Methodenartikel

Detectie van mitochondriën-geassocieerde endoplasmatische reticulummembraanstrakheid met behulp van induceerbare SET-biosensoren

DOI:

10.3791/67914

⸱

7 augustus 2026

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, MassGeneral Institute for Neurodegenerative Disease, Henry and Allison McCance Center for Brain Health, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School,

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een methode om FRET-waarden van induceerbare FET-biosensoren te meten die zich richten op de ER (CFP-getagd) of mitochondriën (YFP-getagd) in vitro om de mitochondriën-geassocieerde ER-membranen (MAM's) te beoordelen, wat de Aβ-generatie beïnvloedt, en deze methode kan worden gebruikt voor initiële screening van synthetische of natuurlijke MAM-modulerende middelen als potentiële AD-therapieën.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meerdere studies hebben aangetoond dat het aantal, de lengte en de breedte (dikte) van ER-mitochondriëncontacten, of mitochondriën-geassocieerde membranen (MAMA's), hun biologische rol beïnvloeden. Ons eerdere onderzoek toonde aan dat de stabilisatie van strakke MAMA's, gekenmerkt door een gapbreedte van ongeveer 7 nm, leidt tot een toename van amyloïde β (Aβ)-niveaus, terwijl de aanwezigheid van losse MAMs, met een gapbreedte van ongeveer 40 nm, de Aβ-productie vermindert in een driedimensionaal (3D) neuraal model van de ziekte van Alzheimer (AD). Om de effecten van MAMA's met verschillende gap-breedtes te onderzoeken, werden ER- en mitochondriën-gerichte FRET (Förster Resonance Energy Transfer) biosensoren-ER-CFP (cyaanfluorescerend eiwit) en Mito-YFP (geel fluorescerend eiwit) respectievelijk ontwikkeld om tight MAMs (<10 nm gap-breedte) te kwantificeren in contrast met losse of niet-MAMs. FRET treedt op wanneer de donorfluorofor (CFP) en de acceptorfluorofoor (YFP) zich binnen 10 nm van elkaar bevinden, waardoor dit systeem geschikt is om de nabijheid van MAM te beoordelen. Dit protocol beschrijft het gebruik van spectrale ratiometrische FRET om de mate van strakke MAM-vorming te meten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriën-geassocieerde endoplasmatische reticulumcontacten (MERC's), die biochemisch worden geïsoleerd als mitochondriën-geassocieerde ER-membranen (MAMM's), worden geïntroduceerd bij verschillende neurodegeneratieve aandoeningen, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD)1. De recent voorgestelde "MAM-hypothese" suggereert dat MAMA's een centrale rol spelen bij de vorming van amyloïde β (Aβ), en daarmee de pathogene cascade van AD inluiden. Deze cascade omvat de vorming van neurofibrillaire tangles (NFT's), calciumdyshomeostase en neuro-ontsteking2. MAMA's bestaan uit cholesterolrijke, lipidenvlotachtige microdomeinen in het endoplasmatisch reticulum en het buitenste mitochondriale membraan (OMM), verbonden door specifieke verbindingseiwitten die bijdragen aan zowel hun structurele als functionele diversiteit3. De stabilisatie van ER-mitochondriëncontacten beïnvloedt verschillende cellulaire processen, waaronder ER-calciumsignalering en apoptose 4,5. Er wordt geschat dat 5%-20% van de mitochondriën fysiek contact maakt met de ER om MAMs6 te vestigen. Verschillende studies hebben aangetoond dat het aantal, de lengte en de breedte (dikte) tussen de ER en mitochondriën op MAM-locaties belangrijke bepalende factoren zijn voor hun functionele rol. Cryo-elektronenmicroscopie en in vivo-analyses van de muizenlever hebben aangetoond dat de metabole toestand van hepatocyten zowel de dikte (variërend van 14 nm tot 20 nm) als de lengte (variërend van 145 nm tot 270 nm) van MAMs7 moduleert.

