnen of pas WLL aan de excitatie- en emissiespectra aan van de fluoroforen die worden gebruikt om het weefselmonster te kleuren. Elimineer overlap tussen kanalen door de instellingen aan te passen en sequenties toe te voegen als fluoroforen vergelijkbare excitatiespectra hebben.
    6. Kies de volgende parameters voor beeldacquisitie: scansnelheid 600 Hz, XY-resolutie 1024 x 1024, gemiddelden van 3 regels en bidirectionele scan.
    7. Kies de volgende Z-stack-parameters: (1) gebruik de Z-stapgrootte die is geoptimaliseerd voor het doel dat wordt gebruikt, (2) definieer het begin en einde van de stapel, (3) pas de Z-compensatieparameters aan om gelijke helderheid in de hele stapel te bereiken, en (4) verkrijg een teststapel van 1 tegel met één gemiddelde.
    8. Definieer het gebied dat moet worden afgebeeld en verkrijg een tegel-Z-stapel met hoge resolutie.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het peritoneum is een vliezige structuur van minder dan 1 mm dik die het oppervlak van de buikwand bekleedt en grenst aan de oppervlakken van buikorganen. Het is samengesteld uit oppervlaktemesotheel en onderliggend bindweefsel dat wordt afgewisseld met vetcellen, lymfocyten, macrofagen en fibroblasten, evenals bloed- en lymfevaten. Peritoneale maligniteiten komen meestal voort uit uitzaaiingen van abdominale tumoren (bijv. eierstokkanker of maagkanker)18 of, minder vaak, kunnen primaire tumoren van het peritoneum zijn (bijv. mesothelioom)19. Deze vaak kleine (<1 cm) tumorlaesies zijn zeer complex, maar zijn vatbaar voor 3D-karakterisering met behulp van de geschetste techniek. Een maximale projectie van vijf confocale secties wordt gebruikt om het volledige monster op een platform te bekijken (Figuur 4, inzet in de linkerbovenhoek). Drie primaire geconjugeerde antilichamen (AF488-CD44, AF594-CD45 en AF647-Podoplanin) samen met de nucleaire kleurstof Hoechst werden gebruikt voor de eerste ronde van IBEX (IBEX1, figuur 4). Tumorlaesies worden duidelijk door de rozetachtige structuren die dubbel positief zijn voor CD44 en Podoplanin en een rangschikking van kernen vertonen die kenmerkend is voor papillair mesothelioom.

Tumorcellen werden geïdentificeerd met behulp van celmorfologie en twee antilichamen, aangezien zowel anti-Podoplanin als anti-CD44 niet-tumorcellen herkennen, zoals blijkt uit de detectie van lymfevaten via anti-Podoplanin en de binding van het CD44-antilichaam aan subsets van immuuncellen. Kleinere interessegebieden (ROI's) worden vervolgens vastgelegd met behulp van een tegelscanformaat in hogere resolutie bij geoptimaliseerde Z-stapgroottes voor het renderen van 3D-projecties (Afbeelding 5A). Platforms werden door de iteratieve kleuringsprocedures geleid en dezelfde ROI's werden in beeld gebracht in IBEX-cycli 1-6. Representatieve beelden voor tumor (gele doos) en tumor-tertiaire lymfoïde structuur (TLS) interfaces (blauwe doos) zijn geassembleerd in Figuur 5B-M.

De aanwezigheid van TLS en de dichtheid van CD3-positieve cellen duiden op significante infiltratie van immuuncellen20 en mogelijk respons op immunomodulerende geneesmiddelen21. Merk op dat TLS en het grootste deel van de tumorlaesies aanwezig zijn in verschillende Z-diepten van het weefsel, zoals aangetoond bij het vergelijken van stapelprojecties van verschillende optische secties in figuur 6, waarbij de voordelen van 3D-beeldvorming en het potentieel gemiste biologie worden benadrukt wanneer 2D-beeldvorming wordt toegepast op 3D-structuren. Het 3D-karakter van deze laesies wordt duidelijker in de filmbestanden (film 1-12), die volumeweergaven van de individuele laesies in figuur 5 weergeven.

