Single Nucleotide Polymorfisme-gevoelige FISH-detectie van Locus-specifieke ribosomale RNA-transcriptie in Drosophila melanogaster

Summary

Het protocol beschrijft de single nucleotide polymorphisms-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) -methode om ribosomale RNA-transcripten te onderscheiden die zijn afgeleid van de X- of Y-chromosoom ribosomale DNA-locus in Drosophila melanogaster.

Abstract

Om ervoor te zorgen dat er voldoende ribosomaal RNA (rRNA) wordt getranscribeerd voor de ribosoomfunctie, bevatten genomen honderden tandemduplicaties van de sequenties die coderen voor rRNA's, waaruit regio's bestaan die ribosomale DNA (rDNA) loci worden genoemd. Het genoom van veel organismen bevat meer dan één rDNA-locus verdeeld over verschillende chromosomen, en rRNA kan worden getranscribeerd van meerdere rDNA-loci of slechts één locus. Veranderingen in rRNA-transcriptiebronnen duiden vaak op ribosomale nood. De homogeniteit van rRNA verhindert echter het onderscheid of rRNA wordt getranscribeerd van meerdere of een enkele rDNA-locus. Hier beschrijven we een methode die gebruik maakt van single nucleotide polymorfisme-gevoelige fluorescentie in situ hybridisatie (SNP-FISH) om rRNA-transcriptie te onderscheiden tussen Drosophila melanogaster rDNA-loci op de X- en Y-chromosomen. Deze methode maakt gebruik van locusspecifieke rRNA-varianten om eenvoudige detectie van de bron van rRNA-transcriptie met eencellige resolutie mogelijk te maken. Deze test kan worden toegepast op elk Drosophila-celtype en kan worden aangepast voor gebruik in andere systemen.

Introduction

De 18S, 5.8S en 28S ribosomale RNA's (rRNA's) die nodig zijn voor de ribosoomfunctie worden gezamenlijk getranscribeerd in een enkele cistron die het 45S pre-rRNA wordt genoemd. De drie rRNA's worden binnen het 45S pre-rRNA gescheiden door twee interne getranscribeerde spacersequenties (ITS) en geflankeerd door externe getranscribeerde spacersequenties (ETS) aan het 5'- en 3'-uiteinde. Al deze spacer-sequenties worden verwijderd uit het 45S pre-rRNA voor de rijpe rRNA's om in ribosomen te worden opgenomen (zie¹). Om te voldoen aan de grote vraag naar rRNA-productie die nodig is om de ribosoomactiviteit te ondersteunen, bevatten alle eukaryote genomen honderden kopieën van de 45S-sequentie. Deze kopieën zijn geclusterd in tandemherhalingen en vormen genomische regio's die ribosomale DNA (rDNA) loci worden genoemd. De meeste eukaryote genomen bevatten meerdere rDNA-loci verspreid over afzonderlijke chromosomen (zie²). De hoge redundantie van 45S-kopieën betekent dat er doorgaans veel meer 45S-kopieën zijn dan nodig is voor transcriptie, en de meerderheid van de 45S-kopieën is transcriptioneel stil en begraven in heterochromatine³. Transcriptionele activiteit is niet uniform over rDNA-loci, en variatie in rDNA-locustranscriptie wordt op grote schaal waargenomen bij organismen ^4,5,6, wat aangeeft dat 45S-transcriptie differentieel wordt gereguleerd op individuele rDNA-loci. Locusbrede rDNA-uitschakeling is waargenomen bij planten, ongewervelde dieren en gewervelde dieren 7,8,9,10, wat suggereert dat locusbrede rDNA-uitschakeling een belangrijk mechanisme is voor het reguleren van de rRNA-dosering¹¹. rRNA-transcriptie is een belangrijke regulerende stap in de productie van ribosomen, en veranderingen in rRNA-transcriptie die de translationele activiteit moduleren, zijn een belangrijk kenmerk van zowel normale differentiatie als ziektetoestanden¹². Veranderingen in de transcriptie van de rDNA-locus worden ook in verband gebracht met een vermindering van het totale aantal rDNA-kopieën^{nummer 13}. Veranderde locusspecifieke rDNA-transcriptie kan dus een belangrijke indicator zijn van verstoorde cellulaire fysiologie.

Hoewel locusspecifieke uitschakeling een belangrijke bron van rRNA-transcriptieregulatie lijkt te zijn, zijn de mechanismen die deze uitschakeling tot stand brengen en bepalen welke rDNA-loci transcriptioneel actief zijn, grotendeels onbekend. De homogeniteit van rDNA-sequenties maakt het moeilijk om individuele rDNA-locustranscriptie te beoordelen, waardoor wijdverbreide analyse van locusspecifieke rDNA-transcriptieactiviteit wordt voorkomen. Deze uitdaging kan worden overwonnen door gebruik te maken van de structurele en enkelvoudige nucleotidesequentievariatie tussen rDNA-kopieën binnen hetzelfde genoom 4,5,6,13. Sommige van deze varianten kunnen worden gedeeld door de meeste of alle kopieën in een individuele locus, waardoor unieke rDNA-locushaplotypes ontstaan van meerdere varianten die een rDNA-locus onderscheiden. Inderdaad, recente mapping van rDNA-varianten naar specifieke loci door het telomeer-naar-telomeerconsortium onthulde locusspecifieke gedeelde rDNA-varianten in het menselijk genoom¹⁴. Dergelijke rDNA-locuskaarten kunnen de identificatie van locusspecifieke transcriptie uit sequentiedatasets mogelijk maken; De beschikbaarheid van deze kaarten blijft momenteel echter beperkt en zijn niet gemakkelijk te produceren. Aangezien rDNA-loci zich alleen op de geslachtschromosomen in Drosophila melanogaster bevinden (één locus op elk X- en Y-chromosoom)¹⁵, is de Y-chromosoom rDNA-locus afwezig bij XX vrouwen. Deze natuurlijke isolatie van de Y-chromosoomlocus betekent dat single nucleotide polymorfisme (SNP) varianten tussen de X en Y rDNA-loci gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd in short-read sequencing als alle varianten die aanwezig zijn bij mannen (XY) maar afwezig zijn bij vrouwen (XX). Eerder geïdentificeerde SNP's kunnen snel worden getest in niet-gegenotypeerde Drosophila-stammen door middel van eenvoudige PCR- en Sanger-sequencing van DNA van mannen en vrouwen. Bovendien betekent de beschikbaarheid van Drosophila-stammen met een X-chromosoom dat geen rDNA-locus¹⁶ heeft, dat individuele X- en Y-rDNA-loci individueel kunnen worden geïsoleerd voor een nog nauwkeurigere rDNA SNP-karakterisering. Deze gemakkelijke identificatie van SNP-varianten tussen de Drosophila rDNA-loci maakt het mogelijk om unieke X- en Y-rDNA-loci SNP-haplotypes¹³ te bepalen. X-chromosoom rDNA-loci zijn meestal ook volledig stil bij Drosophila-mannen, maar beide X-chromosoomloci worden getranscribeerd bij vrouwen^10,17, waardoor Drosophila een nuttig systeem is om locusbrede rDNA-uitschakeling te bestuderen.

Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is een krachtig hulpmiddel om de aanwezigheid van specifieke RNA- of DNA-sequenties in de individuele cellen van een weefsel te visualiseren. FISH-labels richten zich op RNA- of DNA-sequenties via antisense-oligonucleotide-sondes geconjugeerd aan fluoroforen. FISH-sondes moeten doorgaans ~20 nucleotiden lang zijn om stabiel genoeg doelbinding te bieden om te worden gevisualiseerd, maar sondes die zo lang zijn, kunnen ook gemakkelijk binden aan niet-doelsequenties die slechts door een enkele nucleotide verschillen (Figuur 1A). Omgekeerd binden sondes die kort genoeg zijn om single-nucleotide specificiteit te verlenen niet stabiel genoeg voor visualisatie. Om specificiteit en stabiliteit in evenwicht te brengen, combineert SNP-gevoelige FISH (SNP-FISH) een ~26 nucleotide lange antisense fluorescerende sonde met een niet-fluorescerend sensormaskeroligonucleotide dat bindt aan alles behalve het 5'-uiteinde van de sonde¹⁸. Dit masker laat alleen de 10 meest 5'-nucleotiden van de sonde enkelstrengs achter en beschikbaar voor doelbinding (Figuur 1B). Dit korte enkelstrengs deel van de sonde verleent specificiteit aan het doelwit, maar voorkomt kruisreactiviteit met RNA's die zelfs maar een enkele mismatch hebben met deze 10 nucleotiden (Figuur 1B). Zodra het 5'-uiteinde van de sonde zijn doelwit bindt, verwijdert passieve strengverplaatsing het masker van de sonde, waardoor het 3'-gebied het doelwit kan binden en een stabiele doellabeling ontstaat (Figuur 1B)¹⁸. Daarom kan SNP-FISH differentieel RNA's visualiseren die verschillen door een enkele SNP door een paar sondes te gebruiken die verschillende fluoroforen hebben die elk een andere SNP aanvullen maar een gemeenschappelijk masker delen (Figuur 1C). Hoewel bij deze methode slechts een enkele fluorofoor-geconjugeerde sonde naar het doel-SNP wordt gerekruteerd, kan het samenvoegen van meerdere sondemaskersets met verschillende SNP's binnen een gedeeld rDNA-haplotype worden gebruikt om de SNP-gevoelige detectie van een enkel rRNA te versterken (Figuur 1D). Bovendien, omdat rRNA zo overvloedig wordt getranscribeerd, kunnen rRNA-transcripten gemakkelijk worden gevisualiseerd in FISH-experimenten met behulp van een klein aantal fluorescerende labels per RNA. Deze lage vereiste voor fluorofoor per RNA betekent dat SNP-FISH rRNA's van een specifieke locus kan visualiseren met slechts een paar unieke SNP's. Deze methode kan gemakkelijk locusspecifieke rRNA-transcriptie detecteren in een verscheidenheid aan Drosophila-weefsels en ontwikkelingsstadia¹⁷. Het is bijzonder effectief in mannelijke kiembaanstamcellen van Drosophila, die tijdens het ouder worden veranderen tussen exclusieve Y-rDNA-transcriptie en co-expressie van X- en Y-chromosoom rDNA-loci¹³. Hier bieden we een SNP-FISH-protocol om verschillende X- en Y-rRNA-transcripten in de Drosophila-testis te visualiseren om het algemene doel van het beoordelen van locusspecifieke rRNA-uitschakeling te bereiken. Deze methode maakt gebruik van vier SNP's die eerder zijn gekarakteriseerd tussen de rDNA-loci op de X- en Y-chromosomen van de gemeenschappelijke y¹w¹ laboratoriumstam Drosophila (Figuur 1D).

Protocol

1. Bereiding van buffers en reagentia

OPMERKING: RNase-vrije techniek moet worden gebruikt in stap 1, 3 en 4, en gecertificeerde RNase-vrije reagentia moeten worden gebruikt.

