Methodenartikel

Heteromulticellulaire stromale cellen in steigervrije 3D-culturen van epitheelkankercellen om invasie te stimuleren

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67902

⸱

4 april 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Baylor University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Er is een kritieke behoefte aan 3D-kankermodellen die heterocellulaire overspraak vastleggen om kankermetastasen te bestuderen. Onze studie presenteert de generatie van heteromulticellulair stromaal-epitheel in een steiger- en steigervrije omgeving die kan worden gebruikt om invasie en cellulaire ruimtelijke verdelingen te bestuderen.

Samenvatting

Borstkanker is de tweede belangrijkste doodsoorzaak door kanker bij vrouwen in de VS. Van organoïde modellen van solide tumoren is aangetoond dat ze aspecten van kankerprogressie, zoals proliferatie en invasie, getrouw samenvatten. Hoewel van de patiënt afgeleide organoïden en van de patiënt afgeleide xenotransplantaatorganoïden pathofysiologisch relevant zijn, zijn ze kostbaar om te vermeerderen, moeilijk te manipuleren en bestaan ze voornamelijk uit de meest proliferatieve celtypen binnen de tumormicro-omgeving (TME). Deze beperkingen verhinderen het gebruik ervan voor het ophelderen van cellulaire mechanismen van ziekteprogressie die afhankelijk zijn van tumor-geassocieerde stromale cellen die in de TME worden aangetroffen en waarvan bekend is dat ze bijdragen aan metastase en therapieresistentie.

Hier rapporteren we over methoden voor het kweken van epitheel-stromale meercellige 3D-culturen. De voordelen van deze methoden zijn onder meer een kosteneffectief systeem voor het snel genereren van organoïde-achtige 3D-culturen in steigervrije omgevingen die kunnen worden gebruikt om invasie te volgen met een resolutie van één cel in hydrogelsteigers. Concreet laten we zien hoe deze heteromulticellulaire 3D-culturen kunnen worden gegenereerd met behulp van BT-474 borstkankercellen in combinatie met fibroblasten (BJ-5ta), monocytachtige cellen (THP-1) en/of endotheelcellen (EA.hy926). Bovendien maakt differentiële fluorescerende labeling van celpopulaties time-lapse-microscopie mogelijk om de assemblage en invasiedynamiek van 3D-culturen te definiëren.

Met name de toevoeging van twee stromale celcombinaties aan 3D-culturen van BT-474-cellen vermindert de circulariteit van de 3D-culturen aanzienlijk, in overeenstemming met de aanwezigheid van organoïde-achtige of secundaire sferoïde structuren. In tracker-kleurstofexperimenten worden fibroblasten en endotheelcellen gelokaliseerd in de perifere organoïde-achtige uitsteeksels en worden ze ruimtelijk gescheiden van de primaire BT-474-sferoïde. Ten slotte hebben heteromulticellulaire 3D-culturen van BT-474-cellen een verhoogde hydrogel-invasiecapaciteit. Aangezien we deze protrusieve structuren hebben waargenomen in heteromulticellulaire 3D-culturen van zowel niet-tumorigene als tumorigene borstepitheelcellen, biedt dit werk een efficiënte en reproduceerbare methode voor het genereren van organoïde-achtige 3D-culturen in een steigervrije omgeving voor latere analyses van fenotypes geassocieerd met solide tumorprogressie.

Inleiding

Het is nu bekend dat kankerprogressie afhankelijk is van twee belangrijke factoren: de genetische/epigenetische veranderingen in de tumorcellen en een groot aantal interacties met niet-tumorcellen in de tumormicro-omgeving (TME)1. Hoewel wordt erkend dat genetische veranderingen in cellen noodzakelijk zijn voor het initiëren van tumoren, zijn dergelijke veranderingen alleen niet voldoende voor tumorprogressie en metastase2. Van componenten van de TME, waarvan oorspronkelijk werd gedacht dat ze stille omstanders waren, is nu bekend dat ze de progressie van kanker actief bevorderen via wederzijdse en dynamische overspraak met tumorcellen3. De TME-samenstelling verschilt afhankelijk van het weefsel waaruit de tumor afkomstig is, het tumorstadium en de kenmerken van de patiënt, maar kenmerkende kenmerken zijn onder meer stromale kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF's), extracellulaire matrix (ECM), vasculaire endotheelcellen, evenals adaptieve en myeloïde immuuncellen 1,4.

Stromale CAF's in de TME zijn samengesteld uit fibroblastsubtypes van verschillende oorsprong en functies5. Dergelijke CAF's zijn belangrijke componenten van de TME omdat ze op verschillende interfaces interageren met tumorcellen. CAF's scheiden ECM-eiwitten af die de stijfheid van de matrix veranderen, wat ofwel de afgifte van geneesmiddelen kan beperken via overmatige afzetting van collageen, proteoglycanen en fibronectine, ofwel tumorcellen in staat kan stellen de primaire tumorplaats binnen te dringen via secretie van ECM-afbrekende matrixmetalloproteïnasen (MMP's)6,7. Bovendien bevorderen CAF's tumorgroei, -migratie en -vascularisatie via de secretie van een verscheidenheid aan groeifactoren, cytokines en angiogene factoren zoals epidermale groeifactor (EGF), transformerende groeifactor β (TGF-β) en vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), respectievelijk 1,6. Tegelijkertijd bevorderen endotheelcellen, aangespoord door de hypoxische TME, ook de vascularisatie van tumoren en onderdrukken ze de immuuncelfuncties via de verhoogde secretie van angiogene factoren en een verlaagde secretie van leukocytenadhesiemoleculen 1,8.

Met de ogenschijnlijk ingewikkelde complexiteit van kankerprogressie is het essentieel geworden om stromale componenten van TME op te nemen in fundamenteel kankeronderzoek. Het opzetten van modellen die bekende tumorpathofysiologie getrouw recapituleren, is echter nog steeds een belangrijke onvervulde behoefte 9,10. Hoewel traditionele tweedimensionale (2D) celcultuurmodellen gemakkelijk te hanteren zijn, snel kunnen worden gekweekt en zeer reproduceerbaar zijn, bestaat het alleen uit snel prolifererende kankercelklonen en weerspiegelt het niet de cellulaire heterogeniteit die wordt aangetroffen in tumoren 10,11,12. Op een vergelijkbare manier leggen transgene muismodellen ook geen menselijke tumorbiologie vast vanwege de lage genetische heterogeniteit door inteelt, significante verschillen in het immuunsysteem en histologische complexiteit13,14. Vanwege dergelijke beperkingen slagen therapieën die zijn ontwikkeld op basis van klassieke kankermodellen er vaak niet in om te vertalen naar klinische omgevingen.

Patiënt-afgeleide kankermodellen zoals patiënt-afgeleide xenotransplantaten en patiënt-afgeleide organoïden kunnen de nadelen van conventionele kankermodellen aanpakken door in-situ tumormoleculaire kenmerken, genetische achtergrond en cellulaire organisatie vast te leggen 10,11,15. Dergelijke van de patiënt afgeleide xenotransplantaten en organoïden vereisen echter gecompliceerde implantatieprocedures en een lange kweektijd 16,17. Gecombineerd met variatie in tumoracquisitie- en bemonsteringsplaatsen en slechte efficiëntie bij cryopreservatie, is er behoefte aan modellen die fungeren als een brug tussen klassieke 2D-celculturen en van patiënten afgeleide kankermodellen11,18. In dit opzicht kunnen 3D-modellen van celcultuur dienen als modellen die snel kunnen worden gekweekt en belangrijke in vivo tumorkenmerken kunnen vastleggen, zoals cel-celinteractie, cel-ECM-interactie, hypoxie, angiogenese en de productie van ECM19,20.

