Methodenartikel

Meting van mitochondriaal membraanpotentieel in vivo met behulp van een genetisch gecodeerde spanningsindicator

DOI:

10.3791/67911

⸱

21 februari 2025

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Systems Biology Laboratories, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, 2Department of Neurology, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, 3The Academy of Medical Sciences, Zhengzhou University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de toepassing van op mitochondriën gerichte genetisch gecodeerde spanningsindicatoren (GEVI's). Deze GEVI's bieden een aanzienlijk voordeel ten opzichte van traditionele mitochondriale membraanpotentiaalkleurstoffen door specifieke, in vivo en real-time monitoring van het mitochondriale membraanpotentieel mogelijk te maken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP, ΔΨm) is van cruciaal belang voor mitochondriale functies, waaronder ATP-synthese, ionentransport, generatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en de import van eiwitten die door de kern worden gecodeerd. Bestaande methoden voor het meten van ΔΨm maken doorgaans gebruik van lipofiele kationkleurstoffen, zoals Rhodamine 800 en tetramethylrhodamine methylester (TMRM), maar deze worden beperkt door een lage specificiteit en zijn niet goed geschikt voor in vivo toepassingen. Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een nieuw protocol ontwikkeld dat gebruikmaakt van genetisch gecodeerde spanningsindicatoren (GEVI's). Genetisch gecodeerde spanningsindicatoren (GEVI's), die fluorescerende signalen genereren als reactie op veranderingen in de membraanpotentiaal, hebben een aanzienlijk potentieel aangetoond voor het monitoren van plasmamembraan- en neuronale potentialen. Hun toepassing op mitochondriale membranen blijft echter onontgonnen. Hier ontwikkelden we op eiwitten gebaseerde mitochondriaal-gerichte GEVI's die in staat zijn om ΔΨm-fluctuaties in cellen en de motorische cortex van levende dieren te detecteren. De mitochondriale potentiaalindicator (MPI) biedt een niet-invasieve benadering om de dynamiek van ΔΨm in realtime te bestuderen en biedt een methode om de mitochondriale functie onder zowel normale als pathologische omstandigheden te onderzoeken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriën zijn essentiële organellen in eukaryote cellen, die dienen als de primaire energieleveranciers door de productie van adenosinetrifosfaat (ATP), terwijl ze ook een verscheidenheid aan andere cruciale functies vervullen, zoals metabolietsynthese, buffering van calciumionen, warmteproductie en regulering van celoverleving1. Hun rol is vooral van cruciaal belang in zeer metabolische weefsels zoals de hersenen en het hart, waar ze helpen de cellulaire homeostase te behouden. Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP, Ψm) staat centraal in deze processen, waaronder het aansturen van ATP-synthese via oxidatieve fosforylering, het vergemakkelijken van het transport van metabolieten en ionen door de mitochondriale membranen en het bijdragen aan de vorming van reactieve zuurstofsoorten (ROS)2,3. MMP beïnvloedt ook de mitochondriale morfologie en dynamiek4, waaronder mitofagie (de selectieve afbraak van mitochondriën)5en apoptose (geprogrammeerde celdood)6. Het handhaven van een geschikte Ψm is essentieel voor de cellulaire functie; De ontregeling is gekoppeld aan tal van pathologieën, waaronder neurodegeneratieve ziekten, hartfalen en kanker. De huidige methoden voor het meten van Ψm waren voornamelijk gebaseerd op het gebruik van lipofiele kationische kleurstoffen, waaronder TMRM (tetramethylrhodamine methylester), TMRE (tetramethylrhodamine ethylester), Rhodamine 123, Safranin O, Rhodamine 800, DiOC6, JC-1, enz.7. Deze fluorescerende moleculen hebben echter verschillende beperkingen. Deze kleurstoffen missen celspecificiteit, zijn vatbaar voor afschrikken en sommige zijn giftig. Bovendien kunnen ze in de loop van de tijd diffunderen, en wanneer mitochondriaal ΔΨ verloren gaat, lekken ze weg, waardoor ze niet in staat zijn om het membraanpotentieel van gedepolariseerde mitochondriën aan te geven. Bovendien zijn kleurstoffen op basis van rhodamine, zoals TMRM en TMRE, temperatuurgevoelig8, waardoor een zorgvuldige afweging van temperatuureffecten op de kleurstoffluorescentie nodig is, vooral bij het meten van de mitochondriale membraanspanning tijdens fysiologische activiteiten waarbij cellulaire thermogenese betrokken is.

Genetisch gecodeerde spanningsindicatoren (GEVI's), eiwitten die in staat zijn om membraanpotentiaalveranderingen te detecteren door middel van fluorescerende signalen 9,10, zijn naar voren gekomen als krachtige hulpmiddelen voor het monitoren van membraanpotentialen in verschillende cellulaire contexten11. Hoewel GEVI's op grote schaal zijn toegepast om plasmamembranen te bestuderen, is er weinig vooruitgang geboekt bij het aanpassen ervan om intracellulaire membraanpotentialen te meten, met name voor mitochondriën. Dit protocol probeert deze kloof te dichten door gebruik te maken van mitochondriaal gerichte GEVI's die het mitochondriale membraanpotentieel in vitro en in vivo kunnen monitoren. Door mitochondriale signaalsequentie toe te voegen aan de bestaande GEVI's, kan de juiste GEVI worden gericht op mitochondriën12. Deze mitochondriale potentiaalindicatoren (MPI) zouden nieuwe inzichten verschaffen in de mitochondriale fysiologie en een aanzienlijk potentieel bieden voor het onderzoeken van de mitochondriale functie in verschillende ziektetoestanden in vivo, waardoor we beter begrijpen hoe mitochondriale dynamiek bijdraagt aan zowel normale als pathologische cellulaire processen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierenverzorging en -experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Zhengzhou. Steriliseer alle chirurgische instrumenten voor gebruik. Volg aseptische technieken om infectie te voorkomen. Nadat alle gegevens waren verzameld, werden de dieren geëuthanaseerd met behulp van een overdosis inhalatie-anesthesie, gevolgd door onthoofding.

