Methodenartikel

Toediening van vluchtige anesthetica aan zebravislarven voor gedragsobservatie

957 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67896

⸱

6 juni 2025

 ,  , 
1Perelman School of Medicine, Department of Anesthesiology and Critical Care, University of Pennsylvania

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt een toegankelijke methode voor het creëren van een gasdichte omgeving om vluchtige anesthetica toe te dienen aan larvale zebravissen voor gedragsexperimenten.

Samenvatting

Deze studie beschrijft een unieke methode voor het toedienen van vluchtige anesthetica, zoals isofluraan en sevofluraan, aan larvale zebravissen tijdens gedragsexperimenten. Hoewel zebravissen tal van voordelen bieden als modelorganisme voor gewervelde dieren - waaronder complex gedrag, genetische traceerbaarheid, transparante embryo's en snelle ontwikkeling - is hun gebruik bij het bestuderen van vluchtige anesthetica beperkt. De toediening van vluchtige anesthetica vereist vaak complexe of omslachtige apparaten die mogelijk niet breed toegankelijk zijn, waardoor barrières worden opgeworpen voor de farmacologische studie van vluchtige anesthetica in waterige modelorganismen. Deze methode biedt een eenvoudige techniek waarbij zelfklevende siliconenplaten worden gebruikt om een gasdichte afdichting te creëren op glazen platen met 96 putjes. Validatie werd uitgevoerd door de beoordeling van spontane beweging, die geen significante verschillen liet zien tussen afgesloten en open putten over een periode van 90 minuten. Bovendien bleef de anesthesieconcentratie in de loop van de tijd stabiel, zoals gemeten door HPLC. Representatieve resultaten zijn onder meer de experimentele bepaling van de mediane effectieve concentratiewaarden (EC50) voor sevofluraan. Deze studie biedt een eenvoudige en toegankelijke benadering voor farmacologische experimenten met behulp van vluchtige anesthetica, die gemakkelijk kunnen worden aangepast om andere vluchtige stoffen en experimentele eindpunten te bestuderen.

Inleiding

Niet-aquatische diermodellen (wormen, vliegen, knaagdieren, konijnen, primaten, enz.) zijn van oudsher de modellen die het meest worden gebruikt om anesthesiefarmacologie te bestuderen. Bij elk van deze soorten zijn vluchtige anesthetica (toegediend via inademing van gas) veel minder uitdagend dan de toediening van intraveneuze anesthetica (toegediend via intraveneuze of intraperitoneale routes)1. Naast de technische uitdaging van het eenvoudig toedienen van de intraveneuze middelen, is het bereiken van een stabiele toestand van anesthesie veel gemakkelijker met vluchtige middelen dan met intraveneuze middelen2.

Toediening van intraveneuze anesthetica aan larvale aquatische soorten kan worden bereikt door diffusie uit hun omringende waterige medium 3,4, en lijkt dus meer op de toediening van vluchtige anesthetica voor niet-waterige soorten. Jarenlang waren kikkervisjes (Xenopus laevis) het model bij uitstek voor het bestuderen van anesthetica vanwege het gemak van medicijntoediening en de steady-state farmacokinetiek die werd bereikt door eenvoudige badtoevoeging van het verdovingsmiddel aan hun kunstmatige vijverwater 5,6. Er zijn echter relatief weinig voorbeelden van de studie van vluchtige anesthetica in dit model vanwege de vereiste van gasdichte apparaten die vaak speciaal zijn gebouwd en omslachtig kunnen zijn om te gebruiken 7,8.

