Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

MEDUSA voor het identificeren van doodregulerende genen in chemo-genetische profileringsgegevens

1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67892

⸱

7 februari 2025

 , 
1Department of Systems Biology, UMass Chan Medical School

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft hoe de MEDUSA-analysemethode kan worden gebruikt om het doodregulerende effect van elke genknock-out te kwantificeren. Het bevat instructies voor het bepalen van experimentele omstandigheden die de gevoeligheid optimaliseren en een stapsgewijze zelfstudie over het uitvoeren van de analyse.

Samenvatting

Systematische screening van genetische verstoringen met functiewinst of -verlies kan worden gebruikt om de genetische afhankelijkheden en regulatiemechanismen te karakteriseren voor vrijwel elk cellulair proces dat van belang is. Deze experimenten omvatten meestal profilering van een pool van individuele genverstoringen en hoe elke genetische verstoring de relatieve celfitness beïnvloedt. Wanneer ze worden toegepast in de context van onderzoeken naar de werkzaamheid van geneesmiddelen, vaak chemogenetische profilering genoemd, zouden deze methoden effectief moeten zijn bij het identificeren van werkingsmechanismen van geneesmiddelen. Helaas zijn op fitness gebaseerde chemo-genetische profileringsstudies niet effectief in het identificeren van alle componenten van een geneesmiddelrespons. Deze studies slagen er bijvoorbeeld over het algemeen niet in om vast te stellen welke genen door geneesmiddelen geïnduceerde celdood reguleren. Verschillende problemen dragen bij aan het verdoezelen van doodsregulatie in op fitness gebaseerde screenings, waaronder de verstorende effecten van variatie in proliferatiesnelheid, variatie in de door geneesmiddelen geïnduceerde coördinatie tussen groei en dood, en, in sommige gevallen, het onvermogen om DNA te scheiden van levende en dode cellen. MEDUSA is een analytische methode voor het identificeren van doodsregulerende genen in conventionele chemo-genetische profileringsgegevens. Het werkt door computationele simulaties te gebruiken om de groei- en sterftecijfers te schatten die een geobserveerd fitnessprofiel hebben gecreëerd in plaats van de fitness zelf te scoren. Effectief gebruik van de methode hangt af van een optimale beoordeling van de experimentele omstandigheden, waaronder de dosis van het geneesmiddel, de beginpopulatiegrootte en de duur van de test. Dit manuscript beschrijft hoe een chemo-genetische profileringsstudie kan worden opgezet voor MEDUSA-gebaseerde analyse, en we zullen demonstreren hoe de methode kan worden gebruikt om sterftecijfers in chemo-genetische profileringsgegevens te kwantificeren.

Inleiding

Bij chemogenetische profilering worden systematische genetische verstoringen gebruikt om de bijdrage van elk gen aan een bepaalde geneesmiddelrespons te begrijpen 1,2,3. Deze experimenten zijn waardevol en kunnen belangrijke inzichten opleveren over medicijnresponsen, waaronder het bindende doelwit van het medicijn en mechanismen van instroom/efflux van medicijnen. Omdat deze experimenten echter meestal op een gepoolde manier worden uitgevoerd die alle genen tegelijkertijd evalueert, kan het genereren van mechanistische inzichten uit chemo-genetische profileringsgegevens een uitdaging zijn.

De controlemechanismen en genetische afhankelijkheden voor door geneesmiddelen geïnduceerde celdood zijn vaak een uitdaging om op te lossen in chemo-genetische profileringsgegevens. Er zijn verschillende redenen voor dit probleem, maar veel hiervan komen voort uit de effecten van variatie in celproliferatie4. Omdat cellen zich bijvoorbeeld exponentieel vermenigvuldigen, heeft het effect van een genetische verstoring op de proliferatiesnelheid een grotere impact op de populatiegrootte dan veranderende celsterftecijfers. Bovendien, omdat deze vertekende gevoeligheid in de loop van de tijd verergert en omdat deze experimenten doorgaans gedurende meerdere weken worden uitgevoerd, zijn de meeste onderzoeken geoptimaliseerd om zeer gevoelig te zijn voor proliferatiedefecten en in wezen ongevoelig voor veranderingen in door geneesmiddelen geïnduceerde celdood. Andere proliferatiegerelateerde problemen zijn onder meer de gevarieerde coördinatie tussen proliferatie en dood (bijv. hoe snel groeit elke kloon terwijl hij sterft, en varieert dit tussen genetische verstoringen) en de variaties in proliferatiesnelheden voor elke kloon in afwezigheid van het medicijn, wat het verwachte aantal cellen verandert dat had moeten / kunnen worden hersteld als het medicijn niet effectief was. Het komt erop neer dat chemo-genetische profileringsexperimenten over het algemeen de impact van genetische verstoringen scoren met behulp van metingen die evenredig zijn met de relatieve populatiegroottes, waarbij behandelde en onbehandelde populaties worden vergeleken. Omdat de populatiegrootte een product is van zowel de celgroei als de celdood, vertegenwoordigt proliferatie vanuit het perspectief van celdood een verstorende invloed.