1. In-vitro-toepassingen

  1. Plasmide constructie
    1. Verkrijg de versnelde sensor van actiepotentialen 1 (ASAP1) en ASAP3-genen van Addgene of synthetiseren uit de sequentie. (ASAP1, NCBI-toetredings-ID: AHV90412.1, Addgene-ID: 52519; ASAP3, Addgene-ID: 132331).
    2. Gebruik de primers vermeld in tabel 1 voor plasmideconstructies.
    3. Gebruik voor expressie in cellen de EGFPN1-vector voor constructie.
      1. Synthetiseer in eerste instantie de cox8-gensequentie (NP_004065, aminozuren 1-29) met vier tandemherhalingen (4cox8) geflankeerd door NheI- en XhoI-restrictieplaatsen. Verwerk zowel het gesynthetiseerde 4cox8-fragment als de EGFPN1-vector met NheI en XhoI, gevolgd door ligatie om de 4cox8-EGFP-vector te genereren.
      2. Voer vervolgens PCR-amplificatie uit van de ASAP1-sequentie met primer 1 en primer 2. Verteer het ASAP1-fragment en de 4cox8-EGFP-vector met SalI en NotI, gevolgd door ligatie om de uiteindelijke MPI-1-vector te genereren (MPI staat voor mitochondriale potentiaalindicator).
        OPMERKING: De vectorkaart van CMV-MPI-1 is afgebeeld in figuur 1. De gedetailleerde volgorde is toegankelijk via NCBI (Accession ID: PQ678920).
    4. Voor specifieke expressie in neuronen voert u PCR-amplificatie uit van de hSyn-promotorsequentie van AAV-hSyn-EGFP-plasmide (NCBI-toetredings-ID: MH458079, Addgene ID: 50465) met behulp van primer 3 en primer 4.
      1. Verteer zowel de hSyn-sequentie als de 4cox8-EGFP-vector met AseI en NheI, gevolgd door ligatie om de hSyn-4cox8-EGFP-vector te genereren. Voer vervolgens PCR-amplificatie van de ASAP3-sequentie uit met primer 1 en primer 2.
      2. Verteer de hSyn-4cox8-EGFP-vector en de ASAP3-sequentie met SalI en NotI, gevolgd door ligatie om de hSyn-MPI-2-vector te genereren.
        OPMERKING: PCR-omstandigheden zijn afhankelijk van de specifieke enzymen en de smelttemperaturen van de primer (Tm). Een typische PCR-reactie omvat een eerste denaturatiestap bij 95 °C gedurende 30 s, gevolgd door 25-35 cycli van denaturatie (95 °C, 10 s), gloeien (55 °C, 30 s) en extensie (72 °C, 30 s/kb). Een laatste verlengstap bij 72 °C gedurende 5 minuten zorgt voor een volledige productsynthese, gevolgd door een houdfase bij 4 °C. De gloeitemperatuur moet ongeveer 5 °C onder de Tm van de primers liggen. Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor optimale PCR-parameters. De primers voor ASAP1 en ASAP3 zijn identiek.
  2. Beeldvorming in levende cellen
    1. Bereid DMEM-kweekmedium voor door 10% foetaal runderserum en 100 mg/L penicilline/streptomycine aan het medium toe te voegen.
    2. Bereid Ca2+ transfectiereagentia: 2,5 mol/L CaCl2, 2x HEBS (274 mmol/L NaCl, 10 mmol/L KCl, 1,4 mmol/L Na2HPO4, 15 mmol/L D-glucose, 42 mmol/L HEPES, pH 7,07).
    3. Bereid de buffer van Tyrode voor op het behoud van de cellen tijdens de beeldvorming (145 mmol/L NaCl, 3 mmol/L KCl, 10 mmol/L HEPES, 10 mmol/L glucose, pH 7,4).
    4. Kweek Hela-cellen in een kweekschaaltje van 35 mm gevoed met DMEM-kweekmedium in een incubator met een temperatuur van 37 °C en een atmosfeer van 5% CO2/95% lucht. Voeg 2-3 dekglaasjes per schaal toe zodat er cellen op kunnen groeien.
    5. Transfecteer de Hela-cellen via de calciumfosfaatprecipitatiemethode.
      1. Om cellen te transfecteren, begint u met het vervangen van het oude kweekmedium door 2 ml serumvrije DMEM. Bereid na 35 minuten de DNA/Ca2+- oplossing door 10 μg DNA, 4 μl CaCl2 en ddH2O in een microcentrifugebuisje te mengen tot een eindvolume van 40 μl.
      2. Voeg onder krachtig roeren druppelsgewijs 40 μL 2x HEBS toe aan de DNA/Ca2+ oplossing. Blaas lucht met een pipet in het mengsel om de neerslag van calciumfosfaat te vergemakkelijken.
      3. Voeg na 25 minuten 80 μL van deze neerslagoplossing toe aan de schaal met de cellen en breng het terug naar de broedmachine voor nog eens 1-2 uur. Verwijder vervolgens de niet-serum DMEM en spoel de cellen gedurende 2 minuten met 15% glycerol (opgelost in PBS).
      4. Voeg na het opzuigen van de glycerol 2 ml DMEM met 10% FBS toe en ga door met het kweken van de cellen gedurende 16-24 uur.
    6. Plaats dekglaasjes met cellen in een kweekschaaltje van 35 mm met 2 ml Tyrode's buffer en kleur de cellen met de kleurstof rhodamine 800 door 20 μmol/L rhodamine 800 (opgelost in ddH2O) aan het schaaltje toe te voegen tot een uiteindelijke concentratie van 50 nmol/L.
    7. Bereid een fluorescentiemicroscoop voor en stel deze in met de juiste filters en lichtbron om het eiwit te exciteren met een lichtbron van 488 nm en de emissie tussen 490-540 nm te verzamelen. Exciteer de rhodamine 800 kleurstof met een lichtbron van 633 nm en vang de emissie op tussen 650-720 nm.
    8. Bereid een carbonylcyanide m-chloorfenylhydrazonoplossing (CCCP) bij 500 μM (voorraad) en voeg tijdens de beeldvorming aan de cellen toe tot een eindconcentratie van 5 μM.
      OPMERKING: De pH van de 2x HECS-oplossing is cruciaal voor de efficiëntie van transfectie. De pH moet zorgvuldig worden aangepast aan 7,07 met vast natriumhydroxide. De pH mag niet lager zijn dan 7,01 of hoger dan 7,12.

figure-protocol-1
Figuur 1: Vectorkaart van CMV-MPI-1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. In vivo toepassingen