1. Bereid in een chemische kap 40 ml 4% formaldehyde in 1x PBS-fixatieoplossing door 10 ml 16% formaldehyde en 4 ml RNasevrije 10x PBS toe te voegen aan 26 ml RNasevrij water. Verdeel in porties van 1 ml en bewaar bij -20 °C binnen 30 minuten na bereiding. Fixatieoplossing kan maximaal 6 maanden worden bewaard bij -20 °C.
   LET OP: De oplossing bevat formaldehyde. Hanteren met handschoenen en geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en veilig weggooien.
2. Bereid 10 ml hybridisatiebuffer voor door 1 ml 20x RNasevrije zoutoplossing-natriumcitraat (SSC), 1 g dextraansulfaat, 100 μl 100 mg/ml Saccharomyces cerevisiae tRNA, 100 μl 200 ml vanadyl-ribonucleosidecomplex, 1 ml 5% RNase-vrij BSA, 1 ml gedeïoniseerd formamide gecombineerd met 6 ml RNase-vrij water te mengen. Verdeel in 1 ml aliquots in 1,5 ml microfuge tubes en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 1 maand.
3. Bereid 50 ml wasbuffer voor door 5 ml 20x RNase-vrije SSC, 5 ml gedeïoniseerde formamide, 50 μl Triton-X tot 40 ml RNasevrij water toe te voegen. Bewaar bij kamertemperatuur in het donker voor maximaal 1 maand.
4. Bereid 10 ml DNA-isolatiebuffer voor door 100 μl 1M Tris-HCl pH 7.5-8.0, 20 μl 0.5M EDTA en 50 μl 5M NaCl toe te voegen aan 9.8 ml water.

2. Genotypering van monsters voor X- en Y-specifieke rRNA SNP's

1. Verzamel individuele, ongepaarde, homozygoot X, vrouwtje en mannetje met hetzelfde X-chromosoom in buisjes van 0,2 ml en koel af op ijs.
2. Combineer 50 μL DNA-isolatiebuffer met 0,5 μL 20 mg/ml Proteïnase K per monster.
3. Voeg 50 μL DNA-isolatiebuffer / proteïnase K toe aan het Drosophila-monster en homogeniseer het monster met behulp van een pipetpunt.
4. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 37°C, gevolgd door 95°C gedurende 2 minuten. Breng 40 ml monster (vermijd dierlijk afval) over in een schone buis van 1.5 ml.
5. Amplificeer elk SNP-doelgebied van elk DNA-monster afzonderlijk door middel van PCR met behulp van een concentratie van 10 μM van de volgende primerparen: 18S SNP vooruit + achteruit; ITS1 SNP vooruit + achteruit; 28S SNP vooruit + achteruit. De primersequentie en de verwachte PCR-amplicongrootte zijn te vinden in tabel 1.
6. Gebruik gelelektroforese om het hele PCR-monster te scheiden op een 1% agarose 1x TAE-gel om het verwachte PCR-product te bevestigen. Verwachte productgroottes worden vermeld in tabel 1.
7. Isoleer het PCR-product uit de gel met behulp van een in de handel verkrijgbare gelextractiekit.
8. Sequentie van PCR-producten door middel van Sanger-sequencing. Sequentie de monsters in beide richtingen met behulp van afzonderlijke individuele reacties voor de F- en R-primer voor elk doelwit.
9. Bepaal de X-chromosoom SNP-variant op de posities in Tabel 2 in een niet-gedekt vrouwelijk DNA-monster. Het verwachte X-haplotype wordt beschreven in Tabel 2.
10. Bekijk SNP-posities in het sequencingchromatogram van mannelijke DNA-monsters. Leid de Y-chromosoom SNP-variant af op basis van de reeds bepaalde X SNP-variant op elke SNP-positie. Het verwachte Y-haplotype wordt beschreven in Tabel 2.

Naam van de primer	Volgorde	Verwachte amplicongrootte
18S SNP F	GACTACCATGGTTGCAACGG	652 BP
18S SNP R	TTCACCTCTCGCGTCGTAAT
ITS1 SNP F	CTTGCGTGTTACGGTTGTTTC	955 bp
ITS1 SNP R	ACAGCATGGACTGCGATATG
28S SNP F	ATGCGTAGAAGTGTTTGGCG	598 bp
28S SNP R	GCCGACTTCCCTTACCTACA

Tabel 1: Primersequenties voor het sequencen van rDNA SNP's. Primerparen om rDNA-regio's te amplificeren die eerder gekarakteriseerde SNP's bevatten in de 18S-, ITS1- en 28S-rDNA-regio's. De sequentie van het primer-oligonucleotide en de verwachte PCR-amplicongrootte worden vermeld.

Haplotypie	SNP-positie	Volgorde
X rDNA	18S	1603-ATACTTGTATTTTTTCATATG-1625
	ITS1-1	2873-CGTTAATAAATATTTGTAATT-2895
	ITS1-2	3115-GAAAATCGAAGAAACAAAATT-3137
	28S	5932-AACAAAAATGCCTAACTATAT-5954
Y rDNA	18S	1603-ATACTTGTATCTTTTCATATG-1624
	ITS1-1	2873-CGTTAATAAACATTTGTAATT-2895
	ITS1-2	3115-GAAAATCGAAAAAACAAAATT-3137
	28S	5932-AACAAAAATGGCTAACTATAT-5954

Tabel 2: Verwachte rDNA-haplotypes. Verwachte SNP's op X- en Y-chromosoom rDNA-loci in de y¹w¹ Drosophila-stam. SNP aangegeven in vet en onderstreept. Positie vermeld op basis van consensus 45S rRNA-sequentie (aanvullend bestand 1).