Om deze problemen op te lossen, hebben we een methode ontwikkeld voor het evalueren van de dood met behulp van een simulatieondersteunde benadering (MEDUSA)5. MEDUSA werkt door de waargenomen gegevens over de relatieve populatiegrootte te interpreteren door de lens van computationele simulaties om de combinatie van door geneesmiddelen geïnduceerde groei- en sterftecijfers af te leiden die de waargenomen geneesmiddelrespons voor elke genetische kloon genereerden. Eerdere gegevens suggereren dat de methode nauwkeurig kan afleiden hoe genetische verstoringen het door geneesmiddelen geïnduceerde sterftecijfer beïnvloeden, maar de nauwkeurigheid van deze methode hangt af van een gedetailleerd begrip van hoe celproliferatie en celdood worden gecoördineerd door een geneesmiddel en hoe deze percentages in de loop van de tijd variëren 5,6. Bovendien vereisen op MEDUSA gebaseerde gevolgtrekkingen dat een medicijn wordt getest in een dosis die aanzienlijke celdood veroorzaakt. Belangrijk is dat deze omstandigheden bij het drogeren extra zorgen baren over de startpopulatiegroottes en testlengtes, die zorgvuldig moeten worden overwogen en geoptimaliseerd. In dit protocol beschrijven we hoe een chemo-genetische profileringsstudie kan worden opgezet voor MEDUSA-gebaseerde analyse en bieden we een gedetailleerd gebruik van deze analytische methode. Het algemene doel van MEDUSA is om te bepalen hoe elke gendeletie de door geneesmiddelen geïnduceerde groei- en sterftecijfers beïnvloedt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Optimalisatie van de medicijndosis om celdood te induceren

OPMERKING: Het onderstaande protocol is voor het optimaliseren van één combinatie van cellijn, medicijn en dosis met behulp van de FLICK-assay 7,8. De voorbeeldgegevens voor dit protocol beschrijven de optimalisatie en screening van 5 μM-etoposide in U2OS-cellen, maar dezelfde optimalisatiestappen kunnen worden toegepast op elke andere gewenste combinatie van cellijn en geneesmiddel/dosis. Dit protocol vereist niet het verzamelen of analyseren van dode cellen. Dit protocol kan worden gebruikt voor suspensieculturen, op voorwaarde dat dode cellen worden verwijderd. Voor suspensieculturen kunnen dode cellen worden gesorteerd/gescheiden met behulp van een levensvatbaarheidsmarker of een marker die specifiek is voor celdood.