  1. Plasmide constructie
    1. Gebruik voor in vivo expressie het AAV-virus voor transductie. Zorg voor de expressing-backbone voor AAV-verpakkingen (Addgene ID: 46954 of 26968), die omgekeerde terminale herhalingen (ITR)-sequenties bevat voor AAV-virusverpakkingen.
    2. Voer PCR-amplificatie uit van de hSyn-MPI-2-vector (uit stap 1.1.4) met behulp van primers 5 en 7 in tabel 1.
    3. Voer een tweede PCR-amplificatie uit met behulp van dezelfde sjabloon en primers 6 en 8 in tabel 1.
    4. Voer een laatste PCR uit met het product van de eerste en de tweede PCR (stappen 2.1.2 en 2.1.3) als sjabloon en primers 5 en 8 in tabel 1, waarbij de uiteindelijke hSyn-MPI-2-sequentie wordt gegenereerd.
    5. Verwerk de hSyn-MPI-2-sequentie en de pAAV-backbone met MluI en EcoRI, gevolgd door ligatie om het uiteindelijke pAAV-hSyn-MPI-2-construct te genereren. De vectorkaart van pAAV-hSyn-MPI-2 wordt geïllustreerd in Figuur 2. De gedetailleerde volgorde is toegankelijk via NCBI (Accession ID: PQ678919).
      OPMERKING: De hSyn-MPI-2-vector bevat een interne EcoRI-site die afkomstig is van de oorspronkelijke EGFPN1-backbone, die wordt verwijderd met behulp van gemodificeerde primers in een overlappende PCR-strategie (stappen 2.1.2-2.1.4).
  2. Virusbereiding en -transductie
    1. Kweek HEK293t-cellen in een kweekschaal van 100 mm gevoed met 10% FBS DMEM-kweekmedium in een incubator met een temperatuur van 37 °C en een atmosfeer van 5% CO2/95% lucht om een samenvloeiing van 70% te bereiken.
    2. Co-transfecteren van de HEK293t-cellen met AAV-genplasmide, capside (pAAV-DJ of pAAV9) en helperplasmiden (pHelper) met behulp van de calciumfosfaatprecipitatiemethode. De DNA-hoeveelheid voor elk plasmide was als volgt: gen: 10 μg, pHelper: 11 μg, capside: 9 μg. De hoeveelheid transfectiereagens: 12 μL CaCl2, 120 μL 2x HEBS.
    3. Incubeer de getransfecteerde cellen gedurende een periode van 72 uur om de productie van virussen mogelijk te maken.
    4. Oogst de cellen na de incubatietijd door middel van een centrifuge bij 400 g. Spoel de cellen 2 keer met PBS en suspendeer de cel opnieuw in 400 μL PBS.
    5. Oogst virussen uit celsuspensie met vier cycli van vries-dooi-methoden (37 °C en -80 °C ). Centrifugeer het lysaat bij 13.500 g × g bij 4 °C en gooi de pellet weg. Het bovenstaande bevat het AAV-virus.
    6. Voer real-time PCR uit om de titratie van het bereide virus te bepalen. Een gedetailleerd protocol voor de bepaling van de AAV-titratie is te vinden op https://www.addgene.org/protocols/aav-titration-qpcr-using-sybr-green-technology/.
    7. Aliquot en bewaar het bereide AAV-virus bij -80 °C.
  3. Stereotactische virusinjectie
    1. Verdoof een volwassen C57/BL mannelijke muis met een gewicht van 24-26 g met 3% pentobarbitalnatrium via intraperitoneale injectie in een dosering van 30 mg/kg. Eenmaal verdoofd, fixeert u de muizen op een stereotactisch apparaat om tijdens de procedure een stabiele positie te behouden.
    2. Breng veterinaire oogzalf aan om de ogen te beschermen tegen lichte beschadiging en om de ogen vochtig te houden.
    3. Gebruik ontharingscrème om haar op het hoofd van de muis te verwijderen en de hoofdhuid bloot te leggen.
    4. Open de hoofdhuid met een operatieschaar en leg de schedel bloot. Behandel de schedel met 3% waterstofperoxide om belangrijke herkenningspunten zoals de bregma- en lambda-sites te steriliseren en te visualiseren.
    5. Pas de positie van het hoofd van de muis aan om ervoor te zorgen dat de schedel horizontaal staat.
    6. Gebruik een programmeerbare micropipettrekker om glazen pipetten in de gewenste vorm en grootte te trekken voor nauwkeurige injecties. Vul de glazen micropipet met paraffineolie.
    7. Plaats de micropipet op de doelplaats. In dit protocol is het doelwit het M2-gebied aan de rechterkant, met behulp van de volgende coördinaten: AP (anterieur-posterieur), +1,94 mm; ML (mediolateraal), +0,75 mm; DV (dorsoventraal), -1,5 mm.
    8. Gebruik een elektrische boor om een klein gaatje in de schedel te maken op de doellocatie.
    9. Streef naar 500 nL virus met een titer van 1,5 x 1011 genoomkopieën per milliliter (GC/ml) door de punt van de micropipet. Injecteer 500 nL virus in de doelplaats met behulp van een injectiepomp met een debiet van 100 nL/min.
    10. Laat de pipet na de injectie ongeveer 5 minuten op zijn plaats om diffusie mogelijk te maken voordat u deze voorzichtig terugtrekt.
    11. Implanteer optische vezel (200 μm diameter, 0,37 numerieke opening, 2 mm lengte) in de injectieplaats.
    12. Zet de glasvezel op zijn plaats met tandcement.
    13. Hecht de hoofdhuid van de muis vast met 5-0 nylon draad (esthetische naald Δ1/2 4x12) en breng hem terug naar zijn thuiskooi.
    14. Plaats de thuiskooi op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur van de muis op peil te houden totdat deze volledig herstelt van de anesthesie.
    15. Schakel het verwarmingskussen uit zodra het dier begint te bewegen. Laat nog 2 uur wennen aan de kamertemperatuur (RT) voordat u de muis naar de huisvesting brengt.
    16. Huismuis in een 12-uurs licht/12-uurs donkercyclus bij 22 °C met ad libitum toegang tot voedsel en water gedurende 2-3 weken om virale expressie mogelijk te maken.
  4. Vezel fotometrie
    1. Sluit de optische vezel die in de muis is geïmplanteerd aan op een optische kabel.
    2. Sluit het andere uiteinde van de optische kabel aan op een detector die zal worden gebruikt om de beeldgegevens vast te leggen.
    3. Gebruik voor beeldvorming een lichtbron om de eiwitten te exciteren met een golflengte van 488 nm. Stel de detector in om het uitgezonden licht te verzamelen op golflengten van 490 nm tot 540 nm.
    4. Pas de intensiteit van het excitatielicht aan om het signaal te optimaliseren zonder schade aan het hersenweefsel te veroorzaken.
    5. Wijzig de versterking van het fluorescerende signaal om ervoor te zorgen dat een duidelijk en sterk signaal door de detector wordt opgevangen.
    6. Om een snelle verbleking van de fluorescentie te voorkomen, wat de kwaliteit van de beeldvorming zou verminderen, moet u de lichtintensiteit en de versterking van het fluorescerende signaal indien nodig afstemmen.
    7. Voer een muisgedragstest uit.
    8. Bewaak het beeldvormingsproces continu tijdens de gedragstest.
  5. Gegevensanalyse
    1. Gebruik Python en GNUplot om een heatmap van experimentele proeven te maken voor een visuele weergave van de gegevens. De broncodes worden verstrekt in aanvullend bestand 1.

