Methodenartikel

Prion Veiligheid Laboratorium Swipe-test

DOI:

10.3791/67889

⸱

14 februari 2025

 ,  , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, School of Medicine, Creighton University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een methode om veelgebruikte gebieden in laboratoriumomgevingen te beoordelen op prionverontreiniging en effectieve ontsmetting ontbreekt. Het hier beschreven protocol biedt de belangrijkste basisprincipes voor het implementeren van een prionveiligheidstest in het laboratorium die eenvoudig kan worden aangepast aan de individuele behoeften van specifieke laboratoria.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Overdracht van iatrogene prionziekte heeft plaatsgevonden door besmette neurochirurgische instrumenten, transplantatiemateriaal en beroepsmatige blootstelling aan met prionen besmette laboratoriuminstrumenten. Prionen veroorzaken ziekte door de sjabloonvormige misvouwing van de normale cellulaire vorm van het prioneiwit, PrPC, in de verkeerd gevouwen en pathogene vorm PrPSc en zijn altijd dodelijk. Het verminderen van iatrogene en beroepsmatige prionoverdracht is een uitdaging. Ten eerste kunnen prionen zich binden aan en gedurende lange tijd op oppervlakken blijven bestaan. Ten tweede zijn prionen zeer resistent tegen inactivering. Daarom kunnen oppervlakken gedurende lange tijd besmettelijk blijven na ineffectieve ontsmetting. Dit kan niet alleen een potentieel beroepsrisico vormen voor prionlaboratoriummedewerkers, maar het kan ook laboratoriumexperimenten kruisbesmetten met behulp van gevoelige prionversterkingstechnieken. Het hier beschreven protocol voor een veegtest van een prionveiligheidslaboratorium omvat stappen voor de identificatie en documentatie van laboratoriumgebieden met veel verkeer, aanbevolen uitstrijkjes om de geldigheid van de resultaten te waarborgen, stappen om de juiste reacties op positieve oppervlakteuitstrijkjes te identificeren, representatieve resultaten van prionveegtesten, evenals mogelijke artefactische resultaten. Over het algemeen kan de veegtest van het prionveiligheidslaboratorium worden geïmplementeerd als onderdeel van een breder prionveiligheidsprogramma om de ontsmetting van oppervlakken te beoordelen, gemeenschappelijke ruimtes te controleren op prionverontreiniging en de documentatie van de prionontsmettingsstatus te implementeren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prionziekten zijn steevast dodelijke neurodegeneratieve ziekten waarvoor geen behandeling of genezing bekend is. Prionziekten worden veroorzaakt door PrPSc, de verkeerd gevouwen en pathogene vorm van de normale cellulaire vorm van het prioneiwit 1,2,3,4,5, PrP C. Van prionziekten is bekend dat ze mensen en verschillende andere diersoorten treffen. Eén menselijke prionziekte, de ziekte van Creutzfeldt-Jakob, CJD, heeft drie bekende etiologieën: sporadisch, overgeërfd en verworven. Verworven CJD kan optreden als gevolg van accidentele overdracht (iatrogeen en beroepsmatig) en wordt verondersteld de oorzaak te zijn van Kuru in de Fore-bevolking van Papoea-Nieuw-Guinea6.

Priontransmissie is in verband gebracht met met prionen besmette medische hulpmiddelen en transplantatiematerialen 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Iatrogene overdracht van CJD kan plaatsvinden via bloed, weefsel of van met prionen besmette oppervlakken 18,19,20. Iatrogene CJD kan zich bijvoorbeeld ontwikkelen bij patiënten na een elektro-encefalogram met elektroden die eerder zijn gebruikt bij een persoon in het preklinische stadium van CJD, die later bezweek aan CJD21. Recentere beroepsmatige overdracht in het laboratorium heeft zich ook voorgedaan wanneer een laboratoriummedewerker prionziekte opliep via een huidpunctie met een tang die werd gebruikt om hersenplakjes te hanteren van een dier dat besmet was met aan schapen aangepaste BSE22,23. Dergelijke transmissiescenario's kunnen zich voordoen in klinische, laboratorium- en diagnostische laboratoriumomgevingen waar prionmonsters worden behandeld.