MAMA's komen ook op als potentiële therapeutische doelwitten voor diverse aandoeningen, waaronder kanker en stofwisselingsstoornissen. MAM-dikte of spleetbreedte reguleert de celoverleving. De constitutieve MAM-stabilisatoren, MAM 1X en MAM 9X, ontworpen om respectievelijk strakke (6 nm ± 1 nm gapbreedte) en losse MAMA's (24 nm ± 3 nm gapbreedte) te stabiliseren, toonden aan dat de stabilisatie van strakke MAMs de Aβ-generatie drastisch verhoogde in een nieuw 3D-neurale cultuurmodel van AD. Daarentegen had de stabilisatie van de losse MAMA's geen effect8. Het omzetten van de stabilisatie van strakke MAMA's naar losse MAMA's kan dus gunstig zijn voor het verlagen van de amyloïdepathologie. De structurele en functionele complexiteiten en het gebrek aan nauwkeurige kwantitatieve analyse van de mate van MAM-stabilisatie maken het uitdagen van het richten op MAMA's voor geneesmiddelenontdekking. Een nieuwe live-cel beeldvorming en kymografie-gebaseerde analyse van de axonale snelheid van de door ER gebonden mitochondriën toonde aan dat de axonale snelheid van mitochondriën kan worden gebruikt als maatstaf om de stabilisatie van MAM kwantitatief te meten, omdat een nauwer contact met de ER de mitochondriale axonale snelheid significant verminderde vergeleken met vrije mitochondriën 8,9. Met behulp van een induceerbare stabilisator van MAMA's in hAPP-expressieve Neuro 2A (N2AAPP) cellen8, ontdekten we dat het versmallen van MAM-gapbreedtes de Aβ-generatie op dosisafhankelijke wijze verhoogt8. De induceerbare MAM-stabilisatoren zijn expressieplasmiden die coderen voor de CFP (cyan fluorescence protein)-epitoop-getagd ER-targeting en YFP (yellow fluorescence protein)-epitope-taged mitochondriën-targetende biosensoren, gefuseerd met de rapamycine-induceerbare FK506 rapamycinebinding (FRB) of 12-kDa FK506-bindende eiwit (FKBP) domeinen. De biosensoren werden respectievelijk aangeduid als ER-CFP en Mito-YFP. De CFP is een donorfluorofor die energie overdraagt aan de acceptorfluorofoor YFP wanneer deze met >10 nm van elkaar gescheiden zijn. Cellen (N2AAPP) die de induceerbare biosensoren tot expressie brachten, verhoogden de Aβ-aanmaak bij rapamycinebehandeling8, wat suggereert dat het toenemende strakke MAMA's de Aβ-aanmaak verhoogde. Deze methoden zijn gunstig voor het screenen van kleine molecuulmodulatoren van MAMA's en hun effectieve concentratie die nodig is om een optimaal niveau van strakke MAMA's te stabiliseren die pathogene ("Aβ-verhogende") naar therapeutische ("Aβ-verlagende") MAMA's omzetten zonder de ER- en mitochondriëncontacten, die belangrijk zijn voor celoverleving, volledig te destabiliseren.

Experimenteelmodel
Deze studie gebruikte Neuro2A(N2A)-cellen die constitutief APP751 (N2AAPP) tot expressie brachten. Deze cellen geven detecteerbare niveaus van Aβ af in het geconditioneerde medium (CM), vergeleken met naïeve N2A-cellen. N2AAPP-cellen werden behouden in DMEM aangevuld met 10% FBS, 100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine en 2 mM L-glutamaat aangevuld met 200 μg/mL G418, zoals eerder beschreven10.

Expressieplasmide
Een expressieplasmide werd gegenereerd door de YFP (geel fluorescent eiwit)-getagde mitochondriale targetingsequentie van het zoogdier-A-kinaseankereiwit 1 [AKAP1(34-63)] en de CFP-(cyaanfluorescerend eiwit)-gelabelde ER-targetingsequentie van fosfatidylinositol-3-fosfatase Sac1-fosfatase [Sac1(521-587)] samen te voegen met een zelfsplijtende Tav2A-sequentie die codeert voor de EGRGSLLTCTCGDVEENPGP-peptidesequentie, aangeduid als pYFP-AKAP1-Tav2A-Sac1-CFP8 . Het door Tav2A gefuseerde expressieplasmide wordt ook geflankeerd door nucleotidesequenties die coderen voor het FK506 rapamycine-bindingsdomein (FRB) [EMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPL HAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNV (K2095P)DLTQAWDLYYHVFRRISKQ] of het 12-kDa FK506-bindende eiwit (FKBP) domein (MGVEKQVIRPGNGPKPAPGQTVTVTVHCTGGGKD GDLSQKFWSTKDEGDEGQKPFSFQIGIGAVIKGWDEGVIGMQ IGEVARLRCSDYAYGAGGFPAWGIQPVLDFEIEVLSVQ). Het fusieplasmide FRB-YFP-AKAP1(34-63)-Tav2A-Sac1(521-587)-CFP-FKBP, hier aangeduid als MAM-Tav2A, werd gegenereerd om equimolaire expressieniveaus van FRB-YFP-AKAP1(34-63) en Sac1(521-587)-CFP-FKBP te verkrijgen voor de ratiometrische FET-analyse. De Sac1(521-587)-CFP-FKBP, aangeduid als ER-CFP, is de donorfluorofoor, terwijl Mito-YFP-FRB, aangeduid als Mito-YFP, de acceptorfluorofoor is die FRET genereert wanneer deze gescheiden is door ~10 nm8. Daarom detecteren de op FRET gebaseerde biosensoren strakke MAMA's (6-10 nm, gapbreedte). De FRB en FKBP werden geïntroduceerd om de MAM-gapbreedtes te stimuleren bij toevoeging van rapamycine op een dosisafhankelijke manier die gekwantificeerd kon worden door het verhoogde RET-signaal8 te meten.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De reagentia en de gebruikte apparatuur in deze studie zijn vermeld in de Materiaalkunde.

1. Transfectie

  1. Transfect N2AAPP-cellen met MAM-Tav2A expressieplasmide (14-18 uur).
    1. Voordat je begint, plaats plaats 1 × 10 6 N2A APP-cellenper put van 6-wellplaten met glazen dekfolies en houd de cellen 12-16 uur in het groeimedium.
    2. Transfect 1-3 μg MAM-Tav2A plasmide (Supplementair Bestand 1) met behulp van Lipofectamine transfectie-reagens volgens het protocol van de fabrikant.
    3. Na 12-16 uur transfectie voer je medicatiebehandeling uit.
      OPMERKING: Laat cellen altijd transfecteren met een expressieplasmide die alleen codeert voor de donor (ER-CFP) of de acceptor (Mito-YFP) om als RET-achtergrond te worden gebruikt.

2. Drugsbehandeling

  1. Behandel de MAM-Tav2A-expressieve N2AAPP-cellen met Rapamycine (Rapa) of Rapalog (Log) (3-6 uur).
    1. Bereid voor de behandeling voorraadoplossingen (10 mM) van Rapa en Log voor.
    2. Verander het medium met verse media met 0 nM, 100 nM of 250 nM Rapa of Log.
    3. Na 3 uur behandeling voeg je 3,3% paraformaldehyde (PFA) toe om de cellen te herstellen.
    4. Bereid de glaasjes voor voor fluorescentie-confocale microscopie door één druppel antifade-reagens toe te voegen.
    5. Bevestig de dekmantels over de druppel en druk zachtjes met de tang.
      OPMERKING: De glazen dekmantels zijn fragiel en vereisen voorzichtigheid. Gebruik als alternatief voor glazen dekselplaten glazen bodemplaten. Het grootste nadeel van het gebruik van glazen bodemplaten is dat het antifade-reagens niet kan worden gebruikt, wat beeldvorming bemoeilijkt door bleking van de fluoroforen. Gebruik GEEN antifade-reagens met DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindol) omdat de blauwe fluorescentie de FRET tussen CFP en YFP zal verstoren.

3. Confocale microscopie voor fluorescentieresonantie energieoverdracht (FRET)

  1. Plaats de glaasglaasjes onder een omgekeerde microscoop en pas de focus van de microscoop aan totdat de cellen zichtbaar worden.
  2. Exciteer de fluorofoor met een 440 nm laser en maak beelden met 468-503 nm emissie voor de donor CFP (FKBP-CFP-ER) of 525-565 nm voor de acceptor YFP (FRB-YFP-Mito).
  3. Pas de signaalintensiteit aan met het ingebouwde fluorescentiefilter totdat het achtergrondsignaal is verdwenen (moet bijna volledig zwart zijn).
    OPMERKING: Een confocale microscoop werd gebruikt om fluorescerende beelden vast te leggen met NIS Element AR-software. 60x vergroting werd gebruikt met een resolutie van 512 pixels.
  4. Sla de afbeeldingen op als .nds-bestanden.
  5. Voer spectrale ratiometrische FET-analyse uit.

4. Ratiometrische FRET-analyse (6 - 12 uur)

OPMERKING: Fluorescentie-emissie van de donor ER-CFP (468-503 nm) en de acceptor Mito-YFP (525-565 nm) werd gedetecteerd met een confocale microscoop. ImageJ-software werd gebruikt om de gemiddelde pixelfluorescentieintensiteit na achtergrondsubtractie te kwantificeren. De verhouding van YFP tot CFP-emissieintensiteit werd berekend en gebruikt als uitlezing voor spectrale FET-analyse.