figure-protocol-2
Figuur 2: Vectorkaart van AAV-hSyn-MPI-2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na de bouw van het CMV-MPI-1-plasmide werd het vermogen om mitochondriën aan te pakken getest in Hela-cellen met behulp van de mitochondriale marker Rhodamine 800 voor kleuring. Collokalisatie-experimenten toonden een hoge mate van overlap aan tussen het fluorescentiesignaal van MPI-1 en het signaal van Rhodamine 800, wat aangeeft dat MPI-1 met succes was gelokaliseerd in de mitochondriën (Figuur 3).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De mitochondriale membraanspanning wordt onder rustomstandigheden op -120--180 mV gehouden en fluctueert met veranderingen in de metabolische toestand. Momenteel kan de meting van het mitochondriaal membraanpotentiaal worden uitgevoerd met behulp van elektrofysiologische methoden en fluorescentiekleurstofmethoden. Het afklemmen van mitochondriale pleisters vereist de isolatie van mitochondriën en de vernietiging van cellulaire structuren13. Deze aanpak kan leiden ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken de steun van de National Natural Science Foundation (NSF) van China: JSK (32071137 en 92054103) en financiering voor het wetenschappelijk onderzoeks- en innovatieteam van het eerste aangesloten ziekenhuis van de Universiteit van Zhengzhou: JSK (ZYCXTD2023014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BamHIThermoFD0054
Calcium chlorideSigmaC4901
CCCP SigmaC2759
Centrifugeeppendorf5430R
Centrifuge (cell culture)eppendorf5810R
CO2 cell incubatorESCO170L IR Sensor
CoverslipsGlaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co.KG92100100030
Dental adhensive resin cementSun medical company, LTD.Super-Bond C&B Kit
D-glucoseSigmaG7021
DNA Ligation Kit Ver. 2.1Takara6022
Dulbecco's modified Eagle mediumGibco11965092
Electric drill RWD Instruments78001
Fetal bovine serumGibcoA5670701
Fiber optic cannulaRWD InstrumentsR-FOC-L200C-39NA
Fiber photometry detectorThinkerQAXK_FPS-TC-MC-LED
Fluorescence microscope Olympus IX83
Glass pipette (for injection)Drummond Scientific company3.5" Drummond # 3-000-203-G/X
HEK293tATCCCat# CRL-3216
Hela cellsATCCCat# CCL-2
HEPESSigmaH3375
Injection pumpDrummond Scientific company3-000-207
IsofluraneRWD InstrumentsR510-22
Laser scanning confocal microscopeZeissLSM980
MluIThermoFD0564
NheIThermoFD0974
Optical fibersRWD InstrumentsR-FC-L-N3-200-L1
Paraffin oilSangonB500301
PCR thermal Cycleranalytik jenaBiometra Tone 96G
Pentobarbital sodiumSinopharm Chemical Reagent Co.LTD57-33-0
Potassium chlorideSigmaP5405
PrimeSTAR HS DNA PolymeraseTakaraR010A
Programmable micropipette pullerSutter InstrumentsP2000
Quick self-curing acrylic resin YamahachiV-PINK
Real-time PCR  thermal Cycleranalytik jenaqTOWER³ auto
Rhodamine 800Sigma83701
SalIThermoFD0644
Sodium chlorideSigmaS9888
Sodium phosphate dibasicSigmaS9763
Stereotaxic apparatusRWD InstrumentsE06354
Veterinary ophthalmic ointmentPuralubeNA
XhoIThermoFD0694