Prionen zijn bestand tegen gangbare desinfectietechnieken en kunnen gedurende langere tijd aanhouden en besmettelijk blijven op oppervlakken 24,25,26,27,28,29. Gebruikelijke desinfectietechnieken zoals het gebruik van ethanol, fenolische reinigingsmiddelen, waterstofperoxide, verschillende vormen van straling en formaldehyde zijn ontoereikend voor de inactivering van prionen, waardoor oppervlakken infectiviteit kunnen behouden 30,31,32,33,34,35,36,37. Deze kenmerken dragen bij aan de overdracht van prionen tijdens iatrogene en beroepsmatige blootstelling.

Methoden voor de detectie van prionen in het milieu zijn pas onlangs ontwikkeld. Een uitstrijkmethode in combinatie met real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC) kan de resterende prioninfectiviteit van milieuoppervlakken beoordelen, evenals gewone laboratoriumoppervlakken na ineffectieve desinfectie 38,39,40,41,42. Hier beschrijven we hoe deze techniek kan worden opgenomen in een breder prionveiligheidsprogramma. Over het algemeen kan deze methode het mogelijk maken om laboratoriumafhankelijke desinfectieprotocollen te monitoren, de besmettingsstatus te onderzoeken en correct te documenteren, wat kan helpen de geldigheid van experimenten te waarborgen door kruisbesmetting tot een minimum te beperken, de beoordeling van ruimtes voor gedeeld gebruik voor prionverontreiniging en maakt gerichte omscholing van personeel mogelijk op basis van vaak besmette gebieden.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures met dieren zijn goedgekeurd en in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren door de Creighton University Institutional Animal Care and Use Committee.

OPMERKING: Een schematisch overzicht van de prionveiligheidslaboratoriumveegtest wordt weergegeven in figuur 1.

1. Selectie van uitstrijkjes en voorbereiding voor het uitstrijken van het oppervlak

  1. Identificeer en label de juiste bewakingsgebieden voor uitstrijkjes. Raadpleeg het meegeleverde sjabloon voor documentatie en referentie (Figuur 2 en aanvullende afbeelding 1).
  2. Bereid twee microcentrifugebuisjes van 1,5 ml voor op elk van de geïdentificeerde gebieden. Voeg 250 μl Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing toe aan de eerste set microcentrifugebuisjes voor gebruik in stap 3.2. Laat de tweede set microcentrifugebuisjes leeg voor gebruik in stap 4.3.
  3. Haal wattenstaafjes met schuimpunt uit de opslag in een ruimte die vrij is van prionverontreiniging.
  4. Maak een knijpfles met Milli-Q water (MQ H2O) klaar voor gebruik in stap 2.1.

2. Voorbereiding van het positieve en negatieve controlewattenstaafje

  1. Bereid verdunningen voor positieve en negatieve uitstrijkjes voor met behulp van de relevante controletypen. Voorbeeld: Bereid voor positieve controle een verdunning van 1% van prion-geïnfecteerd hersenhomogenaat in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS). Bereid voor negatieve controle een verdunning van 0,1% van niet-geïnfecteerd (UN) hersenhomogenaat (BH) van dezelfde soort als de positieve controle in DPBS.
  2. Haal met schone handschoenen het juiste aantal wattenstaafjes uit de schone verpakking en plaats het handvat met de handvat naar beneden in een buisrek, waarbij u ervoor zorgt dat de schuimstaafjes uit elkaar worden geplaatst zodat de uiteinden niet in contact komen met andere wattenstaafjes of oppervlakken. Maak voor elk controlemonster drie wattenstaafjes. Verwissel de handschoenen tussen elk monster.
  3. Houd een schoon schuimstaafje bij het handvat vast en breng 50 μL respectievelijke positieve en negatieve controlemonsters aan op de tips van het schuimwattenstaafje. Zorg ervoor dat u het op beide zijden van de tip van het wattenstaafje aanbrengt om volledige absorptie te garanderen.
    NOTITIE: Wissel altijd van handschoenen voordat u een schoon wattenstaafje uit het buisrek verwijdert.
  4. Knip met een schaar het overtollige handvat van het wattenstaafje af (ongeveer 1/2 van de lengte) en plaats het wattenstaafje in de voorgeladen microcentrifugebuis met het schuimuiteinde naar beneden gericht. Zorg ervoor dat de schuimtip is ondergedompeld in de DPBS en dat het handvat voldoende is gesneden om het deksel van de microcentrifugebuis volledig te sluiten.
  5. Ga na het verwisselen van handschoenen door met het aanbrengen van controlemonsters totdat alle monsters zijn aangebracht.