3D-celcultuurmodellen zijn onderverdeeld in steigervrije en steigergebaseerde modelsystemen. In steigervrije systemen worden cellen ertoe aangezet zichzelf te aggregeren tot een bolvorm door gebruik te maken van specifieke celkweekplaten met een lage hechting of door de fysische parameters van kweekmethoden te manipuleren. Gevestigde methoden om steigervrije 3D-sferoïden te verkrijgen, variëren van eenvoudige celpelletculturen door centrifugatie tot hangende microplaatdruppels, magnetische levitatie en dynamische bioreactor- en microfluïdische systemen20,21. Op steigers gebaseerde 3D-celculturen worden tot stand gebracht door de toevoeging van op polymeer of hydrogel gebaseerde steigers om de fysiologische extracellulaire matrix te imiteren19,22. Dergelijke modellen hebben een enorm potentieel om in vivo cellulaire organisatie, topologie, matrixaanhechting, migratie en geneesmiddelrespons te modelleren.

Naast scaffoldmanipulatie voor ECM-samenstellingsmodellen in ziektetoestanden, kunnen 3D-celculturen ook worden gebruikt om heterogene cellulaire populaties in een TME te modelleren. 3D-celculturen bestaande uit kankercellen en stromale fibroblasten of endotheelcellen zijn gebruikt om de interactie van kanker en individuele niet-tumorcellijnen te bestuderen 23,24,25. Reproduceerbare en kosteneffectieve methoden voor het uitbreiden van dergelijke 3D-celculturen, bestaande uit meerdere heterogene cellijnen, zouden onderzoekers helpen de tumorprogressie op te helderen. Hier rapporteren we over methoden voor het cultiveren van epitheel-stromale meercellige 3D-culturen om proliferatie, invasie en plasticiteit van de celtoestand te bestuderen. Het protocol beschrijft steigervrije en basaalmembraanextract, op steigers gebaseerde 3D-culturen van borstkankercellen die zijn gekweekt in co-cultuur met een combinatie van stromale cellen, variërend van fibroblasten (BJ-5ta), endotheelcellen (Ea.hy926) cellen en monocytenachtige cellen (THP-1). Borstkanker is momenteel de op één na meest voorkomende vorm van kanker ter wereld en de meest gediagnosticeerde vorm van kanker bij vrouwen in de VS26. Overlijden door borstkanker is grotendeels te wijten aan de gemetastaseerde en therapieresistente aard van de ziekte, aangezien de algehele en metastasevrije overleving significant is verminderd bij patiënten met de diagnose agressieve HER2-verrijkte en basaalachtige borstkankersubtypes27. Onze beschreven 3D-celkweekprotocollen kunnen helpen bij het ontwikkelen van kosteneffectieve, snelle en reproduceerbare kweekmethoden die kunnen worden gecombineerd met in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselconserveringsmethoden en daaropvolgende ruimtelijke biologische toepassingen.

Protocol

1. Celkweek medium

OPMERKING: Bereid alle media voor in een bioveiligheidskast.

  1. Om celkweekmedium voor BJ-5ta, BT474, EA.hy926 en MDA-MB-468 te bereiden, vult u 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hoge glucose aan met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine met een pipet. Voeg 0,1% gentamicine toe met een micropipet.
  2. Om celkweekmedium voor MCF10A te bereiden, vult u 500 ml DMEM/F12 aan met 5% paardenserum en 1% penicilline-streptomycine met een pipet. Voeg 0,1% gentamicine, 1 ml 1 μg/ml hydrocortison, 500 μl 10 μg/ml insuline, 50 μl 100 ng/ml choleratoxine en 10 μl 20 ng/ml epidermale groeifactor toe met een micropipet.
  3. Om celkweekmedium voor MCF10Ca1h voor te bereiden, vult u 500 ml DMEM/F12 aan met 5% paardenserum en 1% penicilline-streptomycine met een pipet. Voeg 0,1% gentamicine toe met een micropipet.
  4. Om het celkweekmedium voor THP-1 voor te bereiden, vult u 500 ml RPMI 1640 aan met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine met een pipet. Voeg 0,1% gentamicine toe met een micropipet.
  5. Verander het celkweekmedium elke 2-3 dagen voor BJ-5ta, BT474, EA.hy926, MDA-MB-468, MCF10A en MCF10Ca1h totdat de cellen 70-80% samenvloeiing bereiken door hun groei dagelijks te beoordelen met een helderveldmicroscoop. Vervang het celkweekmedium eenmaal per week voor THP-1-cellen.
  6. Kweek BJ-5ta-, BT474-, EA.hy926-, MDA-MB-468-, MCF10A- en MCF10Ca1h-cellen in schaaltjes van 100 mm met met celcultuur behandelde oppervlakken in standaard celkweekincubatoren met 5% CO2 .
  7. Kweek THP-1-cellen in T75-celcultuurbehandelde kolven in standaard celkweekincubatoren met 5% CO2.

2. Cel verzameling

  1. Schakel het UV-licht in om de binnenkant van de bioveiligheidskast gedurende 15 minuten te ontsmetten.
  2. Open de raamvleugel van de bioveiligheidskast om de luchtstroom te stabiliseren en schakel het vacuümafzuigsysteem in.
  3. Reinig het oppervlak van de binnenkap en de slang van het vacuümafzuigsysteem met 70% ethanol.
  4. Bereid vers serumvrij celkweekmedium voor in de bioveiligheidskast: vul 500 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) hoge glucose aan met 1% penicilline/streptomycine met behulp van een pipet. Voeg 0,1% Gentamicine toe met een micropipet.
  5. Verwarm het celkweekmedium, de fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en trypsine-EDTA (0,25%) tot 37 °C door de items in een kralenbad te plaatsen voordat u met het experiment begint.
  6. Zorg ervoor dat de cellen voor 70-80% samenvloeien door visuele inspectie door een microscoop.
  7. Zuig het kweekmedium van de geplateerde cellen op en gooi het weg met de vacuümaspirator. Was het resterende medium eenmaal met 2 ml PBS met een pipet, zuig vervolgens de PBS op en gooi deze weg met de vacuümzuiger.
    OPMERKING: THP-1-cellen worden in suspensie gekweekt; Stappen 2.7-2.9 kunnen worden weggelaten.
  8. Voeg met behulp van een micropipet 1 ml trypsine toe aan de celkweekschaal en plaats de plaat gedurende 5 minuten in een 5% CO2 -incubator bij 37 °C.
  9. Inactiveer de trypsine door 1 ml van de soja-trypsineremmer (in 1x PBS) met een micropipet aan de plaat toe te voegen. Verspreid celclusters door het vloeibare mengsel te pipetteren met een P1000-micropipet en vang de celsuspensie op van de bodem van de plaat. Breng de celsuspensie met een micropipet over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer bij 100 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het bovenstaande weg met de vacuümzuiger.
  10. Ga verder met het tellen van cellen.