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vyas, S., Zaganjor, E., Haigis, M. C. Mitochondria and cancer. Cell. 166 (3), 555-566 (2016).
  2. Dzbek, J., Korzeniewski, B. Control over the contribution of the mitochondrial membrane potential (ΔΨ) and proton gradient (ΔpH) to the protonmotive force (Δp): IN SILICO STUDIES. J Biol Chem. 283 (48), 33232-33239 (2008).
  3. O'Rourke, B., Cortassa, S., Aon, M. A. Mitochondrial ion channels: Gatekeepers of life and death. Physiology. 20 (5), 303-315 (2005).
  4. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
  5. Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. J Cell Biol. 191 (5), 933-942 (2010).
  6. Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8 (2), 115-128 (2003).
  7. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
  8. Meng, X. -Y., et al. A sensitive mitochondrial thermometry 2.0 and the availability of thermogenic capacity of brown adipocyte. Front Physiol. 13, 977431(2022).
  9. Kaestner, L., et al. Genetically encoded voltage indicators in circulation research. Int J Mol Sci. 16 (9), 21626-21642 (2015).
  10. Yang, H. H., St-Pierre, F. Genetically encoded voltage indicators: Opportunities and challenges. J Neurosci. 36 (39), 9977(2016).
  11. Sepehri Rad, M., Cohen, L. B., Braubach, O., Baker, B. J. Monitoring voltage fluctuations of intracellular membranes. Sci Rep. 8 (1), 6911(2018).
  12. Yang, R. -Z., Wang, D. -D., Li, S. -M., Liu, P. -P., Kang, J. -S. Development and application of a mitochondrial genetically encoded voltage indicator in narcosis. Neurosci Bull. 40 (10), 1529-1544 (2024).
  13. Kumari, A., Nguyen, D. M., Garg, V. Patch-clamp technique to study mitochondrial membrane biophysics. J Gen Physiol. 155 (8), e202313347(2023).
  14. Bayne, A. N., Dong, J., Amiri, S., Farhan, S. M. K., Trempe, J. -F. MTSviewer: A database to visualize mitochondrial targeting sequences, cleavage sites, and mutations on protein structures. PLoS One. 18 (4), e0284541(2023).
  15. Kim, B. B., et al. A red fluorescent protein with improved monomericity enables ratiometric voltage imaging with ASAP3. Sci Rep. 12 (1), 3678(2022).
  16. Evans, S. W., et al. A positively tuned voltage indicator for extended electrical recordings in the brain. Nat Methods. 20 (7), 1104-1113 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mitochondri le potentiaalindicatorin vivo metingmitochondri le functiemembraanpotentiaaldynamiekfluorescente voltagesensoreiwitgebaseerde voltage indicatormitochondri le targetingreal time monitoring
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen