Analyse van subpopulaties van bloedplaatjes door middel van meerkleurige flowcytometrie

Samenvatting

Meerkleurige flowcytometrie voor bloedplaatjes kan nieuwe subtypes van bloedplaatjes identificeren binnen klassieke subpopulaties van bloedplaatjes, zoals rust-, aggregatoire, procoagulerende en apoptotische bloedplaatjes. Dit maakt het mogelijk om verschillende subpopulatiepatronen te vergelijken die worden geïnduceerd door verschillende bloedplaatjestagonisten. Hier wordt een procedure voor het opstellen van een meerkleurig flowcytometriepaneel in detail beschreven.

Samenvatting

Bloedplaatjes, of trombocyten, zijn kleine bloedcellen met ontkerning die een cruciale rol spelen bij hemostase en trombose. Defecten in de bloedplaatjesfuncties kunnen bloedingen of trombotische voorvallen veroorzaken bij patiënten met hart- en vaatziekten. Daarom is het belangrijk om bloedplaatjes fenotypisch te karakteriseren om subpopulaties van bloedplaatjes te kunnen toewijzen aan de bloedplaatjesfunctie. Stimulatie van menselijke bloedplaatjes met bloedplaatjestagonisten en -activators induceert morfologische en fysiologische veranderingen in bloedplaatjes, vergezeld van veranderingen in de oppervlaktereceptorpopulatie. Dit leidt tot functioneel diverse subpopulaties van bloedplaatjes. Klassiek gedefinieerde subpopulaties van bloedplaatjes zijn rustende, aggregerende, procoagulerende en apoptotische bloedplaatjes. Om het effect van agonisten op subtypes van bloedplaatjes te karakteriseren, hebben we een test opgesteld met behulp van meerkleurige flowcytometrie bestaande uit 10 verschillende antilichamen en kleurstoffen (anti-CD62P, anti-CD63, anti-CD61, anti-CD41, anti-CD42b, anti-Integrine_αIIbβ3 (kloon: PAC-1), anti-CXCR4, anti-ACKR3, Annexin V, Zombie NIR). Geïsoleerde menselijke bloedplaatjes werden geïncubeerd met bloedplaatjesagonisten en gekleurd met specifieke fluorofoor-geconjugeerde antilichamen en kleurstoffen. Daarna werden ze gemeten met flowcytometrie. Dit stelt ons in staat om agonist-specifieke subtypes te definiëren binnen de klassieke vier subpopulaties. Concluderend opent de combinatie van activeringsmarkers (anti-CD62P, anti-CD63, anti-Integrine_αIIbβ3 (kloon: PAC-1)), ontstekingsmarkers (anti-CXCR4, anti-ACKR3) en apoptotische markers (Annexin V, Zombie NIR) die samen het 10-kleuren flowcytometriepaneel vormen dat in dit manuscript wordt beschreven, de mogelijkheid om verdere subtypes van bloedplaatjes te definiëren die kunnen worden gekoppeld aan een specifieke bloedplaatjesfunctie. Deze methode kan worden toegepast in fundamenteel onderzoek naar de functie en fysiologie van bloedplaatjes, maar ook bij het definiëren van nieuwe subtypes van bloedplaatjes in ziektemodellen en patiëntenstudies.

Inleiding

Trombocyten, ook wel bloedplaatjes genoemd, zijn kleine, kernvrije bloedcellen die essentieel zijn voor hemostase en de ontwikkeling van trombose ^1,2. Ze kunnen worden geactiveerd door verschillende bloedplaatjesagonisten. Klassieke, fysiologische bloedplaatjeskagonisten zijn adenosinedifosfaat (ADP), dat zich bindt aan de P2Y12- en P2Y1-receptoren, trombine dat bloedplaatjes activeert via de PAR1- en PAR4-receptoren, en collageen dat interageert met glycoproteïne VI. Collageen kan in in vitro experimenten worden vervangen door het collageengerelateerde peptide (CRP-XL)^3,4. Onlangs is aangetoond dat hemine bloedplaatjesactivering induceert door de interactie van C-type lectine-achtige receptor (CLEC-2) en glycoproteïne VI (GPVI), waardoor hemine wordt vastgesteld als een nieuwe endogene bloedplaatjesactivator/agonist ^5,6. Verschillende pathologische situaties kunnen leiden tot hemolyse, wat resulteert in het vrijkomen van vrij ijzerhoudend hemine. Al deze bloedplaatjesagonisten veranderen de expressie van de oppervlaktereceptor op bloedplaatjes. De verandering van de oppervlaktereceptoren en het plasmamembraan hangt af van de sterkte en concentratie van de bloedplaatjestagonist ^7,8,9. Daarom is het belangrijk om bloedplaatjes fenotypisch te karakteriseren om subpopulaties van bloedplaatjes te kunnen toewijzen aan de bloedplaatjesfunctie.

Hoogdimensionale methoden zoals flowcytometrie hebben aangetoond dat bloedplaatjes subpopulaties vormen met verschillende functies. De subpopulaties kunnen worden geclassificeerd aan de hand van verschillende oppervlaktemarkeringen. In de literatuur is het algemeen bekend dat er twee verschillende subpopulaties van bloedplaatjes aanwezig zijn: het procoagulans, dat wordt gekenmerkt door externalisatie van fosfatidylserine, en het aggregatoire fenotype dat integrine activeert α_IIIbβ_3. Naast de klassieke activeringsmarkers kunnen fluorescentiekleurstoffen zoals glutathion-S-Aryloxide (GSAO) die de mitochondriale functie en oxidatieve stress detecteren, worden gebruikt voor verdere categorisering, bijvoorbeeld procoagulerende bloedplaatjes op basis van hun metabolische toestand¹⁰. Dit maakt het mogelijk om een onderscheid te maken tussen ballonvaren en mitochondriale permeabiliteit overgangsporievorming (MPTP) procoagulant bloedplaatjes fenotype¹¹.

Heemskerk et al. hebben door analyse van de blootstelling aan fosfatidylserine (PS) en de activiteit van integrine α_IIbβ₃ aangetoond dat verschillende bloedplaatjespopulaties verschillende stollingsstappen kunnen beheersen en dat sterke activatoren zoals trombine en collageen nodig zijn voor blootstelling aan fosfatidylserine¹². Verder is het activeren van de bloedplaatjes door GPVI met collageen of de specifieke GPVI-agonist convulxine primair verantwoordelijk voor de vorming van aanhangende procoagulerende bloedplaatjes. Evenzo induceert arachidonzuur, dat leidt tot activering van bloedplaatjes door de productie van tromboxaan A2 door cyclo-oxygenase, blootstelling aan PS¹³. Arachidonzuur is echter, in vergelijking met trombine of collageen, een zwakke bloedplaatjesactivator¹⁴. Van Velzen et al. evalueerden ook antigenen aan het oppervlak van bloedplaatjes (CD42a/b, CD36, CD41, CD61) en activeringsmarkers (PAC-1, CD63, CD62P) in twee afzonderlijke metingen¹⁵. Bovendien waren van Velzen et al. in staat om bloed van trombastheniepatiënten te analyseren en de subpopulaties tussen gezonde en zieke patiënten te vergelijken. Hindle et al. maten de invloed van prostacycline op subpopulaties van bloedplaatjes na behandeling met trombine en CRP-XL met twee individuele panels bestaande uit elk vier markers (PAC-1, Annexin V, CD62P, CD42b of CDCD154, CD62P, CD63, CD42b)¹⁶. Onlangs is meerkleurige flowcytometrie gebruikt om subpopulaties van rustbloedplaatjes (CD42b⁺, PAC1^-, CD62P^-, Annexine V^-), aggregatoire (CD42b⁺, PAC1⁺, CD62P⁺, Annexine V^-) procoagulans (CD42b⁺, PAC1^-, CD62P⁺, Annexine V⁺) en apoptotische (Cd42b^-, PAC1^-, CD62P^-, Annexine V⁺) bloedplaatjes te definiëren ^7,17. Laspa et al. breidden/verfijnden de multi-color flowcytometriebenadering uit door de toevoeging van antilichamen tegen de chemokinereceptoren CXCR4 en ACKR3¹⁸. Op basis van de beschikbare literatuur is dit het eerste 10-kleuren flowcytometerpaneel voor geïsoleerde menselijke bloedplaatjes dat de detectie van 10 verschillende antigenen op een individuele bloedplaatje (eencellig niveau) mogelijk maakt binnen een populatie van geïsoleerde menselijke bloedplaatjes in één buisje. Daarom is het mogelijk om tegelijkertijd activerings-, adhesie- en aggregatiepotentieel, chemokinereceptoren en apoptotisch potentieel van een enkele cel te meten om de bestaande subpopulatie verder te onderscheiden. Het vormt dus een aanvulling op Johnson et al., die de vier belangrijkste subpopulaties definieerden met vier markers (rustend, procoagulans, aggregatorisch, apoptotisch)¹⁷. Het opzetten van een meerkleurige flowcytometrietest maakt het dus mogelijk om verschillende bloedplaatjesagonisten te vergelijken met betrekking tot hun activeringspatroon en de vorming van bloedplaatjessubtypes binnen klassieke bloedplaatjessubpopulaties.

De methode kan worden gebruikt voor fundamenteel onderzoek met betrekking tot de analyse van de bloedplaatjesfunctie en fysiologie. Bovendien kan de gevestigde meerkleurige flowcytometrietest voor menselijke bloedplaatjes worden uitgevoerd met bloedplaatjes die zijn verkregen in patiëntenstudies, bijvoorbeeld onderzoek naar hart- en vaatziekten en trombotische voorvallen, om de door deze ziekten geïnduceerde subpopulaties van bloedplaatjes te decoderen en de effecten van behandelingen op deze geïnduceerde fenotypes. Mueller et al. hebben bijvoorbeeld aangetoond dat de subpopulaties van bloedplaatjes kunnen verschillen bij patiënten met aortastenose¹⁹. De opgedane kennis kan nieuwe mogelijkheden bieden voor farmaceutische interventies.

Protocol

Bloedafname en -behandeling voor onderzoeksdoeleinden werden goedgekeurd door de ethische commissie van de medische faculteit van de Eberhard Karls-universiteit en het universitair ziekenhuis van Tübingen (ethische stemming 238/2018B02), en de onderzoeksmethodologieën voldeden aan de normen die zijn vastgelegd in de Verklaring van Helsinki. Gezonde donoren gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming voor bloedafname. De basiskenmerken voor gezonde donoren staan vermeld in Tabel 1. Figuur 1 geeft een overzicht van het flowcytometrieprotocol.

1. Isolatie van menselijke bloedplaatjes uit volbloed

OPMERKING: De ISTH-richtlijnen werden gevolgd op het gebied van monsterafname, tourniquets en de keuze van het antistollingsmiddel om een gestandaardiseerde manier te garanderen om bloedplaatjes te isoleren²⁰.

1. Buffer voorbereiding
   1. Zuur-citraat-dextrose (ACD) antistollingsbuffer: Los 12,50 g Na 3-Citrat (85 mM_{C 6}H₅Na₃O₇ x 2 H₂O), 6,82 g citraatzuur (71 mM) en 10,00 g glucose (111 mM) op in 475 ml aquadestillata. Pas de pH met 1 M NaOH aan op 4,69. Vul tot 500 ml met aquadestillata. Filter vervolgens, steriliseer de buffer en bewaar bij 4 °C tot gebruik.
      OPMERKING: Alle oplossingen zijn gesteriliseerd met een vacuümaangedreven filtersysteem, dat gebruikmaakt van een snelstromend polyethersulfonmembraan met een poriegrootte van 0,22 μm.
   2. Tyrode's buffer (10x): Weeg 80,00 g NaCl, 10,15 g NaHCO₃ en 1,95 g KCl af en voeg aquadestillata toe aan 1 L. Filter, steriliseer de buffer en bewaar bij 4 °C tot gebruik.
   3. Tyrode's-HEPES-buffer (1x; 137 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 5 mM glucose, 10 mM HEPES): Meng 10 ml 10x Tyrode's buffer en 90 ml aquadestillata. Los 0,1 g glucose en 0,1 g runderserumalbumine (BSA) op. Pas de pH met 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) aan op 7,4. Stel 10 ml Tyrode's buffer in op pH 7,4 en stel de pH van de resterende 90 ml Tyrode's in op 7,4 met 1 N HCl op pH 6,5.
      OPMERKING: BSA kan sommige chemicaliën opruimen, zoals hemin. In dit geval is het belangrijk om de 1x Tyrode's buffer voor te bereiden zonder BSA. Alle buffers moeten voor gebruik worden opgewarmd tot kamertemperatuur of 37 °C.
2. Afname van bloedmonsters
   1. Bereid voor elke donor een spuit van 10 ml met 2 ml ACD-antistollingsmiddel voor en laat deze met behulp van een couveuse wennen aan kamertemperatuur of 37 °C. Houd de verdunningsfactor van 1:5 (ACD: bloed) aan.
      OPMERKING: Gebruik kleinere of grotere spuiten om bloedmonsters af te nemen. Koude ACD-buffer kan de bloedplaatjes vooraf activeren en uw resultaten verminderen.
   2. Gebruik een vlindernaald (21G) om het donorbloed langzaam op te vangen in de voorverwarmde ACD-spuiten. Open de tourniquetslang voordat u de spuit vult om vooractivering te voorkomen.
      OPMERKING: Spuiten met een naald met een grotere dikte kunnen de door afschuiving geïnduceerde activering van bloedplaatjes minimaliseren.
   3. Breng het ACD-bloed langzaam over in een reactiebuis van 15 ml. Gebruik het bloed onmiddellijk om pre-activering van de bloedplaatjes te voorkomen.
3. Isolatie van bloedplaatjes
   1. Centrifugeer het ACD-bloed gedurende 20 minuten bij 209 x g (kamertemperatuur, RT) zonder remmen. Bereid 25 ml Tyrode's-HEPES-buffer pH 6,5 voor in een reactiebuis van 50 ml.
   2. Breng het resulterende bloedplaatjesrijke plasma (PRP, bovenste laag) voorzichtig over in de reactiebuis van 50 ml met Tyrode's-HEPES-buffer, pH 6,5.
   3. Laat ongeveer 1 ml PRP boven de buffy coat en erytrocyten om besmetting met andere bloedcellen te voorkomen.
   4. Centrifugeer de suspensie bij 430 x g gedurende 10 minuten bij RT om de bloedplaatjes te pelleteren. Resuspendeer de resulterende pellet voorzichtig in 200-300 μL van Tyrode's buffer, pH 7,4.
   5. Gebruik een cellenteller om het aantal bloedplaatjes te bepalen. Pas het aantal bloedplaatjes aan met Tyrode's-HEPES-buffer pH 7,4 tot 200 x 10³ bloedplaatjes/μL. Zie stap 3 voor verdere verwerking van bloedplaatjeskleuring.

2. Selectie en titratie van antilichamen voor flowcytometrie

1. Selectie van antilichamen en kleurstoffen
   1. Selecteer de antilichamen en kleurstoffen met geschikte fluoroforen voor de flowcytometer²¹. Let op de filterconfiguratie die wordt aanbevolen door de fabrikant van de flowcytometer. Een voorbeeld van bloedplaatjesmarkers en fluorofoorconfiguratie wordt gegeven in Tabel 2 en Figuur 2 voor de volgende cytometer: BD LSR Fortessa met laserconfiguratie: violet (402 nm), blauw (488 nm), geel/groen (561 nm), rood (640 nm).
      OPMERKING: Gebruik helderdere fluorchromen voor antigenen met een lagere expressie. De heldere fluorchromen BV412 en BV650 werden bijvoorbeeld gebruikt voor de zwak tot expressie gebrachte chemokinereceptoren (ACKR3 en CXCR4)22,23,24.
2. Titratie van antilichamen en kleurstoffen
   1. Titreer de antilichamen om de juiste werkconcentratie te vinden. Gebruik voor de titratie geïsoleerde menselijke bloedplaatjes uit stap 1 en een concentratiereeks van het antilichaam.
      OPMERKING: De door de fabrikant opgegeven werkconcentraties zijn over het algemeen een goed uitgangspunt voor de concentratiereeksen.
      1. Als u werkt met antigenen die alleen tijdens de behandeling tot expressie komen, activeer dan de bloedplaatjes voorafgaand aan de kleuring om er zeker van te zijn dat negatieve en positieve cellen ook kunnen worden gedetecteerd. PAC-1 bindt bijvoorbeeld alleen aan geactiveerde integrine α_IIbβ₃. Activeer daarom de bloedplaatjes sterk om een helder, positief signaal te krijgen, bijvoorbeeld met 10 μg/ml collageengerelateerd peptide (CRP; zie figuur 3).
3. Titratie van monsters
   1. Isoleer de menselijke bloedplaatjes zoals in stap 1 en pas het aantal bloedplaatjes aan op 1 x 10⁶ bloedplaatjes per monster.
      1. Voor receptoren die geen activering nodig hebben voorafgaand aan kleuring: CD61, CD42b, CD41, CXCR7, CXCR4 gebruikt u één ongekleurd en een gekleurd monster per antilichaam. Voor receptoren/markers die voorafgaand aan het kleuren moeten worden geactiveerd met bijvoorbeeld 10 μg/ml CRP-XL: PAC1, CD63, CD62P, Annexin V, Zombie NIR, gebruik één geactiveerd en één niet-geactiveerd monster 15,25,26.
   2. Activeer de bloedplaatjes (1 x 10⁶ bloedplaatjes per monster) indien nodig gedurende 30 minuten met 10 μg/ml crp-xl. Incubeer vervolgens de geïsoleerde bloedplaatjes (1 x 10⁶ bloedplaatjes per monster) gedurende 30 minuten met verschillende concentraties van het fluorchroomgeconjugeerde antilichaam of de kleurstof en voeg 300 μl 1x annexinebindingsbuffer toe om het monster te verdunnen (voorbeelden voor concentraties worden gegeven in tabel 3).
   3. Meet 10.000 gebeurtenissen voor elke steekproef.
   4. Bereken de kleuringsindex die de optimale scheiding van de positieve en negatieve populaties voor elk antilichaam laat zien, zoals weergegeven in aanvullende figuur 1.
   5. Zet de kleuringsindex voor elke concentratie antilichamen in kaart om de optimale concentratie te vinden.

3. Kleuring voor flowcytometrie

OPMERKING: Zie Tabel 4 voor een voorbeeld van kleuring met vier verschillende bloedplaatjesactivatoren (CRP-XL, ADP, trombine, hemine).

1. Hemin moet vers worden bereid. Los het poeder op in 1,4 M NaOH tot een oplossing van 3 M en verwarm het gedurende 5 minuten bij 450 tpm tot 96 °C. Verdun het vervolgens met gedistilleerd H₂O tot een bouillonoplossing van 3 mM.
2. Na aanpassing van het aantal bloedplaatjes (per monster: 1 x 10⁶ bloedplaatjes), activeer de bloedplaatjes in een buisje met de trombocyactivatoren gedurende 30 minuten bij RT zoals aangegeven in tabel 4.
3. Voeg 43,3 μL antilichaamcocktail toe aan de monsters en incubeer de bloedplaatjes gedurende 30 minuten bij RT in het donker.
4. Verdun de monsters na incubatie met 300 μL 1x Annexine Binding Buffer (10 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl₂) zodat het Annexine V eiwit kan binden aan de fosfatidylserine aan de buitenkant van het celmembraan. Meet de monsters direct.
   OPMERKING: Meet de monsters direct na de bereiding. Omdat de monsters niet gefixeerd zijn, kan het uitstellen van de monstervoorbereiding en -meting de variabiliteit van de resultaten vergroten. Fixatie schaadt de Annexin V-binding.

4. Compensatie-instelling en fluorescentie minus één controle (FMO) meting

OPMERKING: Voordat u gegevens opneemt, moet u een compensatie-instelling uitvoeren. Een flowcytometer berekent automatisch de compensatie-instellingen; Raadpleeg de gebruikelijke handleidingen van de flowcytometer voor de specifieke compensatieprocedure. Gebruik echter compensatieregelaars met cellen of met kralen.

1. Compensatie instellen
   1. Voor compensatie met korrels bereidt u 150 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor elke fluorofoor met één druppel bolletjes en 1 μL van het fluorescentie-geconjugeerde antilichaam.
   2. Bewaak de reactiviteit van de korrels van de soort. Gebruik anti-muis IgGκ en de negatieve controle van polystyreen microdeeltjes. Om Annexin V te compenseren, labelt u PE/Cy7-kralen met antilichaam PE/Cy7 anti-humaan CD62L dat dezelfde fluorofoor conjugeert als Annexin V.
   3. Gebruik amine-reactieve compensatiekorrels voor de amine-reactieve kleurstof. Gebruik twee druppels positieve en één druppel negatieve korrels in 150 μL PBS met 1 μL van de kleurstof. Controleer of de amine-reactieve compensatiekorrels reageren met de kleurstof en een positief signaal geven. Controleer of de negatieve kralen niet reageren met de amine-reactieve kleurstof en een negatief signaal afgeven.
      OPMERKING: Gebruik voor Zombie NIR APC-Cy7 negatieve en positieve amine-reactieve kralen.
   4. Incubeer de compensatiemonsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
   5. Laat elke compensatiebuis afzonderlijk draaien en sluit de singletkralenpopulatie aan op basis van FSC en SSC. De kralenpopulatie verschijnt als één kleine geconcentreerde populatie. Teken een poort rond deze populatie.
   6. Toon de histogrammen voor elke compensatiebuis en pas de compensatiewaarden aan totdat de positieve pieken van de verschillende antilichamen en kleurstoffen elkaar niet meer overlappen. Meet vervolgens elke afzonderlijke compensatiebuis en laat de overloop van de fluoroforen worden berekend volgens de SOP van de fabrikant.
   7. Ga verder met het verkrijgen van het eigenlijke kleuringsexperiment met de geïsoleerde menselijke bloedplaatjes (zie stap 3 en tabel 4). Pas de SSC/FSC-spanning aan vóór de meting om de bloedplaatjespopulatie te vinden. Aangezien CD61 alomtegenwoordig tot expressie komt op bloedplaatjes, moet u met deze fluorescentiedrempel controleren of elke grootte van de bloedplaatjes kan worden gedetecteerd.
   8. Meet vervolgens 20.000 gebeurtenissen per steekproef.
2. FMO-meting
   1. Bereid voor elke markering een FMO-regeling voor volgens tabel 5. Om de overlappingen van alle markers te kunnen bepalen, moeten zowel niet-gestimuleerde als gestimuleerde monsters worden bereid.

5. Gegevensanalyse

1. Analyse met een software voor gegevensanalyse van flowcytometrie (Figuur 4)
   1. Sleep de FSC-bestanden naar de software. Definieer met de FMO-controle de positieve populatie voor elke marker.
      1. Bepaal FMO's door elke FMO-besturing uit te zetten tegen elke markering in een puntplot. Dit maakt de spill over naar andere kanalen zichtbaar. Gebruik de FMO-poort met de hoogste fluorescentie-spillover als grens naar de positieve populatie voor de behandelde 10-kleurenmonsters.
2. Analyseren met een cloudgebaseerde flowcytometrie-analyse (Figuur 5)
   1. Open de software en maak een nieuwe dataset. Sleep de FCS-bestanden die met de flowcytometer zijn verkregen.
   2. Start de analyse door een werkstroom te maken. De compensatiematrix wordt automatisch gemaakt op basis van de onbewerkte gegevensbestanden.
   3. Voer een UMAP-analyse uit met de volgende instellingen: Buren: 15, Minimale afstand: 0,4; Componenten: 2; Metrisch: Euclidisch; Leersnelheid: 1; Tijdperken: 200; Inbedding Initialisatie: spectraal. Selecteer alle bestanden en alle 10 markeringen (functies).
   4. Voeg Fenoparaph-analyse toe als een nieuwe taak en voer de analyse uit met de volgende instellingen: K Dichtstbijzijnde buren: 20; Afstand metrisch: Euclidisch; Leuvense pistes: 1; Aantal resultaten: 1.
   5. Voeg een poorttaak toe om de gegenereerde clusters aan te geven. Na het uitvoeren van de analyse is het mogelijk om de gegevens in verschillende blots te presenteren, die kunnen worden geëxporteerd.

Resultaten

Er zijn twee opties voor het analyseren van de onbewerkte gegevens die worden verzameld door een meerkleurig flowcytometriepaneel. Een optie is om het handmatig te analyseren met de analysesoftware (Figuur 3 en Figuur 4). Daarom moeten de onbewerkte gegevens naar het softwarevenster worden gesleept en neergezet. Eerst moeten de cellen worden gevonden door de SSC/FSC-schaal aan te passen in de spreidingsdiagramweergavemodus om de...

Discussie

Meerkleurige flowcytometrie maakt het mogelijk om verschillende bloedplaatjesclusters/subpopulaties te definiëren die geassocieerd zijn met discrete functies 12,17,18. Doorslaggevend voor de resultaten van de subpopulaties en de expressie van het receptoroppervlak is de kwaliteit van de geïsoleerde menselijke bloedplaatjes. Daarom is een belangrijke stap in het gepresenteerde protocol de voorber...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10x Binding Buffer	Invitrogen, Carlsbad, California, USA	88-8103-74	Buffer
Adenosine difosfaat (ADP)	Probe & go Labordiagnostica GmbH Lemgo, Duitsland	70212	trombocytagonist
Annexin V PE-Cyanine7	Invitrogen, Carlsbad, California, USA	88-8103-74	kleurstof
anti-CD41 AF 700	BioLegend, San Diego, CA, USA	303728	antilichaam
anti-CD41 Alexa Fluor 700	BioLegend, San Diego, CA, USA	303727	antilichaam
anti-CD42b PerCP/Cyanine5.5	BioLegend, San Diego, CA, USA	303918	antilichaam
anti-CD61 BV605	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, USA	744382	antilichaam
anti-CD62P PE	Beckman Coulter, Brea, California, USA	IM1759U	antilichaam
anti-CD63 PE/Cy5	Abcam, Cambridge, UK	ab 234251	antilichaam
anti-CXCR4 BV650	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, USA	740599	antilichaam
anti-CXCR7 BV421	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, USA	566234	antilichaam
anti-PAC-1 FITC	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, USA	340507	antilichaam
Bovine serum albumine (BSA)	Applichem, Darmstadt, Duitsland	A1391	-
Citrit zuur	Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland	6490.1	-
CRP-XL	CambCol Laboratories, Ely, UK	CRP-XL	trombocytagonist
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich Co., St. Louis, Missouri, USA	G7528	-
Dubecco’s Fosfaat Gebufferde Saline (PBS)	Sigma Aldrich Co, St. Louis, Missouri, USA	D8537	-
Hemin	Sigma Aldrich Co., St. Louis, Missouri, USA	H9039-10G	trombocytagonist
HEPES	Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland	9105.3	-
Kaliumchloride	Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland	6781.3	-
Natriumchloride	Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland	3957.1	-
Natriumwaterstofcarbonaat	Sigma Aldrich Co, St. Louis, Missouri, USA	401676	-
Trombine	Roche	10602400001	trombocytagonist
tri-Natriumcitraat-dihydraat	Applichem, Darmstadt, Duitsland	1416551211	-
Zombie NIR	BioLegend, San Diego, CA, USA	423105	amine-reactieve kleurstof