In de afgelopen jaren is de zebravis een voorkeursmodel geworden voor de studie van intraveneuze anesthetica vanwege hetzelfde gemak van medicijntoediening naast andere voordelen zoals hun goed beschreven complexe gedrag en de beschikbaarheid van commerciële eenheden om dit gedrag te observeren9. Veel recente studies hebben dergelijke in de handel verkrijgbare observatie-eenheden gebruikt om te screenen op neuroactieve verbindingen, waaronder anesthetica, met behulp van 96-putjes en 24-putjes plaatformaten om het gedrag van de zebravislarven te kwantificeren 4,10,11,12,13,14,15 . De larvale stadia zijn bijzonder geschikt voor farmacologische studies vanwege hun vermogen om veel gedragsreacties te beoordelen, hun kleine formaat, compatibiliteit met hoge doorvoer en goed gekarakteriseerde neurale circuits 9,16,17. Een belangrijke beperking in deze onderzoeken naar anesthetica in het zebravismodel is echter de relatieve moeilijkheid bij het toedienen van vluchtige anesthetica. Deze beperking heeft geleid tot schaarse voorbeelden van vergelijking tussen vluchtige en intraveneuze middelen 4,15,18. Het gemakkelijk kunnen bestuderen en vergelijken van beide klassen anesthetica in een enkel diermodel voegt een belangrijk hulpmiddel toe om de studie van anesthesiefarmacologie in alle klassen te vergemakkelijken.

Traditioneel vereist de studie van intraveneuze anesthetica in een aquatische soort gespecialiseerde, vaak op maat gemaakte apparatuur die moeilijk te gebruiken kan zijn of niet voldoende gasdicht is om verlies van de verdoving voor de duur van het experiment te voorkomen. De hier beschreven procedure biedt een gemakkelijk toegankelijke alternatieve manier om een gasdichte afdichting in een glazen kamer te produceren die geschikt is voor observatie van het gedrag van larvale zebravissen met behulp van een commerciële observatie-eenheid (zie materiaaltabel).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle zebravisexperimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen voor diergebruik die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Volwassen zebravissen werden onderhouden in de aquatische faciliteit van de Universiteit van Pennsylvania onder toezicht van de University Laboratory Animal Resources (ULAR). Tübingen langvin wildtype zebravissen werden voor alle experimenten in eigen huis gekweekt en onder standaard houderijomstandigheden onderhouden met een licht/donkercyclus van 13/11 uur tot ze 5 dagen na de bevruchting (dpf) bereikten. Experimenten werden uitgevoerd met behulp van biologische replicaten, met legsels afgeleid van verschillende paringsparen om voldoende biologische diversiteit te garanderen. Details van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Fabricage van zelfklevende siliconenvellen

OPMERKING: Equivalenten van dit materiaal (siliconenplaat plus lijm) kunnen commercieel worden ingekocht, maar vaak tegen hogere kosten en minder beschikbaarheid.

  1. Leg de 0,5 mm dikke siliconenplaat op een schone, vlakke ondergrond.
  2. Inspecteer de vellen op eventuele kreukels en vermijd deze indien mogelijk.
    OPMERKING: Siliconenvellen met vouwen hechten mogelijk niet voldoende aan de tape en kunnen leiden tot onvoldoende afdichting van de putjes en/of slechte visualisatie van de zebravis.
  3. Reinig de lakens met 70% alcohol om olie of vuil te verwijderen en laat ze drogen.
  4. Breng met een applicator, zoals een penseel, een dunne, gelijkmatige laag zelfklevende primer aan op de siliconenplaat. Om overmatig aanbrengen te voorkomen, werkt u in kleinere secties, omdat de lijmpromotor snel droogt (hardt uit in 1-5 s).
    OPMERKING: Zonder deze hechtingsbevorderaar zal de tape niet voldoende hechten aan de siliconenplaat.
  5. Zodra de lijmpromotor is aangebracht, lijnt u de dubbel gecoate tape uit met het siliconenvel met de papieren achterkant naar boven.
  6. Breng de tape geleidelijk aan op de siliconen met behulp van een roller om het oppervlak glad te strijken en luchtbellen te verwijderen (na de eerste toepassing zal het werken met de siliconenkant naar boven helpen bij het visualiseren en verwijderen van luchtbellen).
  7. Laat de lijmpromotor 24 uur volledig uitharden op een vlakke ondergrond.
  8. Snijd de zelfklevende siliconen in stroken van minimaal 10 mm breed (7,5 mm putdiameter plus overlap aan elke kant).
    OPMERKING: Bij gebruik om de andere rij van de putplaat zal een grotere variatie in strips geen negatieve invloed hebben op putten in aangrenzende rijen, wat niet alleen het aanbrengen kan vergemakkelijken, maar ook nodig kan zijn om een afdichting rond de gehele omtrek van de put te bereiken.
    1. Zorg ervoor dat de stroken lang genoeg zijn om ten minste de breedte van een rij van de putplaat te bedekken.
      NOTITIE: Als u een putplaat gebruikt die niet 96-well is, zoals een plaat met 24 of 48 wells, kunnen de stripmaten worden aangepast of gesneden om op de specifieke afmetingen van de plaat te passen, zodat een goede dekking wordt gegarandeerd, ongeacht de plaatgrootte.