  1. Voordat u een FLICK-test uitvoert, optimaliseert u de instellingen voor celaantal, Triton-X-permeabilisatie, SYTOX-concentratie en acquisitie-instellingen van de plaatlezer met behulp van het gedetailleerde protocol beschreven in8.
  2. Plaatcellen in zwarte, heldere bodem 96-well platen. Typische zaaidichtheden zijn 1500-5000 cellen per putje, en dit aantal moet per cellijn worden geoptimaliseerd. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 en vochtigheid gedurende 16-24 uur.
  3. Bereid geneesmiddelverdunningen voor in media die de concentratie SYTOX bevatten die in stap (1.1) als optimaal is geïdentificeerd. Geneesmiddelen worden doorgaans getest in een log-verdunningsreeks die 8-12 biologisch of klinisch relevante doses bevat.
    OPMERKING: Bepaalde geneesmiddelen kunnen fluorescentie uitzenden op dezelfde golflengte als SYTOX, waardoor kwantificering met deze test onmogelijk is. In dergelijke gevallen kan het nuttig zijn om SYTOX-varianten te gebruiken die fluorescentie op verschillende golflengten uitzenden. Bovendien kan deze test de reactie op geneesmiddelen die de SYTOX-fluorescentie beïnvloeden of voorkomen dat SYTOX aan DNA bindt, niet beoordelen.
  4. Lyseer één plaat (T0) met Triton-X in de concentratie die in stap (1.1) is geoptimaliseerd. Gebruik na cellyse een plaatlezer om de SYTOX-fluorescentie te meten en het totale startcelaantal te bepalen op basis van de empirisch vastgestelde relatie tussen fluorescentie en celaantal (zie FLICK-protocol 7,8).
  5. Meet de SYTOX-fluorescentie in de experimentele platen op T0 met behulp van een plaatlezer, met geoptimaliseerde instellingen in stap (1.1).
  6. Bewaak het SYTOX-signaal gedurende drie dagen in de tijd. Om de resulterende kinetische gegevens te beperken, gebruikt u ten minste drie tijdstippen per dag, elk met een tussenpoos van 4 uur.
    OPMERKING: Dit protocol evalueert celdood en groei gedurende 3 dagen. Deze tijdsduur is meestal voldoende voor dodelijke medicijnen; De test kan echter worden ingekort of verlengd om plaats te bieden aan geneesmiddelen met alternatieve doodskinetiek.
  7. Na het laatste tijdstip lyseert u de experimentele plaat(en) met Triton-X om de uiteindelijke populatiegrootte van elke aandoening te bepalen.
  8. Bereken de fractionele levensvatbaarheid (FV) en pas de eindpuntgegevens aan op dosiscurves, zoals beschreven in het FLICK-protocol 7,8.
  9. Identificeer geneesmiddeldoses die ongeveer 50% celdood induceren door de FV-dosiscurves te evalueren.
    OPMERKING: De identificatie van dode cellen door SYTOX vereist zowel een plasmamembraanbreuk als een afbraak van de nucleaire envelop. Deze membranen hebben continu onderhoud nodig, dus SYTOX zal dode cellen identificeren, ongeacht het celdoodmechanisme dat door het medicijn wordt geïnduceerd. Deze processen verlopen echter niet met dezelfde effectiviteit voor alle vormen van celdood, wat van invloed zou kunnen zijn op het vermogen van SYTOX om dode cellen nauwkeurig te meten. Bovendien zullen verschillende celdoodmechanismen cellichamen met verschillende stabiliteit produceren. We hebben echter ontdekt dat alle tot nu toe geteste vormen van celdood resulteren in SYTOX-gebonden DNA (hetzij in een gepermeabiliseerde kern of in de celkweekmedia). Dit SYTOX-signaal is over het algemeen stabiel gedurende een 72-uurs test, maar kan worden gecontroleerd door het totale aantal cellen aan het begin en einde van de test te evalueren.

2. Selectie van de analyselengte

  1. Bereken met behulp van de FLICK-gegevens die in stap 1 zijn verzameld de Lethal Fraction (LF) van elke aandoening in de loop van de tijd, zoals beschreven in het FLICK-protocol 7,8. Pas kinetische LF-gegevens aan op een lag-exponentiële dood (LED)-model, zoals eerder beschreven9.
  2. Zet LF in de tijd uit voor elke dodelijke dosis die in stap 1 is geïdentificeerd. Selecteer een dosis en tijdstip dat ~50% LF produceert.
    OPMERKING: Een letale fractie van ~50% verrijkt sterke, doodsspecifieke signalen in CRISPR-screeninggegevens, terwijl er voldoende levende cellen achterblijven om de bibliotheekrepresentatie te behouden5. Sommige geneesmiddelen worden echter beperkt door de precedent van de literatuur of een beperkt bereik van doses die een specifiek gewenst fenotype induceren. Als de dosis beperkt is, moet het analyse-eindpunt worden verkort of verlengd om ervoor te zorgen dat de gewenste dosis ~50% LF bereikt. Als 50% dodelijkheid niet mogelijk is, kan het nodig zijn om de omvang van de startpopulatie te vergroten.