3. Oppervlak zwabberen

  1. Houd een schoon wattenstaafje aan het handvat vast, maak de schuimrubberen punt nat met MQ H2O en schud het overtollige eraf. Plaats de bevochtigde schuimpunt van het wattenstaafje op het gebied dat is gekozen voor bewaking en veeg het gebied ongeveer tien keer heen en weer terwijl u tegelijkertijd de punt van het wattenstaafje op het oppervlak draait.
  2. Knip met een schaar het overtollige handvat van het wattenstaafje af (ongeveer 1/2 van de lengte) en plaats het wattenstaafje in de voorgeladen microcentrifugebuis met het schuimuiteinde naar beneden gericht. Zorg ervoor dat de schuimtip is ondergedompeld in de DPBS en dat het handvat voldoende is gesneden om het deksel van de microcentrifugebuis volledig te sluiten.
  3. Gooi handschoenen weg en trek nieuwe handschoenen aan voor elke respectieve uitstrijkplaats om de kans op kruisbesmetting te minimaliseren.
  4. Herhaal de procedure totdat alle gebieden die voor bewaking zijn gekozen, zijn uitgenomen.

4. Wattenstaafje-extractie en vacuümconcentratie

NOTITIE: Zet de vacuümconcentrator 30 minuten voor gebruik aan om het instrument op te warmen.

  1. Plaats de microcentrifugebuisjes in een rond buisrek. Plaats het microfuge-buisrek in het waterbad van de bekerhoornsonicator. Zorg ervoor dat de schuimwattenstaafjes in DPBS in de microcentrifugebuisjes zich onder het wateroppervlak in de bekerhoorn bevinden (het handvatgedeelte hoeft niet te worden ondergedompeld). Pas de volgende instellingen toe: 15 s totale looptijd (5 s aan, 5 s uit) bij ~75-85 watt.
  2. Na sonicatie centrifugeert u de buizen gedurende ongeveer 15 s om DPBS op de bodem van de buis te verzamelen voordat u ze overbrengt.
  3. Gebruik een P1000-pipet die is ingesteld op 250 μL om voorzichtig alle vloeistof (wattenstaafje-extract) van de bodem van de microcentrifugebuis te verzamelen en over te brengen in de overeenkomstige microcentrifugebuis van de tweede, lege voorgelabelde set. Gebruik de pipetpunt om overtollige vloeistof uit de schuimtip te persen. Gooi lege buisjes met wattenstaafjes weg.
  4. Stel de volgende instellingen in op de vacuümconcentrator: Temperatuur: 45 °C, Warmtetijd: 15 min, Looptijd: 2 uur, Vacuüm: 5.1.
  5. Plaats de microcentrifugebuisjes met wattenstaafjesextracten in de vacuümconcentrator en zorg ervoor dat de buisjes in balans zijn en dat alle buisdoppen open zijn.
  6. Zorg er na voltooiing van de cyclus voor dat de monsters volledig geconcentreerd zijn (alleen de pellet blijft over). Bewaar de pellets bij -80 °C totdat ze worden gebruikt voor RT-QuIC.
    NOTITIE: In sommige gevallen kan extra vacuümconcentratietijd nodig zijn om volledige concentratie te garanderen. Verwijder alle geconcentreerde monsters en laat alleen de buisjes over die nog vloeistof bevatten. Breng de resterende buisjes in de concentrator weer in evenwicht en draai ze in extra stappen van 1 uur totdat de monsters volledig zijn geconcentreerd.

5. Voorbereiding van wattenstaafjes voor gebruik in RT-QuIC

OPMERKING: De RT-QuIC-controles moeten worden uitgevoerd voorafgaand aan de bepaling van extracten van uitstrijkjes uit de omgeving om er zeker van te zijn dat er geen verontreiniging is geïntroduceerd tijdens de uitstrijk-, extractie- of concentratieprocedures. Zie bijvoorbeeld lay-outs 3 en 4 Afbeelding.