2. Bereiding van oplossingen

OPMERKING: Alle voorraad- en analyseoplossingen van vluchtige anesthetica werden vlak voor het experiment gemaakt om verlies van de concentratie vluchtige stoffen te voorkomen.

  1. Voeg voor elke oplossing (bouillon- of werkoplossing) een volume niet-vluchtig oplosmiddel (E3-embryowater, DMSO, enz.) toe aan een HPLC- of scintillatieflacon dat, in combinatie met de uiteindelijke verdunning van het vluchtige anestheticum, het totale volume de injectieflacon voldoende zal vullen en minimale vrije ruimte overlaat (zie figuur 1A).
  2. Voeg vluchtig anestheticum toe met een Hamilton gasdichte spuit en sluit de injectieflacon snel af.
    OPMERKING: Voorraadoplossingen in injectieflacons met septumdeksels kunnen worden gebruikt om verdere verdunningen te vergemakkelijken via het overbrengen van de oplossing met gasdichte spuiten.
  3. Meng vervolgens de injectieflacons (vortex, sonicatie) indien nodig en bewaar ze tijdelijk tijdens het bereiden van zebravisplaten.

3. Opzet van het gedragsexperiment

OPMERKING: Deze stap van het protocol kan enige oefening vergen. Het wordt aanbevolen om zonder vis of oplossingen met kostbaar materiaal te werken totdat u vertrouwd bent met de techniek.