figure-results-1
Figuur 1: Workflow van 3D-printen naar 3D-beeldvorming van peritoneale tumoren. Het protocol bestaat uit een reeks van vijf stappen om 3D-gemultiplexte beelden van tumordragend peritoneaal weefsel voor te bereiden. (1) Printen van weefselontvangende platforms, onderdelen van beeldvormingsadapters en incubatieplaat. (2) Procedures voor het verkrijgen en monteren van weefsel. (3) Fixatie met paraformaldehyde. (4) IBEX-kleurings- en beeldvormingscycli. (5) 3D-reconstructie met behulp van beeldvormingssoftware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Hardwarecomponenten met weefselinterface voor 3D-beeldvorming. (A) Schematisch diagram van de platformassemblage in de beeldverwerkingsadapter. (B) Een incubatieplaat met 9 putjes. (C) Foto's van beeldadaptercomponenten met montage. (D) Mesothelioom-dragend peritoneum zoals waargenomen tijdens diagnostische laparoscopie. (E) Montage van weefsel op het platform. (F,G) Tumordragend peritoneum gemonteerd op platforms. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Tijdlijnschema van IBEX-cycli. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Overzicht van het platform na incubatie met IBEX1-paneel. Maximale projectie van het volledige platform na incubatie met IBEX1-paneel (Hoechst, AF488-CD44, AF594-CD45 en AF647-Podoplanin). De gestippelde cirkel markeert de tumor. Inzet: Foto van tumordragend peritoneum gemonteerd op het beeldvormingsplatform. Schaal balk: 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Immunofluorescentiebeelden met hoge resolutie van geselecteerde platformregio's. (A) Maximale projectie van het samengevoegde beeld van de 56-tegel Z-stack verkregen na incubatie met het IBEX1-paneel (Hoechst, AF488-CD44, AF594-CD45 en AF647-Podoplanin). Gele rechthoek: tumorlaesie weergegeven in panelen (B-G). Blauwe rechthoek: tumor-tertiaire lymfoïde structuurinterface weergegeven in (H-M). (B-G) Eén individuele tumorlaesie met IBEX-panel 1-6 in volumeweergave. (B) IBEX1, groen: CD44, rood: CD45, cyaan: Podoplanin. (C) IBEX2, groen: CD20, rood: F-actine, cyaan: CD3. (D) IBEX3, groen: CD8, rood: CD4, cyaan: panCK. (E) IBEX4, groen: CD31, cyaan: CD68. (F) IBEX5, groen: CD206, cyaan: Calretinine. (G) IBEX6, groen: Vimentin, rood: HLADR. (H-M) Eén individuele tumor-tertiaire lymfoïde structuur interface met IBEX-paneel 1-6 in volumeweergave. (H) IBEX1, groen: CD44, rood: CD45, cyaan: Podoplanin. (I) IBEX2, groen: CD20, rood: F-actine, cyaan: CD3. (J) IBEX3, groen: CD4, rood: panCK, cyaan: CD8. (K) IBEX4, groen: CD31, rood: SMA, cyaan: CD68. (L) IBEX5, groen: CD206, cyaan: Calretinine. (M) IBEX6, groen: HLADR, cyaan: Vimentin. Alle panelen, blauw: Hoechst. Schaal staven: (A, 1 mm); (B-M, 250 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Gesimuleerde 2D-beeldvorming. Vergelijking van beperkte (10 optische secties) en full stack (102 optische secties) projecties bevestigt het verlies van weefselcontext in 2D-simulatie. (A) Maximale projectie van secties 30-40 (10 μm). (B) Maximale projectie van secties 85-95 (10 μm). (C) Maximale projectie van secties 1-102 (~100 μm). Alle panelen, IBEX2 (Hoechst, AF488-CD20, AF647-CD3, AF790-falloïdine). Schaalbalk: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Tabel 1: Antilichamen gebruikt voor de afzonderlijke IBEX-panelen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Film 1: Geanimeerde volumeweergave van de individuele laesie met IBEX-paneel 1 (blauw: Hoechst, groen: CD44, rood: CD45, cyaan: Podoplanin). Klik hier om deze film te downloaden.