  1. Open Image J (Fiji).
  2. Sleep het .nds-bestand naar Afbeelding J, of druk op Bestand -> Open en selecteer de afbeelding.
  3. Selecteer op het volgende scherm het vakje Split Channels .
  4. Klik op het C = 0 paneel.
  5. Klik op Analyseren -> Meten.
    OPMERKING: Schrijf de gemiddelde waarde op voor latere berekening.
  6. Klik op Proces -> Wiskunde -> Trek af.
  7. Hier komt de gemiddelde waarde.
  8. Herhaal stap 4 voor het C = 1 paneel.
  9. Klik op de Freehand-selectietool .
  10. Omcirkel een cel van interesse en druk dan op Ctrl+T om het op te nemen in de ROI.
  11. Klik onderaan de ROI op 'Alles weergeven ' om te zien wat je al hebt geselecteerd.
  12. Selecteer alle geselecteerde cellen en klik op Meten, Noteer deze waarden in Excel.
  13. Klik op het C = 1 paneel en klik op Toon alles.
  14. Selecteer alle cellen en klik opnieuw op Meten, en noteer deze waarden in een aparte kolom in Excel.
  15. Maak in Excel een functie om de waarden van het donorsignaal over de ontvanger te plaatsen (C0/C1). Dit is de FRET-verhouding.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ratiometrische FET-analyse van FACS-verrijkte N2AAPP-cellen die MAM-Tav2A tot expressie brengen, toonde een dosisafhankelijke toename van Aβ40-niveaus na rapamycinebehandeling8. Rapamycine werkt door het signaalpad van rapamycine (mTOR) van het zoogdierdoelwit te remmen, wat op zijn beurt de expressie van TREM2 (Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 2) in microglia verlaagt, wat leidt tot verminderde Aβ-plaque-verwijdering in 5XFAD muismodellen van de ziekte van Alzheimer11. Het rapamycine-analoge AP21967, vaak rapalog (Log) genoemd, vertoont een lage affiniteit voor mTOR en is daarom relatief niet-toxisch voor cellen. Het behoudt echter het vermogen om het FRB-domein te binden met dezelfde affiniteit als rapamycine, dankzij een compenserende holtevormende mutatie (K2095P) die in het FRB-domein12 is geïntroduceerd.

Rapa- en Log-behandeling verhoogde de FRET-ratio (Figuur 1). De behandeling vertoonde weinig tot geen effect op de niveaus van APP of andere MAM-eiwitten, zoals IP3R3 of VDAC1. Dus het verhogen van tight (<10 nm) MAMs verhoogde de Aβ-generatie in vitro8. Opvallend is dat de FRET-assays uitgevoerd in naïeve N2A-cellen ook vergelijkbare resultaten opleverden.

figure-results-1
Figuur 1: Het aanscherpen van MAM-gapbreedtes verhoogde de Aβ-generatie in vitro. (A) Schema van de induceerbare MAM-stabilisator CFP-FRB-ER-Tav2A-Mito-FKBP-YFP (MAM-Tav2A) die zelfsplijting ondergaat, waarbij equimolaire niveaus van de donor (CFP-FRB-ER of ER-CFP) en de acceptor (Mito-FKBP-YFP of Mito-YFP) worden gegenereerd, en FRET/FLIM wordt bevorderd wanneer deze is bevestigd aan de endogene strakke MAMs of bij versterking van de strakke MAM-vorming door de FRB- en FKBP-interactie met Rapamycine (Rapa) of zijn analoge Rapalog (Log) te induceren. (B) IB van cellen die MAM-Tav2A (Tav2A) expressief maken en equimolaire expressie van de CFP-ER (blauwe doos) en Mito-YFP (gele doos) vertonen na de zelfsplijting van Tav2A. (C) Confocale beelden van DMSO (Veh) of Rapa (250 nM) behandelde cellen die MAM-Tav2A overexpresseren. (D,E). Ratiometrische FET-analyse van cellen behandeld zonder (Veh) of met 100 nM rapamycine (Rapa) (D) of rapalog (Log) (E). FRET-waarden worden weergegeven als verhoudingen van intensiteiten tussen kanaal 2 (465-500 nm) en kanaal 1 (525-555 nm). Voor elke FET-analyse werden 40-50 cellen willekeurig geselecteerd om ROI's per cel te genereren. Eenrichtings-ANOVA. p < 0,0001. (F) Representatieve Western blot-afbeelding van MAM-Tav2A-expressieveN2A APP-cellen na 24-uur behandeling met Rivastigmine (Riv: 0 of 50 μM). MAM-Tav2A genereerde equimolaire niveaus van de donor (CFP-ER) en acceptor (Mito-YFP). (G) Kwantificatie van de FET-verhouding tussen de donor en de acceptor van vehiclebehandeld (0 μM) of Riv-behandeld (50 μM). (H) Aβ ELISA (Wako) van het geconditioneerde medium (CM) van vehicle-behandelde (0 μM) of Riv-behandelde (50 μM) cellen toonde een significante vermindering van Aβ40 (pM) niveaus na 50 μM Riv-behandeling. n = 6, p < 0,001. (I) FRET (ratio) en Aβ (pM) waarden worden getabelleerd. De figuur is aangepast van Zellmer et al.8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: MAM-Tav2A plasmidesequentiebestand. De DNA-sequentie van het expressieplasmide dat codeert voor de ER-gerichte Sac1-sequentie (521FLALPIIMVVAFSMCIICLLMA GDTWTETLAYVLFWGVASIGTFFIILYNGKDFVDAPRLVQ KEKID587) gekoppeld aan FKBP- en CFP-sequenties en de mitochondriën-gerichte AKAP1-sequentie (34SSHDEQQVEAGAVQLRADPAIKEPLPVEDV63) gekoppeld aan FRB- en YFP-sequenties gekoppeld aan de zelfsplijtende Tav2A-sequentie (EGRGSLLTCGGD VEENPGP). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De modulatie van MAMA's is een opkomend onderzoeksgebied met mogelijke implicaties voor diverse aandoeningen, waaronder kanker, stofwisselingsstoornissen en neurodegeneratieve ziekten13. Veel farmacologische middelen, waaronder de dyneïne-antagonist LDC-3/Dynarrestine, het antidiabetische medicijn metformine en het antikankermiddel sulforafaan, verstoren MAMA's en zijn momenteel in preklinische en klinische proeven voor kanker en stofwisselingsstoornissen. Deze farmacologische middelen moduleren de ER-mitochondriëncontacten of MAM-contactbreedtes door de interacties tussen MAM-tethering-eiwitten zoals PTPIP51, VAPB, VDAC1, PACS2, MFN2, VDAC1 en IP3R3 14,15,16,17,18,19,20 te reguleren. De sigma-1 receptor (S1R) antagonist (NE-100) verlaagde de MAMA's en verlaagde de axonale Aβ-niveaus drastisch in een 3D-neuronaal model van AD21. Een recent rapport toonde aan dat het verlies van S1R losse MAMA's verhoogde en strakke MAMs verminderde, wat suggereert dat S1R een therapeutisch doelwit is om MAM-strakheid 8,9 te moduleren.

Live FRET (fluorescentie resonantie energieoverdracht) beeldvorming van neuronen afgeleid van transgene ratten van Alzheimer (AD) toonde een significante verstoring in strakke MAMs (<10 nm), zonder waarneembare verandering in losse MAMs (~20 nm), vergeleken met die in wildtypecontroles1. Opwekbare FRET/FLIM-gebaseerde MAM-stabilisatoren met rapamycine (Rapa)/rapalog (Log)-induceerbare FRB- en FKBP-dimerisatiedomeinen, tot expressie gebracht in N2AAPP-cellen, toonden aan dat Rapa/Log-behandeling de MAM-strakheid verbeterde en de productie van Aβ40 op dosisafhankelijke wijze verhoogde 8,9. Dit leverde het eerste bewijs van concept op dat het versmallen van de breedte van de MAM-kloof de amyloïedgene verwerking bevordert. Het door de FDA goedgekeurde anti-amnestische medicijn rivastigmine, momenteel preklinisch onderzocht voor milde tot matige AD22,23, verlaagde significant de Aβ40-niveaus (p < 0,001) zonder de expressie van VDAC1 of BACE1 te veranderen, of de colokalisatiefrequentie tussen CFP-ER en Mito-YFP 8,9 te beïnvloeden. Rivastigmine lijkt de stabilisatie van MAM te beïnvloeden door de niveaus van het MAM-ankerende eiwit mitofusine-2 (MFN2)24 te moduleren. Deze bevinding komt overeen met andere studies die melden dat rivastigmine de Aβ-niveaus in gekweekte neuronen en AD-muismodellen verlaagt (3xTg)25,26. Omdat de breedte van de MAM-gap verschillende cellulaire processen reguleert die essentieel zijn voor celoverleving, kan gerichte modulatie van MAM-stabiliteit een effectievere therapeutische strategie bieden tegen Aβ-accumulatie dan volledige destabilisatie van MAMA's, wat kan leiden tot onbedoelde bijwerkingen.