3. Bepalen van de startpopulatiegrootte

  1. Selecteer de gewenste medicijndosis om de screening verder te optimaliseren op basis van de bovenstaande optimalisatie.
  2. Plaatcellen op schaaltjes van 10 cm in complete media. Elke toestand moet worden geplateerd met technische drievouden en voldoende biologische replicaten, zodat cellen elke 12-24 uur kunnen worden geteld voor de lengte van het scherm, inclusief het T = 0-tijdstip.
    OPMERKING: Het aantal geplateerde cellen moet mogelijk afzonderlijk worden geoptimaliseerd voor onbehandelde en behandelde cellen, rekening houdend met de netto populatiegroeisnelheid en celgrootte. Cellen moeten over het algemeen worden geplateerd met dichtheden die resulteren in een confluentie die de celgezondheid op het testeindpunt niet in gevaar brengt (d.w.z. voor veel celtypen < 80% confluent). Behandelde en onbehandelde cellen kunnen indien nodig ook opnieuw worden geplateerd tijdens de screening, zolang de weergave van de bibliotheek behouden blijft.
  3. Incubeer de cellen een nacht bij 37 °C met 5% CO2.
  4. Voeg het medicijn in de gewenste concentratie toe aan de behandelingsplaten. Oogst tegelijkertijd cellen van 3 onbehandelde platen en tel het aantal levende cellen met behulp van een hemocytometer. Kleur de dode cellen met trypanblauw (of een vergelijkbare kleurstof voor levensvatbaarheid) om ervoor te zorgen dat alleen levende cellen worden geteld. Deze gegevens bepalen het aantal cellen op het T = 0 tijdstip.
  5. Oogst na 12-24 uur cellen van 3 onbehandelde en 3 behandelde platen en tel het aantal levende cellen. Herhaal het oogsten totdat het analyse-eindpunt is bereikt. Om de kinetiek van geneesmiddelen en celdood volledig te begrijpen, wordt aanbevolen om levende cellen gedurende 24-48 uur na het in stap (2.2) aangegeven tijdstip te controleren.
  6. Visualiseer veranderingen in levensvatbaarheid door de populatiegrootte (y-as) in de loop van de tijd (x-as) in kaart te brengen.
    OPMERKING: Op basis van het maximaal waargenomen celaantal en de uiteindelijke populatiegrootte kan een ruwe schatting worden gemaakt van de letale fractie op het eindpunt. Dit moet worden vergeleken met de gegevens over de fractionele levensvatbaarheid en de letale fractie die zijn gegenereerd met behulp van de FLICK-assay (stap 1.9 en stap 2.2) om ervoor te zorgen dat de verwachte hoeveelheid celdood wordt bereikt.
  7. Identificeer het tijdstip met de kleinste populatiegrootte. Afhankelijk van de hoeveelheid groei die optreedt in aanwezigheid van het medicijn, zal dit aan het begin of einde van het CRISPR-scherm zijn.
  8. Selecteer een beginpopulatiegrootte. Zorg ervoor dat het startaantal cellen is geoptimaliseerd om een minimale bibliotheekdekking van 500x-1000x op het hele scherm te behouden.
    OPMERKING: De TKOv3-bibliotheek heeft bijvoorbeeld 70.948 sgRNA's. Om deze bibliotheek met een dekking van 500x weer te geven, moeten niet minder dan 35.474.000 cellen per replicaat per conditie gedurende de hele test worden aangehouden. Deze knelpuntpopulatiegrootte wordt vaak aangetroffen aan het begin van de test of na trypsinisatie en downsampling voor onbehandelde of prolifererende aandoeningen. Daarentegen wordt de populatiegrootte van het knelpunt vaak bepaald door de populatiegrootte op het eindpunt van de test voor medicamenteuze behandelingen die substantiële letaliteit induceren.
  9. Herhaal desgewenst de bovenstaande optimalisatie op de platen die zullen worden gebruikt voor de CRISPR-screening (bijv. platen van 15 cm) om te bevestigen dat de werkzaamheid van het geneesmiddel correct wordt geschaald.