  1. Bereid een geschikte negatieve RT-QuIC-plaatcontrole voor (bijv. niet-geïnfecteerd hersenhomogenaat [UN BH]) door te verdunnen tot de juiste concentratie in weefselverdunningsoplossing (N2-0,1%SDS/PBS). Bereid een positieve plaatcontroleverdunning voor door prion-geïnfecteerd hersenhomogenaat te verdunnen tot een verdunning van 10-3 in een weefselverdunningsoplossing.
  2. Verwijder de eerder bewaarde pellets van het controlewattenstaafje bij -80 °C en suspendeer elk met 50 μl MQ H2O door ongeveer 10 keer op en neer te pipetteren, gevolgd door kort vortexen. Laat monsters op kamertemperatuur (RT) staan terwijl u de resterende stappen uitvoert.
  3. Laad 2 μl gespecificeerde plaatcontroles, inclusief negatieve plaatcontroles (alleen weefselverdunningsoplossing en niet-geïnfecteerd hersenhomogenaat) en een positieve plaatcontrole (geïnfecteerd hersenhomogenaat).
  4. Laad 2 μL van elk positief en negatief uitstrijkje extract technische replicatie in minimaal vier gerepliceerde RT-QuIC-plaatputjes.
    OPMERKING: Als negatieve uitstrijkjes RT-QuIC-zaaien vertonen boven de norm van een laboratorium voor een positieve bepaling, zou dit erop wijzen dat er besmetting is geïntroduceerd tijdens het uitstrijk-, extractie- en concentratieproces en dat het uitstrijkjesexperiment opnieuw moet worden uitgevoerd

6. Voorbereiding van monsters voor gebruik in RT-QuIC

  1. Bereid een geschikte negatieve plaatcontrole voor (bijv. niet-geïnfecteerd hersenhomogenaat, niet-geïnfecteerde lymfeklier, enz.) door te verdunnen tot de juiste concentratie in weefselverdunningsoplossing (N2-0,1%SDS/PBS). Bereid positieve plaatcontroles voor door geïnfecteerd hersenhomogenaat te verdunnen tot een verdunning van 10-3 in weefselverdunningsoplossing.
  2. Verwijder eerder bewaarde swab-extractpellets van -80 °C en suspendeer opnieuw met 20-50 μL weefselverdunningsoplossing (afhankelijk van de vermoedelijke hoeveelheid verontreiniging) door ongeveer tien keer op en neer te pipetteren, gevolgd door kort vortexen. Laat samples op RT zitten terwijl u de resterende stappen uitvoert.
  3. Laad 2 μl gespecificeerde plaatcontroles, inclusief negatieve plaatcontroles (alleen weefselverdunningsoplossing en niet-geïnfecteerd hersenhomogenaat) en een positieve plaatcontrole (geïnfecteerd hersenhomogenaat) in de RT-QuIC-plaatputjes.
  4. Laad 2 μL van elk wattenstaafje in vier herhaalde putjes.

7. RT-QuIC analyse en resultaten

  1. Voer RT-QuIC uit volgens individuele laboratoriumprotocollen (optionele protocollen38,40).
  2. Definieer de parameters die nodig zijn om de positiviteit van een steekproef te bepalen (zie representatieve resultaten, figuur 5).
    OPMERKING: Deze parameters worden door elk lab gedefinieerd.
  3. Noteer de resultaten in de verstrekte tabel en onderneem passende maatregelen op basis van de beste praktijken van het laboratorium (tabel 1 en aanvullende afbeelding 2).

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schriftelijke beschrijving van positieve en negatieve resultaten (inclusief positieve/negatieve plaat en uitstrijkjes)

Negatieve controlestaafjes worden opgenomen in het bewakingsuitstrijkje om te controleren op mogelijke prionverontreiniging die zou kunnen worden geïntroduceerd tijdens het uitstrijkje, de extractie en het concentratieproces. De eerste RT-QuIC-plaat die voor een bepaalde maandelijkse controle wordt uitgevoerd, moet de positieve en negatieve uitstrijkjes bevatten. Succesvolle negatieve controles slagen er niet in de positieve fluorescentiedrempel te overschrijden (figuur 6A). Dit resultaat zou erop wijzen dat er tijdens de experimentele procedures geen besmetting was geïntroduceerd. Succesvolle extracten van positieve controle-uitstrijkjes zouden positieve uitzaaiing vertonen in alle replicaatputten voor een bepaald monster (positieve controle-uitstrijkjes waren besmet met de aan hamsters aangepaste overdraagbare nertsencefalopathiestam Hyper (HY TME) hersenhomogenaat. Door de opname van een positieve-controleverdunningsreeks kan de gevoeligheid van de priondetectie voor een bepaald experiment worden bepaald (figuur 6A).

Bij het onderzoeken van monsters van oppervlakteuitstrijkjes kunnen oppervlakken die geen seeding boven de vooraf bepaalde positieve fluorescentiedrempel vertonen, als prionnegatief worden beschouwd (Figuur 6B). Omgekeerd zullen met prionen verontreinigde extracten van oppervlakteuitstrijkjes zaaimogelijkheden vertonen boven de positieve fluorescentiedrempel, hoewel de maxpointverhouding (MPR) en de tijd tot fluorescentie kunnen variëren in vergelijking met de meegeleverde positieve plaatcontrole (Figuur 6B). Het vermogen van de methode om adequate desinfectie te beoordelen, wordt benadrukt door de met bleekmiddel behandelde prionbesmette oppervlakken, die nu geen RT-QuIC meer zaaien (Figuur 6B).

Belangrijk is dat, hoewel ons laboratorium een positief monster definieert als een monster dat in ten minste de helft van de duplicaatputten de ingestelde positieve fluorescentiedrempel passeert, het noodzakelijk is dat elk laboratorium zijn eigen normen vaststelt. De snelheid van amyloïdvorming (RAF) en de tijd tot fluorescentie kunnen ook worden gebruikt om laboratoriumspecifieke drempels voor positiviteit vast te stellen.

We hebben resultaten van oppervlakteartefacten waargenomen die de positieve fluorescentiedrempel overschrijden, maar met veranderde kinetische curven en na een abnormaal lange tijd tot fluorescentie in vergelijking met positieve controlemonsters (Figuur 6C). Deze resultaten moeten met de nodige voorzichtigheid worden geïnterpreteerd, aangezien ze kunnen worden veroorzaakt door de aanwezigheid van stof of achtergebleven chemicaliën op een oppervlak. Deze bevindingen benadrukken de noodzaak van algemene reinheid van het laboratorium, evenals criteria om onderscheid te maken tussen echt positief en vals-positief zaaien.

De verwijdering van vast en vloeibaar biologisch gevaarlijk afval moet gebeuren volgens de huidige richtlijnen voor de verwijdering van biologische gevaren van een bepaalde instelling. Veel voorkomende priondesinfectietechnieken zijn behandeling met natriumhydroxide, natriumhypochloriet (bleekmiddel) of autoclaveren bij 134 °C gedurende 18 minuten 43,44,45,46.

figure-results-1
Figuur 1: Schematisch overzicht van de prionveiligheidslaboratorium-swipetest. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Voorbeeld van een lay-out van de zwabbersite. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Voorbeeldexperimentontwerp voor uitstrijkjes inclusief prionveiligheidslaboratoriumveegtest. (A) Steekproeflay-out voor negatieve en positieve uitstrijkjes. (B) Negatieve en positieve uitstrijkjes moeten opnieuw worden gesuspendeerd met 50 μl H2O. Een 10-voudige verdunning van het geresuspendeerde wattenstaafje moet worden gegenereerd door het te verdunnen tot een weefselverdunningsoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Ontwerp van het voorbeeldexperiment voor extracten van oppervlakteuitstrijkjes van de veegtest van het prionveiligheidslaboratorium. (A) Voorbeeldlay-out voor extracten van oppervlakteuitstrijkjes. (B) Monsters van het uitstrijkje van het oppervlak moeten opnieuw worden gesuspendeerd met 20 μl weefselverdunningsoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Maandelijkse prionveiligheidstest in het laboratorium. Stroomdiagram dat wordt gebruikt voor het interpreteren van resultaten en het bepalen van de juiste reactie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Representatief experiment met uitstrijkjes van het oppervlak. (A) Controleplaat van het uitstrijkje van het oppervlak met negatieve uitstrijkjescontroles in drievoud (DPBS, niet-geïnfecteerd hamsterhersenhomogenaat 10-4 en 10-10) en positieve uitstrijkjesextractcontroles in drievoud (HY-hersenhomogenaat 10-3). (B) Representatieve uitstrijkjes voor werkbladen, glazen en roestvrijstalen oppervlakken (SS) die zijn afgenomen voorafgaand aan besmetting, na besmetting met HY 10-3 en na bleekbehandeling van besmette oppervlakken. (C) Fluorescentietracering vergelijking van niet-geïnfecteerd hersenhomogenaat 10-4, HY hersenhomogenaat 10-3 en het uitstrijkje van het werkblad bedekt met een fijne stoflaag. Negatieve plaatcontroles voor panelen A en B omvatten een blanco (weefselverdunningsoplossing) en niet-geïnfecteerde hamsterhersenen homogenaat 10-4. Panel B omvat de toevoeging van niet-geïnfecteerd hersenhomogenaat 10-4 en de positieve plaatcontrole van HY hersenhomogenaat 10-3. Een positieve fluorescentiedrempel (geïllustreerd door een rode stippellijn) werd vastgesteld op 2. De gerapporteerde maxpointverhouding (MPR) is de maximale fluorescentie gedeeld door de initiële fluorescentiewaarde die door de plaatlezer is verkregen. Elk punt vertegenwoordigt een technische putreplicatie voor een bepaald type monster. Het gemiddelde en de standaarddeviatie worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Voorbeeld van een maandelijks documentatieformulier voor de uitstrijksite. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende figuur 1: Sjabloon voor de lay-out van de zwabbersite. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Maandelijks documentatieformulier voor het uitstrijken van de site. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De beschreven prionveiligheidszwabbermethode kan worden gebruikt om bestaande prionveiligheidsmaatregelen te verbeteren. Deze methode kan prionlaboratoriumruimtes en -apparatuur, evenals gedeelde laboratoriumruimtes, monitoren op mogelijke prionverontreiniging. Belangrijk is dat deze methode kan worden aangepast om laboratoriumspecifieke desinfectietechnieken te testen om de ontsmetting van met prionen besmette oppervlakken te verifiëren. Aangezien verschillende prionstammen verschillende gevoeligheden vertonen voor desinfectietechnieken, kan deze methode bevestigen dat deze technieken effectief zijn voor huidige laboratoriumexperimenten, zoals behandeling met natriumhydroxide of natriumhypochloriet (bleekmiddel)43,44.

De belangrijkste stappen voor deze methodologie zijn onder meer de identificatie van geschikte uitstrijklocaties die een steekproef zullen opleveren van zowel gebieden met veel verkeer als gebieden om te monitoren die mogelijk betrokken zijn bij stroomafwaartse kruisbesmetting van experimenten. Bovendien moeten laboratoria positieve en negatieve controles gebruiken die nauw aansluiten bij de controles die gewoonlijk in een bepaald laboratorium of kliniek worden gebruikt. Als er bijvoorbeeld met prionen van knaagdieren wordt gewerkt, moeten de positieve en negatieve controles overeenkomen met die soort. Ten slotte moeten surveillancegegevens up-to-date worden gehouden en georganiseerd, zodat trends in positiviteit gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd, waardoor mitigatie en herscholing van laboratoriumpersoneel mogelijk wordt in het geval van consistente positieve resultaten voor een bepaald gebied.

Een beperking van dit protocol is het mogelijk genereren van foutieve RT-QuIC-resultaten. Gezien de gevoelige aard van RT-QuIC kan de aanwezigheid van achtergebleven reinigingsmiddelen, zout en andere stoffen op laboratoriumoppervlakken de uitkomst van de reactie beïnvloeden39. Over het algemeen is het, gezien deze observatie, voordelig dat oppervlakken vrij blijven van stoffen die RT-QuIC kunnen verstoren, zoals restzout, wasmiddelen en stof. Naarmate er verbeteringen in de RT-QuIC-methodologie beschikbaar komen, verwachten we dat veel van de huidige beperkingen van RT-QuIC zullen worden opgelost. We moedigen de eindgebruiker daarom aan om op de hoogte te blijven van de literatuur om te profiteren van de nieuwste verbeteringen in RT-QuIC.

Een belangrijk voordeel van deze methode voor laboratoria die prionen onderzoeken, is het vermogen om verontreiniging te minimaliseren die van invloed kan zijn op de resultaten van gevoelige amplificatietests. Necropsie-instrumenten worden gewoonlijk gedesinfecteerd voordat ze opnieuw worden gebruikt voor toekomstige necropsieën. De beschreven zwabbermethode biedt een methode om obductie-instrumenten te beoordelen op resterende prioninfectiviteit die de stroomafwaartse resultaten kan beïnvloeden. Dit kan een extra niveau van nauwkeurigheid geven aan experimenten om de mogelijkheid uit te sluiten dat priondetectie in weefsels niet te wijten was aan contaminatie door de obductie-instrumenten.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.B. en Q.Y. zijn uitvinders van een octrooiaanvraag met betrekking tot prion-oppervlaktezwabbertechnologie.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk werd ondersteund door een subsidie van de Creutzfeldt Jacob Disease Foundation. De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek, het verzamelen en interpreteren van gegevens, of de beslissing om het werk voor publicatie in te dienen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Fisherbrand PurSwab Foam SwabsFisher brandCatalog #14-960-3E
Milli-Q IQ 7005 Ultrapure Water SystemMilliporeSigmaQ7005T0C
Mini-centrifuge, 6000 rpmSouthern LabwareMLX-306
Omega plate readerBMG LabtechFLUOstar Omega plate reader
Q700 sonicatorQSonicaQ700-110
Recombinant hamster prion proteinMNPROMNPROtein-Hamstersyrische hamster, aminozuren 90-231
Savant speedvac Thermo ScientificSPD1030-230
Silica nanospheres (50 nm)nano Composix SISN50-25M

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  2. Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
  3. Oesch, B., et al. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell. 40 (4), 735-746 (1985).
  4. Caughey, B., Raymond, G. The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive. J Biol Chem. 266 (27), 18217-18223 (1991).
  5. Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. Formation of native prions from minimal components in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (23), 9741-9746 (2007).
  6. Gajdusek, D. C., Zigas, V. Degenerative disease of the central nervous system in New Guinea: the endemic occurrence of "kuru" in the native population. N Engl J Med. 257, 974-978 (1957).
  7. Centers for Disease Control. Fatal degenerative neurologic disease in patients who received pituitary-derived human growth hormone. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 34, 359-361 (1985).
  8. Duffy, P., Wolf, J., Collins, G., DeVoe, A. G., Streeten, B., Cowen, D. Letter: possible person-to-person transmission of Creutzfeldt-Jakob disease. N Engl J Med. 290 (12), 692-693 (1974).
  9. Brown, P., et al. Iatrogenic Creutzfeldt-Jakob disease at the millennium. Neurology. 55 (8), 1075-1081 (2000).
  10. Huillard d'Aignaux, J., et al. Incubation period of Creutzfeldt-Jakob disease in human growth hormone recipients in France. Neurology. 53 (6), 1197-1201 (1999).
  11. Marzewski, D. J., Towfighi, J., Harrington, M. G., Merril, C. R., Brown, P. Creutzfeldt-Jakob disease following pituitary-derived human growth hormone therapy: a new American case. Neurology. 38, 1131-1133 (1988).
  12. Hannah, E. L., et al. Creutzfeldt-Jakob disease after receipt of a previously unimplicated brand of dura mater graft. Neurology. 56 (8), 1080-1083 (2001).
  13. Shimizu, S., et al. Creutzfeldt-Jakob disease with florid-type plaques after cadaveric dura mater grafting. Arch Neurol. 56 (3), 357-362 (1999).
  14. Antoine, J. C., et al. Creutzfeldt-Jakob disease after extracranial dura mater embolization for a nasopharyngeal angiofibroma. Neurology. 48 (5), 1451-1453 (1997).
  15. Esmonde, T., Lueck, C. J., Symon, L., Duchen, L. W., Will, R. G. Creutzfeldt-Jakob disease and lyophilised dura mater grafts: report of two cases. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 56, 999-1000 (1993).
  16. Willison, H. J., Gale, A. N., McLaughlin, J. E. Creutzfeldt-Jakob disease following cadaveric dura mater graft. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 54, 940(1991).
  17. Diringer, H., Braig, H. R. Infectivity of unconventional viruses in dura mater. Lancet. 334, 439-440 (1989).
  18. Peden, A. H., Head, M. W., Ritchie, D. L., Bell, J. E., Ironside, J. W. Preclinical vCJD after blood transfusion in a PRNP codon 129 heterozygous patient. Lancet. 364 (9433), 527-529 (2004).
  19. Will, R. G., Matthews, W. B. Evidence for case-to-case transmission of Creutzfeldt-Jakob disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 45, 235-238 (1982).
  20. el Hachimi, K. H., Chaunu, M. P., Cervenakova, L., Brown, P., Foncin, J. F. Putative neurosurgical transmission of Creutzfeldt-Jakob disease with analysis of donor and recipient: agent strains. C R Acad Sci III. 320 (4), 319-328 (1997).
  21. Alper, T., et al. Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid. Nature. 214, 764-766 (1967).
  22. Casassus, B. France halts prion research amid safety concerns. Science. 373 (6554), 475-476 (2021).
  23. Brandel, J. P., et al. Variant Creutzfeldt-Jakob disease diagnosed 7.5 years after occupational exposure. N Engl J Med. 383 (1), 83-85 (2020).
  24. Flechsig, E., Hegyi, I., Enari, M., Schwarz, P., Collinge, J., Weissmann, C. Transmission of scrapie by steel-surface-bound prions. Mol Med. 7 (10), 679-684 (2001).
  25. Zobeley, E., Flechsig, E., Cozzio, A., Enari, M., Weissmann, C. Infectivity of scrapie prions bound to a stainless steel surface. Mol Med. 5 (4), 240-243 (1999).
  26. Brown, P., Gajdusek, D. C. Survival of scrapie virus after 3 years' interment. Lancet. 337 (8736), 269-270 (1991).
  27. Seidel, B., et al. Scrapie agent (strain 263K) can transmit disease via the oral route after persistence in soil over years. PLoS One. 2 (5), e435(2007).
  28. Maddison, B. C., et al. Environmental sources of scrapie prions. J Virol. 84 (21), 11560-11562 (2010).
  29. Pritzkow, S., Morales, R., Lyon, A., Concha-Marambio, L., Urayama, A., Soto, C. Efficient prion disease transmission through common environmental materials. J Biol Chem. 293 (9), 3363-3373 (2018).
  30. Alper, T., Cramp, W., Haig, D., Clarke, M. Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid. Nature. 214 (90), 764-766 (1967).
  31. Bernoulli, C., et al. Danger of accidental person-to-person transmission of Creutzfeldt-Jakob disease by surgery. Lancet. 309 (8009), 478-479 (1977).
  32. Brown, P., Rohwer, R. G., Green, E. M., Gajdusek, D. C. Effect of chemicals, heat, and histopathologic processing on high- infectivity hamster-adapted scrapie virus. J Infect Dis. 145 (5), 683-687 (1982).
  33. Brown, P., et al. Chemical disinfection of Creutzfeldt-Jakob disease virus. N Engl J Med. 306, 1279-1282 (1982).
  34. Dickinson, A. G., Taylor, D. M. Resistance of scrapie agent to decontamination. N Engl J Med. 299, 1413-1414 (1978).
  35. Hunter, G. D., Millson, G. C. Studies on the heat stability and chromatographic behavior of the scrapie agent. J Gen Microbiol. 37, 251-258 (1964).
  36. Pattison, I. H. Resistance of the scrapie agent to formalin. J Comp Pathol. 75, 159-164 (1965).
  37. Fraser, H., Farquhar, C., McConnell, I., Davies, D. The scrapie disease process is unaffected by ionising radiation. Prog Clin Biol Res. 317, 653-658 (1989).
  38. Yuan, Q., et al. Sensitive detection of chronic wasting disease prions recovered from environmentally relevant surfaces. Environ Int. 166, 107347(2022).
  39. Simmons, S. M., et al. Rapid and sensitive determination of residual prion infectivity from prion-decontaminated surfaces. mSphere. 9, e00504-e00524 (2024).
  40. Orru, C. D., et al. Sensitive detection of pathological seeds of alpha-synuclein, tau and prion protein on solid surfaces. PLoS Pathog. 20 (4), e1012175(2024).
  41. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217(2010).
  42. Srivastava, A., et al. Enhanced quantitation of pathological alpha-synuclein in patient biospecimens by RT-QuIC seed amplification assays. PLoS Pathog. 20 (9), e1012554(2024).
  43. Hughson, A. G., et al. Inactivation of prions and amyloid seeds with hypochlorous acid. PLoS Pathog. 12 (9), e1005914(2016).
  44. Williams, K., Hughson, A. G., Chesebro, B., Race, B. Inactivation of chronic wasting disease prions using sodium hypochlorite. PLoS One. 14 (10), e0223659(2019).
  45. Taylor, D. M. Autoclaving standards for Creutzfeldt-Jakob disease agent [letter]. Ann Neurol. 22 (4), 557-558 (1987).
  46. Brown, P., Rohwer, R. G., Gajdusek, D. C. Newer data on the inactivation of scrapie virus or Creutzfeldt-Jakob disease virus in brain tissue. J Infect Dis. 153 (6), 1145-1148 (1986).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Prioncontaminatieoppervlakte swabbingRT QuIC analyseprioninactiveringpriondecontaminatieberoepsrisico bij prionenoppervlaktedesinfectiepriondetectie

Gerelateerde artikelen