Film 2: Geanimeerde volumeweergave van de individuele laesie met IBEX-paneel 2 (blauw: Hoechst, groen: CD20, rood: F-actine, cyaan: CD3). Klik hier om deze film te downloaden.

Film 3: Geanimeerde volumeweergave van de individuele laesie met IBEX-paneel 3 (blauw: Hoechst, groen: CD8, rood: CD4, cyaan: panCK). Klik hier om deze film te downloaden.

Film 4: Geanimeerde volumeweergave van de individuele laesie met IBEX-paneel 4 (blauw: Hoechst, groen: CD31, cyaan: CD68). Klik hier om deze film te downloaden.

Film 5: Geanimeerde volumeweergave van de individuele laesie met IBEX-paneel 5 (blauw: Hoechst, groen: CD206, cyaan: Calretinine). Klik hier om deze film te downloaden.

Film 6: Geanimeerde volumeweergave van de individuele laesie met IBEX-paneel 6 (blauw: Hoechst, groen: Vimentin, rood: HLADR). Klik hier om deze film te downloaden.

Film 7: Geanimeerde volumeweergave van de tertiaire lymfoïde structuur-laesie-interface met IBEX-paneel 1 (blauw: Hoechst, groen: CD44, rood: CD45, cyaan: Podoplanin). Klik hier om deze film te downloaden.

Film 8: Geanimeerde volumeweergave van de tertiaire lymfoïde structuur-laesie-interface met IBEX-paneel 2 (blauw: Hoechst, groen: CD20, rood: F-actine, cyaan: CD3). Klik hier om deze film te downloaden.

Film 9: Geanimeerde volumeweergave van de tertiaire lymfoïde structuur-laesie-interface met IBEX-paneel 3 (blauw: Hoechst, groen: CD8, rood: CD4, cyaan: panCK). Klik hier om deze film te downloaden.

Film 10: Geanimeerde volumeweergave van de tertiaire lymfoïde structuur-laesie-interface met IBEX-paneel 4 (blauw: Hoechst, groen: CD31, rood: SMA, cyaan: CD68). Klik hier om deze film te downloaden.

Film 11: Geanimeerde volumeweergave van de tertiaire lymfoïde structuur-laesie-interface met IBEX-paneel 5 (blauw: Hoechst, groen: CD206, cyaan: Calretinine). Klik hier om deze film te downloaden.

Film 12: Geanimeerde volumeweergave van de tertiaire lymfoïde structuur-laesie-interface met IBEX-paneel 6 (blauw: Hoechst, groen: Vimentin, rood: HLADR). Klik hier om deze film te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Print het bestand voor de incubatieplaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Bestand afdrukken voor de 36 afzonderlijke platforms. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Bestand afdrukken voor de hoogteverstellingsring. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: Bestand afdrukken voor het buitendeksel. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 5: Lasergesneden bestand voor de slider. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige multiplextechnieken voor fluorescentiebeeldvorming zijn beperkt tot dunne secties en bieden geen 3D-context. De huidige studie beschrijft een protocol om de IBEX-beeldvormingsmethode16,17 toe te passen op intacte tumoren die op op maat ontworpen platforms zijn gemonteerd. Peritoneale tumorlaesies werden gekozen om de techniek te benadrukken, aangezien patiënten vaak meerdere tumorafzettingen van ideale grootte vertonen die samen met het omringende normale peritoneum worden genomen als onderdeel van de standaard cytoreductiechirurgie die wordt uitgevoerd in de meeste tertiaire verwijzingscentra over de hele wereld22,23. Het protocol is niettemin van toepassing op zowel parenchymale metastasen als muismodeltumoren met behulp van tumorplakjes zoals eerder beschreven 24,25. Bovendien kan de diameter van de montagering op de platforms worden aangepast aan experimentele/weefselbehoeften, hoewel grotere gebieden gevoelig zijn voor weefselverslapping en langere beeldvormingstijden. Ongeacht de weefselbron en -grootte moet de tijd tussen verkrijging en bewaring minimaal worden gehouden om een optimale kwaliteit te garanderen26. De opstelling van een voorbereidingstafel in de operatiekamer garandeert een snelle verwerking wanneer er patiënten bij betrokken zijn. De tijd tussen verkrijging en fixatie van het weefsel moet worden genoteerd om de vergelijkbaarheid van de experimenten te waarborgen.