4. CRISPR-scherm uitvoeren

OPMERKING: Cellen kunnen worden gescreend met behulp van gevestigde CRISPR-screeningmethoden na optimalisatie van de dosis en de testduur van het geneesmiddel. Gevestigde protocollen, zoals het TKO-screeningsprotocol van het Moffat-lab10,11, kunnen worden gebruikt om de CRISPR-screeningbibliotheek voor te bereiden, virussen te produceren, de CRISPR-screening uit te voeren en bibliotheken voor te bereiden op sequencing (Figuur 1A-B). Het onderstaande protocol beschrijft de stappen die specifiek zijn voor de Medusa-analyse, die na sequentiebepaling moeten worden uitgevoerd op gegevens op telniveau.

  1. Bereken experimenteel waargenomen vouwveranderingen voor elk sgRNA (Figuur 1C) zoals hieronder beschreven.
    1. Genereer een teltabel op sgRNA-niveau om sequentiegegevens voor te bereiden voor analyse. Trim en breng sequencingbibliotheken in kaart met behulp van standaardpijplijnen, zoals beschrevenin 5,12.
    2. Normaliseer de diepte van de sequentiebibliotheek. Normaliseer bibliotheken handmatig of met behulp van ingebouwde functies zoals die in DESeq2, zoals in 5,12. Voer normalisatie uit op alle hulplijnen of door gebruik te maken van de distributie van niet-doelgerichte hulplijnen.
    3. Wijs willekeurig niet-gerichte sgRNA's toe aan niet-gerichte genen. Een bibliotheek met vier sgRNA's per gen zou bijvoorbeeld vier niet-gerichte sgRNA's per niet-gericht gen moeten hebben.
    4. Bereken voor elke vergelijking van rente (onbehandeld/T0 en/of behandeld/onbehandeld) de log2 (vouwverandering). Het wordt aanbevolen om dit te berekenen met behulp van een parametrische fit in DESeq2, hoewel een handmatige berekening van de vouwverandering ook kan worden uitgevoerd.
    5. Knip sgRNA's af met een laag aantal tellingen. De juiste trimstrategie hangt af van het geluidsniveau tussen replicaten en hoe dit varieert over tellingen. Deze functies zijn afhankelijk van de CRISPR-bibliotheek en testen meerdere cutoffs parallel voor nieuwe gegevens. Gebruikelijke cut-off-strategieën op basis van precedenten in de literatuur zijn onder meer het verwijderen van de laagste 5% van de gidsen of het verwijderen van guides onder een nominale drempel13.
  2. Bepaal de impact van elke afzonderlijke genknock-out op de groeisnelheid, zoals hieronder beschreven.
    1. Bereken de netto populatiegroeisnelheid (NPG) van de onbehandelde cellen (d.w.z. de waargenomen populatieverdubbelingstijd, Figuur 1D). Dit kan worden geëxtraheerd uit de FLICK-gegevens in stap 1, live celtellingen in de loop van de tijd in stap 3, of eerdere experimentele metingen voor de cellijn van interesse.
    2. MEDUSA vereist drie parameters om de onbehandelde aandoening te modelleren: NPG: Netto bevolkingsgroei, in verdubbelingen/uur; Tstart: Starttijdpunt, in h. Dit is ingesteld op een standaard van 0; Tendens tot: Eindtijdstip voor de onbehandelde aandoening, in h.
    3. Simuleer alle mogelijke verstoringen van de NPG-snelheid. Gebruik een for-lus om een reeks mogelijke NPG-waarden te evalueren. Bereken voor elke relatieve groeisnelheid de log2 (vouwverandering) die zou worden waargenomen op het eindpunt van de analyse.
    4. Identificeer voor elk experimenteel sgRNA in stap 4.1.5 de gesimuleerde vouwverandering die het dichtst bij de waargenomen gegevens ligt. Wijs de relatieve groeisnelheid die resulteerde in de gesimuleerde vouwverandering toe aan dat sgRNA.
  3. Karakteriseer de coördinatie tussen groei en dood zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: De parameters die nodig zijn voor MEDUSA kunnen worden geëxtraheerd uit gegevens in FLICK-stijl wanneer ze worden geanalyseerd met de GRADE-analysemethode14. Gegevens uit (1) en (2) kunnen hiervoor worden gebruikt, of er kan een aanvullend parametriseringsexperiment worden uitgevoerd.