3. Bereiding van werkende kleurstofoplossing en kleuringscellen in suspensie

  1. Voordat u de injectieflacon met moleculaire fluorescerende sondes van de cell tracker opent (zie materiaaltabel), moet u het product 15 minuten laten opwarmen tot kamertemperatuur in een kralenbad op 37 °C.
  2. Los de blauwe kleurstof van de gevriesdroogde cell tracker (massa = 5 mg, molecuulgewicht = 209,6 g/mol) op tot een eindconcentratie van 10 mM met 2,385 ml DMSO met behulp van een micropipet.
  3. Los de gevriesdroogde cell tracker oranje kleurstof (massa = 50 μg, molecuulgewicht = 550,4 g/mol) op tot een eindconcentratie van 10 mM met 9,084 μL DMSO met behulp van een micropipet.
  4. Los de gevriesdroogde cell tracker dieprode kleurstof (massa = 15 μg, molecuulgewicht = 698,3 g/mol) op tot een eindconcentratie van 1 mM met 20 μL DMSO met behulp van een micropipet.
  5. Bereid de werkende oplossing van de blauwe kleurstof van de cell tracker (5 μM) voor door 1 μl van de kleurstof te verdunnen in 2 ml serumvrij DMEM-medium met een micropipet.
  6. Bereid de werkende cell tracker oranje kleurstofmedia-oplossing (5 μM) voor door 1 μL van de kleurstof te verdunnen in 2 ml serumvrij DMEM-medium met een micropipet.
  7. Bereid de werkende cell tracker dieprode kleurstofmedia-oplossing (1 μM) voor door 2 μL van de kleurstof te verdunnen in 2 ml serumvrij DMEM-medium met een micropipet.
  8. Resuspendeer de epitheelcellen, BJ-5ta-fibroblasten en Ea.hy926 endotheelcellen in de voorbereide werkende celtracker blauwe, oranje en dieprode kleurstofmedia-oplossingen (2 ml), respectievelijk met een micropipet.
  9. Incubeer de buisjes 30 minuten bij 37 °C in de 5% CO2 incubator.
  10. Centrifugeer de buisjes na 30 minuten incubatie 5 minuten bij kamertemperatuur op 100 x g .
  11. Zuig het bovenstaande op en gooi het weg met de vacuümaspirator en resuspendeer de pellet grondig in 1 ml DMEM-medium met 10% FBS-serum met een micropipet.
  12. Ga verder met het tellen van cellen.

4. Cellen tellen

  1. Verzamel 10 μL van de celsuspensie en breng deze met een micropipet over in een microbuisje.
  2. Meng met 10 μL trypan blauw en pipetteer grondig.
  3. Breng 20 μl van de cel-trypanoplossing met een micropipet over op een objectglaasje van de celtelkamer. Voer de cellen in en tel ze met behulp van een geautomatiseerde cellenteller.
  4. Bereken het gemiddelde totale aantal live cellen op basis van twee metingen.

5. Berekeningen

  1. Bereid werkcelvoorraden voor elk celtype voor in een concentratie van 6,67 × 103 cellen/ml, overeenkomend met 2.000 cellen/300 μl.
    OPMERKING: Het totale voorraadvolume is afhankelijk van de experimentele steekproefomvang.
  2. Zorg er bij monocultuursferoïden voor dat elk onafhankelijk monster bestaat uit 300 μl van het werkmateriaal van de epitheelcel, wat overeenkomt met 2.000 epitheelcellen.
  3. Zorg er bij co-cultuursferoïden (twee celtypen) voor dat elk onafhankelijk monster bestaat uit 150 μl epitheelcelmateriaal en 150 μl stromale celmateriaal. Het monster zal 1.000 epitheelcellen en 1.000 stromale cellen bevatten.
  4. Voor co-cultuur sferoïden (drie celtypen), zorg ervoor dat elk onafhankelijk monster bestaat uit 150 μL epitheelcelwerkmateriaal, 75 μL stromale cel #1 werkvoorraad en 75 μL stromale cel #2 werkvoorraad. Het monster zal 1.000 epitheelcellen, 500 stromale cellen van werkvoorraad #1 en 500 stromale cellen van werkvoorraad #2 bevatten.

6. Beplating

  1. Breng het vereiste volume over met een micropipet voor drie technische replicaten, plus één extra, in een microbuisje. Meng grondig met een pipet en breng vervolgens 300 μL van het monster over naar een putje met een U-vormige, ultralage bevestiging 96-well microplaat.
  2. Herhaal het proces voor elke extra technische replicatie.
  3. Plaats de plaat met 96 putjes in een broedmachine bij 37 °C.

7. Brightfield-beeldvorming

  1. Observeer de sferoïde groei en morfologie elke 24 uur tot 96 uur met behulp van een microscoop.
  2. Beeld sferoïden af met behulp van een fasecontrastmicroscoop.

8. Widefield-beeldvormingsprotocolopstelling voor sferoïden gekleurd met trackerkleurstoffen en sferoïden bedekt met basaalmembraanextract

  1. Schakel de beeldvormings- en geautomatiseerde couveuses in die worden vermeld in de materiaaltabel en maak een nieuw beeldvormingsprotocol in de taakbeheerder van de beeldverwerkingssoftware. Stel op het tabblad Procedure het temperatuurinstelpunt van de geautomatiseerde broedmachine in op 37 °C en laat de broedmachine CO2% en temperatuur in evenwicht brengen voordat u verder gaat met de volgende stap.
    OPMERKING: Een alternatieve fluorescerende imager kan worden gebruikt als deze de juiste filters heeft voor elk van de gebruikte kleurstoffen (blauw, dieprood en oranje).
  2. Stel de beeldinstellingen in op de volgende specificaties: Vergroting: 4X PL FL-fase, Gezichtsveld: 3185 x 3185 μm, volledige WFOV.
  3. Gebruik de volgende specificaties voor de kanalen: DAPI: 377/447 nm, verlichting = 10, integratietijd = 107 ms, versterking = 10, RFP: 531/593 nm, verlichting = 10, integratietijd = 137 ms, versterking = 10, CY5: 628/685 nm, verlichting = 10, integratietijd = 137 ms, versterking = 10.
  4. Gebruik voor het afbeelden van sferoïden in een overlay van een basaalmembraanextractoplossing de volgende helderveldspecificaties: verlichting = 10, integratietijd = 5 ms en versterking = 17,1.
  5. Selecteer de gewenste putjes voor beeldvorming en keur de specificatiewijzigingen goed door op het pictogram Putjes selecteren te klikken.
  6. Navigeer naar het tabblad Gegevensreductie om de instellingen voor mobiele analyse aan te passen.
  7. Stel de drempelwaarde in op 19.500 met een lichte achtergrond en selecteer Gaten in maskers opvullen.
  8. Stel voor objectselectie de minimale objectgrootte in op 100 μm en de maximale objectgrootte op 1.000 μm en selecteer Gehele afbeelding analyseren.
    OPMERKING: Voor deze analyse zijn alleen een primair masker en objecttelling nodig.
  9. Sla alle wijzigingen op en open de imager-applicatie.
  10. Plaats de experimentele U-vormige microplaat met bodem in de broedmachine door de lade te openen en vervolgens te sluiten met behulp van de imager-software.
  11. Om het protocol uit te voeren, klikt u op het tabblad Procedure-informatie , voegt u een gebruiker toe en kiest u het protocol.
  12. Zorg ervoor dat het juiste plaattype is geselecteerd en stel de beeldvormingstijd in op 30 minuten per plaat.
  13. Selecteer het gewenste beeldvormingsinterval, geef aan of de plaat een deksel heeft en pas de starttijd en duur van de beeldvorming aan.
  14. Klik op Plaat/vat plannen om het beeldvormingsproces te starten.

