Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gebruik van in vivo assemblage voor zeer efficiënte plasmideconstructie

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67870

⸱

7 februari 2025

 , 
1College of Medicine, Department of Biochemistry, Microbiology, and Immunology, University of Saskatchewan

In dit artikel

Samenvatting

In vivo assemblage is een ligatie-onafhankelijke kloneringsmethode die berust op intrinsieke DNA-reparatie-enzymen in bacteriën om DNA-fragmenten te assembleren door homologe recombinatie. Dit protocol is zowel tijd- als kosteneffectief, aangezien er weinig reagentia nodig zijn en de kloonefficiëntie kan oplopen tot 99%.

Samenvatting

In vivo assemblage (IVA) is een moleculaire kloneringsmethode die gebruik maakt van intrinsieke enzymen die aanwezig zijn in bacteriën die intermoleculaire recombinatie van DNA-fragmenten bevorderen om plasmiden te assembleren. Deze methode werkt door DNA-fragmenten met gebieden van 15-50 bp homologie om te zetten in veelgebruikte Escherichia coli-stammen in het laboratorium en de bacteriën gebruiken de RecA-onafhankelijke reparatieroute om de DNA-fragmenten in een plasmide te assembleren. Deze methode is sneller en kosteneffectiever dan veel moleculaire kloonmethoden die afhankelijk zijn van in vitro assemblage van plasmiden voorafgaand aan transformatie in E. coli-stammen . Dit komt omdat in-vitromethoden de aankoop van gespecialiseerde enzymen en de uitvoering van sequentiële enzymatische reacties vereisen die incubaties vereisen. In tegenstelling tot in-vitromethoden is echter niet experimenteel aangetoond dat IVA lineaire plasmiden assembleert. Hier delen we het IVA-protocol dat door ons laboratorium wordt gebruikt om snel plasmiden te assembleren en DNA-fragmenten te subklonen tussen plasmiden met verschillende oorsprong van replicatie en antibioticaresistentiemarkers.

Inleiding

Moleculair klonen omvat een reeks laboratoriumtechnieken die nodig zijn om plasmiden te produceren die specifiek recombinant DNAbevatten 1. Deze alomtegenwoordige technieken fungeren vaak als een knelpunt in de experimentele workflow2. Veel moleculaire kloontechnieken zijn gebaseerd op de assemblage van DNA-fragmenten in vitro met behulp van een reeks enzymatische reacties voorafgaand aan de transformatie in een gastheerstam (bijv. Escherichia coli DH5a) voor amplificatie 3,4,5,6,7. Aangezien in vitro plasmide-assemblagemethoden afhankelijk zijn van enzymen, kan het kopen of zuiveren van enzymen zowel kostbaar als tijdrovend zijn.

In vivo assemblage (IVA) is een moleculaire kloonmethode die berust op intermoleculaire recombinatie van DNA-fragmenten in een geschikte gastheer 8,9,10,11,12. De basis van deze methode was de observatie dat veelgebruikte recA-kloneringsstammen van E. coli intermoleculaire recombinatie konden mediëren van een enkelstrengs primer met een plasmide gesplitst door restrictie-enzymen13. Het gebruik van PCR om homologe DNA-uiteinden te genereren voor plasmide-assemblage in E. coli werd beschreven in de jaren 1990 en deze methode werd recombinatie-PCR 3,14 genoemd. De efficiëntie van recombinatie-PCR werd gerapporteerd als ongeveer 50%14. Deze methode werd echter niet op grote schaal toegepast, waarschijnlijk vanwege de hoge kosten van primers en het risico van het introduceren van ongewenste mutaties met behulp van low-fidelity polymerasen om grote DNA-fragmenten te amplificeren. Deze nadelen waren aanzienlijk in de jaren 1990 en konden worden vermeden door gebruik te maken van in vitro kloonmethoden zoals restrictie-enzym-gemedieerd klonen.