    1. MEDUSA gebruikt vier parameters om de coördinatie tussen groei en dood in de aanwezigheid van het geneesmiddel te karakteriseren: GRgeneesmiddel1: Geneesmiddel-geïnduceerde groeisnelheid vóór het begin van de dood, in verdubbelingen/uur; DO: Aanvangstijd van de dood, in h; GRdrug2: Geneesmiddel-geïnduceerde groeisnelheid na het begin van de dood, in verdubbelingen/uur; DRgeneesmiddel: Geneesmiddel-geïnduceerd sterftecijfer, in eenheden van Lethal Fractie/h. Gebruik LF-kinetiek omD O te parametriseren. Haal de aanvangstijd uit de LED-fitting.
  4. BepaalDR-medicijn met behulp van LF-kinetiek. Bepaal het gemiddelde sterftecijfer door de uiteindelijke LF te delen door de tijd na het begin van de dood (in h).
  5. Bepaal GRdrug1 uit de gegevens van de levende celtelling in stap 3. Bepaal vóór het begin van de dood de door het geneesmiddel geïnduceerde groeisnelheid door de gegevens aan te passen aan een eenvoudige exponentiële vergelijking.
    1. Bepaal GRdrug2 met behulp van een combinatie van gegevens uit stap 3 en drug GRAAD14. Bereken en plot de GRADE voor de geselecteerde medicijndosis op een GRADE-plot. Als GRAAD = 0, neem dan aan dat GRdrug2 0 is; Als GRADE > 0, gebruik dan GRADE om de gemiddelde groeisnelheid van de populatie te bepalen. Bepaal op basis van de experimenteel bepaalde waarde voorGR-medicijn1 de waarde voorGR-medicijn2 die resulteert in de waargenomen gemiddelde groeisnelheid.
      OPMERKING: De gemiddelde door het geneesmiddel geïnduceerde groeisnelheid kan worden afgeleid uit een GRADE-plot door de paarsgewijze afstand te berekenen tussen het waargenomen gegevenspunt (d.w.z. een paar GR- en FV-gegevens voor een geneesmiddel) en elk punt dat de GRADE-ruimte vormt en het dichtstbijzijnde punt te identificeren. Voor gedetailleerde instructies, zie ref14. Geneesmiddelgeïnduceerde groeipercentages en sterftecijfers zijn geen vaste waarden per geneesmiddel en zijn specifiek voor een geneesmiddel bij een bepaalde dosis in een bepaalde celcontext.
  6. Genereer gesimuleerde vouwveranderingen voor alle mogelijke combinaties van groeisnelheid en sterftecijfer, zoals hieronder beschreven.
    1. Bouw met behulp van de experimenteel bepaalde coördinatie van door drugs geïnduceerde groeisnelheid en sterftecijfer een model dat de door drugs geïnduceerde populatiegrootte in de loop van de tijd simuleert (Figuur 1D). Dit model kan worden opgebouwd als een stukgewijze functie die twee onafhankelijke fasen van de geneesmiddelrespons combineert (voor en na het overlijden).
    2. Neem voor een volledig MEDUSA-model deze acht parameters op: NPG: Netto bevolkingsgroei, in verdubbelingen/uur; GRdrug1: Geneesmiddel-geïnduceerde groeisnelheid vóór het begin van de dood, in verdubbelingen/uur; DO: Aanvangstijd van de dood, in h; GRdrug2: Geneesmiddel-geïnduceerde groeisnelheid na het begin van de dood, in verdubbelingen/uur; DRgeneesmiddel: Geneesmiddel-geïnduceerd sterftecijfer, in eenheden van Lethal Fractie/h; Tstart: Starttijdpunt, in h. Dit is ingesteld op een standaard van 0; Neigingtot: Eindtijdstip voor de onbehandelde aandoening, in h; Tendens tr: Eindtijdstip voor de behandelde aandoening, in h.
    3. Simuleer voor het basismodel alle mogelijke verstoringen van het groei- en sterftecijfer. Bereken voor elke combinatie de log2 (vouwverandering) die zou worden waargenomen.
      OPMERKING: In MEDUSA wordt aangenomen dat verstoringen van de groeisnelheid evenredig zijn tussen NPG,GR-medicijn1 enGR-medicijn2. Een verlaging van het NPG-percentage met 80% resulteert bijvoorbeeld ook in een vermindering van 80% van beide door geneesmiddelen geïnduceerde groeipercentages.
  7. Leid het sterftecijfer van elke knock-out af (Figuur 1D-E) zoals hieronder beschreven.
    1. Trianguleer voor elk sgRNA het door het geneesmiddel geïnduceerde sterftecijfer dat de waargenomen vouwverandering zou hebben veroorzaakt. Extraheer eerst de relatieve groeisnelheid bepaald in stap (4.2.4).