  1. Breng een larvale zebravis (5 dpf) over in elke andere rij van de glazen plaat met 96 putjes.
    OPMERKING: Door elke andere rij leeg te laten, wordt de kans op verontreiniging van aangrenzende putten door overloop verkleind, aangezien de putten in stap 3.4 worden afgedicht.
  2. Verwijder voorzichtig de E3-oplossing uit elk putje. Dit kan één rij per keer worden gedaan of op de hele plaat als het snel kan werken.
    OPMERKING: De duur dat de larven uit de oplossing waren, werd geminimaliseerd om mogelijke stress te verminderen. Alternatieve procedures kunnen worden gebruikt op basis van verschillende experimentele behoeften, waaronder slechts gedeeltelijke verwijdering van de oplossing vóór de toevoeging van de geneesmiddelbevattende oplossing om stress te minimaliseren. Het protocol moet worden aangepast aan de behoeften van het experiment, met inbegrip van de evenwichtstijd die aan de dieren wordt gegeven om mogelijke stress te compenseren, de efficiëntie van het mengen van de oplossing en de nauwkeurigheid van de concentraties van een geneesmiddelhoudende oplossing, indien niet het gehele E3-gehalte is verwijderd voordat de werkoplossing wordt toegevoegd.
  3. Gebruik vervolgens een transferpipet om elk putje in de rij te vullen met de experimentele oplossing. Pas op dat er geen bubbels ontstaan. Vul elke put te vol (Figuur 1B).
  4. Gebruik de zelfklevende siliconenstrips die in stap 1 zijn gemaakt en druk de strip snel naar beneden (Afbeelding 1C). Dit helpt de vorming van luchtbellen te voorkomen en voorkomt dat vissen in aangrenzende putten terechtkomen.
  5. Druk stevig op de bovenkant van de plaat om ervoor te zorgen dat elk putje is afgesloten.
  6. Herhaal stap 2-5 totdat de oplossing is verwisseld en de putjes voor elke andere rij van de putplaat zijn afgesloten (Figuur 1D).
  7. Draai de plaat voorzichtig om en inspecteer op luchtbellen.
    OPMERKING: De aanwezigheid van luchtbellen zal de visualisatie van de beweging van zebravissen belemmeren.
  8. Plaats de plaat in de gedragsobservatie-eenheid (siliconen met de kleefzijde naar beneden) en voer het gedragsexperiment uit (zie het gedeelte Resultaten voor meer informatie).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Vergelijking met traditionele observatie van open putten
Om te beoordelen of lijmafdichting enig effect heeft op spontane bewegingen, is een vergelijking gemaakt tussen de controles in open versus afgesloten putten. Zoals te zien is in figuur 2A, werd er geen statistisch significant verschil in beweging waargenomen tussen deze groepen gedurende de standaard duur van ~30 minuten die werd gebruikt in de experimenten die in dit artikel worde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel beschrijft een methode voor het gemakkelijk toedienen van vluchtige anesthetica, zoals sevofluraan, aan larvale zebravissen, die werd gebruikt om de vluchtige anesthesiepotentie bij wildtype vissen te kwantificeren. Hoewel deze techniek conceptueel eenvoudig is, kan het oefening vergen om in korte tijd een adequaat afgedichte, luchtbelvrije rij putten te garanderen om het verlies van vluchtige stoffen tot een minimum te beperken. Omdat deze methode bedoeld is voor vluchtige s...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de Foundation for Anesthesia Education and Research (FAER). Figuur 1 is gemaakt in BioRender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96 well glass microplatesZinsser North America3600500"Deze glazen microplaten zijn gemaakt van speciaal hoogwaardig, temperatuurbestendig borosilicaatglas en de oppervlakken zijn zuur gepolijst. Platen zijn rechthoekig in de standaard SBS-microplatevoetafdruk (85 x 127 mm). Deze glazen reactormicroplaten zijn voornamelijk ontworpen voor gebruik bij chemische toepassingen en zijn bestand tegen temperaturen tot 530° C. Ze kunnen worden geautoclaveerd. Ze worden machinaal bewerkt uit een homogeen glasplaat en hebben een uniforme geometrie en vorm om consistente temperaturen van put tot put te bieden (typisch binnen 0,2 graden C)."