9. Overlay van de basaalmembraanextractieoplossing (facultatief)

OPMERKING: Oplossing voor basaalmembraanextract kan 24 uur na het plateren op sferoïden worden aangebracht.

  1. Vul een ijsemmer met ijs om de oplossing van het basaalmembraanextract koud te houden en bewaar deze bij 4 °C wanneer deze niet in gebruik is.
  2. Zuig ongeveer 170 μL medium op met een meerkanaals pipet.
  3. Gebruik een vergrootglas en een mini-lichtbak om de kleine sferoïden van dichtbij te observeren. Plaats de sferoïde plaat met 96 putjes over de lichtbak en plaats het vergrootglas boven het hoofd.
  4. Stel de P200-pipet in op 30 μl en verzamel het extract van het basaalmembraan om drie microdruppels te maken.
  5. Voeg met een micropipet een microdruppel toe over elke sferoïde van de drie technische replicaten.
  6. Zorg ervoor dat de plaat met 96 putjes plat is en plaats de pipet verticaal boven de sferoïde. Laat de druppel los zonder de bodem van de put aan te raken.
  7. Plaats de plaat 20 minuten in een broedmachine bij 37 °C.
  8. Bedek de sferoïden met een extra micropipet met een extra 50 μL van de basaalmembraanextractoplossing per putje.
  9. Verplaats de sferoïden naar het midden van de put met behulp van een pipetpunt.
  10. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
  11. Voeg 100 μL celkweekmedium toe aan elk putje.

10. Kwantificering

  1. Download en open de ImageJ-software. Upload de sferoïde afbeeldingen.
  2. Stel metingen in door te klikken op Analyseren | Stel Metingen in en selecteer Gebied | Zwaartepunt. Meet de sferoïden door het lasso-gereedschap te gebruiken om de sferoïde te traceren en het object te meten.
  3. Noteer de waarden voor drie biologische replicaten en bereken de gemiddelde oppervlakte en circulariteit.
  4. Converteer het gebied van pixels naar vierkante meters met behulp van de volgende formule:
    Oppervlakte (m2) = ((550/504) × √ (oppervlakte in pixels)) 2
  5. Analyseer gegevens.
    1. Selecteer Repliceren invoeren
    2. Voer de gegevens in de kolommen in en selecteer de sferoïde monsters van de monocultuursferoïde controle en de co-cultuurbehandeling.
    3. Voer een eenrichtingsanalyse van de ANOVA-kolom uit.
  6. Gebruik de volgende ANOVA-parameters:
    1. Vermijd matchen of koppelen.
    2. Ga uit van een Gaussiaanse verdeling van residuen.
    3. Ga uit van gelijke standaarddeviaties.
    4. Gebruik de meervoudige vergelijkingstest van Tukey om het gemiddelde van elke kolom te vergelijken met het gemiddelde van elke andere kolom.

11. Breedveld immunofluorescerende beeldverwerking

  1. Sla de afbeeldingen rechtstreeks vanuit de imager-software op als PNG- of Tiff-bestandsindeling.
  2. Selecteer elk afzonderlijk kanaal of overlappende kanalen en sla het op als PNG-bestand.
  3. Pas de helderheid en het contrast aan in de imager-software of in ImageJ als afbeeldingen worden geëxporteerd als Tiff-bestanden.

Resultaten

In deze studie hebben we een celkweeksysteem ontwikkeld om heteromeercellige 3D-sferoïden te genereren, bestaande uit epitheel- en stromale cellen met organoïde-achtige morfologie. Spheroïden werden tot stand gebracht door 2.000 epitheelcellen in monocultuuromstandigheden te plateren. In co-cultuuromstandigheden van twee celtypen werden sferoïden tot stand gebracht door 1.000 epitheelcellen en 1.000 stromale cellen te plateren. In co-cultuuromstandigheden van drie celtypen werden sferoïden tot stand gebracht door 1.000 epitheelcellen en twee verschillende stromale celtypen van 500 cellen van elk celtype te plateren. Stroomopwaarts van de sferoïde vestiging kunnen cellen worden gekleurd met fluorescerende kleurstoffen voor celtrackers die het mogelijk maken om de cellulaire ruimtelijke organisatie te volgen. Na 24 uur na de initiële sferoïdevorming omvatten stroomafwaartse toepassingen farmacologische verstoringen, beeldvorming en monsterverzameling. Time-lapse-beeldvorming is nuttig voor het beoordelen van veranderingen in sferoïde gedrag en morfologie, inclusief oppervlakte en circulariteit (Figuur 1A). Na 24 uur na het plateren kunnen sferoïden worden ingebed in een steigeromgeving en kan time-lapse-beeldvorming worden gebruikt om het begin van invasieve structuren van de sferoïde te beoordelen (Figuur 1B). Het verzamelen van heteromulticellulaire sferoïde monsters heeft vele toepassingen, waaronder genomische en proteomische profilering op mondiaal en eencellig niveau door middel van experimentele technieken zoals RNA-sequencing, eencellige RNA-sequencing, proteomische sequencing en cyclische immunofluorescentie.

figure-results-1
Figuur 1: Schematische weergave van het 3D-celkweekproces en mogelijke toepassingen. (A) Celsuspensie van epitheelcellen met niet-epitheliale stromale cellen wordt gepipetteerd in 3D ultralage hechtingsplaten om sferoïden te vormen. Sferoïden worden elke 24 uur gedurende 96 uur in beeld gebracht door middel van helderveldmicroscopie. Cellijnen kunnen worden gekleurd met fluorescerende kleurstoffen voor celtrackers voor stroomafwaartse breedveldmicroscopie voordat sferoïde vorming wordt geïnduceerd, of kunnen farmacologisch worden verstoord na sferoïdevorming. Sferoïde parameters zoals morfologie, oppervlakte, circulariteit en organisatie kunnen worden geanalyseerd. (B) Sferoïden van epitheel- en epitheelcellen met stromale cellen worden gevormd met behulp van het protocol van A. Spheroïden werden tot stand gebracht door 2.000 epitheelcellen in monocultuuromstandigheden te plateren. In co-cultuuromstandigheden van twee celtypen werden sferoïden tot stand gebracht door 1.000 epitheelcellen en 1.000 stromale cellen te plateren. In co-cultuuromstandigheden van drie celtypen werden sferoïden tot stand gebracht door 1.000 epitheelcellen en twee verschillende stromale celtypen van 500 cellen van elk celtype te plateren. Na 24 uur wordt een steigerachtige oplossing van basaalmembraanextract over elkaar gelegd en worden er elke 24 uur gedurende 120 uur beelden vastgelegd in helderveldmicroscopie. (C) Gevestigde steigervrije en op steigers gebaseerde hetero-multicellulaire 3D-culturen kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan stroomafwaartse toepassingen, zoals cyclische immunofluorescentie, eencellige RNA-sequencing en eencellige proteomics. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