    2. Bepaal de tarieven voorGR-medicijn1 enGR-medicijn2. Pas de relatieve groeisnelheid van NPG toe om een proportionele groeisnelheid te berekenen voorGR-medicijn1/GR-medicijn2.
    3. Gebruik de beperkingen voor NPG,GR-medicijn1 enGR-medicijn2 om de gesimuleerde vouwverandering te identificeren die het dichtst bij de waargenomen vouwverandering ligt voor elk sgRNA (behandeld/onbehandeld). Gebruik een combinatie van deze observaties om het door drugs veroorzaakte sterftecijfer terug te berekenen.
  8. Bereken groeipercentages en sterftecijfers op genniveau zoals hieronder beschreven.
    1. Bepaal de snelheid op genniveau voor elk gen in de bibliotheek. Bereken het gemiddelde voor elke groeisnelheid en sterftecijfer voor alle sgRNA's geassocieerd met een bepaald gen (meestal 4-10).
    2. Om empirische p-waarden te berekenen, start u de gegevens op sgRNA-niveau op. Voer een FDR-correctie uit met de Benjamini-Hochberg-procedure.
      OPMERKING: Aanvullende instructies, evenals voorbeeldgegevens voor het analyseren van CRISPR-screeninggegevens met behulp van MEDUSA, zijn opgenomen in onze GitHub-repository (https://github.com/MJLee-Lab/MEDUSA).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van dit protocol hebben we de genetische afhankelijkheden van door etoposide geïnduceerde dood in U2OS-cellen onderzocht. Etoposide is een veelgebruikte DNA-beschadigende chemotherapie15. Dit chemo-genetische profileringsexperiment werd uitgevoerd met behulp van de GeCKOv2-bibliotheek16 in Cas9 die U2OS-cellen5 tot expressie brengt. In dit soort experimenten wordt de genfunctie meestal afgeleid uit de rela...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit protocol beschrijven we het gebruik van de MEDUSA-analysemethode voor het kwantificeren van chemo-genetische profileringsgegevens om te scoren hoe genetische verstoringen de door geneesmiddelen geïnduceerde groei- en sterftecijfers veranderen. Omdat de primaire output van een chemo-genetisch profileringsexperiment gerelateerd is aan de populatiegrootte, niet aan de percentages, worden de onderliggende percentages afgeleid met behulp van simulaties. De kritieke stappen in de method...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken alle leden van het Lee Lab, vroeger en nu, voor hun bijdragen aan het standpunt van ons lab over het evalueren van medicijnresponsen. Dit werk werd ondersteund door de financiering van MJL en MEH van de National Institutes of Health (U01CA265709, R21CA294000 en R35GM152194 aan MJL en F31CA268847 aan MEH), de financiering MJL van de Jayne Koskinas Ted Giovanis Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100mm Fisherbrand TC DishesFisher ScientificFB012924Voor het kweken van cellen en optimalisatie van populatiegrootte
150mm Fisherbrand TC DishesFisher ScientificFB012925Voor het kweken van cellen en optimalisatie van populatiegrootte
DESeq2R Packagev1.44.0Voor het berekenen van fold-change
DMEMCorning10017CVVoor het zaaien en behandelen van cellen
DMSOFisher ScientificMT-25950CQCVoor het zaaien en behandelen van cellen
Fisherbrand 96-Well, Cell Culture-Treated, U-Shaped-Bottom MicroplateFisher ScientificFB012932Voor het zaaien en behandelen van cellen (pin plate)
Greiner Bio-One CELLSTAR μClear 96-well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom MicroplateGreiner655090Voor het zaaien en behandelen van cellen
MATLABMathworks R2024aVoor het uitvoeren van FLICK, GRADE en MEDUSA
Microplate fluorescence readerTecanSparkVoor metingen van dode cellen
Sytox GreenThermo Fisher ScientificS7020Voor metingen van dode cellen
TKOV3 CRISPR libraryAddgene125517Voor het uitvoeren van CRISPR screen
Triton-X 100Thermo Fisher ScientificJ66624-APVoor het permeabiliseren van cellen
Trypan blue CorningMT25900CIVoor het meten van levende/dode cellen

Referenties

  1. Przybyla, L., Gilbert, L. A. A new era in functional genomics screens. Nat Rev Genet. 23 (2), 89-103 (2021).
  2. Colic, M., Hart, T. Chemogenetic interactions in human cancer cells. Comput Struct Biotechnol J. 17, 1318-1325 (2019).
  3. Colic, M., Hart, T. Common computational tools for analyzing CRISPR screens. Emerg Top Life Sci. 5 (6), 779-788 (2021).
  4. Dixon, S. J., Lee, M. J. Quick tips for interpreting cell death experiments. Nat Cell Biol. 25 (12), 1720-1723 (2023).
  5. Honeywell, M. E., et al. Functional genomic screens with death rate analyses reveal mechanisms of drug action. Nat Chem Biol. 20 (11), 1443-1452 (2024).
  6. Leylek, O., Honeywell, M. E., Lee, M. J., Hemann, M. T., Ozcan, G. Functional genomics reveals an off-target dependency of drug synergy in gastric cancer therapy. Gastric Cancer. 27 (6), 1201-1219 (2024).
  7. Richards, R., et al. Drug antagonism and single-agent dominance result from differences in death kinetics. Nat Chem Biol. 16 (7), 791-800 (2020).
  8. Richards, R., Honeywell, M. E., Lee, M. J. FLICK: an optimized plate reader-based assay to infer cell death kinetics. STAR Protoc. 2 (1), 100327(2021).
  9. Forcina, G. C., Conlon, M., Wells, A., Cao, J. Y., Dixon, S. J. Systematic quantification of population cell death kinetics in mammalian cells. Cell Syst. 4 (6), 600-610.e6 (2017).
  10. Hart, T., et al. Evaluation and design of genome-wide CRISPR/SpCas9 knockout screens. G3. 3 (8), 2719-2727 (2017).
  11. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  12. Cruz-Gordillo, P., Honeywell, M. E., Harper, N. W., Leete, T., Lee, M. J. ELP-dependent expression of MCL1 promotes resistance to EGFR inhibition in triple-negative breast cancer cells. Sci Signal. 13 (658), eabb9820(2020).
  13. Parnas, O., et al. A Genome-wide CRISPR screen in primary immune cells to dissect regulatory networks. Cell. 162 (3), 675-686 (2015).
  14. Schwartz, H. R., et al. Drug GRADE: An integrated analysis of population growth and cell death reveals drug-specific and cancer subtype-specific response profiles. Cell Rep. 31 (12), 107800(2020).
  15. Montecucco, A., Biamonti, G. Cellular response to etoposide treatment. Cancer Lett. 252 (1), 9-18 (2007).
  16. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  17. Colic, M., et al. Identifying chemogenetic interactions from CRISPR screens with drugZ. Genome Med. 11 (1), 52(2019).
  18. Olivieri, M., Durocher, D. Genome-scale chemogenomic CRISPR screens in human cells using the TKOv3 library. STAR Protoc. 2 (1), 100321(2021).
  19. Cai, X., Stringer, J. M., Zerafa, N., Carroll, J., Hutt, K. J. Xrcc5/Ku80 is required for the repair of DNA damage in fully grown meiotically arrested mammalian oocytes. Cell Death Dis. 14 (7), 397(2023).
  20. Colville, A., et al. Death-seq identifies regulators of cell death and senolytic therapies. Cell Metab. 35 (10), 1814-1829.e6 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Functionele genomicsregulatie van celdooddoor geneesmiddelen ge nduceerde sterftecijfergene knockout screeningvariatie in groeisnelheiddosis responscurvesfalse discovery ratepopulatiegrootte assay
MEDUSA voor het identificeren van doodregulerende genen in chemo-genetische profileringsgegevens
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.