Weefselmonsters worden genomen via het IBEX-protocol terwijl hele mounts, d.w.z. fixatie en beeldvorming, evenals bleekstappen, worden uitgevoerd met het intacte weefsel dat op het platform is bevestigd. Dit garandeert de conservering van het monster door middel van de iteratieve kleurings-/beeldvormings-/bleekcycli, aangezien er geen semi-permanente sectie-glasinterface is en het niet nodig is om herhaaldelijk een afdekglas van het weefsel te plaatsen/verwijderen, wat beide kan leiden tot weefselverlies. Om reagentia te besparen, garandeert de op maat ontworpen 9-well-plaat een optimale pasvorm van het platform met een minimaal "dood volume". Alle antilichamen die voor de kleuring worden gebruikt, zijn primaire geconjugeerde antilichamen en alle fluorofoorconjugaten die worden gebruikt (behalve de Hoechst-kleurstof) zijn Alexa Fluor-kleurstoffen, die werden gekozen vanwege hun uitstekende helderheid27. Andere fluoroforen-antilichaampanelen zijn ontworpen op basis van gegevens die zijn gedeponeerd door de IBEX-beeldvormingsgemeenschap, een open, wereldwijde opslagplaats die datasets, protocollen en feedback verzamelt van een internationale groep wetenschappers die IBEX (https://ibeximagingcommunity.github.io/ibex_imaging_knowledge_base/) gebruiken. De volgorde van de antilichaampanelen werd zorgvuldig gekozen. Over het algemeen werden doelen met een lage abundantie in eerdere cycli geplaatst. IBEX-cyclus 1 (CD45, CD44 en Podoplanin) is een uitzondering, aangezien deze drie markers werden gebruikt om tumorlaesies te identificeren in de eerste kleuringsronde.

Antilichaampanelen zijn relatief klein om kanaaloverspraak te verminderen bij hoge laserintensiteitsinstellingen, wat nodig is om het weefsel dieper in beeld te brengen met behulp van een confocale microscoop. Waar mogelijk werden AF750-conjugaten opgenomen om het panel uit te breiden van 2 naar 3 antilichamen. Merk op dat er niet veel AF750-conjugaten in de handel verkrijgbaar zijn, en het feit dat het doel voor dit kanaal zeer overvloedig zou moeten zijn, beperkt het gebruik van deze fluorofoor. Een voorbeeld is het AF750-geconjugeerde anti-SMA-antilichaam dat in dit protocol is gebruikt. Hoewel dit een kloon is die betrouwbaar werkt geconjugeerd met AF488 of AF594, is de signaalintensiteit voor dit antilichaam geconjugeerd met AF750 aanzienlijk lager, wat het moeilijk maakt om Z-stacks van hoge kwaliteit te genereren.

Antilichaamincubaties van 3 uur bij kamertemperatuur zijn kort in vergelijking met het oorspronkelijke protocol en weerspiegelen hoogstwaarschijnlijk de lagere celdichtheid in peritoneale weefselmonsters. Daarentegen was de bleekstap met 1,5 mg/ml lithiumborohydride gedurende 60 minuten strenger. Deze parameters zijn empirisch bepaald en kunnen variëren afhankelijk van het weefsel en de antilichamen die worden gebruikt. Van belang is dat door incubatie in de reactieve bleekoplossing kleine luchtbelletjes in het weefsel kunnen worden opgesloten. Telkens wanneer dit duidelijk werd tijdens de beeldvormingsstap van de procedure, werden monsters ontgast door het platform in de incubatieplaat met 9 putjes bloot te stellen aan vacuüm met behulp van een zuigbus. Eenvoudige ITK-monsterregistraties, vaak toegepast in IBEX-onderzoeken, konden niet worden uitgevoerd vanwege de overweldigende gegevensinvoer naar de beeldanalysesoftware. Desalniettemin kunnen identieke celpopulaties gemakkelijk worden geïdentificeerd door individuele datasets te vergelijken. Over het algemeen waren de iteratieve cycli zo getimed dat één cyclus op één dag kon worden voltooid, waarbij beeldvorming het grootste deel van een hele cyclus in beslag nam (~ 8 uur).