MCF10A, MCF10Ca1h en BT-474 monocultuur sferoïden behouden een compact bolvormig fenotype tot 96 uur na het uitplaten. Wanneer ze werden gekweekt met EA.hy926 microvasculaire endotheelcellen, BJ-5ta-fibroblasten en/of THP-1 monocytachtige cellen, ontwikkelden de sferoïden cellulaire uitsteeksels aan de periferie, die na 96 uur meer uitgesproken werden (Figuur 2A-C). Belangrijk is dat deze uitsteeksels, ontluikende en verdichtingsverschijnselen van sferoïden variaties vertegenwoordigen in de cellulaire organisatie van de kankersferoïde en de co-gekweekte stromale cellen die correleerden met 3D-invasiviteit na toevoeging van een op basaalmembraan gebaseerde hydrogel zoals Matrigel. De ontluikende morfologie varieerde van vaste tot losse celaggregaten, die lijken op organoïde morfologie. Daarentegen verschenen MDA-MB-468 monocultuursferoïden als grote, losse celaggregaten. Toen MDA-MB-468-cellen echter samen met EA.hy926, BJ-5ta en/of THP-1 werden gekweekt, vormden ze compacte sferoïden (Figuur 2D).

figure-results-2
Figuur 2: Het scala aan architecturen en morfologieën die worden aangenomen door combinaties van niet-epitheliale stromale cellen in combinatie met epitheliale tumor/niet-tumorcellen in steigervrije 3D-culturen. Representatieve helderveldbeelden van (A) MCF10A, (B) MCF10Ca1h, (C) BT-474, (D) MDA-MB-468 sferoïden in monocultuur of in co-cultuuromstandigheden met stromale BJ-5ta-fibroblasten/Ea.hy926 microvasculaire endotheelcellen of Ea.hy926/THP-1 monocytachtige cella of BJ-5ta/THP-1-cellen gedurende 96 uur. Elke sferoïde werd gevormd door 2.000 cellen te plateren. Spheroïden in monocultuuromstandigheden werden gevormd met behulp van 2.000 epitheelcellen. Spheroïden in co-cultuuromstandigheden werden gevormd met behulp van 1.000 epitheelcellen en twee verschillende stromale celtypen van 500 cellen. De vorming van ontluikende of geaggregeerde organoïde-achtige structuren werd geïnitieerd in sferoïde co-cultuuromstandigheden 24 uur na het plateren in MCF10A-, MCF10Ca1h- en BT-474-epitheelcellen. Verdichting van MDA-MB-468-cellen werd waargenomen in sferoïde co-cultuuromstandigheden 25 uur na het plateren. Schaalbalken = 100 μm. Afkorting: hpp = uren na het plateren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

72 uur na het plateren vertoonden MCF10A-, MCF10Ca1h- en BT-474-cellen die samen met EA.hy926 en THP-1, of met BJ-5ta en THP-1 waren gekweekt, een significante toename van het sferoïde gebied in vergelijking met monocultuurepitheliale sferoïden. MCF10Ca1h vertoonde ook een significante toename van het sferoïde gebied wanneer het samen met EA.hy926 en BJ-5ta werd gekweekt. Het begin van ontluikende structuren in co-gekweekte sferoïden leidde tot een significante afname van de sferoïde circulariteit voor MCF10A, MCF10Ca1h en BT-474 gecocultureerd met EA.hy926 en THP-1, of met BJ-5ta en THP-1. Vergelijkbare effecten werden waargenomen voor BT-474 in co-cultuur met zowel EA.hy926 als BJ-5ta (Figuur 3A,B). Daarentegen vertoonden MDA-MB-468-cellen die samen met EA.hy926 en BJ-5ta, EA.hy926 en THP-1, of BJ-5ta en THP-1 waren gekweekt, een significante afname van het sferoïde gebied in vergelijking met monocultuur MDA-MB-468-sferoïden; toch was er geen effect op de circulariteit (Figuur 3A,B).

figure-results-3
Figuur 3: Grafieken voor gebieds- en circulariteitsanalyse van monogekweekte en heteromulticellulaire stromale 3D-steigervrije culturen 72 uur na het plateren. (A) Gemiddelde oppervlakte (cm2) en (B) gemiddelde circulariteit van MCF10A, MCF10Ca1h, BT-474 en MDA-MB-468 in monogekweekte en heteromeercellige stromale sferoïde culturen 72 uur na het plateren. De gerapporteerde gegevens zijn representatief voor ten minste drie onafhankelijke biologische replicaten en worden gerapporteerd als technische duplogemiddelden ± SEM, tenzij anders aangegeven. *, **, *** of **** vertegenwoordigen P-waarden < respectievelijk 0,05, 0,01, 0,001 of 0,0001, tenzij anders vermeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De toepassing van kleurstof van de celtracker op BT-474 tumorigene epitheelcellen en stromale cellen voorafgaand aan de vestiging van sferoïden toonde aan dat stromale cellen, waaronder EA.hy926 en BJ-5ta, de ontluikende structuren vormden aan de omtrek van de centrale BT474-sferoïden (Figuur 4, Aanvullende Video S1, Aanvullende Video S2, Aanvullende Video S3 en Aanvullende Video S4). 48 uur na het plateren laten individuele breedveldfluorescentiebeelden van sferoïden die samen met fibroblasten zijn gekweekt, zien dat fibroblastsferoïden samen met endotheelcellen zijn gelokaliseerd, maar niet co-lokaliseerd met BT-474-sferoïden. Een minderheid van de endotheelcellen bleek ook co-lokalisatie te vinden met BT-474 sferoïden in co-cultuuromstandigheden. Dit suggereert dat de rangschikking van stromale cellen in de sferoïde gecorreleerd is met een organoïde-achtige morfologie.

figure-results-4
Figuur 4: Breedveldfluorescentiebeelden van differentieel geverfde stromale en BT-474-cellen in heteromulticellulaire 3D-culturen 48 uur na het plateren. BT-474 sferoïden zijn gekleurd met blauwe cell tracker fluorescerende kleurstof. BJ-5ta-fibroblasten zijn gekleurd met oranje celtracker-kleurstof, weergegeven in rode kleur. Ea.hy926 endotheelcellen zijn gekleurd met dieprode kleurstof voor het volgen van cellen, weergegeven in groene kleur. Elke sferoïde werd gevormd door 2.000 cellen te plateren. Spheroïden in monocultuuromstandigheden werden gevormd met behulp van 2.000 epitheelcellen. Spheroïden in co-cultuuromstandigheden (BT-474/BJ-5ta, BT-474/Ea.hy926) werden gevormd met behulp van 1.000 epitheelcellen en 1.000 stromale cellen. Spheroïden in dubbele co-cultuuromstandigheden (BT-474/BJ-5ta/Ea.hy926) werden gevormd met behulp van 1.000 epitheelcellen en 500 cellen van elk stromale celtype. De cijfers zijn representatief voor ten minste drie biologische replicaten. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Om de biologische relevantie van ons organoïde sferoïdemodel te beoordelen, werden de sferoïden 24 uur na het plateren bedekt met een oplossing voor basaalmembraanextract. Monocultuur BT-474 sferoïden vertoonden geen invasieve eigenschappen 120 uur na het plateren. BT-474-sferoïden die samen met BJ-5ta of EA.hy926 werden gekweekt, ontwikkelden echter structuren aan de periferie van de sferoïde, die de omgeving van de steigerbasaalmembraanextractoplossing binnendrongen. Het aantal en de lengte van deze uitsteeksels waren significant verbeterd in BT-474-sferoïden die samen met zowel BJ-5ta als EA.hy926 werden gekweekt gedurende 48 uur tot 120 uur na het plateren (Figuur 5, Aanvullende Video S5, Aanvullende Video S6, Aanvullende Video S7 en Aanvullende Video S8).

figure-results-5
Figuur 5: Brightfield stilstaande beelden van BT-474 cellen in heteromulticellulaire 3D-culturen met overlay van basaalmembraanextractoplossing 5 dagen na de overlay. Elke sferoïde werd gevormd door 2.000 cellen te plateren. De oplossing van het basaalmembraanextract werd 24 uur na het plateren over de sferoïden gelegd. Spheroïden in monocultuuromstandigheden werden gevormd met behulp van 2.000 epitheelcellen. Spheroïden in co-cultuuromstandigheden (BT-474/BJ-5ta en BT-474/Ea.hy926) werden gevormd met behulp van 1.000 epitheelcellen en 1.000 stromale cellen. Spheroïden in dubbele co-cultuuromstandigheden (BT-474/BJ-5ta/Ea.hy926) werden gevormd met behulp van 1.000 epitheelcellen en 500 cellen van elk stromale celtype. (A) Invasieve structuren die uit de kankersferoïde steken, ingebed in een basaalmembraanextractoplossing, kunnen worden waargenomen in co-cultuuromstandigheden. (B) Kwalificatie van het aantal invasieve uitsteeksels op tijdstip 48 hpp. (C) Kwalificatie van de lengte van het invasieve uitsteeksel op het tijdstip 48 hpp. De cijfers zijn representatief voor ten minste drie biologische replicaten. Schaal balk = 200 μm. Afkorting: hpp = uren na het plateren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende video S1: BT-474 monocultuur sferoïde met blauwe kleurstof voor mobiele trackers. BT-474 (2.000) cellen werden geresuspendeerd in een U-vormige, ultralage bevestiging 96-well microtiterplaat om sferoïden te vormen. Een overlapping van helderveld- en breedveldfluorescentiebeelden werd vastgelegd gedurende 48 uur. Afkorting: ULA = ultralow attachment. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S2: BT-474 sferoïden gecocultureerd met BJ-5ta-fibroblasten. BT-474 (1.000) en 1.000 BJ-5ta fibroblasten werden opnieuw gesuspendeerd in ULA-platen om sferoïden te vormen. BT-474-cellen werden geïncubeerd met blauwe kleurstof van de cell tracker en BJ-5ta-fibroblasten met oranje kleurstof van de cell tracker. Een overlapping van helderveld- en breedveldfluorescentiebeelden (blauw = BT-474, rood = BJ-5ta) werd gedurende 48 uur vastgelegd. Afkorting: ULA = ultralow attachment. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S3: BT-474 sferoïden gekweekt samen met Ea.hy926 endotheelcellen. BT-474 (1.000) en 1.000 Ea.hy926 endotheelcellen werden opnieuw gesuspendeerd in ULA-platen om sferoïden te vormen. BT-474-cellen werden geïncubeerd met blauwe kleurstof van de cell tracker en Ea.hy926 endotheelcellen met dieprode kleurstof van de cell tracker. Een overlapping van helderveld- en breedveld-fluorescerende (blauw = BT-474, groen = Ea.hy926) beelden werd gedurende 48 uur vastgelegd. Afkorting: ULA = ultralow attachment. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S4: BT-474 sferoïden gekweekt samen met BJ-5ta-fibroblasten en Ea.hy926 endotheelcellen. BT-474 (1.000), 500 BJ-5ta-fibroblasten en 500 Ea.hy926 endotheelcellen werden opnieuw gesuspendeerd in ULA-platen om sferoïden te vormen. BT-474-cellen werden geïncubeerd met blauwe kleurstof van de celtracker. BJ-5ta-fibroblasten en Ea.hy926 endotheelcellen werden geïncubeerd met respectievelijk celtracker-oranje kleurstof en dieprode kleurstof. Een overlapping van helderveld- en breedveld-fluorescerende beelden (blauw = BT-474, rood = BJ-5ta, groen = Ea.hy926) werd gedurende 48 uur vastgelegd. Afkorting: ULA = ultralow attachment. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S5: BT-474 monocultuur sferoïde in oplossing voor het extract van basaalmembraan. BT-474-cellen (2.000) werden opnieuw gesuspendeerd in ULA-platen om sferoïden te vormen, en de sferoïden werden 24 uur na het plateren ingebed in een basaalmembraanoplossing. De beelden van Brightfield werden gedurende 60 uur genomen. Afkorting: ULA = ultralow attachment. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S6: BT-474 sferoïden gekweekt samen met BJ-5ta-fibroblasten in een oplossing voor het extract van basaalmembraan. BT-474 (1.000) en 1.000 BJ-5ta fibroblasten werden geresuspendeerd in ULA-platen om sferoïden te vormen, en de sferoïden werden 24 uur na het plateren ingebed in een oplossing voor het extract van een basaalmembraan. De beelden van Brightfield werden gedurende 60 uur genomen. Afkorting: ULA = ultralow attachment. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S7: BT-474 sferoïden gekweekt in co-cultuur met Ea.hy926 endotheelcellen in een oplossing voor basaalmembraanextract. BT-474 (1.000) en 1.000 Ea.hy926 endotheelcellen werden opnieuw gesuspendeerd in ULA-platen om sferoïden te vormen, en de sferoïden werden 24 uur na het plateren ingebed in een oplossing voor het extract van basaalmembraan. De beelden van Brightfield werden gedurende 60 uur genomen. Afkorting: ULA = ultralow attachment. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S8: BT-474 sferoïden gekweekt samen met BJ-5ta-fibroblasten en Ea.hy926 endotheelcellen in een oplossing voor basaalmembraanextract. BT-474 (1.000), 500 BJ-5ta-fibroblasten en 500 Ea.hy926 endotheelcellen werden opnieuw gesuspendeerd in ULA-platen om sferoïden te vormen, en de sferoïden werden 24 uur na het plateren ingebed in een oplossing voor het extract van een basaalmembraan. De foto's van Brightfield zijn gedurende 60 uur gemaakt. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussie

Ons hetero-multicellulaire sferoïde model toont aan dat epitheel-stromale celinteracties de oorzaak zijn van het ontluiken van stromale cellen in steigervrije 3D-kweekomstandigheden en de vorming van invasieve structuren in 3D-kweekomstandigheden op basis van steigers. We zagen consistente ontluikende structuurvorming in zowel tumorigene cellijnen (MCF10Ca1h en BT-474) als de niet-tumorigene epitheelcellijn MCF10A (Figuur 2A-C). Interessant is dat terwijl sferoïden van cellijnen MCF10A, MCF10Ca1h en BT-474, hetzij in monocultuur of co-cultuur met fibroblasten en endotheelcellen, cirkelvormige en compacte ontluikende structuren vormden in steigervrije omgevingen, sferoïden van cellijn MDA-MB-468 minder verdichting vertoonden (Figuur 2D). Dit was onverwacht, aangezien werd verwacht dat MDA-MB-468-cellen cirkelvormige sferoïden zouden vormen, net als de andere geteste epitheelcellijnen. Cellijn SUM-149, een hybride epitheel-mesenchymale primaire borstkankercellijn, bleek compacte sferoïden te vormen zoals MCF10A, MCF10Ca1h en BT-474 (gegevens niet getoond)28. Toekomstig onderzoek zou de signaalroutes moeten onderzoeken die de vorming van minder compacte sferoïden in de MDA-MB-468-cellijn mediëren, aangezien dergelijke anomalieën kunnen wijzen op cellulaire kwetsbaarheden die kunnen worden gebruikt voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën.