2.0 mL Clear, Large Opening, 9 mm Thread Vials Chemglass Life SciencesCV-1150-1232"Met een 40% grotere opening zijn deze flessen specifiek ontworpen om in robotarm autosamplers te werken. Ze bevatten ook het unieke Step Vial-ontwerp dat een beperkt volume-inzetstuk precies in het nekje van de fles centreert. "
3M Double Coated Tape 9490LEAbbVie Inc24WG90"3M Double Coated Tape 9490LE met 3M Laminating Adhesive 300LSE biedt hoge hechtingskracht op de meeste oppervlakken, inclusief veel kunststoffen met lage oppervlakte-energie zoals polypropyleen en poedergecoate verven. De acrylische kleefstof biedt ook uitstekende hechting op oppervlakken die lichtjes zijn vervuild met olie, typisch gebruikt bij machineonderdelen. 3M double coated tape 9490LE biedt de toegevoegde functie van 3M Laminating Adhesive 300MP aan één kant om uitstekende hechtingskracht te bieden aan een verscheidenheid aan schuim- en textielmaterialen (6 inch x 5 yard)"
DanioVision Observation ChamberNoldusDVOC-0041"DanioVision is een compleet systeem, ontworpen voor het hoogdoorvoertesten van zebravislarven in multi-well platen. Het omvat de Observatiekamer en de bekende EthoVision XT videotrackingsoftware."
DanioVision Temperature Control UnitNoldusDVTCU-0011"De DanioVision Temperatuurregelunit is een doorstromend systeem: water stroomt gelijkmatig onder de welplade op de temperatuur naar keuze. De temperatuur is overal hetzelfde in de welplade."
Ethovision XT16 softwareNoldusNSE-EV-BASE"EthoVision XT is de meest toegepaste videotrackingsoftware die het gedrag, de beweging en de activiteit van elk dier volgt en analyseert, gedeponeerd door Noldus"
IsofluranePiramal Critical CareNDC # 66794-017-10Vloeistof voor inhalatie, een niet-brandbaar niet-explosief inhalatieanestheticum, bevattend 100 mL isoflurane. Opgeslagen bij gecontroleerde kamertemperatuur 20º tot 25º C
Scotch-Weld Instant Adhesive Primer AC79 Clear3M"62-3916-0860-1 (Product ID) C2103N (Lot)""3M Scotch-Weld Instant Adhesive Primer AC79 is ontworpen voor gebruik op moeilijk te verlijmen elastomeren met lage oppervlakte-energie, zoals EPDM, siliconen en andere rubbers. Voorbereiding en toepassing van het oppervlak zijn eenvoudig en de kleefstofprimer droogt snel om werkzaamheden snel te laten verlopen."
Silicone Sheets 0.5 mm thickvarious suppliersN/Atransparante siliconen platen werden bij meerdere leveranciers gekocht
Speedball Pop-in Hard Rubber Brayer with Plastic Frame, 4 Inches"Speedball793728"De Speedball Pop-In Hard Brayer heeft een roller die uitklapt voor eenvoudig schoonmaken. Kunststof, één stuk frame met afneembare 4 inch brede roller. Gemaakt van puur natuurlijke gomrubber met een gemalen afwerking. De harde rubberen brayer is 4 inch breed met een stevig kunststof frame en is geweldig voor lijmpriktoepassing"
SureSTART 9 mm Screw Caps, Level 2 High-throughput Applications, Type: AVCS Screw Cap Black PP, White Silicone/RED PTFE Septa 1.0 mmThermo Scientific6ASC9ST1B"Gebruik Thermo Scientific SureSTART 9 mm schroefdoppen met schroefvials met een 9 mm opening. De prestatieniveau 2-doppen zijn vervaardigd en getest om lage bloeding, robuustheid en reproduceerbaarheid van resultaten te garanderen voor uw routine GC-MS en LC-MS analyses. Kies uit polypropyleen doppen met all-purpose silicone/PTFE septa van verschillende hardheidswaarden ontworpen om autosampler naaldproblemen te verminderen. Onze AVCS-doppen bevatten Advanced Vial Closure System technologie om optimale sealcompressie te garanderen bij het sluiten van een fles."
Ultane SevofluraneAbbVie IncNDC # 0074-4456-04Vluchtige vloeistof voor inhalatie, wordt verpakt in amber gekleurde flessen met 250 mL sevoflurane. Opgeslagen bij gecontroleerde kamertemperatuur 15º tot 30º C
Wheaton Liquid Scintillation Vials, Caps Attached to Vials, Glass, Metal Foil / Pulp, 24-400, 20 mL DWK Life Sciences98656120 mL scintillatievialen geconverteerd van Type I borosilicaatglasbuis, PET, of HDPE. Beschikbaar met dop bevestigd.