3. Dissectie, fixatie en permeabilisatie van de testis

1. Reinig de stereomicroscoop, het werkstation, de ontleedschaal en de ontleedtang met 70% ethanol (of een andere RNase-behandeling).
2. Ontleed Drosophila onder een stereomicroscoop om de teelballen te isoleren in 1x RNASE-vrije PBS. Pak het midden van de buik van het dier vast met een tang en pak het uiteinde van de buik vast met een andere tang om het dier voorzichtig uit elkaar te trekken. De teelballen zullen zich dissociëren van het dier en kunnen verder worden gescheiden met behulp van een tang. Verzamel 30 - 40 testikels per monster.
3. Pak met een tang de teelballen op en breng ze over van de snijschaal naar een microfugebuisje van 1,5 ml met 0,5 ml 1x RNase-vrije PBS.
4. Zuig PBS aan en voeg 1 ml fixatieoplossing toe. Incubeer bij kamertemperatuur op een nutating shaker gedurende 30 min. Aspiratiefixeermiddel.
5. Was 2x met 1 ml 1x RNase-vrije PBS gedurende 5 minuten elk op een nutating shaker. Aspireer 1x PBS op en voeg 1 ml RNase-vrije 70% ethanol (EtOH) toe. Incubeer een nacht bij 4 °C op een nutating shaker.

4. SNP-gevoelige ribosomale RNA-VIS

1. Zuig ethanol op en voeg 1 ml wasbuffer toe. Incubeer 3 minuten op kamertemperatuur op een nutating shaker, gevolgd door 2 minuten buis rechtop rustend.
2. Meng sondes en maskers met hybridisatiebuffer, waardoor 100 μL totaal volume per monster ontstaat. Sonde, maskersequenties en fluorofoorlabels worden vermeld in tabel 3. Wanneer u alle 4 SNP's gebruikt, bereidt u 80 μL hybridisatiebuffer voor, 1 μL elk van 10 μM Y-SNP-sonde (4 μL totaal), 1 μL elk van 10 μM X-SNP-sonde (4 μL totaal) en 3 μL elk van 10 μM gemeenschappelijk masker (12 μL totaal)
3. Zuig de wasbuffer op en voeg vervolgens 100 μL hybridisatieoplossing toe. Breng transparante folie aan op de randen van de buis, wikkel deze in aluminiumfolie ter bescherming tegen licht en incubeer in een waterbad van 37 °C gedurende ten minste 24 uur.
4. Voeg 1 ml wasbuffer toe aan het monster zonder de hybridisatieoplossing op te zuigen. Incubeer in een waterbad van 37 °C gedurende 30 minuten in het donker.
5. Zuig de wasbuffer op en voeg vervolgens 1 ml wasbuffer toe aan het monster. Incubeer in een waterbad van 37 °C gedurende 30 minuten in het donker.
6. Zuig de wasbuffer aan en voeg 50 μL montagemedia toe. Monsters kunnen onmiddellijk op objectglaasjes worden gemonteerd of tot 1 week bij 4 °C worden bewaard voordat ze worden gemonteerd.

SNP-positie	Oligonucleotide	Volgorde		3' geconjugeerd fluorofoor
18S	X SNP-sonde	AAAAAATACAAGTATTTAATCACATA		Alexa 488
	Y SNP-sonde	AAAAGATACAAGTATTTAATCACATA		Alexa 647
	Masker	TATGTGATTAAATACT
ITS1-1	X SNP-sonde	AAATATTTTATTAACGGTAAGGATATT		Alexa 488
	Y SNP-sonde	AAATGTTTATTAACGGTAAGGATATT		Alexa 647
	Masker	AATATCCTTACCGTTA
ITS1-2	X SNP-sonde	GTTTCTTCGATTTTCATGTTCGAAAC		Alexa 488
	Y SNP-sonde	GTTTTTTCGATTTTCATGTTCGAAAC		Alexa 647
	Masker	GTTTCGAACATGAAAA
28S	X SNP-sonde	TTAGGCATTTTTTTTTTACTTGAAAA		Alexa 488
	Y SNP-sonde	TTAGCCATTTTTTTTTTACTTGAAAA		Alexa 647
	Masker	TTTTCAAGTAAAACAA

Tabel 3: Sonde- en maskersequenties voor rDNA SNP-FISH. SNP-posities zijn vetgedrukt gemarkeerd. Het sondegedeelte dat bindt aan het maskeroligonucleotide is onderstreept. Voorbeelden van geschikte 3' geconjugeerde fluoroforen worden vermeld, maar alle compatibele fluoroforen kunnen worden gebruikt.

5. Voorbereiding van monsters voor beeldvorming

1. Werk onder een ontledende stereomicroscoop en gebruik een pipet met brede opening om het monster over te brengen naar een microscoopglaasje.
2. Gebruik een tang om de testikels in een rij te plaatsen om gemakkelijk monsters te vinden bij beeldvorming (geen specifieke oriëntatie vereist). Dek het monster af met een dekglaasje. Dep de randen van het dekglaasje af met een tissuedoekje om overtollig montagemateriaal te verwijderen.
3. Sluit de randen van het dekglaasje af met nagellak. Laat de schuif 10 minuten in het donker op kamertemperatuur staan om de nagellak te laten drogen. Objectglaasjes kunnen onmiddellijk worden gebruikt voor confocale beeldvorming of tot een maand worden bewaard bij 4 °C voorafgaand aan beeldvorming^.

Results

Sequentieresultaten van SNP-genotypering zullen naar verwachting SNP-verschillen tussen de X- en Y-rDNA-loci detecteren. Deze SNP's worden gedetecteerd door de SNP-posities in sequentiechromatogrammen direct te beoordelen (Figuur 2). Sequencing van vrouwelijke monsters zal naar verwachting een enkel sequentiesignaal hebben op de SNP-positie, wat wijst op SNP-homozygotie tussen de twee X-chromosomen (Figuur 2A). De resultaten van de sequentiebepaling van mannelijke monsters zullen naar verwachting een dubbele piek hebben op de SNP-positie (Figuur 2B). Op basis van het X-chromosoomgenotype dat is bepaald op basis van sequentiebepaling van vrouwelijke monsters, wordt geconcludeerd dat de niet-X-variant een Y-chromosoom rDNA SNP is (d.w.z. X = T, Y = C voor de 18S SNP-sequencing in figuur 2). Als alternatief zou een enkele sequentiepiek op een SNP-positie in het mannelijke monster homozygotie tussen mannelijke en vrouwelijke rDNA-loci op die SNP-positie aangeven, en die positie zou niet bruikbaar zijn voor rRNA SNP-VISSEN.