De techniek heeft wel beperkingen die het vermelden waard zijn. De tijdsvereiste van het protocol maakt het onwaarschijnlijk dat deze methode op grote schaal zal worden toegepast, maar eerder in bepaalde omstandigheden. We stellen ons voor dat dit protocol het beste kan worden gebruikt om veranderingen in de immuunmicro-omgeving van de tumor voor en na de behandeling te karakteriseren (bijv. bispecifieke antilichamen voor kankerimmunotherapie) of om algemene behandelingsresultaten te voorspellen. Hoewel dit protocol 3D-karakterisering biedt, is het niet bekend hoeveel gebied moet worden ondervraagd om een tumor effectief te beschrijven, inclusief de complexe celpopulaties28. Toegang tot vers menselijk weefsel kan in bepaalde centra ook moeilijk zijn, maar we stellen ons voor dat dit protocol ook van toepassing is op diermodellen29.

De toepassingen voor dit protocol zijn divers, van fundamenteel onderzoek naar de analyse van de TME-samenstelling over meerdere solide tumoren tot pre-/postweefselbiopten voor patiënten die deelnamen aan klinische onderzoeken. Hoewel de gegevens die kunnen worden verkregen uit een enkele cellaag dik weefselgedeelte immens zijn, kan 3D-biologie gemakkelijk over het hoofd worden gezien. We zien 3D-beeldvorming als een aanvulling op andere ruimtelijke biologietechnieken, die waarschijnlijk helpen bij de selectie van 2D-secties voor latere analyses. Bovendien is er actief een protocol aan de gang om een live beeldvormingscomponent gedurende meerdere uren op te nemen met behulp van de beschreven weefselmontage en beeldvormingsopstelling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door het Intramural Research Program van de National Institutes of Health en het National Cancer Institute (NCI). Dit onderzoek werd ook gedeeltelijk ondersteund door de CAT-I, een onderzoekssamenwerking tussen NIAID en NCI, onder leiding van Ronald Germain. We willen Andrea Radtke bedanken voor haar enthousiaste, gezamenlijke inspanningen. Haar expertise kwam deze studie goed van pas.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alexa Fluor Plus 750 PhalloidinInvitrogenA30105F-actin kleurstof
Alexa Fluor 488 anti-human CD206 (MMR) AntibodyBioLegend321114antilichaam
Alexa Fluor 488 anti-human CD31 AntibodyBioLegend303110antilichaam
Alexa Fluor 488 anti-human CD4 AntibodyBioLegend300519antilichaam
Alexa Fluor 488 anti-human HLA-DR AntibodyBioLegend307656antilichaam
Alexa Fluor 488 anti-mouse/human CD44 AntibodyBioLegend103016antilichaam
Alexa Fluor 594 anti-human CD45 AntibodyBioLegend304060antilichaam
Alexa Fluor 647 Anti-Calretinin antibody [EP1798]Abcamab214244antilichaam