Referenties

  1. Wasilczuk, A. Z., Maier, K. L., Kelz, M. B. The mouse as a model organism for assessing anesthetic sensitivity. Methods Enzymol. 602, 211-228 (2018).
  2. Shortal, B. P., et al. Development and validation of brain target-controlled infusion of propofol in mice. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
  3. Halbach, K., et al. Yolk sac of zebrafish embryos as backpack for chemicals. Environ Sci Technol. 54 (16), 10159-10169 (2020).
  4. Bedell, V. M., Meng, Q. C., Pack, M. A., Eckenhoff, R. G. A vertebrate model to reveal neural substrates underlying the transitions between conscious and unconscious states. Sci Rep. 10, 1-10 (2020).
  5. Stetter, M. D., et al. Isoflurane anesthesia in amphibians: Comparison of five application methods. In American Association of Zoo Veterinarians. , Puerto Vallarta, Mexico. 255-257 (1996).
  6. Woll, K. A., Eckenhoff, R. G. High-throughput screening to identify anesthetic ligands using Xenopus laevis tadpoles. Methods Enzymol. 602, 177-187 (2018).
  7. Meyer, H. Zur Theorie der Alkoholnarkose. Arch Exp Pathol Pharmakol. 46, 338-346 (1901).
  8. Downes, H., Courogen, P. M. Contrasting effects of anesthetics in tadpole bioassays. J Pharmacol Exp Ther. 278, 284-296 (1996).
  9. Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10, 70-86 (2013).
  10. Abramova, V., et al. Effects of pregnanolone glutamate and its metabolites on GABAA and NMDA receptors and zebrafish behavior. ACS Chem Neurosci. 14, 1870-1883 (2023).
  11. Germann, A. L., et al. Comparison of behavioral effects of GABAergic low-and high-efficacy neuroactive steroids in the zebrafish larvae assay. ACS Chem Neurosci. 15, 909-915 (2024).
  12. Hoyt, H., et al. Photomotor responses in zebrafish and electrophysiology reveal varying interactions of anesthetics targeting distinct sites on gamma-aminobutyric acid type A receptors. Anesthesiology. 137, 568(2022).
  13. Li, F., et al. Characterization of the locomotor activities of zebrafish larvae under the influence of various neuroactive drugs. Annals Trans Med. 6, 173(2018).
  14. McCarroll, M. N., Gendelev, L., Kinser, R. Zebrafish behavioural profiling identifies GABA and serotonin receptor ligands related to sedation and paradoxical excitation. Nat Commun. 10, 4078(2019).
  15. Plasencia, D. M., Rodgers, L. H., Knighton, A. R., Eckenhoff, R. G., White, E. R. Antagonism of propofol anesthesia by alkyl-fluorobenzene derivatives. Sci Rep. 14, 15943(2024).
  16. Dash, S. N., Lipika, P. Flight for fish in drug discovery: A review of zebrafish-based screening of molecules. Biology Lett. 19, 20220541(2023).
  17. Nelson, J. C., Michael, G. Zebrafish behavior as a gateway to nervous system assembly and plasticity. Development. 149, 177998(2022).
  18. Zhang, L., et al. Sevoflurane postconditioning ameliorates cerebral hypoxia/reoxygenation injury in zebrafish involving the Akt/GSK-3β pathway activation and the microtubule-associated protein 2 promotion. Biomed Pharmacother. 175, 116693(2024).
  19. Abdallah, S. J., Thomas, B. S., Jonz, M. G. Aquatic surface respiration and swimming behaviour in adult and developing zebrafish exposed to hypoxia. J Exp Biol. 218, 1777-1786 (2015).
  20. Targ, A. G., Yasuda, N., Eger, E. I. Solubility of I-653, sevoflurane, isoflurane, and halothane in plastics and rubber composing a conventional anesthetic circuit. Anesth Analg. 69, 218-225 (1989).
  21. Yang, X., et al. Drug-selective Anesthetic insensitivity of zebrafish lacking γ-aminobutyric acid Type A receptor β3 subunits. Anesthesiology. 131, 1276-1291 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Farmacologie van anestheticatoediening van sevofluraantoediening van isofluraanafdichten met siliconenvelglazen wellplaatspontane bewegingmediane effectieve concentratie

Gerelateerde artikelen