Wat betreft de combinatie van verschillende cellijnen, induceren THP-1 monocytachtige cellen de vorming van losse aggregaatstructuren in alle co-cultuuromstandigheden van sferoïden. Er wordt minder verdichting waargenomen in ontluikende structuren in co-cultuuromstandigheden met THP-1/Ea.hy926-cellen in vergelijking met die in co-cultuuromstandigheden met THP-1/BJ-5ta-cellen (Figuur 2A-D). Daarom wordt de verdichting van sferoïden beïnvloed door de stromale celsamenstelling in het model 29,30.

Inconsistente beplating van de hetero-celcombinaties kan resulteren in onvolledige sferoïde ontwikkeling of variabiliteit in sferoïde grootte, in vergelijking met hun technische replicaten. Het is van cruciaal belang om te zorgen voor consistentie in de celbeplating, aangezien de ruimtelijke rangschikking van cellen die het sferoïde fenotype en de ontwikkeling bepaalt, voornamelijk plaatsvindt in de eerste 48 uur31. Tijdens deze kritieke periode spelen celverhoudingen een cruciale rol, waarbij het aandeel stromale cellen zowel het sferoïde gebied als de circulariteit beïnvloedt.

Losse sferoïde aggregaten, die afhankelijk zijn van het celtype, kunnen gemakkelijk uit elkaar worden gehaald tijdens handmatige behandeling. Handmatige manipulatie is echter noodzakelijk bij het overlappen van sferoïden met een steigerachtige basaalmembraanextractoplossing of bij het verzamelen van hele sferoïde monsters. Om dit probleem te verhelpen, is het raadzaam om in een langzamer tempo te werken bij het verzamelen van sferoïden via pipetaspiratie en om handmatige hantering waar mogelijk tot een minimum te beperken. Tijdens de overlay van de oplossing van het basaalmembraanextract zijn sferoïden vatbaar voor verschuiving in de put, vaak bezinkend aan de rand van de put. Een verhouding tussen oplossing en media van basaalmembraanextract is belangrijk voor het behoud van de matrixeigenschappen van het 3D-systeem; De sferoïden kunnen echter niet volledig worden omhuld vanwege de viscositeit van de basaalmembraanextractoplossing, dus handmatig ingrijpen is vereist32. Niet-gecentreerde sferoïde positionering vormt een uitdaging voor beeldvorming, omdat lichtbreking nabij de plastic rand van de put de helderheid van het beeld kan verstoren.

De sferoïden die in deze studie werden gebruikt, waren samengesteld uit menselijke kankercellijnen; De hier beschreven methoden zijn nog niet toegepast op primaire cellijnen. Onze resultaten suggereren dat specifieke cel-celinteracties de vorming van organoïde-achtige structuren kunnen stimuleren, wat wijst op de mogelijke toepasbaarheid van deze methode op een breed scala aan tumorigene cellijnen. Hoewel ons model probeert de complexiteit van de micro-omgeving van de tumor na te bootsen, vormen de verschillende snelheden van cellulaire proliferatie een uitdaging voor langetermijnstudies33. Snel prolifererende cellen hebben de neiging om langzamer prolifererende cellen te ontgroeien, waardoor dit model minder geschikt is voor uitgebreide experimenten. Bovendien kunnen verschillende vereisten voor groeimediatypen voor cellijnen extra factoren introduceren die kunnen leiden tot sferoïde fenotypes. De meeste cellijnen in deze studie werden gekweekt in DMEM-media. Studies met cellijnen die in verschillende media zijn gekweekt, kunnen verschillende kweekomstandigheden vereisen, waarbij verschillende mediaverhoudingen worden getest; Toch wordt dit effect waargenomen bij langdurige experimenten30.

Ons model biedt verschillende voordelen ten opzichte van andere 3D-kankermodellen. De sferoïden die we genereren hebben een uniforme en reproduceerbare initiële morfologie en grootte, waardoor het gemakkelijker wordt om behandelingsresultaten te vergelijken met controles. Daarentegen kunnen sommige modellen die gebruik maken van afzonderlijke cellen die in media of steigers zijn opgehangen, resulteren in variabele cellulaire ruimtelijke verdelingen, wat leidt tot inconsistentie. Dit model toont aan dat interacties tussen verschillende celpopulaties effectief kunnen worden bestudeerd.

Traditioneel zijn organoïde en sferoïde modellen samengesteld uit monocultuur kankercellen of co-culturen van kankercellen om gradiënten van voedingsstoffen, hypoxie of cellulaire rangschikking te onderzoeken34. Bovendien kan dit model binnen 24 uur na het plateren in een steigeromgeving worden bestudeerd, wat de mogelijkheid biedt om vroege invasie-gebeurtenissen te onderzoeken die worden aangedreven door diverse cel-celinteracties. Terwijl alternatieve 3D-kankerbenaderingen verschillende steigermatrixcomponenten gebruiken om veranderingen in sferoïde morfologie en invasiviteit te bestuderen, vult dit model deze aan door het mogelijk te maken deze veranderingen te onderzoeken in de context van zowel de dynamiek van de celpopulatie als de samenstelling van de steiger35.

De meeste sferoïden die met onze methoden worden geproduceerd, behouden hun structurele integriteit na handmatige behandeling, waardoor monsterverzameling in downstream-toepassingen mogelijk is. Conventionele genetische modificaties zoals CRISPR-Cas9, lentivirale shRNA-transductie en siRNA-interferentie kunnen stroomopwaarts van de sferoïde vorming worden geïntroduceerd. Het complexe gedrag dat bij deze sferoïden wordt waargenomen, suggereert dynamische veranderingen in genexpressie, die verder kunnen worden onderzocht met behulp van RNA-seq. Geavanceerde technieken zoals CycIF, scRNA-seq, CosMx en Visium kunnen ook worden gebruikt om genomica en proteomics op ruimtelijk of eencellig niveau te bestuderen. Dit sferoïde model heeft het potentieel om in vivo studies van gerichte tumortherapieën na te bootsen door interacties tussen stromale celknoppen en therapeutische middelen vast te leggen voordat het de kankercellen bereikt. Dit is belangrijk omdat het kan helpen bepalen of stromale cellen de potentie van het medicijn beïnvloeden, waardoor de kankercellen mogelijk worden beschermd tegen de therapeutische effecten.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

We danken de leden van het Baylor University Developmental Oncogene Laboratory voor hun nuttige opmerkingen en feedback tijdens de voorbereiding van dit manuscript. Financieringssteun werd verleend door Baylor University Department of Biology en College of Arts and Sciences, NIH-NIGMS 2SC1GM121182 (naar J.A.K.).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes  Falcon 14-959-53A 
96-Well, Treated, U-Shaped-Bottom Microplate Thermo Scientific 12566432 
100 mm Dish Cell Culture Treated Surface Thermo Scientific 130182 
170 L CO2 Incubators VWRVWR51014991(10810902)
200 Self-Sealing Barrier Pipet TipsFisher Scientific02-682-255
500 mL DMEM/Hams F-12, [+] L-glutamineCorning10-090-CV
1000 Self-Sealing Barrier Pipet TipsMolecular Biology Products Inc.2179HR
Animal-Free Recombinant Human EGFPeproTechAF-100-15
Automated Pipette Repeater E3xEppendorf4987000410
Basement membrane solutionHuntsman Cancer Institute https://healthcare.utah.edu/huntsmancancerinstitute/
Bead BathLab Armor 74300706
Biorender BiorenderBiorender.com 
Biosafety Laminar Flow Cabinets Thermo Scientific300590389
BioSpa 8 Automated Incubator Agilent  23082120
Cell Counter InvitrogenAMQAF2000
Cell Counting Chamber SlidesThermo ScientificC10283
CellTracker Deep Red Thermo Fisher Scientific C34565 
Centrifuge Thermo Scientific 13100675
Cholera Toxin B subunitSigma-AldrichC9903-1MG
Combitips advanced, Sterile, 5.0 mLFisher Scientific13-683-714
Cytation 10 Reader ImagerAgilent 2105245
Defined Trypsin Inhibitor Gibco R007100 soybean trypsin inhibitor in 1x PBS
Donor Horse Serum, 500 mL, United States OriginCorning35-030-CV
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-013-CV 
Excel Sofware Microsoft office 365 https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
Fetal Bovine Serum Thermo Scientific 26140079 
Fetal Bovine Serum, qualified, US originThermo Scientific26140079
Gentamicin Sulfate, LiquidCorning30-005-CR
GraphPad Prism
Hydrocortisone solution,50 µM, sterile-filtered, BioXtraSigma-AldrichH6909-10ML
Image J Software Fiji https://imagej.net/ij/
Insulin solution humanSigma-AldrichI9278-5ML
Magnifying Glass Fisher Scientific 01-182-392 
Microcentrifuge Tube Costar 3621 
MicroscopeOlympusCKX53SF
Mini Lightbox Fisher Scientific 361044708 
Molecular Probes CellTracker Blue CMAC Dye Fisher Scientific C2110 
Molecular Probes CellTracker Orange CMRA Dye Fisher Scientific C34551 
Penicillin-Streptomycin SolutionCytivaSV30010
Penicillin-Streptomycin Solution Cytiva SV30010 
Phase-Contrast Microscope Echo RVSF1000
Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific SH3025601 
Pipet ControllerCorning4099
Pipette 100 – 1,000 µLEppendorf3123000063
Pipette 20 – 200 µLEppendorf3123000055
Prism GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com/features
RPMI 1640 with L-glutamine and 25 mM HEPESCorning10-041-CV
Serological Pipette, 10 mLThermo Scientific170356N
Serological Pipette, 25 mLThermo Scientific170357N
Serological Pipette, 5 mLThermo Scientific170355N
Trypan Blue Solution, 0.4% Corning 25900CI 
Trypsin-EDTA, 0.25% Corning 25053CI 

Referenties

  1. de Visser, K. E., Joyce, J. A. The evolving tumor microenvironment: From cancer initiation to metastatic outgrowth. Cancer Cell. 41 (3), 374-403 (2023).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Anderson, N. M., Simon, M. C. The tumor microenvironment. Curr Biol. 30 (16), R921-R925 (2020).
  4. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Commun Signal. 18 (1), 59(2020).
  5. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  6. Erdogan, B., Webb, D. J. Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis. Biochem Soc Trans. 45 (1), 229-236 (2017).
  7. Iozzo, R. V., Sanderson, R. D. Proteoglycans in cancer biology, tumour microenvironment and angiogenesis. J Cell Mol Med. 15 (5), 1013-1031 (2011).
  8. Amersfoort, J., Eelen, G. Immunomodulation by endothelial cells - partnering up with the immune system. Nat Rev Immunol. 22 (9), 576-588 (2022).
  9. Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. Modeling the process of human tumorigenesis. Nat Commun. 8 (1), 15422(2017).
  10. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  11. Wang, E., Xiang, K., Zhang, Y., Wang, X. -F. Patient-derived organoids (PDOs) and PDO-derived xenografts (PDOXs): New opportunities in establishing faithful pre-clinical cancer models. J Natl Cancer Cent. 2 (4), 263-276 (2022).
  12. Kamb, A. What's wrong with our cancer models. Nat Rev Drug Discov. 4 (2), 161-165 (2005).
  13. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
  14. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J. Mouse models in oncoimmunology. Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).
  15. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 160(2023).
  16. Ben-David, U., et al. Patient-derived xenografts undergo mouse-specific tumor evolution. Nat Genet. 49 (11), 1567-1575 (2017).
  17. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nat Rev Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
  18. Ivanics, T., et al. Patient-derived xenograft cryopreservation and reanimation outcomes are dependent on cryoprotectant type. Lab Invest. 98 (7), 947-956 (2018).
  19. Biju, T. S., Priya, V. V., Francis, A. P. Role of three-dimensional cell culture in therapeutics and diagnostics: an updated review. Drug Deliv and Transl Res. 13 (9), 2239-2253 (2023).
  20. Urzì, O., et al. Three-dimensional cell cultures: The bridge between in vitro and in vivo models. Int J Mol Sci. 24 (15), 12046(2023).
  21. Cacciamali, A., Villa, R., Dotti, S. 3D cell cultures: Evolution of an ancient tool for new applications. Front Physiol. 13, 836480(2022).
  22. Abuwatfa, W. H., Pitt, W. G. Scaffold-based 3D cell culture models in cancer research. J Biomed Sci. 31 (1), 7(2024).
  23. Yakavets, I., et al. Advanced co-culture 3D breast cancer model for investigation of fibrosis induced by external stimuli: optimization study. Sci Rep. 10 (1), 21273(2020).
  24. Mohammadrezaei, D., et al. Predicting and elucidating the post-printing behavior of 3D printed cancer cells in hydrogel structures by integrating in-vitro and in-silico experiments. Sci Rep. 13 (1), 1211(2023).
  25. Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLOS ONE. 12 (7), e0182039(2017).
  26. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  27. Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).
  28. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
  29. Pingitore, P., et al. Human multilineage 3D spheroids as a model of liver steatosis and fibrosis. Int J Mol Sci. 20 (7), 1629(2019).
  30. Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K. Organoids in immunological research. Nat Rev Immunol. 20 (5), 279-293 (2020).
  31. Beerkens, A. P. M., et al. Characterizing OXPHOS inhibitor-mediated alleviation of hypoxia using high-throughput live cell-imaging. Cancer Metab. 12 (1), 13(2024).
  32. Feaster, T. K., et al. Matrigel mattress. Cir Res. 117 (12), 995-1000 (2015).
  33. Huang, Z., Yu, P., Tang, J. Characterization of triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cell spheroid model. Onco Targets Ther. 13, 5395-5405 (2020).
  34. Nam, S., Khawar, I. A., Park, J. K., Chang, S., Kuh, H. -J. Cellular context-dependent interaction between cancer and stellate cells in hetero-type multicellular spheroids of pancreatic tumor. Biochem Biophys Res Commun. 515 (1), 183-189 (2019).
  35. Monteiro, M. V., Gaspar, V. M., Ferreira, L. P. Hydrogel 3D in vitro tumor models for screening cell aggregation mediated drug response. Biomater Sci. 8 (7), 1855-1864 (2020).

Herprints en machtigingen

Tags

3D-celkweekscaffold-vrije organoïdenco-kweek van stromale cellenborstkanker-modellentumor-micro-omgevingsferoïdevormingcelinvasie-assayfluorescente celmarkeringbasaalmembraan-extractepitheliale stromale interactie
Heteromulticellulaire stromale cellen in steigervrije 3D-culturen van epitheelkankercellen om invasie te stimuleren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.