Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Biofilmtest voor Clostridioides difficile met toepassingen voor het ontdekken van geneesmiddelen

988 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67913

⸱

8 juli 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology and The South Texas Center for Emerging Infectious Diseases (STCEID), The University of Texas at San Antonio

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Biofilms van de bacteriële ziekteverwekker Clostridioides difficile en hun betekenis bij ziekten worden niet goed begrepen. Recente bevindingen hebben een rol bij recidief gesuggereerd, wat het belang ervan onderstreept. Hier beschrijven we de aanpassing van een biofilmtest gekoppeld aan een metabole uitlezing met toepassingen voor het ontdekken van geneesmiddelen tegen biofilms.

Samenvatting

Clostridioides difficile is een gastro-intestinale bacteriële ziekteverwekker die in staat is om te profiteren van een dysbiotische microbiota-omgeving om zich te vermenigvuldigen, gifstoffen af te scheiden en het darmepitheel te beschadigen. Een subgroep van patiënten met C. difficile-infectie (CDI) zal te maken krijgen met antibiotica (15%-30%) of fecale microbiota-transplantatie (FMT) (<10%) behandelingsfalen. Daarom is de ontwikkeling van aanvullende therapeutische interventies van cruciaal belang. De rol van C. difficile biofilms bij recidief is onduidelijk. Biofilms in andere organismen zijn echter verantwoordelijk voor chronische en recidiverende ziekte, wat suggereert dat dit ook het geval zou kunnen zijn bij recidiverende CDI. Onze hypothese is dat biofilms van C. difficile een waardevol therapeutisch doelwit vormen. Het doel van het hier gepresenteerde protocol is het aanpassen van een biofilmvormingstest voor de identificatie van herpositioneerbare verbindingen met activiteit tegen gevestigde C. difficile-biofilms . Het protocol verfijnt een robuuste en reproduceerbare test voor het vormen van biofilms, koppelt deze aan een metabole test en past deze toe op het ontdekken van geneesmiddelen. Dit protocol schetst de biofilmvormingstest, uitlezingen van biomassa en metabole activiteit, gevoeligheidstesten voor geneesmiddelen, geneesmiddelscreening van een herpositioneringsbibliotheek en representatieve resultaten.

Inleiding

Clostridioides difficile is een sporenvormende, anaërobe bacteriële ziekteverwekker die in staat is ernstige schade toe te brengen aan het menselijke maagdarmkanaal (GI) door toxines te produceren. C. difficile is verantwoordelijk voor bijna een half miljoen gevallen per jaar, met ~30.000 dodelijke slachtoffers (CDC, 2015). De behandeling van C. difficile-infectie (CDI) brengt aanzienlijke kosten met zich mee voor het toch al overbelaste gezondheidszorgsysteem (~ $ 4.8 miljard)1,2,3. Personen die het meeste risico lopen, zijn mensen met immunosuppressie, blootstelling aan antibiotica en/of ouderen, alle populaties die zowel in de VS als over de hele wereld aanzienlijk blijven groeien 4,5,6,7.

C. difficile is sterk afhankelijk van de status van de gastro-intestinale microbiota van de gastheer, en als zodanig is behandeling met antibiotica een belangrijke predisponerende factor voor CDI. De identificatie van antibioticaresistente klinische isolaten van C. difficile bemoeilijkt de behandeling verder 8,9,10. Bovendien zal tussen de 15% en 30% van de patiënten die met antibiotica voor CDI worden behandeld, de eerste behandeling mislukken 5,11,12,13,14,15,16. Zodra een patiënt een recidiefepisode ervaart, neemt de kans op recidiefepisodes toe tot 45%-64% (recidiefroltrap) en gaat dit gepaard met een verhoogd risico op verder falen van de behandeling 16,17. Belangrijk is dat de meeste gevallen van terugval van CDI worden veroorzaakt door de oorspronkelijke stam die de eerste infectie-episode in de gastheer tot stand bracht18,19, wat suggereert dat de kolonisatie door C. difficile wordt voortgezet, zelfs na succesvolle behandeling. Hoewel is aangetoond dat sporen in het maagdarmkanaal blijven bestaan en tot terugval leiden in ex vivo- en muizenmodellen20, zijn C. difficile-biofilms en hun rol bij ziekte en terugval onderbelicht. Biofilms zijn microbiële gemeenschappen die worden beschermd door een zelf geproduceerde extracellulaire matrix, een eigenschap die ze zeer recalcitrant maakt voor milieubeledigingen zoals antibioticabehandeling en immuunresponsen21. Verder is biofilmvorming een significante virulentiefactor 22,23,24,25 en bij bacteriële infecties, zoals die veroorzaakt door Staphylococcus aureus en Pseudomonas aeruginosa, zijn biofilms de sleutel tot recidief en chronische manifestaties26,27. Onlangs zijn C. difficile-biofilms gesuggereerd als een reservoir voor terugkerende infecties 28,29,30 en vormen daarom een hoogwaardig doelwit voor de behandeling en/of preventie van CDI-recidief.

Huidige modellen om C. difficile-biofilms te bestuderen zijn onder meer koloniebiofilmmodellen31,32, microfermentoren33, chemostaat-darmmodellen34,35 en vloeibare kweeksystemen met behulp van kolven of putplaten36,37. Al deze modellen hebben belangrijke informatie opgeleverd over C. difficile-biofilms in verschillende stadia van ontwikkeling en in verschillende omgevingen. Sommige van deze modellen (d.w.z. microfermentoren, chemostaan-darmmodellen, koloniebiofilms) zijn echter niet geschikt voor het ontdekken van geneesmiddelen. Tot op heden hebben de meeste onderzoeken naar het ontdekken van geneesmiddelen zich gericht op de planktonische levensstijl van C. difficile 38,39,40,41. Daarom heeft het hier beschreven protocol tot doel het bestaande biofilmmodel met 96 putjes aan te passen, te standaardiseren en te valideren met als doel een platform te ontwikkelen voor het screenen van bibliotheken om herpositioneerbare moleculen te identificeren met het vermogen om gevestigde (24 uur oude) C. difficile-biofilms te doden. Validatie van het protocol werd uitgevoerd door de mogelijkheden voor biofilmvorming te vergelijken tussen een in het laboratorium aangepaste stam (630 Δerm) en een epidemisch klinisch isolaat (UK1-stam geïsoleerd tijdens een uitbraak in 2006 in het Stoke-Mandeville Hospital in het Verenigd Koninkrijk42). De vorming van biofilm werd gekwantificeerd met behulp van de klassieke kristalviolette test om biomassa te meten en een metabole test om de levensvatbaarheid van de biofilms te meten. Er werden significante verschillen in biofilmvormingsvermogen tussen de stammen geïdentificeerd, wat wijst op mogelijke klinische implicaties. Verder werd de test gebruikt om antibioticagevoeligheidsprofielen van gevestigde biofilms te bepalen. Ten slotte werd als proof of concept de Global Health Priority-box van Medicines for Malaria Venture (MMV), een non-profitorganisatie die zich richt op het ontdekken van nieuwe therapieën tegen verwaarloosde ziekten zoals malaria, gescreend om verbindingen met activiteit te identificeren tegen gevestigde biofilms van C. difficile. Het hier beschreven protocol past een klassieke biofilmtest aan en valideert deze voor gebruik als screeningplatform voor geneesmiddelen gericht op rijpe biofilms.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Cellen voorbereiden op de biofilmtest

LET OP: Clostridioides difficile is een menselijke ziekteverwekker en vereist BSL-2-inperking.

OPMERKING: Sporen die voor deze studie werden gebruikt, werden verkregen van Dr. Carol Kumamoto aan de Tufts University School of Medicine. C. difficile sporenvoorraden werden geprepareerd zoals eerder beschreven 43,44,45. Sporen worden vervolgens in volumes van 10 μl in PCR-buisjes verdeeld om platen uit te strepen. Alle media en fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) die voor het experiment nodig zijn, moeten 24 uur voor gebruik in de anaërobe kamer worden voorgereduceerd. Dit wordt bereikt door de dop van de fles met de media of PBS in de kamer los te maken.

