Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Voorspelling van de significantie van antilichamen tegen rode bloedcellen met behulp van de monocyt-macrofaagtest

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67877

⸱

7 februari 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 2Centre for Innovation, Canadian Blood Services, Keenan Research Centre, 3Polytech Clermont, 4Department of Medicine, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

We hebben verbeteringen en bijgewerkte methoden ontwikkeld voor de bestaande monocyt-monolaagtest (MMA), waarin macrofagen worden gebruikt om de klinische relevantie van allo-antilichamen van rode bloedcellen in transfusiegeneeskunde en immunologie beter te voorspellen. Deze test wordt de monocyt-macrofaagtest (M-MA) genoemd.

Samenvatting

Afgeleid van monocyten in het beenmerg, zijn macrofagen grote, aangeboren immuuncellen die een belangrijke rol spelen bij het opruimen van dode cellen, puin, tumorcellen en vreemde ziekteverwekkers. De fagocytische capaciteit van monocyten versus macrofagen is een concept dat niet goed wordt begrepen. Hier willen we een verschil onderzoeken in de fagocytose van monocyten versus macrofagen, met name M1/M2-macrofagen, tegen verschillende opsoniseerde rode bloedcellen met behulp van een aangepaste en bijgewerkte versie van de gevestigde monocytmonolaagtest (MMA). Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) werden geïsoleerd uit donorbuffy-vachten. Met behulp van gezuiverde monocyten werden inflammatoire M1- en ontstekingsremmende M2-macrofagen geproduceerd door in vitro cultuur en polarisatie. M1/M2-cellen werden geoogst en gebruikt in een MMA-achtige test, die we de M-MA noemen, om klinisch significante fagocytose van verschillende antilichamen van rode bloedcellen te ontcijferen. Een fagocytaire index (PI) > 5 werd als klinisch significante fagocytose beschouwd bij het gebruik van monocyten. Een fagocytaire index (PI) > 12 werd als klinisch significante fagocytose beschouwd bij het gebruik van M1/M2-macrofagen. M2-macrofagen vertonen een verhoogd vermogen om opsoniseerde RBC's te fagocyteren in vergelijking met monocyten en M1's. Hetzelfde zwakke antilichaam (anti-S) levert significante fagocytose op met alleen M2-macrofagen (PI=43) maar niet M1's (PI=2) of monocyten (PI=0), en dit werd herhaaldelijk aangetoond met behulp van verschillende antilichamen. Het gebruik van M2-macrofagen in plaats van monocyten kan nauwkeurigere resultaten opleveren, aangezien deze cellen meer fagocytisch zijn, wat verdere klinische relevantie voor de test biedt. Verdere studies met verschillende antilichamen tegen rode bloedcellen, waaronder validatie van de monocyt-macrofaagtest (M-MA) met antilichamen waarvan de klinische betekenis bekend is, kunnen aantonen dat de M-MA nuttiger is om klinisch significante allo-antilichamen van rode bloedcellen en transfusiereacties te helpen voorspellen. Deze methode zal het gebied van transfusiegeneeskunde en immunologie vooruit helpen.

Inleiding

Het voorspellen van transfusiereacties blijft een belangrijke uitdaging op het gebied van transfusiegeneeskunde. In de afgelopen 4 decennia heeft de monocyt-monolaagtest (MMA), ontwikkeld door Tong en Tak 1,2, gediend als een waardevolle in vitro cellulaire test voor het voorspellen van de klinische uitkomst van hemolyse bij bloedtransfusiepatiënten1. Deze test heeft inderdaad een belangrijke rol gespeeld bij het onderscheiden van klinisch significante en niet-significante antilichamen tegen rode bloedcellen (RBC)2. Hoewel monocyten van oudsher de standaard leukocyten zijn die in deze test worden gebruikt, is ons onderzoek gericht op het onderzoeken van de potentiële voordelen van het gebruik van van monocyten afgeleide macrofagen als alternatief. Deze cellen kunnen het vermogen van de tests verbeteren om de klinische relevantie van allo-antilichamen van rode bloedcellen te beoordelen.

In de historische MMA worden monocyten, die de voorlopers zijn van macrofagen, de immuuncellen die verantwoordelijk zijn voor de klaring en vernietiging van rode bloedcellen tijdens een ongunstige transfusiereactie, geïntroduceerd in een in vitro test samen met RBC's en antilichamen 1,2,3,4,5,6,7. Fagocytose wordt vervolgens visueel beoordeeld door gefagocyteerde RBC's in monocyten te tellen. Een fagocytaire index (PI) van < 5 gefagocyteerde RBC's per 100 getelde monocyten geeft aan dat de patiënt een verminderd risico loopt op het ervaren van een nadelige transfusiereactie en dat het antilichaam als klinisch onbeduidend wordt beschouwd 4,5,6,7. Voorlopige experimenten tonen aan dat het gebruik van monocyten uit perifeer bloed mogelijk niet ideaal is voor het bepalen van klinische significantie, aangezien ze een lagere fagocytische capaciteit hebben dan geactiveerde monocyten en bepaalde macrofagen.

Monocyten zijn een subset van cellen die worden aangetroffen in het bloed, de milt en het beenmerg en zijn goed voor 10% van het totale aantal leukocyten bij mensen8. Deze cellen circuleren meestal 1-2 dagen voordat ze worden gerekruteerd door verschillende weefsels, waar ze vervolgens differentiëren tot macrofagen8. Dit gebeurt meestal tijdens hematopoëse, waarbij het beenmerg monocyten produceert die in de bloedsomloop worden vrijgegeven om weefselmacrofagen te worden die zich in de milt en de lever bevinden2. Macrofagen staan bekend als de eerste verdedigingslinie tegen vreemde ziekteverwekkers en zijn grote fagocytische mononucleaire cellen die een rol spelen bij adaptieve en aangeboren immuniteit9. Onder de ingewikkelde en complexe rollen van het immuunsysteem vormt het begrijpen en karakteriseren van macrofaagfenotypes een formidabele uitdaging die nog niet volledig is begrepen. In de afgelopen twee decennia heeft het begrip polarisatie van macrofagen steeds meer erkenning gekregen, met recente studies die het gebruik van eencellige RNA-sequencing gebruiken om het spectrum te onderscheiden waarin deze macrofagen bestaan.

Klassiek geactiveerde M1- en M1-achtige macrofagen ontstaan in inflammatoire omgevingen die worden gedomineerd door Toll-like receptoren (TLR's)10. Deze cellen kunnen betrokken zijn bij auto-immuunziekten en arteriosclerose en vertonen oppervlaktemarkers zoals MHC-II, CD80 en CD8611,12. Ontstekingsremmende M2- en M2-achtige macrofagen worden aangetroffen in omgevingen die worden gedomineerd door Th2-reacties, missen expressie van CD80 en vertonen oppervlaktemarkers zoals CD209 en CD20611,12. M1/M2-macrofagen kunnen in vitro worden gekweekt uit perifere mononucleaire bloedcellen, waarbij lipopolysaccharide (LPS) en cytokinen zoals GM-CSF en IFNγ (M1) en M-CSF en IL-4 (M2) hun polarisatie stimuleren10,12.

Dit manuscript en de bijbehorende studies hebben tot doel aan te tonen dat M2-macrofagen een verhoogde gevoeligheid voor fagocytose vertonen in vergelijking met M1-macrofagen en monocyten. Het onderzoeken van de fagocytische activiteit van M1/M2-macrofagen versus monocyten in de context van allo-antilichamen van rode bloedcellen en transfusiegeneeskunde is een gebied dat nog moet worden verkend. Hier beschrijven we het huidige lopende werk voor het genereren van M1/M2-macrofagen en vergelijken we de klassieke monocyt-monolaagtest (MMA) met de nieuwe monocyt-macrofaagtest, waarbij we het acroniem M-MA gebruiken om deze macrofaagtest te onderscheiden van de monocytentest, om de voorspellende waarde van in vitro fagocytose-assays te verbeteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen voor het uitvoeren van ethisch onderzoek met menselijke proefpersonen. Ethische goedkeuring werd verleend door de Canadian Blood Services Research Ethics Board (REB), goedkeuring CBSREB#2023.008. Alle stappen van dit protocol moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast onder steriele omstandigheden.

1. Isolatie van PBMC's

  1. Verkrijg volledig menselijk bloed van een donor in een ACD-buisje. Bewaar het bloed maximaal 36 uur bij kamertemperatuur (18 °C–22 °C).
  2. Breng de volbloed ACD-buisjes over in centrifugebuisjes van 50 ml (een enkel buisje van 50 ml voor elke twee ACD-buisjes). Voeg RPMI-1640 compleet medium bij kamertemperatuur toe tot een eindvolume van 35 ml.
  3. Voeg 15 ml kleurdichtheidsgradiënt medium toe aan een nieuwe tube van 50 ml. Breng het verdunde volbloed voorzichtig aan op het dichtheidsgradiëntmedium, waarbij vermenging op het grensvlak tot een minimum wordt beperkt voor een optimale scheiding van het bloed.
  4. Centrifugeer het gelaagde mengsel op 700 x g gedurende 30 minuten met de remmen UIT. De dichtheidsgradiëntcentrifugatie scheidt het mengsel van boven naar beneden in de volgende lagen: plasma, buffy-laag (met PBMC's), dichtheidsgradiëntmateriaal, granulocyten en rode bloedcellen.
  5. Zuig het grootste deel van de toplaag (plasma) op en gooi deze weg. Haal met behulp van een transferpipet voorzichtig de buffy coat (PBMC's) laag op en vermijd het meenemen van extra materiaal. Breng de opgehaalde PBMC's over in een nieuwe buis van 50 ml.
  6. Was de geïsoleerde buffy vachtlaag 1x met pH 7,4 PBS-oplossing gedurende 10 minuten op 350 x g met volledige remmen AAN.
  7. Gebruik een celzeef van 70 μM om vuil of ongewenst materiaal van de PBMC's te verwijderen voordat u ze overbrengt naar een conische buis van 15 ml. Was 2x met pH 7,4 PBS-oplossing gedurende 10 minuten op 350 x g met volledige remmen AAN.
  8. Optioneel: Lyseer alle RBC's die zijn overgedragen met ACK-lysisbuffer. Voeg 5-10 ml ACK-lysisbuffer toe, afhankelijk van de korrelgrootte, en incubeer maximaal 3 minuten bij kamertemperatuur. Na de incubatie een pH van 7,4 PBS bijvullen en 10 minuten centrifugeren bij 350 x g met volledige remmen AAN en 1x wassen. Voer deze stap uit als het aantal rode bloedcellen te hoog is.
    OPMERKING: Het is altijd beter om het gebruik van ACK te vermijden voor betere resultaten. Als alternatief kan water worden gebruikt om niet-gefagocyteerde rode bloedcellen te elimineren door niet langer dan 15 seconden met water te incuberen en vervolgens onmiddellijk 1X PBS toe te voegen aan de wasbeurt.
  9. Reconstitueer PBMC-pellet in 2-3 ml (gebruik 0,5 ml per initiële ACD-buis) van RPMI-1640 compleet medium. Tel PBMC's met een hemocytometer na het bereiden van een 1:1 mengsel met trypanblauw. Telt alleen cellen die niet gekleurd zijn met trypanblauw. Reconstitueer PBMC's tot 2 x 106 cellen/ml in RPMI-1640 volledig medium.

2. Cultuur van M1/M2 macrofagen

  1. Dag 0: zaaien van monocyten
    1. Bereid een celkweekkolf van 25 ml voor elke macrofaagpopulatie. Voeg aan elk 5 ml poly-D-lysine (50 mg/500 ml) toe en laat het minimaal 1 uur in de afzuigkap zitten. Spoel de kolf met PBS om de resterende poly-D-lysine te verwijderen.
    2. Isoleer PBMC's uit de vacht van Buffy of patiëntmonsters, zoals gewoonlijk (zie stap 1). Nadat een pellet PBMC's is gegenereerd, resuspendeert u deze in 10 ml voorverwarmd RPMI-1640 compleet medium.
    3. Bepaal het celnummer en begin met de isolatie van monocyten met de Monocyte-isolatiekit. Gebruik minimaal 50 x 106 cellen om de kit te laten draaien.
    4. Resuspendeer de cellen bij 50 x 106 cellen/ml in een isolatiemedium. Afhankelijk van het verkregen celnummer, gebruikt u de paarse (0,25-2 ml) of grijze (0,5-8,5 ml) magneet die wordt aanbevolen in de monocytisolatiekit.
    5. Volg de instructies van de kit en voeg het monster toe aan de benodigde propyleenbuis (5 ml of 14 ml). Voeg een verrijkingscocktail toe aan het monster van 50 μL/ml monster.
    6. Pilt op en neer of vortex om het monster te mengen en incubeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 2-8 °C in een ijsemmer. Ondertussen, vortex magnetische deeltjes gedurende 30 s. Voeg na de incubatie magnetische deeltjes toe aan het monster: 100 μL/ml monster.
    7. Piket op en neer of vortex om het monster te mengen en incubeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 2-8 °C. Vul bij met een isolatiemedium tot 2,5 ml of 10 ml, dienovereenkomstig met behulp van een gegradeerde pipet. Pipetteer 2x-3x op en neer om te mengen.
    8. Plaats de buis (zonder deksel) in de magneet en incubeer gedurende 2,5 minuut bij kamertemperatuur. Pak de magneet op en keer in één continue beweging de magneet en de buis om, waarbij de celsuspensie in een nieuwe buis wordt gegoten, 5 ml of 14 ml.
    9. Resuspendeer cellen in RPMI-1640-medium en tel ze. Voer deze stap zo snel mogelijk uit. Zaai tussen 1 x 106 – 5 x 106 monocyten in elke kolf van 25 ml die vooraf is voorgecoat met poly-D-lysine. Breng het volume indien nodig op 5 ml met RPMI-1640.
    10. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2, gedurende ten minste 2 uur. Bereid ondertussen M1- en M2-differentiatiemedia voor. Bereid je voldoende voor op dag 0 (10 ml) en dag 4 (2 ml) bijvullen.
      OPMERKING: M1 differentiatiemedium: RPMI-1640 + 2,5 ng/mL GM-CSF; M2 differentiatie medium: RPMI-1640 + 50 ng/mL M-CSF.
    11. Was elke kolf na de incubatietijd 1x met PBS en 2x met volledige RPMI-1640. Voeg 10 ml differentiatiemedium toe aan elke kolf, afhankelijk van het celtype om te differentiëren.
    12. Laat de cellen 6 dagen in de broedmachine differentiëren bij 37 °C, 5% CO2. Vanwege verdamping op dag 4 bijvullen met differentiatiemedium.
  2. Dag 4 - Opwaarderen
    1. Voeg 2 ml van elk differentiatiemedium toe aan de respectieve kolf. Voeg het medium rechtstreeks toe aan de kolf.
  3. Dag 6 - Polarisatie van macrofagen
    1. Bereid M1- en M2-polarisatiemedia voor. Bereid voor M1-polarisatiemedia 5 ml M1-polarisatiemedia voor om aan de corresponderende kolf toe te voegen. De uiteindelijke concentraties moeten 50 ng/ml IFNγ, 10 ng/ml LPS en 2,5 ng/ml gm-csf zijn in RPMI-1640. De kolf aan het einde heeft 15 ml totaal volume (10 ml al in + 5 ml toe te voegen), voer de berekeningen dienovereenkomstig uit.
    2. Bereid voor M2-polarisatiemedia 5 ml M2-polarisatiemedium voor om aan de corresponderende kolf toe te voegen. De uiteindelijke concentraties moeten 20 ng/ml IL-4 en 50 ng/ml m-CSF zijn in RPMI-1640. Merk op dat de kolf aan het einde 15 ml totaal volume zal hebben (10 ml al in + 5 ml toe te voegen); Voer de berekeningen dienovereenkomstig uit.
    3. Voeg 5 ml polarisatiemedium M1 of M2 toe aan elke kolf. Laat de macrofagen minimaal 2 dagen en maximaal 4 dagen in de broedmachine polariseren bij 37 °C, 5% CO2.
  4. Dag 8 - Oogst en flowcytometrie
    1. Voordat u de M1- of M2-macrofagen oogst, verzamelt u het bovenstaande in buisjes van 1,5 ml voor verder gebruik (indien nodig). Voeg 1 ml celloskoppelingsoplossing toe aan de kolf en laat deze gedurende 5 minuten in de incubator bij 37 °C met 5% CO2 staan.
    2. Om de reactie te stoppen, voegt u 3 ml volledige RPMI-1640 toe. Verzamel media in een tube van 15 ml. Voeg 3 ml complete RPMI-1640 toe aan de kolf en gebruik een celschraper om de cellen van de bodem van de kolf los te maken.
    3. Verzamel cellen in een tube van 15 ml. Plaats de kolf 10x onder de microscoop en kijk hoe de cellen ervoor zorgen dat er geen cellen meer aan de bodem van de kolf worden bevestigd.
    4. Was de cellen in PBS 2x. Resuspendeer ze in volledige RPMI-1640 en tel met behulp van de hemocytometer.
    5. Om de kwaliteit en kwantiteit van M1/M2-macrofagen te analyseren, voert u een flowcytometrietest uit. Gebruik 0,5 x 106 cellen per tube en kleur als volgt aan: M1: CD80+ CCR7+ CD209- M2: CD206+ CD209+ CD80-. Gating strategie gebruikt in deze test: #1 Forward Scatter (FSC-A) vs. Side Scatter (SSC-A) Dot Plot, #2 Forward Scatter Height (FSC-H) vs. Forward Scatter Area (FSC-A) Dot Plot voor Doublet Discriminatie, #3 Side Scatter (SSC-A) vs. DAPI-A Dot Plot voor Levende/Dode Cel Discriminatie, #4 Side Scatter (SSC-A) vs. Single Parameter Dot Plot of Histogram (d.w.z., SSC-A vs. FITC-A), #5 Double Parameter Dot Plot (d.w.z. FITC-A vs. APC-A).

3. MMA met behulp van M1/M2-macrofagen

  1. Nadat u de M1/M2-macrofagen hebt verkregen, telt u ze met behulp van een hemocytometer in een kleuringsverhouding van 1:1 met trypanblauw. Reconstitueer M1/M2 tot 1 x 106 cellen/ml in RPMI-1640 compleet medium.
  2. Zaai 400 μl (400.000 cellen) celsuspensie met behulp van een micropipet in elk putje van het kamerglaasje met 8 putjes en incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende ten minste 1,5 uur in een volledig bevochtigde weefselkweekincubator. Elke test moet worden uitgevoerd met een minimum aan drievoudige putjes.
  3. Opsonisatie van testmonsters en RhD+ R2R2 rode bloedcellen
    1. Was RhD+ R2R2 RBC's 3x in pH 7,4 PBS door telkens 5 minuten te centrifugeren op 350 x g . We geven er de voorkeur aan om R2R2 RhD+ RBC's te gebruiken als onze controle omdat het een hogere D-antigeendichtheid heeft, maar alle RhD+ RBC's kunnen worden vervangen. Opsoniseer het testende RBC-monster (bijv. patiënt of donor) RBC's met behulp van interessante antilichamen. Gebruik een 5% RBC-suspensie door 15 μl verpakte RBC's toe te voegen aan 300 μl antilichaammengsel. Opsoniseer de R2R2 RBC's met Anti-D door 15 μL verpakte R2R2 RBC's toe te voegen aan 300 μL Anti-D antilichaammengsel (100 ng/ml).
    2. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 1 uur. Voer intermitterende reconstitutie uit van rode bloedcellen die zich op de bodem hebben genesteld (bijv. vortex elke 15 minuten). Was opsoniseerde RBC's met pH 7,4 PBS 3x door centrifugeren op 350 x g gedurende 5 minuten per keer.
    3. Om te controleren op RBC-opsonisatie, voert u een indirecte antiglobulinetest (IAT) uit. Voeg een secundair opsoniserend anti-humaan antilichaam toe aan het primaire opsoniserende antilichaam. Hemagglutinatie of klontering van RBC's kan binnen 30 s worden waargenomen en geïnterpreteerd als een succesvolle opsonisatie13.
    4. Reconstitueren van gewassen opsoniseerde RhD+ R2R2 RBC's in 1,25% (v/v) met RPMI-1640 compleet medium. Voeg 1.200 μL medium toe aan 15 μL RBC's om 1,25% (v/v) per putje te verkrijgen.
  4. Fc-receptor-gemedieerde fagocytose
    1. Na de incubatie van 1,5 uur van de M1/M2-macrofagen, om deze cellen in staat te stellen zich aan de putjes van de kamer te hechten, zuigt u het bovenstaande medium op en gooit u het weg, volgens een zachte techniek, waarbij u ervoor zorgt dat de pipetpunt alleen de hoek van de putjes raakt. De macrofagen moeten aan de putjes worden gehecht. Raak het midden van de putjes niet aan met de pipetpunt.
    2. Spoel de putjes 1x voorzichtig met een pH van 7,4 PBS. Voeg 400 μL van het juiste 1,25% (v/v) opsonized RBC-mengsel toe aan elk putje van het drievoud. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 2 uur ongestoord.
    3. Bereid na de incubatie twee bekers voor met elk een pH van 100 ml 7,4 PBS.
    4. Verwijder de kamers met 8 putjes met behulp van de adapters van de fabrikant. Dep het overtollige product af op keukenpapier terwijl de dia's vochtig blijven.
    5. Dompel het objectglaasje onder in het bekerglas met de weggegooide supernatanten en spoel het door het langzaam heen en weer te bewegen (20-30 slagen) om de resterende niet-gefagocyteerde rode bloedcellen te verwijderen.
    6. Dompel het glaasje vervolgens onder in de tweede beker en spoel langzaam nog 20-30 bewegingen. Verwijder het glaasje van PBS en dep het overtollige af op keukenpapier. Raak de voorkant van de kamers niet aan. Dompel het glaasje nu 1 minuut in water om eventuele aanhangende, niet-gefagocyteerde rode bloedcellen te verwijderen, maar het is misschien niet nodig als u gefagocyteerde van aanhangende rode bloedcellen kunt onderscheiden. Aan de lucht drogen.
    7. Dompel de objectglaasjes 45 s onder in 100% methanol om ze te fixeren en laat ze vervolgens aan de lucht drogen. Monteer de dia met behulp van een zelf voorbereid montagemedium en voeg dekglaasjes (24 x 75 mm) toe. Laat het een nacht drogen voordat u het kwantificeert.
  5. Kwantificering van fagocytose
    1. Met behulp van een fasecontrastmicroscoop, een 40x objectieflens en een handmatige celteller wordt fagocytose gekwantificeerd.
    2. Met behulp van twee handmatige celtellers, één in elke hand, tellen gefagocyteerde RBC's met de ene teller en het totale aantal monocyten/macrofagen met de andere. Tel 300 monocyten/macrofagen per putje.
    3. Bereken de gemiddelde fagocytaire index (PI) per test (over drievouden) door het aantal gefagocyteerde RBC's te delen door het totale aantal getelde monocyten en te vermenigvuldigen met 100. Druk de gegevens uit als gemiddelde PI ± standaardfout van het gemiddelde (SEM).
      PI = (gefagocyteerde RBC's / 300 macrofagen) x 100

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De resultaten in Figuur 1 komen overeen met de literatuur en duiden op een succesvolle polarisatie van macrofagen van hun M0-toestand naar hun daaropvolgende M1/M2-toestand. M1- en M2-macrofagen werden gedurende 8 dagen gekweekt (6 dagen met groeifactoren en 2 dagen polarisatie) en anti-D of anti-k opsonized RBC's werden getest (Figuur 2). M2-macrofagen vertonen een hoge fagocytische index in vergelijking met M1...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Om het succes van de methode te garanderen, moet men zich houden aan de volgende kritieke stappen: 1) succesvolle M1/M2-polarisatie, 2) generatie van de macrofaaglaag en RhD+-controle 3) kwantificering van de fagocytische index. Hoewel onze methoden aangeven dat geïsoleerde monocyten worden gebruikt voor de celcultuur, kunnen PBMC's worden gebruikt, maar we raden aan om gezuiverde monocyten te gebruiken. Het is bekend dat PBMC's verschillende celtypen bevatten, waarbij deze cellen meerde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund en gefinancierd door het Canadian Blood Services Centre for Innovation in Toronto, ON. Onderzoek wordt uitgevoerd in het Keenan Research Centre for Biomedical Sciences in het St. Michaels Hospital in Toronto, ON.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1X PBS, pH 7.4, zonder Ca2+/Mg2+Wisent Bioproducts 311-425-CLBewaar bij 4 graden of kamertemperatuur 
AccutaseTMSTEMCELL Technologies 7920Celaflossingsoplossing
ACK Lysis Buffer STEMCELL Technologies 07850, 07800Bewaar bij 4 graden
Anti-Human GlobulinNOVACLONE, Immunocor. N/ANOVACLONE Anti-IgG voor IAT-testen 
Anti-Rh(D) (WinRho. SDF CDN)Saol Therapeutics 1003092Elke commerciële bron van Rh-immunoglobine is voldoende 
Cell ScraperUofT Medstore83.395cel loslating 
Cell Strainer 70uM nylonFalcon352350filter voor cellen 
Chamber slide Nunc. Lab-TekTM II met deksel, RS glazen schuifstel Sterile Thermo Fisher Scientific 154534kamer slides voor MMA 
Dekvlakken VWR48393-08124 x 50 mm
Cytiva Ficoll Paque Plus, dichtheid 1,077 g/LThermo Fisher Scientific 17-1440-03scheiding van PBMC's van vol bloed; dichtheidsgradiëntmedium
Elvanol montagemediumN/AN/ADulbecco’s PBS (D-PBS) zonder Ca2+/Mg2+, 15% (w/v) polyvinylhars en 30% (v/v) glycerine.
Fers vers bloed (ACD-buis) of Buffy-jasCanadian Blood ServicesMag tot 36 uur op kamertemperatuur staan 
Human recombinant GM-CSFSTEMCELL Technologies 78015.1Cytokine voor polarisatie van M1-macrofagen
Human recombinant IFN-gammaSTEMCELL Technologies 78020Cytokine voor polarisatie van M1-macrofagen
Human recombinant IL-4STEMCELL Technologies 78045.1Cytokine voor polarisatie van M2-macrofagen
Human recombinant M-CSFSTEMCELL Technologies 78057.1Cytokine voor polarisatie van M2-macrofagen
ID-CellStabBio-Rad005650 05740RBC celopslag/stabilisatieoplossing 
Isolation Medium N/AN/APBS Ca2+ en Mg2+ vrij + FBS 2% + 1mM EDTA
Lipopolysaaracide (LPS)Sigma AldrichL3024-5MGCytokine voor polarisatie van M1-macrofagen
Methanol (100%)N/AN/AFixeren van slides 
Monocyte Isolation Kit STEM-cells EasySep Human Monocyte Enrichment Kit zonder CD16 Depletion STEMCELL Technologies 19058Isolatie van monocyten uit PBMC's
Poly-D-ysine UofT Medstore P6407Celhechtingsoplossing 
Rh(D) positieve R2R2 RBC'sCanadian Blood ServicesN/AOok commercieel verkrijgbaar
RPMI-1640Wisent Bioproducts 350-000-CLAangevuld met 10% hitte-inactieve FBS, 1 mM GlutaMAX-supplement, 1 mM HEPES en 1% penicilline/streptomycine. Bewaar bij 4 graden. 
Trypan Blue oplossing Thermo Fisher Scientific 15250061Celltellingsoplossing 

Referenties

  1. Tong, T. N., Branch, D. R. Use of a monocyte monolayer assay to evaluate Fcγ receptor-mediated phagocytosis. J Vis Exp. (119), e55039(2017).
  2. Tong, T. N., Cen, S., Branch, D. R. The monocyte monolayer assay: Past, present and future. Transfus Med Rev. 33 (1), 24-28 (2019).
  3. Frias Boligan, K., Sandhu, G., Branch, D. R. Methods to evaluate the potential clinical significance of antibodies to red blood cells. Curr Protoc. 2 (8), e504(2022).
  4. Lemay, A. S., et al. The first case of severe acute hemolytic transfusion reaction caused by anti-Sc2. Transfusion. 58 (11), 2506-2512 (2018).
  5. Tong, T. N., et al. The utility of a monocyte monolayer assay in the assessment of intravenous immunoglobulin-associated hemolysis. Transfusion. 60 (12), 3010-3018 (2020).
  6. Srivastava, K., et al. SCAR: the high-prevalence antigen 013.008 in the Scianna blood group system. Transfusion. 61 (1), 246-254 (2021).
  7. Branch, D. R., et al. Potentially clinically significant anti-Dib identified by monocyte monolayer assay before transfusion. Transfusion. 61 (1), 331-332 (2021).
  8. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5, 514(2014).
  9. Mills, C. M1 and M2 macrophages: Oracles of health and disease. Crit Rev Immunol. 32 (6), 463-488 (2012).
  10. Atri, C., Guerfali, F. Z., Laouini, D. Role of human macrophage polarization in inflammation during infectious diseases. Int J Mol Sci. 19 (6), 1801(2018).
  11. Bertani, F. R., et al. Classification of M1/M2-polarized human macrophages by label-free hyperspectral reflectance confocal microscopy and multivariate analysis. Sci Rep. 7, 8965(2017).
  12. Murray, J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  13. Cohn, C., Delaney, M., Johnson, S. T., Katz, L. M., Schwartz, J. Technical Manual. , 21st Ed, American Association for the Advancement of Blood and Biotherapeutics. Maryland, USA. (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Antilichamen tegen rode bloedcellenmonocytenmonolaag assayantilichaam gemedieerde hemolyseM1 macrofagenM2 macrofagenfagocytose indexgeopsoniseerde rode bloedcellenflowcytometriemononucleaire cellen uit perifeer bloed
Voorspelling van de significantie van antilichamen tegen rode bloedcellen met behulp van de monocyt-macrofaagtest
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.