Alexa Fluor 647 anti-human CD3 AntibodyBioLegend300416antilichaam
Alexa Fluor 647 anti-human CD8 AntibodyBioLegend344726antilichaam
Alexa Fluor 647 anti-human Podoplanin AntibodyBioLegend337007antilichaam
Alexa Fluor 647 anti-Vimentin AntibodyBioLegend677807antilichaam
Alexa Fluor 647 CD68 Antibody (KP1)Santa Cruzsc-20060AF647antilichaam
Alexa Fluor 750 Cytokeratin, pan Antibody (AE-1/AE-3)NovusNBP2-33200AF750antilichaam
Alexa Fluor 750 Human alpha-Smooth Muscle Actin AntibodyR&DIC1420Santilichaam
Alexa Fluor 488 CD20 Monoclonal Antibody (L26) eBioscienceThermo Fisher53-0202-82antilichaam
Antibiotic-AntimycoticGibco15240096supplement harvest medium
BioMed Clear Resin (Form 3)FormLabsRS-F2-BMCL-01hars gebruikt voor platform + incubatieplaat
BSASigmaA7906-500gonderdeel blokkeringsoplossing
Cast acrylic 1/32" thickmateriaal gebruikt voor het snijden van de schuifregelaar
CleanStation DT3 StratasysDT3nabewerking voor hoogteversteller & buitenklep
Container, Specimen McKesson870203overdracht van weefsel van werktafel naar voorbereidingstafel
CorelDraw CorelDRAWSoftware om het vectorgebaseerde ontwerpbestand voor lasersnijden voor te bereiden
CytofixBD Bioscience554655fixeermiddel
Dish 15 cmFalcon353025schaal gebruikt tijdens montage
Dish 35 mm No. 1.5 Coverslip 14 mm Glass Diameter UncoatedMatekP35G-1.5-14-Cbeeldvormingsschaal
DMEM (no glucose)Gibco11966025oogstmedium
Fc BlockBD Bioscience564220onderdeel blokkeringsoplossing
Form 3B+FormlabsForm 3B+printer gebruikt voor platform + incubatieplaat
Form CureFormlabsFH-CU-01nabewerking voor platform + incubatieplaat
Form WashFormlabsFH-WA-01nabewerking voor platform + incubatieplaat
GrabCAD PrintGrabCADGrabCAD PrintSoftware om modellen voor Stratasys-printers voor te bereiden
Hoechst 33342 10 mg/mLBiotium40046nucleaire kleurstof
J826 Prime 3D PrinterStratasysJ826printer gebruikt voor hoogteversteller & buitenklep
LAS XLeicaLAS XConfocale software
Laser cutting system Universal Laser SystemsULS PLS6.150DCO2 laser snijden gebruikt voor de schuifregelaar
Lithium BorohydrideSTREM Chemicals93-0397bleekmiddel
PBS, pH 7.4Gibco10010023basisbuffer voor wassen, blokkeren, kleuren
PreFormFormLabsPreFormSoftware om modellen voor Formlab-printers voor te bereiden
Silk sutures 2-0 EthiconA305.O35weefsel bevestigen aan het platform
Stellaris 8 WLL confocal microscopeLeicaSTELLARIS 8Confocale beeldvorming 
Syringe filteroplossing voor filterab
Triton X-100American BioAB02025-00100permeabeliserend reagens, onderdeel blokkeringsoplossing
Vero ContactClearStratasysCTT610, 4 KGhars gebruikt voor hoogteversteller & buitenklep
Warming TraySpring USAST-1220medium en weefsel warm houden
Water, distilledGibco15230-170diluent voor LiBH4

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, N. M., Simon, M. C. The tumor microenvironment. Curr Biol. 30 (16), R921-R925 (2020).
  2. Li, Z., Li, J., Bai, X., Huang, X., Wang, Q. Tumor microenvironment as a complex milieu driving cancer progression: A mini-review. Clin Transl Oncol. , (2024).
  3. Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. The immune contexture in cancer prognosis and treatment. Nat Rev Clin Oncol. 14 (12), 717-734 (2017).
  4. Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. Targeting tumor microenvironment for cancer therapy. Int J Mol Sci. 20 (4), 840(2019).
  5. Sheng, W., et al. Multiplex immunofluorescence: A powerful tool in cancer immunotherapy. Int J Mol Sci. 24 (4), 3086(2023).
  6. Bollhagen, A., Bodenmiller, B. Highly multiplexed tissue imaging in precision oncology and translational cancer research. Cancer Discov. 14 (11), 2071-2088 (2024).
  7. Jin, Y., et al. Advances in spatial transcriptomics and its applications in cancer research. Mol Cancer. 23 (1), 129(2024).
  8. Kashyap, A., et al. Quantification of tumor heterogeneity: From data acquisition to metric generation. Trends Biotechnol. 40 (6), 647-676 (2022).
  9. Chang, Q., Hedley, D. Emerging applications of flow cytometry in solid tumor biology. Methods. 57 (3), 359-367 (2012).
  10. Zhang, L., et al. Single-cell analyses inform mechanisms of myeloid-targeted therapies in colon cancer. Cell. 181 (2), 442-459.e29 (2020).
  11. Wang, X. Q., et al. Spatial predictors of immunotherapy response in triple-negative breast cancer. Nature. 621 (7980), 868-876 (2023).
  12. Maestri, E., et al. Spatial proximity of tumor-immune interactions predicts patient outcome in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 79 (4), 768-779 (2024).
  13. Wang, Q., et al. Role of tumor microenvironment in cancer progression and therapeutic strategy. Cancer Med. 12 (10), 11149-11165 (2023).
  14. Veninga, V., Voest, E. E. Tumor organoids: Opportunities and challenges to guide precision medicine. Cancer Cell. 39 (9), 1190-1201 (2021).
  15. Lin, J. R., et al. Multiplexed 3d atlas of state transitions and immune interaction in colorectal cancer. Cell. 186 (2), 363-381.e19 (2023).
  16. Radtke, A. J., et al. Ibex: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
  17. Radtke, A. J., et al. Ibex: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
  18. Van Baal, J. O., et al. The histophysiology and pathophysiology of the peritoneum. Tissue Cell. 49 (1), 95-105 (2017).
  19. Bridda, A., Padoan, I., Mencarelli, R., Frego, M. Peritoneal mesothelioma: A review. MedGenMed. 9 (2), 32(2007).
  20. Demuytere, J., Ernst, S., Van Ovost, J., Cosyns, S., Ceelen, W. The tumor immune microenvironment in peritoneal carcinomatosis. Int Rev Cell Mol Biol. 371, 63-95 (2022).
  21. Wang, Q., et al. Heterogeneity of tertiary lymphoid structures predicts the response to neoadjuvant therapy and immune microenvironment characteristics in triple-negative breast cancer. Br J Cancer. , (2024).
  22. Kepenekian, V., et al. Peritoneal mesothelioma: Systematic review of hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (HIPEC) protocol outcomes. Indian J Surg Oncol. 14 (Suppl 1), 39-59 (2023).
  23. Mcquade, C., Renton, M., Chouhan, A., Macdermott, R., O'brien, C. Review of imaging peritoneal disease and treatment. Can Assoc Radiol J. , (2024).
  24. Kenerson, H. L., et al. Tumor slice culture as a biologic surrogate of human cancer. Ann Transl Med. 8 (4), 114(2020).
  25. Arrizabalaga, L., et al. Tumor slice culture system for ex vivo immunotherapy studies. Methods Cell Biol. 189, 55-69 (2024).
  26. Neumeister, V. M., et al. Quantitative assessment of effect of preanalytic cold ischemic time on protein expression in breast cancer tissues. J Natl Cancer Inst. 104 (23), 1815-1824 (2012).
  27. Panchuk-Voloshina, N., et al. Alexa dyes: A series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47 (9), 1179-1188 (1999).
  28. Rajaram, S., et al. Sampling strategies to capture single-cell heterogeneity. Nat Methods. 14 (10), 967-970 (2017).
  29. Bella, A., et al. Mouse models of peritoneal carcinomatosis to develop clinical applications. Cancers (Basel). 13 (5), 963(2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Tumor MicroenvironmentMultiplex ImmunofluorescenceThree Dimensional ImagingIterative BleachingIBEX MethodConfocal MicroscopyImmune Cell InfiltrationTumor Lesion AnalysisTertiary Lymphoid StructuresTissue Mounting

Gerelateerde artikelen