  1. Verklein vooraf een agarplaat voor hersenhartinfusie aangevuld met 0,1% (m/v) taurocholaat en 0,1% (m/v) L-cysteïne (BHIS) in de anaërobe kamer, bij voorkeur een nacht of gedurende ten minste 3 uur om volledige reductie mogelijk te maken. Stel de temperatuur van de anaërobe kamer in op 37 °C.
  2. Verwarm het PCR-buisje met 10 μl sporen gedurende 20 minuten bij 70 °C. Dit kan in een waterbad of thermocycler.
  3. Breng sporen in de anaërobe kamer, meng door voorzichtig 5x-6x te pipetteren en pipetteer 10 μL op de voorgereduceerde BHIS-plaat. Voer een reeks van vier kwadranten uit zoals eerder beschreven46 en incubeer de plaat een nacht bij 37 °C (temperatuur van de anaërobe kamer).
  4. Na 24 uur groei zouden geïsoleerde kolonies zichtbaar moeten zijn. Selecteer een enkele kolonie en breng deze met behulp van een wegwerplus over in een tube met 10 ml BHIS-vloeistof. Incubeer een nacht (14-18 uur).
  5. Bepaal de celdichtheid door de nachtcultuur in de kamer serieel te verdunnen.
    1. Voer 10-voudige verdunningen van de nachtcultuur uit. De verdunning 103 levert een telbaar monster op voor elk van de stammen die in dit protocol worden gebruikt. Standaardisatie van deze stap kan echter nodig zijn voor klinische isolaten met groeiverschillen.
    2. Breng de buisjes uit de anaërobe kamer, plaats 10 μL van elk monster in een hemocytometer en tel met een helderveldmicroscoop zoals beschreven door de fabrikant van de hemocytometer.
    3. Volg de instructies van de fabrikant om de celconcentratie na het tellen te bepalen.

2. Vorming van biofilm

OPMERKING: Hoewel dit protocol kan worden aangepast aan verschillende putgroottes, is het geoptimaliseerd voor het 96-well-platform. Als de grootte van de put wordt gewijzigd, moet de celconcentratie worden aangepast op basis van het oppervlak van de put.

  1. Na het bepalen van de celconcentratie uit de nachtcultuur, pas de celconcentratie aan op 1 x 107 cellen/ml in BHIS (aangevuld met 10% (w/v) L-cysteïne en 0,1M glucose).
    OPMERKING: Van de glucosesuppletie van 0,1 miljoen is eerder aangetoond dat het de vorming van biofilm verhoogt door de C. difficile 630 Δerm stam47. Voor dit protocol werd de concentratie van 1 x 107 cellen/ml geselecteerd na het testen van verschillende startconcentraties (Figuur 1). Robuuste biofilmvorming kan nog steeds worden bereikt zonder glucosesuppletie.
  2. Doseer 100 μL cellen in de putjes van een microtiterplaat met 96 putjes (platte bodem en weefselkweek behandeld), laat controlekolommen (alleen cellen) en lege (alleen media) kolommen achter. Incubeer gedurende 24 uur in de anaërobe kamer (37 °C).
    1. Als de verdamping van media een probleem wordt, plaats dan biofilmplaten uit de buurt van een verwarmingseenheid. U kunt ook biofilms in een extra container plaatsen of afdekken met doorlaatbare plaatmembranen met 96 putjes.
  3. Verwijder voorzichtig het medium uit alle putjes, te beginnen met de blanco. Hierdoor worden niet-aanhangende cellen verwijderd en blijft er een biofilm achter. Deze stap is cruciaal omdat alleen cellen in de biofilm van belang zijn.
  4. Was de biofilms 2x voorzichtig met 200 μL voorgereduceerd PBS. Om deze wasbeurt voorzichtig uit te voeren, kantelt u de plaat met 96 putjes iets, steekt u de pipetpunten tegen de wand van de put, schuift u de tips dicht bij de bodem van de put zonder de bodem te schrapen en zuigt u langzaam aan. Als PBS onderaan achterblijft, herhaalt u het proces opnieuw. In dit stadium kunnen niet-aanhangende cellen worden verwijderd, en dat is normaal. Verwijder de PBS voordat u de plaat uit de anaërobe kamer haalt.
  5. Gebruik nu biofilms voor: Biomassametingen (zie stap 3); metingen van de metabole activiteit (zie stap 4); testtests voor vatbaarheid voor geneesmiddelen en screening op geneesmiddelen (zie stap 5).
    OPMERKING: Dit protocol is gevalideerd voor de in het laboratorium aangepaste 630 Δerm-stam en de epidemische UK1-stam. Verschillende klinische isolaten en stammen kunnen zwakke biofilmvormende eigenschappen vertonen. Om verstoring van de biofilm tot een minimum te beperken, wast u 1x in plaats van 2x met PBS en verlaagt u het wasvolume tot 100 μl.