Volgens het protocol voor SNP FISH kunnen monsters worden gevisualiseerd door ze op dia's te monteren en onder een verzegelde dekstrook te plaatsen, gevolgd door confocale microscopie. Met behulp van de sondes die in tabel 3 worden vermeld, wordt het Y-afgeleide rRNA-signaal gedetecteerd door Alexa Fluor 647-emissie en het X-afgeleide rRNA-signaal wordt gedetecteerd door Alexa Fluor 488-emissie. rRNA-signalen zullen naar verwachting worden waargenomen in de nucleolus, die kunnen worden geïdentificeerd als het DAPI-arme gat in de kern (Figuur 3A). De nucleolus is bijzonder gemakkelijk te identificeren in kiemcellen vanwege hun grote kern en nucleolus (Figuur 3A). Het zwakke signaal kan meestal ook in het cytoplasma worden gevonden (Figuur 3), maar dit is een niet-specifiek signaal dat ook kan worden gedetecteerd in monsters zonder rRNA dat een complementaire SNP bevat (d.w.z. Y-signaal in cellen zonder Y rDNA of X-signaal in cellen zonder X rDNA; Figuur 3B-C). Bovendien kan kunstmatige co-labeling van X- en Y-rRNA soms worden gedetecteerd in de somatische hub, zelfs in monsters zonder X- of Y-rDNA-loci (Figuur 3B-C, gele pijlen). Daarom mogen alleen nucleaire signalen worden gebruikt om locusspecifieke transcriptie te beoordelen. Van de meeste cellen, met name somatische cellen, wordt verwacht dat ze alleen een Y-rRNA-signaal hebben, wat aangeeft dat rRNA uitsluitend wordt getranscribeerd van de Y-rDNA-locus (Figuur 3A, gele stippelcirkel en rode pijl)^10,17. Co-expressie van X- en Y-rRNA wordt echter vaak gedetecteerd in geslachtscellen, met name kiembaanstamcellen¹³ (Figuur 3A, witte gestippelde cirkels). X- en Y-rRNA-signalen in cellen die samen tot expressie komen, kunnen aangrenzend zijn en een enkele nucleolus vormen (bovenste cel Figuur 3A) of kunnen gescheiden zijn en twee nucleoli vormen (Figuur 3A onderste cel). De voorbeelden in Figuur 3 zijn afkomstig van rDNA SNP-FISH met behulp van sondesets die gericht zijn op slechts twee SNP's (de twee ITS1 SNP's), wat aantoont dat er slechts twee SNP's nodig zijn voor rDNA SNP-FISH. Er worden echter robuustere signalen waargenomen bij het gebruik van sondes die gericht zijn op alle vier de SNP's¹³.

Negatieve controles zijn een belangrijke toevoeging voor deze test om te bevestigen dat sondes niet kruisreageren met het verkeerde SNP-doelwit, vooral wanneer de methode voor het eerst wordt opgelost. Negatieve controles op het X-chromosoom omvatten elke aandoening die geen X-chromosoom rDNA heeft, zoals mannen die een X-chromosoom herbergen met een rDNA-deletie. Verwacht wordt dat de negatieve controles op het X-chromosoom alleen een Y-rRNA-signaal detecteren en geen X-rRNA (Figuur 3B). Negatieve controles op het Y-chromosoom omvatten elke aandoening zonder Y-chromosoom rDNA. Enkele voorbeelden van deze aandoeningen zijn XX vrouwelijke weefsels, weefsel van mannen zonder Y-chromosoom of mannen met een Y-chromosoom met een rDNA-deletie¹⁵. Van de Y-chromosoomnegatieve controles wordt verwacht dat ze alleen een X-rRNA-signaal detecteren en geen detecteerbaar Y-rRNA-signaal hebben (Figuur 3C). Merk op dat deze bedieningselementen niet alleen belangrijk zijn om de specificiteit van de sonde te bepalen, maar ook om eventuele signaalachtergrond of artefacten te bepalen. Alle nieuwe sondes of testcondities die specificiteit bieden in dergelijke controles, kunnen nauwkeurig worden gebruikt om locusspecifieke rDNA-transcriptie te detecteren.

Verschillende genetische, ontwikkelings- of omgevingsomstandigheden kunnen de waarschijnlijkheid veranderen dat rDNA uitsluitend wordt getranscribeerd van de Y-chromosoom rDNA-locus^13,17. De frequentie van rDNA-transcriptie van een enkele locus of meerdere loci kan worden gekwantificeerd en direct worden vergeleken tussen monsters. Om verschillen in rDNA-locustranscriptie kwantitatief te vergelijken, moet elke cel afzonderlijk worden gecategoriseerd als Y-dominant, Co-dominant of X-dominant. Cellen worden alleen gecategoriseerd als Y- en X-dominant als alleen dat respectievelijke signaal wordt gedetecteerd. Elke cel met zowel Y- als X-rRNA-signalen wordt als co-dominant beschouwd, zelfs als het ene signaal veel zwakker is dan het andere. Cellen met zeer sterke X- en Y-signalen worden dus kwalitatief als hetzelfde beschouwd als cellen met sterke Y- en zwakke X- of sterke X- en zwakke Y-signalen. Het totale percentage van alle cellen in alle monsters in elke categorie kan tussen de monsters worden vergeleken door middel van chi-kwadraattoets. Hoewel deze test goed werkt om kwalitatief te bepalen of een bepaalde rDNA-locus wordt getranscribeerd of niet, hebben we geen consistente evaluaties tussen monsters waargenomen bij het direct kwantificeren van de fluorescentie-intensiteit van individuele SNP-FISH-signalen. We raden dus af om kwantitatieve beoordelingen te maken van de FISH-signaalintensiteit tussen monsters of de relatieve intensiteit van X- en Y-rDNA-signalen binnen een enkele cel. De bron van deze inconsistentie in fluorescentie-intensiteit is onduidelijk, hoewel dit te wijten kan zijn aan de inefficiënte binding van gemaskeerde sondes die niet aan alle doel-rRNA's binden.

Figuur 1: Schema van de SNP-FISH-methode. (A) Traditionele FISH-antisense-oligonucleotide-sondes reageren kruisreageren met niet-doelwit-RNA's die slechts één nucleotide verschillen. (B) De SNP-FISH-methode maakt gebruik van complementair maskeroligonucleotide gebonden aan het 3'-gebied van de oligonucleotidesonde. Het masker laat slechts 10 nucleotiden vrij om aan de doelsequentie te binden. Een ontmaskerd sondegebied bindt niet stabiel aan niet-doelwitsequenties die een of meer nucleotiden verschillen. Het masker dissocieert van de sonde nadat de sonde aan het doel is gebonden, waardoor een stabiele binding tussen de sonde en het doel mogelijk is. (C) Anders gelabelde gepaarde SNP-sondes in combinatie met een gemeenschappelijk masker binden specifiek doelen die verschillen door een enkele nucleotide zonder kruisreacties. (D) Meerdere sondes kunnen worden samengevoegd om verschillende rRNA-haplotypes specifiek te labelen. Er zijn vier SNP-verschillen gekarakteriseerd tussen X- en Y rDNA-loci in de y¹w¹ Drosophila melanogaster-stam . Eén SNP in het 18S rRNA, één in het 28S rRNA en twee in het ITS1-gedeelte van het pre-rRNA. X- en Y-specifieke rRNA-haplotypes die worden gebruikt voor SNP-FISH worden weergegeven. Sondes die zich richten op de X rDNA-variant op de vier rRNA SNP's worden geconjugeerd aan een gemeenschappelijke fluorofoor (groen), en sondes die gericht zijn op de Y rDNA-varianten worden geconjugeerd aan een andere fluorofoor (magenta). Voor elke SNP wordt een gemeenschappelijk masker gebruikt (vier in totaal). SNP-specifieke sondebinding op elke SNP-positie op het rRNA kan rRNA van de X- en Y-rDNA-loci specifiek labelen met maximaal vier FISH-oligonucleotide-sondes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Voorbeelden van homozygote en heterozygote rDNA SNP-sequencingresultaten. Voorbeeld sequentiechromatogrammen van 18S SNP-sequencing van DNA van (A) vrouwelijke en (B) mannelijke monsters. 18S SNP-positie aangegeven met een asterisk (*). Het enkele thymine (T)-signaal voor de SNP-positie in het vrouwelijke monster duidt op een thymine op de SNP-positie in de X-chromosoom rDNA-locus. Het dubbele signaal op de SNP-positie, verdeeld tussen thymine en cytosine (C) in het mannelijke monster, duidt op een cytosine op de SNP-positie in de Y-chromosoom rDNA-locus (afgeleid door te weten dat thymine zich op de X-chromosoomlocus bevindt). De resultaten van de sequentiebepaling werden bekeken met behulp van ApE - een plasmide-editorsoftware¹⁹. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Voorbeelden van SNP-FISH-resultaten in de Drosophila-testis met slechts twee SNP-FISH-sondesets. SNP FISH-voorbeelden in de testis van dieren met (A) zowel X als Y rDNA, (B) alleen Y rDNA, of (C) alleen X rDNA. Deze voorbeelden gebruikten alleen sondesets die de twee ITS1 rRNA SNP's labelden, wat aantoont dat rRNA SNP FISH werkt met slechts twee doel-SNP's. Kiemcellen worden geïdentificeerd aan de hand van hun grote ronde kern en somatische cellen aan hun kleinere en minder ronde kern. Kiembaanstamcellen worden geïdentificeerd aan de hand van hun positie direct naast de somatische hub, gemarkeerd met een asterisk (*). Kiemcellen die rDNA van zowel de X- als de Y-rDNA-loci transcriberen, worden geïdentificeerd door zowel X- als Y-nucleaire FISH-signalen (witte gestippelde cirkels, A-A''). Kiemcellen die DNA transcriberen van alleen de Y rDNA-locus hebben alleen een Y-nucleair FISH-signaal (gele gestippelde cirkel). Somatische cellen die alleen Y tot expressie brengen, zijn gemarkeerd met een rode pijl. Kunstmatige co-labeling van X en Y rDNA-loci kan worden waargenomen in de somatische hub (gele pijl). De schaalbalk is 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Aanvullend bestand 1: rRNA-sequentie van X-chromosoomlocus. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Hier beschrijven we een methode om SNP-FISH te gebruiken om 45S rRNA-transcripten te onderscheiden die zijn afgeleid van de X- en Y-chromosoom rDNA-loci in Drosophila melanogaster-weefsels . De meest cruciale stap in dit protocol is de nauwkeurige genotypering van 45S SNP's die moeten worden gebruikt als SNP-FISH-doelen. We bieden primers en een protocol voor het genotype van vier bekende Drosophila 45S SNP's, maar andere sequencingmethoden kunnen nieuwe SNP's aan het licht brengen die als alternatief voor de test kunnen worden gebruikt. Alle SNP-posities die identiek blijken te zijn tussen X- en Y-chromosoom rDNA-loci (d.w.z. er is een enkele sequentiepiek in mannelijke DNA-monsters) kunnen niet worden gebruikt voor SNP FISH. Sommige SNP-posities kunnen heterogeen blijken te zijn binnen een enkele rDNA-locus (d.w.z. sequentieresultaten geven geen enkele SNP-variant voor XX-monsters of slechts een zeer kleine tweede sequencingpiek in XY-monsters). SNP's die heterogeen zijn binnen een enkele rDNA-locus zijn ook niet geschikt voor deze test, aangezien een van de varianten zou worden gedeeld tussen de twee rDNA-loci, waardoor transcriptie van een enkele locus of meerdere loci niet van elkaar te onderscheiden is. Bovendien kan DNA geïsoleerd uit gepaarde vrouwtjes, vanwege de opslag van vrouwelijk sperma²⁰, Y-chromosoom rDNA bevatten. Het is dus van cruciaal belang dat niet-gedekte vrouwtjes worden gebruikt voor XX-sequencing-analyse. Belangrijk is dat deze methode ten minste twee chromosoomspecifieke SNP's vereist om ten minste twee locusspecifieke sondes in staat te stellen elk rRNA-molecuul te binden voor detectie, waardoor de toepassing ervan op rDNA-loci wordt beperkt met ten minste twee onderscheidende SNP's ertussen. De beschikbaarheid van meer SNP's zorgt voor meer sondes om elk rRNA te binden en kan een grotere signaaleffectiviteit bieden. Interessant is dat deze methode alleen rRNA in de nucleolus labelt, ondanks twee sondeparen die zich richten op SNP's in de 18S en 28S rRNA's die naar het cytoplasma worden geëxporteerd (rRNA dat de twee ITS1-doelwitten bevat, bestaat alleen in de nucleolus). Het ontbreken van een cytoplasmatisch FISH-signaal suggereert twee niet-exclusieve mogelijkheden: 1) de 18S- en 28S-sondes alleen zijn onvoldoende om cytoplasmatisch rRNA te detecteren, misschien omdat rRNA meer verspreid is over het cytoplasma dan in de nucleolus, of 2) er is een lagere sondebindingsefficiëntie voor rRNA's die zijn geïntegreerd in de rijpe ribosomale subeenheden dan voor het onbewerkte 45S-rRNA. Aanvullende SNP's in de 18S- en 28S-rRNA's kunnen SNP-gevoelige FISH-detectie van cytoplasmatische rRNA's mogelijk maken.

Andere methoden om locusspecifieke rRNA-transcriptie te beoordelen, zijn onder meer rRNA-sequencingbenaderingen die de expressie van rRNA-varianten differentiëren die zijn toegewezen aan specifieke loci⁶. Evenzo kan qPCR differentieel de expressie beoordelen van rRNA-varianten die duidelijk genoeg zijn om unieke detectie mogelijk te maken ^5,21, hoewel het onduidelijk is of het uitschakelen van deze varianten het uitschakelen van een volledige rDNA-locus vertegenwoordigt. Hoewel deze methoden effectief kunnen zijn bij het kwantificeren van de expressie van specifieke rRNA-varianten, kunnen ze niet worden gedaan met een resolutie van één cel. De heterogeniteit van rDNA-uitschakeling op het X-chromosoom in Drosophila-weefsels suggereert dat er een sterke cel-tot-celvariatie is in rDNA-locustranscriptie¹⁷ en benadrukt de behoefte aan technieken die deze variabiliteit kunnen verklaren. Beeldvormingskenmerken geassocieerd met actieve transcriptie op rDNA-loci, zoals de H3.3 histonvariant¹⁰ of de Pol I-transcriptiefactor UBF²², zijn gebruikt om locusspecifieke rRNA-transcriptie met eencellige resolutie te identificeren. Beide methoden vereisen echter de gecondenseerde chromosomen van mitotische cellen om transcriptie te onderscheiden die plaatsvindt op een bepaalde rDNA-locus. In Drosophila-cellen kunnen rDNA-loci op de X- en Y-chromosomen worden geïdentificeerd aan de hand van chromosoomvorm¹⁰, maar identificatie van transcriptioneel actieve rDNA-loci in menselijke cellen vereist ook co-kleuring met chromosoomspecifieke labels²². De SNP-FISH-methode vereist geen chromosoomspecifieke co-labeling of labeling van transcriptionele markers en kan worden beoordeeld in elk stadium van de celcyclus of post-mitotische cellen, wat flexibiliteit biedt voor gebruik in diverse weefsels en experimentele omstandigheden.

Deze rRNA SNP-FISH-methode kan worden aangepast voor gebruik met andere SNP's die onderscheid maken tussen Drosophila-rRNA's of mogelijk worden toegepast op SNP's die onderscheid maken tussen rDNA-loci in andere organismen. Om deze methode toe te passen op organismen met meer dan twee rDNA-loci, moet een locus een uniek rDNA-varianthaplotype hebben dat ten minste twee SNP's bevat die op geen enkele andere rDNA-locus aanwezig zijn en die worden gedeeld tussen alle 45S-kopieën op die locus. Deze vereiste betekent dat de methode alleen transcriptie van één specifieke locus kan specificeren in vergelijking met alle andere (d.w.z. rRNA SNP's van locus 1 in vergelijking met SNP's gedeeld door loci 2 en 3). Als elke rDNA-locus echter een compatibel haplotype heeft, kunnen meerdere experimenten worden gecombineerd om de transcriptie van elke locus één voor één afzonderlijk te beoordelen. De relatief lage strengheid van de hybridisatietemperatuur (37 °C) die in dit protocol wordt gebruikt, zorgt voor een sterke sondebinding, vooral gezien het korte, ontmaskerde deel van de sonde, hoewel is aangetoond dat hybridisatie bij hogere temperaturen (50-75 °C) het signaal van sommige FISH-sondes verbetert²³. Hogere hybridisatietemperaturen kunnen de verplaatsing van maskerstrengen verbeteren en de sondebinding vergroten, maar te hoge temperaturen kunnen de sonde-maskerbinding destabiliseren en SNP-specificiteit verliezen. Om deze reden verwachten we niet dat SNP-FISH DNA specifiek zal labelen, omdat de temperaturen die nodig zijn om dubbelstrengs DNA-doelen te smelten om sondebinding mogelijk te maken, ook de sonde-maskerbinding zouden destabiliseren en SNP-gevoelige doelspecificiteit zouden elimineren. Toch kan optimalisatie van de hybridisatietemperatuur voor nieuwe rRNA SNP-sondes het signaal verhogen, vooral wanneer er slechts twee SNP-sites beschikbaar zijn. Verlies van rDNA-uitschakeling op het X-chromosoom is geassocieerd met vermindering van het aantal rDNA-kopieën in Drosophila¹³, dus de ontwikkeling van SNP-FISH-assays om locusspecifieke rRNA-transcriptie in andere systemen te karakteriseren, kan dienen als een nuttig hulpmiddel om de integriteit van rDNA en ribosoomfunctie te evalueren. Bovendien is deze methode aangepast voor gebruik met een deletievariant in Drosophila, en deze enkele structurele rRNA-variant was geschikt voor detectie (misschien vanwege een grotere affiniteit voor doelbinding zonder een sondemasker)¹⁷. Het gebruik van structurele rRNA-varianten, mogelijk gecombineerd met SNP-varianten, verbreedt het potentieel voor toepassing in andere systemen. Aangezien de mechanismen die de transcriptie van rDNA-locus reguleren grotendeels onduidelijk blijven, maken de flexibiliteit en het potentiële aanpassingsvermogen van rRNA SNP-FISH aan andere systemen het een krachtig hulpmiddel voor toekomstige studies om rRNA-transcriptie te onderzoeken.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PTC Tempo 96 Thermal Cycler	Bio Rad	12015382	Elke thermische cycler kan worden gebruikt
0.2 mL 8 strip flatcap PCR tubes	VWR	89133-912	Elke compatibele buisjes kunnen worden gebruikt
1 kb DNA ladder	NEB	N3232S	Te gebruiken bij het controleren van de grootte van de sequencing PCR amplicon door gelelektroforese
1.5 mL graduated microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5510	Elke gecertificeerde RNase-vrije buisjes zullen doen
2 mM dNTP Mix	ThermoFisher Scientific	R0241
50x TAE Buffer	Bio Rad	1610743	Gebaat voor gelelektroforese. Elke TAE buffer kan worden gebruikt.
5M NaCl			Elke NaCl kan worden gebruikt of bereid uit elke bron
Agarose	VWR	97064-250	Elke Agarose kan worden gebruikt
ApE - A plasmid Editor software	N/A	N/A	https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/
Clear nail polish			Elke nagellak van elke retailer kan worden gebruikt
Cover glass, No. 1 Thickness	Thomas Scientific	6672A38
Deionized Formamide	Fisher Scientific	NC9569627
Dextran Sulfate Sodium	Sigma Aldrich	D8906-10G
DreamTaq Green PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	K1081
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-20	Gebaat voor het dissekeren van monsters
EDTA (0.5M), Ph 8.0	ThermoFisher Scientific	R1021	Elk vergelijkbaar product kan worden gebruikt
Ethanol	VWR	89125-172	Elke 200 proof Ethanol kan worden gebruikt. Gebaat voor verdunning tot 70% ethanol voor permeabilisatie en reiniging voor Rnase-vrije omstandigheden
Ethidium Bromide	ThermoFisher Scientific	15585011
Horizontal Mini Gel Electrophoresis System	Fisher Scientific	14-955-170	Elk gelelektroforese systeem kan worden gebruikt
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Micro-Test Staining Dish	Electron Microscopy Sciences	71564	Gebaat voor het dissekeren van monsters
Nutating shaker	Sigma Aldrich	BMSB3D1020	Elke nutating shaker kan worden gebruikt
Parafilm	USA Scientific	3023-4526
Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4, RNase-free	Life Technologies	AM9624
Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Life Technologies	28908
Precision General Purpose Water Bath	Life Technologies	TSGP02	Elke waterbad kan worden gebruikt
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Elk gel extractie kit kan worden gebruikt
Recombinant Proteinase K Solution (20 mg/mL)	Invitrogen	AM2546	Elk vergelijkbaar product kan worden gebruikt
Rnase-free UltraPure BSA	ThermoFisher Scientific	AM2618
S. cerevisiae tRNA	Sigma Aldrich	R8759
SSC (20X), RNase-free	Fisher Scientific	AM9763
Triton-X 100	Life Technologies	A16046.AE
UltaPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5	ThermoFisher Scientific	15567027	Elk vergelijkbaar product kan worden gebruikt
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Life Technologies	10977023
Vanadyl ribonucleoside complex	NEB	S1402S
VECTASHIELD mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200-10
VWR Superfrost Microscope Slide	VWR	48311-601
y[1]w[1] Drosophila melanogaster line	Bloomington Drosophila Stock Center	1495
Zeiss LSM 980 confocal microscope	Zeiss microscopy		Elke confocale microscoop met compatibele emissie en detectie kan worden gebruikt
Zeiss Stemi 2000-C Stereo Microscope and light source	Microscope Central	455053	Elke steromicroscoop kan worden gebruikt