In de afgelopen jaren zijn de kosten van primers gedaald en hebben nieuwe commerciële polymerasen de getrouwheid van PCR-amplificatie verhoogd. Als gevolg hiervan werd recombinatie-PCR opnieuw bekeken als een snelle en kosteneffectieve moleculaire kloontechniek en omgedoopt tot IVA 2,9,15,16. Met een grotere haalbaarheid werd IVA verder onderzocht en werd de methode geoptimaliseerd om kloonrendementen tot 99%16 te bereiken. Optimalisaties identificeerden kenmerken van homoloog DNA, zoals het aantal basenparen en de smelttemperatuur, die de in vivo recombinatie-efficiëntie maximaliseren 2,16. Verdere analyse toonde aan dat tot 6 DNA-fragmenten, variërend van 150 bp tot 7 kbp, efficiënt konden worden geassembleerd door IVA15. Daarnaast heeft onze groep onlangs IVA gebruikt om een plasmideserie samen te stellen met verschillende antibioticaresistentiecassettes en origins of replication17. In deze studie was IVA-klonen zeer efficiënt (71-100%) met een klein aantal klonen getest voor elk plasmide (n = 2)17. Hier beschrijven we het IVA-protocol dat door ons laboratorium wordt gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Ontwerp primers of DNA-fragmenten met homologe uiteinden

  1. Gebruik tekstverwerkingssoftware of gespecialiseerde DNA-analysesoftware om het gewenste plasmide kunstmatig samen te stellen.
    OPMERKING: Het is vaak nuttig om DNA-fragmenten uit verschillende bronnen een kleurcode te geven en homologe gebieden te markeren die zullen worden gebruikt in stroomafwaartse assemblagestappen. Daarnaast is het ook nuttig om homoloog DNA een kleurcode te geven om gerichte assemblage te garanderen.
  2. Ontwerp primers die aan elk DNA-fragment binden en 15-50 bp van de homologe DNA-sequentie bevatten (Figuur 1)2,15.
    1. Voor een verhoogde IVA-efficiëntie moet ervoor worden gezorgd dat homologe DNA-fragmenten een smelttemperatuur van 47-52 °C2 hebben.
      OPMERKING: De smelttemperatuur kan worden bepaald met behulp van online software18 of de formule: Smelttemperatuur = 64.9 + 41 * (nG + nC - 16.4)/(nA + nT + nG + nC), waarbij n = aantal G, C, A of T in de reeks 6,19.
    2. Vermijd primers met zeer repetitieve sequenties zoals CATCATCATCATCATCATCAT die coderen voor een HIS-tag, omdat deze instabiliteit kunnen introduceren20. Als een laatste repetitieve aminozuursequentie nodig is voor toepassingen zoals het invoegen van een poly-HIS-tag, gebruik dan alternatieve codons zoals CATCACCATCATCACCAC om de herhaling van de nucleïnezuursequentie te verminderen.
      OPMERKING: Primers kunnen worden besteld bij elke voorkeursleverancier. Als DNA-fragmenten worden gesynthetiseerd, moeten homologe uiteinden worden opgenomen in het gesynthetiseerde DNA-fragment.

2. Amplificatie van DNA-producten die homologe uiteinden bevatten

  1. Isoleer plasmide-DNA of genomische DNA-sjablonen met behulp van standaard in de handel verkrijgbare DNA-isolatiekits of alkalische lysis 6,17.
  2. Gebruik sjabloon-DNA (uit stap 2.1) en primers met homologe gebieden (stap 1.2) in een PCR-reactie met een in de handel verkrijgbare high-fidelity polymerase. Om de overdracht van de DNA-sjabloon in stroomafwaartse reacties te beperken, gebruikt u in elke reactie een kleine hoeveelheid sjabloon-DNA (20 pg-1 ng). Raadpleeg de aanbevelingen van de fabrikant voor enzymspecifieke PCR-reactiemengselcomponenten en aanbevolen PCR-cyclusomstandigheden. Ga verder met de PCR-reactie.
    1. Stel de PCR-reacties (50 μL) in om de DNA-fragmenten in figuur 2 te amplificeren om 100 μM dNTP's, 0,2 μM van elke DNA-primer, sjabloon-DNA (50 pg pSU19 en 1 ng pSU18mCherry), 1x PCR-reactiebuffermengsel met Mg2+ (2 mM eindconcentratie) en 1 U high-fidelity DNA-polymerase te bevatten.
    2. Gebruik een touchdown PCR-fietsprogramma om pSU19 en mCherry te versterken (Figuur 2). Stel de eerste denaturatiestap in op 95 °C gedurende 5 min, gevolgd door 10 cycli van 95 °C gedurende 15 s, 55 °C-0,5 °C per cyclus gedurende 15 s en 72 °C gedurende 1 minuut en vervolgens 20 extra cycli van 95 °C gedurende 15 s, 50 °C gedurende 15 s en 72 °C gedurende 1 min. Voltooi de PCR-cyclus met een laatste verlengstap bij 72 °C gedurende 10 minuten.
      OPMERKING: Als een plasmide-ruggengraat moet worden geamplificeerd, pas dan de hoeveelheid DNA-sjabloon aan op basis van het molecuulgewicht: met ~20 pg/1 kbp plasmide-DNA per 50 μL PCR-reactie (50 pg DNA voor pSU19 (afgebeeld)). Pas bovendien de PCR-cycli aan om het aantal mutaties dat tijdens de amplificatie wordt geïntroduceerd te minimaliseren: voor amplificatie van de plasmide-backbones zijn slechts 20-25 PCR-cycli voldoende.
  3. Zodra de PCR-reactie is voltooid, verwijdert u een aliquoot (2 μL) van de PCR-reactie, combineert u met ladende kleurstof (tot 1x concentratie) en scheidt u DNA-fragmenten door agarosegelelektroforese21. Gebruik een ultraviolette (UV) of LED-transilluminator om DNA-fragmenten te visualiseren die in de agarosegel zijn gemigreerd. Bepaal of PCR-producten uniek zijn en vergelijk producten met de DNA-ladder om te controleren of ze het verwachte molecuulgewicht hebben (Figuur 2). Als er geen PCR-producten met het juiste molecuulgewicht worden gevisualiseerd, raadpleeg dan de aanbevelingen van de fabrikant voor het optimaliseren van de PCR-reactie.
    OPMERKING: Wanneer de PCR-producten niet uniek zijn, maar er een overvloedig DNA-fragment is dat overeenkomt met het verwachte molecuulgewicht, kan een extra PCR-reactie worden vermeden.
  4. Als er meerdere DNA-fragmenten in de agarosegel aanwezig zijn, verwijder dan het DNA-fragment dat overeenkomt met het verwachte molecuulgewicht van de agarosegel en gebruik een agarosegelextractiekit om het DNA-fragment te herstellen.
  5. Om gemethyleerd sjabloon-DNA uit de PCR-reacties te verwijderen, voegt u 1 μL DpnI rechtstreeks toe aan de reactiebuis. Incubeer de reacties bij 37°C gedurende 15 minuten tot een nacht.
    OPMERKING: Deze optionele stap wordt ten zeerste aanbevolen om de hoeveelheid sjabloon-DNA te beperken die wordt overgedragen in stroomafwaartse reacties. Deze stap kan echter worden overgeslagen als bij de PCR-reactie zeer lage concentraties sjabloon-DNA worden gebruikt.
  6. Gebruik een nucleïnezuurzuiveringskit om resterende enzymen, zouten, primerdimeren en andere ongewenste laagmoleculaire DNA-producten te verwijderen die het resultaat zijn van enzymatische tests.
    OPMERKING: Stappen 2.1-2.6 kunnen worden overgeslagen als DNA-fragmenten worden gesynthetiseerd.
  7. Kwantificeer de DNA-concentratie van de gezuiverde DNA-fragmenten door middel van spectrofotometrie of gelschatting.

3. IVA (Figuur 3)

  1. Bereken de hoeveelheid DNA die nodig is voor elke IVA-reactie (25-50 ng plasmide-DNA wordt aanbevolen). Gebruik grotere hoeveelheden plasmide-DNA voor plasmiden met een hoger molecuulgewicht (bijv. voor plasmiden van 2,3 kbp, gebruik 25 ng plasmide, maar als plasmiden 9 kbp zijn, gebruik dan 50 ng in elke reactie). Bereken het volume van het insert-DNA dat nodig is voor de reactie; gebruik een molaire verhouding van 1:3 of 1:5 van plasmide:insert DNA.
    OPMERKING: Online bio-calculators of de onderstaande formules kunnen worden gebruikt om de molaire hoeveelheid van een dubbelstrengs DNA-fragment te berekenen en de molaire verhouding van elk DNA-fragment te bepalen.
    We gebruiken de volgende formule om de molaire hoeveelheid van een dubbelstrengs DNA-fragment te berekenen: pmol = (gewicht in ng) × 1.000 / (basenparen × 650 dalton). Bovendien kunnen molaire verhoudingen worden berekend door: massa insertie (g) = gewenste insert/plasmide-molaire verhouding × massa van plasmide (g) × verhouding van insert tot plasmidelengtes6.
  2. Combineer het berekende volume plasmide en breng DNA in een voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 ml en bewaar op ijs.
  3. Breng het plasmide over en breng het DNA-mengsel uit stap 3.2 in in een aliquoot (25-100 μl) ontdooide chemisch competente E. coli (bv. E. coli DH5a;22).
    OPMERKING: Het volume van de gebruikte competente cellen is afhankelijk van het volume van het plasmide en het insert-DNA-mengsel; Dit mengsel mag niet meer dan 10% van het volume van de competente cellen bedragen.
  4. Ga verder met een hitteschoktransformatie23.
    1. Incubeer het mengsel van chemisch competente E. coli en DNA op ijs gedurende 30 minuten.
    2. Breng over naar een waterbad van 42 °C gedurende 1 minuut en breng de buis vervolgens 2 minuten over op ijs.
    3. Breng LB aseptisch over naar de buis om het volume aan te vullen tot 1 ml.
    4. Breng het volume van 1 ml over in een glazen kweekbuis en plaats deze in een schudbroedmachine die is ingesteld op 37 °C, 220 tpm of de aanbevolen temperatuur voor de bacteriestam en/of het plasmide om te herstellen (typisch bereik van 25 °C-37 °C) en zorg voor de productie van de plasmide-gecodeerde antibioticaselectiemarker.
  5. Nadat de cellen zich gedurende 30 minuten tot 1 uur hebben hersteld, wordt een aliquoot (100 μl van 1.000 μl) van de transformatiereactie op vaste selectiemedia gedeponeerd en wordt een steriele celverspreider gebruikt om het aliquot over de agar-kweekplaat te verspreiden. Verzamel de rest van de getransformeerde cellen door centrifugatie (13.000 × g gedurende 1 minuut), gooi de supernatant weg, suspendeer de celpellet opnieuw in 100 μL steriele media en deponeer op vaste selectiemedia zoals hierboven. Laat de vloeistof 30 minuten intrekken in vaste media, keer de kweekplaten om. En plaats ze een nacht in een broedmachine op de aanbevolen temperatuur voor de bacteriestam en/of het plasmide.

4. Screening op correcte plasmide-assemblage

  1. Na de incubatie (stap 3.5) verwijdert u de kweekplaten uit de broedmachine en telt u de kolonies op door direct te tellen of er meerdere geïsoleerde bacteriekolonies op elke kweekplaat zijn. Selecteer verschillende kolonies (1-10) voor screening om te bepalen of ze het gewenste geassembleerde plasmide bevatten.
    1. Breng steriele groeimedia aangevuld met geschikte antibiotica over in steriele kweekbuisjes (glas of plastic). Inoculeer de kweekmedia door 1 kolonie aan te raken met een steriele transfernaald of -lus en breng de cellen met de transfernaald over in de kweekbuismedia. Plaats de kweekbuisjes in een schudbroedmachine en incubeer gedurende 16-18 uur bij de aanbevolen temperatuur voor de bacteriestam en/of het plasmide (typisch bereik van 25 °C tot 37 °C).
  2. Isoleer de volgende dag plasmide-DNA uit de bacterieculturen door middel van alkalische lysis6 of met behulp van een in de handel verkrijgbare plasmide-isolatiekit volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Bepaal of de plasmiden correct zijn samengesteld.
    1. Kwantificeer de DNA-concentratie van de geïsoleerde plasmiden door middel van spectrofotometrie of gelschatting.
    2. Gebruik een aliquoot (50-150 ng) plasmide-DNA voor een diagnostische restrictieve spijsverteringsreactie (10 μL eindvolume). Selecteer restrictie-enzymen op basis van waar ze naar verwachting het geassembleerde plasmide-DNA zullen splitsen.
      OPMERKING: We raden twee afzonderlijke reacties aan: (1) het behandelen van plasmide-DNA met een restrictie-enzym waarvan wordt verwacht dat het het plasmide op een enkele plaats splitst en (2) het behandelen van plasmide-DNA met twee restrictie-enzymen waarvan wordt verwacht dat ze het ingebrachte DNA-fragment geheel of gedeeltelijk wegsnijden. Restrictie-enzymen zijn in de handel verkrijgbaar en moeten worden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Zodra de restrictie-enzymreactie is voltooid, combineert u met ladende kleurstof (tot 1x concentratie), laadt u het hele mengsel op een agarosegel en scheidt u de DNA-fragmenten door agarosegelelektroforese21. Gebruik een UV- of LED-transilluminator om de DNA-fragmenten te visualiseren die in de agarosegel zijn gemigreerd. Vergelijk beperkte DNA-fragmenten met de molecuulgewichtsladder om te bepalen of ze het verwachte molecuulgewicht of de verwachte molecuulgewichten hebben (Figuur 4). Let op de plasmiden met de verwachte enzymrestrictiepatronen ( positieve klonen genoemd); Gooi de buisjes weg die plasmiden bevatten die niet het verwachte restrictiepatroon hebben ( negatieve klonen genoemd).
  4. Om ervoor te zorgen dat positieve klonen de verwachte nucleotidesequentie hebben, stuurt u een aliquot positieve plasmide-klonen voor sequencing.
    OPMERKING: Sequencing van het hele plasmide wordt aanbevolen (bijv. sequencing van nanoporiën).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit manuscript hebben we, als voorbeeld van IVA-gebruik, de IVA-workflow gevolgd die is verstrekt om het open leesraam van mCherry opnieuw te klonen naar de meervoudige kloonplaats van plasmide pSU19 om een plasmide te genereren dat identiek is aan pSU19mCherry (Figuur 3)17. Primers die geschikt zijn voor IVA zijn ontworpen op basis van protocolstap 1.1 en 1.2. Vervolgens werd een plasmide-isolatiekit gebruikt om pSU19 en pSU18mChe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De meest cruciale stap voor succesvol IVA klonen is het ontwerp van het DNA-fragment en de primer. De IVA-efficiëntie wordt sterk verbeterd wanneer homologe fragmenten worden ontworpen om ten minste 15 bp lang te zijn met een smelttemperatuur van ongeveer 47-52 °C. Er is een gedetailleerde studie gepubliceerd waarin de optimalisatie van het ontwerp van IVA-fragmenten wordt onderzocht16. Een andere belangrijke stap voor een hoge kloonefficiëntie is het gebruik van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

HGB wordt gefinancierd door een Canada Graduate Scholarships - Master's programma van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) en een Dean's Doctoral Award (University of Saskatchewan). Dit werk werd ondersteund door een NSERC Discovery Grant (RGPIN-2021-03066), startfondsen (aan JLT) van de University of Saskatchewan en Canada Foundation for Innovation John R. Evans Leaders Fund (subsidienummer 42269 aan JLT). De auteurs danken de heer Eric Toombs voor het verstrekken van de foto van DNA-kwantificering door UV-spectroscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 kb Plus DNA ladderFroggaBioDM015-R500DNA molecuulgewicht marker
AccuReady M Single Channel 0,5-10 µLBulldog BioBPP020Pipetten voor het overbrengen van vloeistof
AccuReady M Single Channel Pipettor KitBulldog BioBPK100Pipetten voor het overbrengen van vloeistof
AgarBioShop CanadaAGR003.1Verstevigingsmiddel voor groeimedium
AgaroseBiobasicD0012Maak agarose gels voor DNA elektroforese
Biometra TOne Analytikjena846-2-070-301Thermocycler
Kappen voor glazen kweekbuizenFisher Scientific14-957-91Herbruikbare kappen voor glazen kweekbuizen
DNA-primersIntegrated DNA TechnologiesN/ABind en versterk sjabloon-DNA in PCR-reactie
DpnI New England BiolabsR0176SKnip gemethyleerd sjabloon-DNA na PCR-amplificatie
EcoRINew England BiolabsR3101LBeperkingsenzym, wordt geleverd met geschikte buffer
Eppendorf microtubes 1,5 mLSarstedt72.690.300Microbuis, 1,5 mL, conische bodem, PP, aangehechte platte dop, gegoten gradaties en bevroren schrijfruimte
EthidiumbromideFisher ScientificAAL0748203DNA-visualisatie/intercaleringsmiddel, giftig
EZ-10 Spin Column Plasmid DNA Miniprep KitBiobasicBS614Isolateer plasmide-DNA van overnachtelijke bacterieculturen
GelDoc Go-Gel systeemBio-Rad12009077Afbeeldingen van DNA-gels
Glazen kweekbuizenFisher Scientific14-925EGlazen kweekbuizen
myGel Mini Elektroforese SysteemSigma-AldrichZ742288Systeem gebruikt voor gelelektroforese
NanoDrop OneThermo FisherND-ONE-WBepaal DNA-concentratie
PCR Clean Up voor DNA-sequencingBiobasicBT5100Zuiver PCR-producten 
PetrischaalSarstedt82.1473.011Petrischaal 92 x 16 mm, PS, transparant, met ventilatie-cam
Pipettip, 1000 µLSarstedt70.305Pipettips voor 100-1000 µL
Pipettip, 2,5 µLSarstedt70.3010.265Pipettips voor maximaal 2,5 µL
Pipettip, 20 µLSarstedt70.3020.200Pipettips voor maximaal 20 µL
Pipettip, 200 µLSarstedt70.3030.020Pipettips voor 1-200 µL
Zout (NaCl)Fisher ScientificS271-10Component van bacterieel groeimedium (10 g/L)
Enkel 0,2 mL PCR-buizen met platte dopFroggaBioTF-1000PCR-buizen
Tryptone (Bacteriologisch)BioShop CanadaTRP402.5Component van bacterieel groeimedium (10 g/L)
VeriFi DNA polymerasePCR BiosystemsPB10.42-01Hoge-fidelity polymerase, de PCR-buffer met Mg2+ en dNTP's wordt bij aankoop geleverd
Xba INew England BiolabsR0145SBeperkingsenzym, wordt geleverd met geschikte buffer
GistextractBioShop CanadaYEX401.205Component van bacterieel groeimedium (5 g/L)

Referenties

  1. Bertero, A., Brown, S., Vallier, L. Methods of cloning. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Chapter 2, Academic Press. 19-39 (2017).
  2. Garcia-Nafria, J., Watson, J. F., Greger, I. H. IVA cloning: A single-tube universal cloning system exploiting bacterial in vivo assembly. Sci Rep. 6, 27459(2016).
  3. Bubeck, P., Winkler, M., Bautsch, W. Rapid cloning by homologous recombination in vivo. Nucleic Acids Res. 21 (15), 3601-3602 (1993).
  4. Avilan, L. Assembling multiple fragments: the Gibson assembly. Methods Mol Biol. 2633, 45-53 (2023).
  5. Stukenberg, D., et al. The Marburg Collection: A Golden Gate DNA assembly framework for synthetic biology applications in Vibrio natriegens. ACS Synth Biol. 10 (8), 1904-1919 (2021).
  6. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  7. Engler, C., Marillonnet, S. Golden Gate cloning. Methods Mol Biol. 1116, 119-131 (2014).
  8. Ma, H., Kunes, S., Schatz, P. J., Botstein, D. Plasmid construction by homologous recombination in yeast. Gene. 58 (2-3), 201-216 (1987).
  9. Cao, P., Wang, L., Zhou, G., Wang, Y., Chen, Y. Rapid assembly of multiple DNA fragments through direct transformation of PCR products into E. coli and Lactobacillus. Plasmid. 76, 40-46 (2014).
  10. Conley, E. C., Saunders, V. A., Saunders, J. R. Deletion and rearrangement of plasmid DNA during transformation of Escherichia coli with linear plasmid molecules. Nucleic Acids Res. 14 (22), 8905-8917 (1986).
  11. Conley, E. C., Saunders, V. A., Jackson, V., Saunders, J. R. Mechanism of intramolecular recyclization and deletion formation following transformation of Escherichia coli with linearized plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 14 (22), 8919-8932 (1986).
  12. Sung, W. L., Zahab, D. M. Site-specific recombination directed by single-stranded crossover linkers: specific deletion of the amino-terminal region of the beta-galactosidase gene in pUC plasmids. DNA. 6 (4), 373-379 (1987).
  13. Mandecki, W. Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 83 (19), 7177-7181 (1986).
  14. Jones, D. H., Howard, B. H. A rapid method for recombination and site-specific mutagenesis by placing homologous ends on DNA using polymerase chain reaction. Biotechniques. 10 (1), 62-66 (1991).
  15. Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5alpha-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), e0137466(2015).
  16. Chen, F., et al. Simplified plasmid cloning with a universal MCS design and bacterial in vivo assembly. BMC Biotechnol. 21 (1), 24(2021).
  17. Braun, H. G., Kanwal, N., Rivera Lopez, L. F., Thomassin, J. L. Generation of a plasmid series for rapid sub-cloning and use in various Enterobacteriaceae. J Biosci Bioeng. 138 (6), 478-487 (2024).
  18. Kibbe, W. A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Res. 35 (Web Server issue), W43-W46 (2007).
  19. Wallace, R. B., et al. Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch. Nucleic Acids Res. 6 (11), 3543-3557 (1979).
  20. Bzymek, M., Lovett, S. T. Instability of repetitive DNA sequences: The role of replication in multiple mechanisms. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (15), 8319-8325 (2001).
  21. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923(2012).
  22. Sambrook, J., Russell, D. W. The inoue method for preparation and transformation of competent E. coli: "ultra-competent" cells. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  23. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  24. Fürste, J. P., et al. Molecular cloning of the plasmid RP4 primase region in a multi-host-range tacP expression vector. Gene. 48 (1), 119-131 (1986).
  25. Bäumler, A. J., et al. Identification of a new iron regulated locus of Salmonella typhi. Gene. 183 (1-2), 207-213 (1996).
  26. Godiska, R., et al. Linear plasmid vector for cloning of repetitive or unstable sequences in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 38 (6), e88(2010).
  27. Watson, J. F., Garcia-Nafria, J. In vivo DNA assembly using common laboratory bacteria: A re-emerging tool to simplify molecular cloning. J Biol Chem. 294 (42), 15271-15281 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Moleculaire kloneringDNA-fragmentassemblageEscherichia coliPCR-amplificatieagarosegelelektroforesehitteschoktransformatieantibioticaselectierestrictiedigestie
Gebruik van in vivo assemblage voor zeer efficiënte plasmideconstructie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.