3. Meting van biofilmbiomassa met behulp van de kristalviolette test

OPMERKING: De kleuring van kristalviolet was gebaseerd op een eerder beschreven protocol48.

  1. Na het wassen van de biofilms in de anaërobe kamer (zie stap 2.4), verwijdert u de plaat en brengt u deze over naar een chemische zuurkast.
  2. Om de biofilms te fixeren, voegt u voorzichtig 150 μL methanol toe aan elk putje. Dek het bord met het deksel 10 minuten af.
  3. Verwijder methanol en laat de putjes volledig drogen terwijl het deksel is verwijderd. Dit duurt tussen de 30 minuten en 45 minuten.
  4. Voeg 100 μL 0,3% Crystal violet toe aan alle putjes en bevlek gedurende 10 min. Verwijder Crystal violet voorzichtig om vlekken op de rand en wanden van de put te voorkomen, aangezien dit de uitlezing kan beïnvloeden.
  5. Laat het bord drogen en verwijder het deksel. Dit duurt tussen de 30 minuten en 45 minuten.
  6. Was de putjes 3x met 200 μL gedestilleerd water en laat de plaat volledig drogen. Dit duurt 30 tot 45 minuten.
  7. Eenmaal droog, gebruik een helderveldmicroscoop om de biofilms in beeld te brengen (Figuur 2A). Hoewel deze stap optioneel is, maakt het een grondigere observatie van de cellen in de biofilm mogelijk.
    1. Plaats de plaat met 96 putjes op een omgekeerde helderveldmicroscoop met een plaatadapter. Identificeer representatieve putjes voor elke geteste stam.
    2. Maak foto's voor elke put met de gewenste vergroting. De beelden die in dit protocol worden gepresenteerd, zijn gemaakt met een vergroting van 40x.
  8. Zodra de gewenste beelden zijn verkregen, brengt u de plaat terug naar een chemische zuurkast om deze te verwijderen.
  9. Om de biofilm te ontkleuren, voegt u 150 μL 33% azijnzuur toe en plaatst u dit gedurende 10 minuten op een shaker op gemiddelde snelheid.
  10. Verwijder 90 μL uit elk putje en breng over naar een nieuwe plaat met 96 putjes met platte bodem. Afleesinterginctie bij 595 nm met behulp van een plaatlezer (Figuur 2B).

4. Meting van de levensvatbaarheid van de biofilm met behulp van de metabolische kleurstof PrestoBlue

  1. Voer de meting van de metabolische activiteit uit volgens het protocol van de fabrikant voor de test met belangrijke wijzigingen. Verwarm het plaatleesapparaat voor op 37 °C voordat u de biofilms voor de test voorbereidt. Een plaatlezer die fluorescentie kan meten, wordt aanbevolen.
    OPMERKING: Als alternatief kan de metabolische activiteit worden afgelezen bij OD600; We hebben echter niet gemerkt dat die benadering gevoelig genoeg is voor deze testen. Het wordt aanbevolen dat gebruikers het protocol van de fabrikant bekijken en indien nodig standaardiseren.
  2. Na het wassen van de biofilms met PBS in de anaërobe kamer zoals hierboven beschreven (zie stap 2.4), verwijdert u de plaat uit de kamer.
  3. Verwijder samen met de plaat 9 ml voorgereduceerde BHIS (aangevuld met 10% (w/v) L-cysteïne en 0,1 M glucose).
  4. Voeg snel 1 ml PrestoBlue-reagens toe aan 9 ml voorgereduceerde BHIS en vortex. Reduceer het reagens niet vooraf, omdat dit de kleuring van het reagens kan beïnvloeden (zie discussie).
  5. Voeg 100 μL BHIS-PrestoBlue-mengsel toe aan elk putje. Plaats de plaat in een plaatlezer met de volgende instellingen: Temperatuur bij 37 °C, testtype als Kinetic; leestijd als 30 min; leesfrequentie om de 2 min; Fluorescentie-intensiteit afhankelijk van het type plaatlezer dat beschikbaar is. De metingen die in dit protocol worden beschreven, zijn uitgevoerd met behulp van excitatie-/emissiegolflengten van respectievelijk 560 nm / 590 nm.
  6. Gooi na het lezen de borden weg.
  7. Zodra fluorescentiewaarden zijn verkregen uit de plaatuitlezingen, gebruikt u lege putjes (alleen media) om de ruis van alle monsterputjes af te trekken. Hierna verdeel je de met elke verbinding behandelde biofilmputjes door de controleputjes die een onbehandelde (100%) biofilm bevatten om metabolische activiteit te verkrijgen.

5. Toevoeging van medicijnen aan biofilms

OPMERKING: De hieronder beschreven opstelling kan worden aangepast voor gevoeligheidstesten voor geneesmiddelen en screening van geneesmiddelen met een vaste concentratie. Voor beide hieronder beschreven methoden wordt de PrestoBlue-test aanbevolen.

  1. Bepaling van minimale remmende concentraties (MIC) van verschillende antibiotica
    OPMERKING: Biofilms worden gedurende een periode van 48 uur behandeld, waardoor de kans op besmetting toeneemt. Het is van groot belang om lege putten eerst te verwerken en aseptische procedures te volgen. MIC-waarden die in de literatuur worden gerapporteerd voor andere C. difficile-stammen en testdosis-responsassays werden gebruikt om de startantibioticaconcentraties te informeren voor de MIC-assays die in dit protocol worden gepresenteerd. Deze benadering zal nuttig zijn voor het bepalen van startende antibioticaconcentraties bij het werken met klinische isolaten.
    1. Was de rijpe (24 uur oude) biofilms met PBS in de anaërobe kamer zoals hierboven beschreven (zie stap 2.4).
    2. Voeg 200 μL voorgereduceerde BHIS (aangevuld met 10% (m/v) L-cysteïne en 0,1M glucose) media met tweevoudige verdunningen van het testantibioticum toe aan elk putje, behalve de controle- (alleen cellen) en lege (alleen media) kolommen in de plaat.
    3. Incubeer nog eens 24 uur. In deze studie werden vancomycine (startconcentratie van 200 μg/ml), metronidazol (startconcentratie van 16 μg/ml) en fidaxomicine (startconcentratie van 4 μg/ml) gebruikt om de test te valideren. MIC-waarden worden gerapporteerd in tabel 1.
    4. Om uitdroging van de platen te voorkomen, uit de buurt van de verwarmingseenheid in de anaerobe kamer houden of een gasdoorlatend membraan gebruiken.
      OPMERKING: Als alternatief kan een voorgereduceerde PBS- of mediagracht (300 μL) worden gebruikt op de buitenste putten van de plaat.
    5. Na 24 uur incubatie met de medicijnen, verwijdert u de media en wast u de biofilms voorzichtig 1x met PBS. Verwerk biofilms met behulp van de Crystal violet-assay of de PrestoBlue-assay.
  2. Screening van drugsbibliotheken
    1. Was de rijpe (24 uur oude) biofilms met PBS in de anaërobe kamer zoals hierboven beschreven (zie stap 2.4).
    2. Voeg 200 μL media met een vaste concentratie van geneesmiddelbibliotheekverbindingen toe aan elk putje, behalve de controlekolommen (cellen in media zonder antibiotica) en lege (media zonder antibiotica) in de plaat. Incubeer nog eens 24 uur. Om uitdroging van de platen te voorkomen, houdt u deze uit de buurt van de verwarmingseenheid in de anaerobe kamer.
    3. Na 24 uur incubatie met de medicijnen, verwijdert u de media en wast u de biofilms voorzichtig 1x met PBS. Verwerk biofilms met behulp van de Crystal violet-assay of de metabole assay.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het doel van het hierboven beschreven protocol is het aanpassen en valideren van het biofilmvormingsmodel met 96 putjes als een screeningsplatform voor geneesmiddelen voor de identificatie van herpositioneerbare verbindingen met activiteit tegen gevestigde biofilms van C. difficile. De impact van verschillende celdichtheden (10,4, 10,5, 10,6 en 10,7 cellen/ml) op de vorming van biofilm werd bepaald, en ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De vorming van biofilm C. difficile en de rol die het speelt bij ziekten zijn niet goed begrepen. Recente bevindingen suggereren een rol voor biofilms bij terugval van ziekten 28,34. Biofilmvorming is een significante virulentiefactor 22,23,24,25 en bij bacteriële infecties, zoals die veroorzaakt door Staphylococcus aureus en Pseudomonas aeruginosa, zijn biofilms de sl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

J.A.R. ontwierp de studie en het protocol en schreef het manuscript. A.S. en P.Z. voerden de experimenten uit en hielpen bij het verfijnen van het protocol. Dit werk werd ondersteund door startfondsen van de Universiteit van Texas in San Antonio (UTSA) tot J.A.R., en A.S. werd ondersteund door het UTSA MARC-programma (T34GM145507). De auteurs willen Medicines for Malaria Venture (MMV, Zwitserland) bedanken voor het verstrekken van de Global Health Priority Box-bibliotheek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AZijnzuur SAF-CT ACS 500MLFisher ScientificA38S500
AGAR BACTERIOLOGISCH GR 1KGFisher ScientificAC443570010
BioTek Synergy H1 plate readerFisher ScientificBTH1MG
FLACON GISTEXTRACHT 500GFisher ScientificDF0127179
HERSENHART INFUSIEBROODJEFisher ScientificCM1135R
Kristal Violet USP graad 100GVWR97061-850Voor het kleuren van biofilms voor biomassa-analyses
CytoOne 96-well TC-plaat, platte bodem, helder, individueel verpakt met deksels, 50/doosUSA ScientificCC7682-7596
D-(+)-Glucose, watervrijFisher Scientific50712744
Dimethylsulfoxide voor moleculaire biologie (DMSO)Millipore SigmaD8418-250ML
FIDAXOMICINE 250MGFisher ScientificAC468312500
L-CYSTEINE 98+% 1KGFisher ScientificAAA104350BVoor C. difficile media
METHANOL 99,8 ACROSEAL 1LTFisher ScientificAC364390010
METRONIDAZOL, 99% 5GRFisher ScientificAC210340050
Fosfaat bufferoplossing (PBS) 10XFisher ScientificBP3991
PrestoBlue Cel Levensvatbaarheid ReagensFisher ScientificA13262
SILVERSEAL OPAQUE ADHES 100/CSFisher Scientific7000379Wordt gebruikt om moeder- en dochtergeneesmiddelenplaten te verzegelen voor opslag
NATRIUM TAUROCHOLAT 100MGVWR100291-598
VANCOMYCINFisher ScientificBP29581

Referenties

  1. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S88-S92 (2012).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
  3. Sheitoyan-Pesant, C., et al. Clinical and healthcare burden of multiple recurrences of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 62 (5), 574-580 (2016).
  4. Abou Chakra, C. N., Pepin, J., Sirard, S., Valiquette, L. Risk factors for recurrence, complications and mortality in Clostridium difficile infection: A systematic review. PLoS One. 9 (6), e98400(2014).
  5. Aslam, S., Hamill, R. J., Musher, D. M. Treatment of Clostridium difficile-associated disease: Old therapies and new strategies. Lancet Infect Dis. 5 (9), 549-557 (2005).
  6. Brown, K. A., Khanafer, N., Daneman, N., Fisman, D. N. Meta-analysis of antibiotics and the risk of community-associated Clostridium difficile infection. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2326-2332 (2013).
  7. Dicks, L. M. T., Mikkelsen, L. S., Brandsborg, E., Marcotte, H. Clostridium difficile, the difficult "kloster" fuelled by antibiotics. Curr Microbiol. 76 (6), 774-782 (2019).
  8. Sholeh, M., et al. Antimicrobial resistance in Clostridioides (Clostridium) difficile derived from humans: A systematic review and meta-analysis. Antimicrob Resist Infect Control. 9 (1), 158(2020).
  9. Peng, Z., et al. Update on antimicrobial resistance in Clostridium difficile: Resistance mechanisms and antimicrobial susceptibility testing. J Clin Microbiol. 55 (7), 1998-2008 (2017).
  10. Dilnessa, T., Getaneh, A., Hailu, W., Moges, F., Gelaw, B. Prevalence and antimicrobial resistance pattern of Clostridium difficile among hospitalized diarrheal patients: A systematic review and meta-analysis. PLoS One. 17 (1), e0262597(2022).
  11. Hopkins, R. J., Wilson, R. B. Treatment of recurrent Clostridium difficile colitis: A narrative review. Gastroenterol Rep (Oxf). 6 (1), 21-28 (2018).
  12. Bartlett, J. G. Treatment of antibiotic-associated pseudomembranous colitis. Rev Infect Dis. 6 (Suppl 1), S235-S241 (1984).
  13. Merino, E., Salavert, M. Treatment of Clostridioides difficile infection: From guidelines to clinical practice. Rev Esp Quimioter. 35 (Suppl 3), 97-101 (2022).
  14. Pepin, J., et al. Increasing risk of relapse after treatment of Clostridium difficile colitis in Quebec, Canada. Clin Infect Dis. 40 (11), 1591-1597 (2005).
  15. Cornely, O. A., Miller, M. A., Louie, T. J., Crook, D. W., Gorbach, S. L. Treatment of first recurrence of Clostridium difficile infection: Fidaxomicin versus vancomycin. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S154-S161 (2012).
  16. Mcfarland, L. V., Elmer, G. W., Surawicz, C. M. Breaking the cycle: Treatment strategies for 163 cases of recurrent Clostridium difficile disease. Am J Gastroenterol. 97 (7), 1769-1775 (2002).
  17. Mcfarland, L. V., et al. A randomized placebo-controlled trial of Saccharomyces boulardii in combination with standard antibiotics for Clostridium difficile disease. JAMA. 271 (24), 1913-1918 (1994).
  18. Kamboj, M., et al. Relapse versus reinfection: Surveillance of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 53 (10), 1003-1006 (2011).
  19. Figueroa, I., et al. Relapse versus reinfection: Recurrent Clostridium difficile infection following treatment with fidaxomicin or vancomycin. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S104-S109 (2012).
  20. Castro-Cordova, P., et al. Entry of spores into intestinal epithelial cells contributes to recurrence of Clostridioides difficile infection (vol 12, 1140, 2021). Nat Commu. 13 (1), 2456(2021).
  21. Orazi, G., O'toole, G. A. "It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00619 (2019).
  22. Costerton, J. W., et al. Bacterial biofilms in nature and disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
  23. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
  24. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  25. Donlan, R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  26. Scherr, T. D., Heim, C. E., Morrison, J. M., Kielian, T. Hiding in plain sight: Interplay between Staphylococcal biofilms and host immunity. Front Immunol. 5, 37(2014).
  27. Thomsen, K., et al. Animal models of chronic and recurrent Pseudomonas aeruginosa lung infection: Significance of macrolide treatment. Apmis. 130 (7), 458-476 (2022).
  28. Normington, C., et al. Biofilms harbour Clostridioides difficile, serving as a reservoir for recurrent infection. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 16(2021).
  29. Frost, L. R., Cheng, J. K. J., Unnikrishnan, M. Clostridioides difficile biofilms: A mechanism of persistence in the gut. PLoS Pathog. 17 (3), e1009348(2021).
  30. Meza-Torres, J., Auria, E., Dupuy, B., Tremblay, Y. D. N. Wolf in sheep's clothing: Clostridioides difficile biofilm as a reservoir for recurrent infections. Microorganisms. 9 (9), 1922(2021).
  31. James, G. A., et al. Analysis of Clostridium difficile biofilms: Imaging and antimicrobial treatment. J Antimicrob Chemother. 73 (1), 102-108 (2018).
  32. Brauer, M., et al. What's a biofilm?-how the choice of the biofilm model impacts the protein inventory of Clostridioides difficile. Front Microbiol. 12, 682111(2021).
  33. Poquet, I., et al. Clostridium difficile biofilm: Remodeling metabolism and cell surface to build a sparse and heterogeneously aggregated architecture. Front Microbiol. 9, 2084(2018).
  34. Crowther, G. S., et al. Comparison of planktonic and biofilm-associated communities of Clostridium difficile and indigenous gut microbiota in a triple-stage chemostat gut model. J Antimicrob Chemother. 69 (8), 2137-2147 (2014).
  35. Crowther, G. S., et al. Development and validation of a chemostat gut model to study both planktonic and biofilm modes of growth of Clostridium difficile and human microbiota. PLoS One. 9 (2), e88396(2014).
  36. Dawson, L. F., Valiente, E., Faulds-Pain, A., Donahue, E. H., Wren, B. W. Characterisation of Clostridium difficile biofilm formation, a role for spo0a. PLoS One. 7 (12), e50527(2012).
  37. Dubois, T., et al. A microbiota-generated bile salt induces biofilm formation in Clostridium difficile. NPJ Biofilms Microbiomes. 5 (1), 14(2019).
  38. Abdelkhalek, A., Mohammad, H., Mayhoub, A. S., Seleem, M. N. Screening for potent and selective anticlostridial leads among fda-approved drugs. J Antibiot (Tokyo). 73 (6), 392-409 (2020).
  39. Chen, J., Lu, Y., Du, Y., Wang, H., Wu, Q. Recent development of small-molecular inhibitors against Clostridioides difficile infection. Bioorg Chem. 125, 105843(2022).
  40. Katzianer, D. S., Yano, T., Rubin, H., Zhu, J. A high-throughput small-molecule screen to identify a novel chemical inhibitor of Clostridium difficile. Int J Antimicrob Agents. 44 (1), 69-73 (2014).
  41. Pal, R., Dai, M., Seleem, M. N. High-throughput screening identifies a novel natural product-inspired scaffold capable of inhibiting Clostridioides difficile in vitro. Sci Rep. 11 (1), 10913(2021).
  42. Sun, X., et al. Mouse relapse model of Clostridium difficile infection. Infect Immun. 79 (7), 2856-2864 (2011).
  43. Edwards, A. N., Mcbride, S. M. Isolating and purifying Clostridium difficile spores. Methods Mol Biol. 1476, 117-128 (2016).
  44. Romo, J. A., Kumamoto, C. A. Characterization of the effects of Candida gastrointestinal colonization on Clostridioides difficile infection in a murine model. Methods Mol Biol. 2542, 271-285 (2022).
  45. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. Chapter 9 (Unit9A), 1(2009).
  46. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Plating methods. J Vis Exp. (63), e3064(2012).
  47. Dapa, T., Unnikrishnan, M. Biofilm formation by Clostridium difficile. Gut Microbes. 4 (5), 397-402 (2013).
  48. O'toole, G. A. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis Exp. (47), e2437(2011).
  49. Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J Bacteriol. 195 (3), 545-555 (2013).
  50. Morais, M., et al. Comparative biofilm-forming ability between Clostridioides difficile strains isolated in Latin America and the epidemic nap1/027 strain. Front Cell Infect Microbiol. 12, 1033698(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Biofilmvormingmetabolische assaygenevatbaarheid voor geneesmiddelenbiomassa-uitlezingscreening van geneesmiddelenrecidiverende infectietherapeutisch doelwit

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.