Een belangrijke beperking van de methode is dat de ratiometrische FET-techniek afhankelijk is van de equimolaire expressie van de donor en de acceptor. Co-expressie van de expressieplasmiden die de donor of de acceptor coderen, zal inconsistente resultaten opleveren. Het gebruik van een zelf-splijtende Tav2A die de donor- en acceptorbiosensoren verbindt, zorgt voor equimolaire expressie van de biosensoren. De expressieniveaus van de biosensoren werden echter gecontroleerd met Western blot-analyse vóór de RET-analyse.

Rapamycine (Rapa) is mogelijk niet ideaal om de effecten van MAM-verscherping op de Aβ-productie te beoordelen, omdat het het zoogdierdoelwit van rapamycine (mTOR) signaalweg remt, wat leidt tot downregulatie van TREM2 (Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 2) in microglia en daardoor de verwijdering van Aβ-plaque in Alzheimer's disease (AD) muismodellen (5XFAD)11. Als alternatief kan het rapamycine-analoge AP21967, algemeen bekend als rapalog (Log), worden gebruikt. Log vertoont een lage bindingsaffiniteit voor mTOR, waardoor het relatief niet-toxisch is voor cellen. Het behoudt echter het vermogen om het FRB-domein te binden met een vergelijkbare affiniteit als rapamycine, dankzij de introductie van een compenserende holtevormende mutatie (K2095P) in het FRB-domein12.

De beschreven methode heeft een grote betekenis. Ondanks het bewijs van verschillende preklinische studies die veelbelovende therapeutische effecten van synthetische of natuurlijke kleinmolecuulmodulatoren van MAMA's bij kanker en stofwisselingsstoornissen laten zien, zijn er nog geen klinische onderzoeken uitgevoerd. Een van de belangrijkste redenen hiervoor is het ontbreken van een betrouwbare methode die de stabiliteit van MAM kwantitatief kan meten, een vereiste voor het ontwikkelen van effectieve therapieën. Kwantificering van de structuur-functierelatie van MAM vereist een volledig beeld van de cel, wat voor volwassen neuronen niet kan worden bereikt met traditionele TEM of andere hoge-resolutie microscopieën, maar wel met een lage vergrotingvan 28 kan worden verkregen. Traditionele technieken zoals TEM, cryo-TEM of Scanning Electron Microscopies (SEM) kunnen cellulaire structuren op nanoschaalniveau detecteren, maar hebben beperkingen in het meten van de mate van MAM-stabilisatie omdat de zeer dynamische aard van mitochondriën29 en de ER30,31 MAM-structuren transientmaken 32,33,34. Om de structuur-functierelatie van de MAM te onderzoeken, is het meten van de axonale snelheid van mitochondriën die met de ER verbonden zijn via strakke of losse MAK's met behulp van live-celbeeldvorming en kymografie-analyse voorgesteld 8,9. Dit komt overeen met rapporten die een verminderd axonaal transport van mitochondriën in corticale neuronen van AD-hersenen35 en gedifferentieerde AD-cybridcellen36 aantonen. Ondanks de hoge kwantitatieve nauwkeurigheid is de live-cell imaging-techniek mogelijk niet bruikbaar voor high-throughput geneesmiddelenscreening. Daarentegen kan FRET/FLIM-analyse in de toekomst worden toegepast als een snellere kwantitatieve techniek dan de bestaande live-cel- of hogeresolutiemicroscopie om kleinmolecuultherapieën voor AD te identificeren.

Het hier beschreven FRET-protocol is aangetoond specifiek toepasbaar te zijn in de context van kunstmatig geïnduceerde koppeling tussen de ER en mitochondriën. De eenvoud maakt een efficiënte beoordeling van de stabiliteit van ER-mitochondriën en het onderzoeken van de resulterende effecten op de amyloïde pathologie mogelijk, wat het primaire doel van deze aanpak vormt. We willen deze methode verder inzetten om een bibliotheek van potentiële MAM-modulerende kleine moleculen te screenen binnen een recent ontwikkeld driedimensionaal (3D) AD geneesmiddelscreeningsplatform37. De resultaten zullen enorm nuttig zijn bij het selecteren van potentiële anti-Aβ kleinmolecuul MAM-modulatoren13 in vitro die in de toekomst kunnen worden uitgebreid naar in vivo of klinische studies.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken oprecht Dr. Rudolph E. Tanzi, hoogleraar aan het Massachusetts General Hospital (MGH), voor zijn inzichtelijke opmerkingen over het manuscript. Wij danken Dr. Masato Maesako, assistent-professor aan MGH, voor het delen van zijn expertise in FLIM-assays. Wij danken Dr. Gyorgy Hajnoczky, hoogleraar aan de Thomas Jefferson University in Philadelphia, voor het genereus verstrekken van expressieplasmiden die ER-CFP of Mito-YFP coderen. Deze studie werd ondersteund door het Cure Alzheimer's Fund to RB.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BSAFisher Scientific501781532
Confocal microscope Olympus FV3000RS (Tokyo, Japan)N/A
DMEM met GlutaMAX supplementGibco/Thermo Fisher Scientific10564011
EDTA  Life Technologies41116134
Falcon 6 Well Plates VWR International41122107
GAPDH polyklonaal antilichaamThermo Fisher ScientificPA1-988
Gelatine VWR International9000-70-8
Geneticin (G418 Sulfaat)Gibco/Thermo Fisher Scientific10131035
GFP monoklonaal antilichaamInvitrogenMA5-15256
Graphpad Prism N/APrism 9, versie 9.5.0N/A
HeparineSigma-Aldrich H0200000
ImageJ Software ImageJ 1.53aN/A
Omgekeerde confocale microscoop Nikon (C2 Eclipse Ti2)N/A
Lipofectamine2000Invitrogen11668027
MS Excel  Microsoft Excel, versie 2302N/A
NaCl  Fisher Scientific7647145
NuPAGE 4–12% Bis-Tris gel  InvitrogenNP0321BOX
Penicilline/Streptomycine/Amphotericine B Lonza 17-745E
PhotoshopAdobe Photoshop CC 20.0.10 N/A
Tris-HCL, pH 7.6  Boston BioProducts42000000
Triton X-100  Sigma-AldrichT8787
Trypsine-EDTAGibco/Thermo Fisher Scientific25200056
Tween 20Fisher Scientific501657287

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martino Adami, P. V., et al. Perturbed mitochondria-ER contacts in live neurons that model the amyloid pathology of Alzheimer's disease. J Cell Sci. 132 (20), 229906(2019).
  2. Area-Gomez, E., Schon, E. A. On the pathogenesis of Alzheimer's disease: The MAM hypothesis. FASEB J. 31 (3), 864-867 (2017).
  3. Fujimoto, M., Hayashi, T. New insights into the role of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane. Int Rev Cell Mol Biol. 292, 73-117 (2011).
  4. Prudent, J., et al. MAPL SUMOylation of Drp1 stabilizes an ER/mitochondrial platform required for cell death. Mol Cell. 59 (6), 941-955 (2015).
  5. Carpio, M. A., et al. controls apoptosis by Ca2+ through ER-mitochondrial contact sites. Cell Rep. 34 (10), 108827(2021).
  6. Degechisa, S. T., Dabi, Y. T., Gizaw, S. T. The mitochondrial associated endoplasmic reticulum membranes: A platform for the pathogenesis of inflammation-mediated metabolic diseases. Immun Inflamm Dis. 10 (7), e647-e658 (2022).
  7. Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: Structure and signaling functions. Trends Cell Biol. 28 (7), 523-540 (2018).
  8. Zellmer, J. C., et al. Stabilization of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes regulates Aβ generation in a three-dimensional neural model of Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 21 (2), e14417(2024).
  9. Zellmer, J. C., Lomoio, S., Tanzi, R. E., Bhattacharyya, R. Quantitative analysis of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) stabilization in a neural model of Alzheimer's disease (AD). J Vis Exp. (215), e66129(2025).
  10. Bhattacharyya, R., et al. The neuronal-specific isoform of BIN1 regulates beta-secretase cleavage of APP and Abeta generation in a RIN3-dependent manner. Sci Rep. 12 (1), 3486-3500 (2022).
  11. Shi, Q., et al. Microglial mTOR activation upregulates Trem2 and enhances β-amyloid plaque clearance in the 5XFAD Alzheimer's disease model. J Neurosci. 42 (27), 5294-5313 (2022).
  12. Wilmington, S. R., Matouschek, A. An inducible system for rapid degradation of specific cellular proteins using proteasome adaptors. PLoS One. 11 (4), e0152679(2016).
  13. Magalhaes Rebelo, A. P., et al. Chemical modulation of mitochondria-endoplasmic reticulum contact sites. Cells. 9 (7), 1637-1655 (2020).
  14. De Vos, K. J., et al. VAPB interacts with the mitochondrial protein PTPIP51 to regulate calcium homeostasis. Hum Mol Genet. 21 (6), 1299-1311 (2012).
  15. Yang, M., et al. Mitochondria-associated ER membranes: The origin site of autophagy. Front Cell Dev Biol. 8, 595(2020).
  16. Filadi, R., et al. Mitofusin 2 ablation increases endoplasmic reticulum-mitochondria coupling. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (17), E2174-E2181 (2015).
  17. Filadi, R., et al. On the role of Mitofusin 2 in endoplasmic reticulum-mitochondria tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2266-E2267 (2017).
  18. Xie, Q., et al. ABT737 reverses cisplatin resistance by regulating ER-mitochondria Ca2+ transduction in human ovarian cancer cells. Int J Oncol. 49 (6), 2507-2519 (2016).
  19. Tsunoda, T., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1 modulates the acquisition of cisplatin resistance in bladder cancer cell lines. Oncogene. 24 (8), 1396-1402 (2005).
  20. Tubbs, E., et al. Sulforaphane improves disrupted ER-mitochondria interactions and suppresses exaggerated hepatic glucose production. Mol Cell Endocrinol. 461, 205-214 (2018).
  21. Bhattacharyya, R., et al. Axonal generation of amyloid-beta from palmitoylated APP in mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes. Cell Rep. 35 (7), 109134(2021).
  22. Alhazmi, H. A., Albratty, M. An update on the novel and approved drugs for Alzheimer disease. Saudi Pharm J. 30 (12), 1755-1764 (2022).
  23. Rountree, S. D., et al. Effectiveness of antidementia drugs in delaying Alzheimer's disease progression. Alzheimers Dement. 9 (3), 338-345 (2013).
  24. Hadwen, J., et al. Transcriptomic RNAseq drug screen in cerebrocortical cultures: Toward novel neurogenetic disease therapies. Hum Mol Genet. 27 (18), 3206-3217 (2018).
  25. Ray, B., et al. Rivastigmine modifies the α-secretase pathway and potentially early Alzheimer's disease. Transl Psychiatry. 10 (1), 47(2020).
  26. Bailey, J. A., Ray, B., Greig, N. H., Lahiri, D. K. Rivastigmine lowers Aβ and increases sAPPα levels, which parallel elevated synaptic markers and metabolic activity in degenerating primary rat neurons. PLoS One. 6 (7), e21954(2011).
  27. Ziegler, D. V., Martin, N., Bernard, D. Cellular senescence links mitochondria-ER contacts and aging. Commun Biol. 4 (1), 1323(2021).
  28. Neikirk, K., et al. Call to action to properly utilize electron microscopy to measure organelles to monitor disease. Eur J Cell Biol. 102 (4), 151365(2023).
  29. Liu, X., et al. Mitochondrial 'kiss-and-run': Interplay between mitochondrial motility and fusion-fission dynamics. EMBO J. 28 (20), 3074-3089 (2009).
  30. Szymanski, J., et al. Interaction of mitochondria with the endoplasmic reticulum and plasma membrane in calcium homeostasis, lipid trafficking and mitochondrial structure. Int J Mol Sci. 18 (7), ijms18071576(2017).
  31. Tikhomirova, M. S., et al. A role for endoplasmic reticulum dynamics in the cellular distribution of microtubules. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (15), e2104309119(2022).
  32. Stacchiotti, A., et al. Perspective: Mitochondria-ER contacts in metabolic cellular stress assessed by microscopy. Cells. 8 (1), 8010005(2018).
  33. Cieri, D., et al. SPLICS: A split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  34. Giacomello, M., Pellegrini, L. The coming of age of the mitochondria-ER contact: A matter of thickness. Cell Death Differ. 23 (9), 1417-1427 (2016).
  35. Dai, J., et al. Impaired axonal transport of cortical neurons in Alzheimer's disease is associated with neuropathological changes. Brain Res. 948 (1), 138-144 (2002).
  36. Trimmer, P. A., Borland, M. K. Differentiated Alzheimer's disease transmitochondrial cybrid cell lines exhibit reduced organelle movement. Antioxid Redox Signal. 7 (9-10), 1101-1109 (2005).
  37. Quinti, L., et al. Neurotherapeutics in the Era of Translational. Smith, R. A., Kaspar, B. K., Svendsen, C. N. , Academic Press. 311-331 (2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

BiologieNummer 234Nummer 234Deze maand in JoVENummer
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen