Hier beschrijven we de protocollen voor het verkrijgen van primaire culturen van menselijke renale tubulaire epitheelcellen (HRTEC) uit de nierschors om monolagen en driedimensionale culturen te ontwikkelen op een extracellulaire matrix (3D-HRTEC).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ontwikkeling van primaire culturen van menselijke niertubulaire epitheelcellen in monolagen en driedimensionale omstandigheden
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Primaire culturen van menselijke niertubulaire epitheelcellen (HRTEC) worden geïsoleerd uit nieren die zijn verwijderd bij pediatrische patiënten die nefrectomieën ondergaan die zijn aangegeven door de afdeling Kindernefrologie van het Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde, Buenos Aires, Argentinië. Macroscopisch wordt de normale niercortex ontleed van het niermerg en in fragmenten gesneden. Corticale fragmenten worden vervolgens verteerd in Hank's oplossing aangevuld met 0,1% collagenase type 1 en gefilterd door een gaas van 70 μm poriën om de niertubuli van glomeruli te scheiden. Niertubuli ondergaan een tweede vertering met collagenase om epitheelcellen te isoleren. Ten slotte wordt de enzymvertering gestopt en worden de epitheelcellen gekweekt in kolven met RPMI 1640 met supplementen van minder dan 5% CO2bij 37 °C tot confluentie. HRTEC-cellen kunnen worden gekweekt als monolagen op platen met 96 putjes, glazen dekglaasjes tot platen met 24 putjes of celkweekhouders bedekt met collageen. Ook worden driedimensionale humane renale tubulaire epitheelcelculturen (3D-HRTEC) verkregen uit HRTEC-cellen die zijn gezaaid op een basaalmembraan (BM) matrix. Celaggregatie en vorming van buisvormige vormstructuren worden gemonitord. We gebruiken al vele jaren primaire HRTEC-culturen om de cytotoxische werking te bestuderen die wordt veroorzaakt door Shiga-toxine in de pediatrische nier, wat leidt tot pathofysiologische veranderingen die resulteren in hemolytisch-uremisch syndroom (HUS). Zowel HRTEC- als 3D-HRTEC-culturen kunnen worden gebruikt om de effecten van verschillende toxines, synthetische geneesmiddelen, biologische factoren, hormonen, enz. te evalueren, specifiek op het epitheel van de menselijke nierproximale tubulus.
Inleiding
In onze groep werden primaire culturen van menselijke renale tubulaire epitheelcellen (HRTEC) ontwikkeld in monolagen en in driedimensionale (3D-HRTEC) omstandigheden gebruikt om in de pediatrische nier de cytotoxische werking van Shiga-toxine type 2 (Stx2) te bestuderen die wordt veroorzaakt na gastro-intestinale infectie met Shiga-toxineproducerende Escherichia coli (STEC).
Stx1 en Stx2 (Stxs) zijn de belangrijkste virulentiefactoren van STEC die hemolytisch-uremisch syndroom (HUS) na diarree kunnen veroorzaken1. HUS is een systemische complicatie die ongeveer 5-10% van de met STEC geïnfecteerde kinderen treft en bestaat uit hemolytische anemie, trombocytopenie en acuut nierletsel bij kinderen (AKI), waarvoor ondersteunende behandeling nodig is2. In Argentinië is STEC-HUS een endemische ziekte met een jaarlijkse incidentie van 6,52 gevallen per 100.000 kinderen jonger dan 5 jaar (de hoogste wereldwijd), wat een van de belangrijkste oorzaken van acuut nierletsel vertegenwoordigt3. Hoewel de mortaliteit minder dan 4%3 is, ontwikkelt ongeveer 50% van de patiënten nierresten, de op één na meest voorkomende oorzaak van niertransplantatie in ons land 4,5.
Voorafgaand aan internalisatie en het uitoefenen van zijn cytotoxische werking, bindt Stx2 specifiek aan de glycolipide globotriaosylceramide (Gb3)-receptor die tot expressie komt op het celoppervlak van doelorganen6. De nier is het belangrijkste orgaan dat door Stxs wordt beschadigd door de aanwezigheid van Stx-gevoelige cellen, die grote hoeveelheden biologisch actieve Gb3-receptoren tot expressie brengen in nierepitheel- en endotheelcellen 7,8.
Eerdere werken uitgevoerd in HRTEC gekweekt als monolagen toonden aan dat Stx2 de eiwitsynthese remde, de levensvatbaarheid van cellen en celproliferatie verminderde en apoptose en necrose induceerde 9,10,11,12. Bovendien remde de blootstelling van 3D-HRTEC aan Stx2 de celmigratie en de ontwikkeling van tubulaire structuren met kenmerken van de renale proximale tubuli12,13.
De primaire culturen van HRTEC- en 3D-HRTEC-culturen werden ook gebruikt om het effect van oestradiol op celproliferatie te evalueren door de opname van 5-broom-2-deoxyuridine (BrdU) in het DNA van cellen in de S-fase van de celcycluste meten 14.
Om de epitheelcellen te isoleren, gaan we uit van nierfragmenten verkregen uit pediatrische nefrectomieën die zijn geïndiceerd voor de correctie van urologische aandoeningen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De ethische commissie van het Hospital General de Niños Pedro de Elizalde heeft het gebruik van menselijk nierweefsel voor de ontwikkeling van primaire celculturen voor onderzoeksdoeleinden goedgekeurd. Voor het gebruik van niermonsters voor onderzoek is schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen van de nabestaanden of voogden namens de kinderen.
OPMERKING: De primaire culturen van menselijke renale tubulaire epitheelcellen (HRTEC) zijn afgeleid van pediatrische patiënten die nefrectomieën ondergaan, geïndiceerd voor de correctie van urologische aandoeningen of tumorresecties, in het Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde in Buenos Aires, Argentinië.
1. Ontwikkeling van primaire culturen van menselijke renale tubulaire epitheelcellen (HRTEC)
OPMERKING: De corticale nierfragmenten worden ontleed uit nieren die zijn verwijderd bij pediatrische patiënten die nefrectomieën ondergaan in het ziekenhuis. De primaire cultuur van de HRTEC wordt uitgevoerd volgens de eerder beschreven methode11.
Het protocol wordt beschreven in de volgende stappen:
- Bewaar het nierfragment gekoeld in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of Hanks' Balanced Salt-oplossing (Hanks) totdat het in het laboratorium wordt verwerkt.
- Ontleed het nierkapsel met een tang. Scheid de nierschors van de medulla en snijd deze in kleine stukjes van ongeveer 1 mm.
- Om de digestie uit te voeren, plaatst u de nierfragmenten in een steriele Hanks-oplossing zonder Ca2+ en Mg2+, aangevuld met 0,1% collagenase type I.
- Incubeer de nierfragmenten gedurende 30 minuten bij 37 °C door te schudden.
- Om de spijsvertering te stoppen, voegt u een volume PBS met 10% foetaal runderserum (FBS) toe en wast u het monster driemaal door centrifugeren bij 160 × g gedurende elk 10 minuten, in een centrifuge die in de koelkast bij 4 °C wordt bewaard. Gooi bij elke centrifugatie het bovenstaande weg en suspendeer de pellet opnieuw in dezelfde oplossing.
- Laat het spijsverteringsproduct door een poriëngaas van 70 μm lopen om de buisjes te filteren en gooi de glomeruli weg die in het filter achterblijven.
- Centrifugeer de gefiltreerde buisjes bij 160 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C, gooi het bovenstaande weg en suspendeer de pellet opnieuw in een steriele Hanks-oplossing, zonder Ca2+ en Mg2+, aangevuld met 0,2% collagenase type I.
- Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 37 °C en schud.
- Om de spijsvertering te stoppen, voegt u een volume PBS toe dat 10% foetaal runderserum (FBS) bevat.
- Was het monster driemaal door centrifugeren bij 160 × g, elk 10 min, in een centrifuge die in de koelkast bij 4 °C is bewaard. Gooi bij elke centrifugatie het bovenstaande weg en suspendeer de pellet opnieuw in dezelfde oplossing.
- Na de laatste centrifugatie wordt de celpellet geresuspendeerd in 5 ml volledig kweekmedium (RPMI 1640 aangevuld met 5% FBS, L-glutamine [2 mmol/l], penicilline [100 e/ml], streptomycine [100 μg/ml] en endotheelcelgroeisupplement [ECGS, 1%]).
- Zaai de celsuspensie in een kweekkolf van 25cm2 met een geventileerd deksel.
- Incubeer de cellen bij 37 °C in een vochtige atmosfeer en 5% CO2 .
- Was de celcultuur de volgende dag 3 keer, gooi de vloeistof uit de kolf, voeg elk 5 ml PBS toe en voeg 5 ml volledig kweekmedium toe aan de kolf. Deze wasbeurten verwijderen rode bloedcellen en buisvormige fragmenten die niet volledig waren verteerd en niet aan de kweekkolf waren bevestigd.
- Incubeer de epitheelcellen in de celkweekincubator bij 37 °C, zodat ze in monolaag tot samenvloeiing kunnen groeien.
- Vervang het medium elke 3 dagen door een vers compleet kweekmedium en observeer de celcultuur dagelijks onder een omgekeerde microscoop.
2. Ontwikkeling van driedimensionale HRTEC-culturen (3D-HRTEC)
OPMERKING: In dit gedeelte worden de stappen beschreven om driedimensionale culturen (3D-HRTEC) te ontwikkelen. De 3D-HRTEC-culturen worden uitgevoerd volgens de eerder beschreven methode12.
- Gebruik een BM-matrix van Engelbreth-Holm-Swarm muizensarcoom. Deze BM-matrix wordt diepgevroren geleverd en blijft in deze staat solide. Ontdooi de BM-matrixoplossing een nacht in een ijsbad in de koelkast bij 4 °C, zoals aangegeven door de fabrikant.
- Koel de tips af in de vriezer voordat u de BM-matrix plaatst en laat de multiwell-plaat op ijs liggen om stolling van de matrix tijdens het proces te voorkomen.
- Neem een hoeveelheid vloeibare BM-matrix (150 ml/cm2) en plaats deze in elk putje van de plaat om de bodem van het putje te bedekken. Incubeer de plaat in de celincubator gedurende 1 uur bij 37 °C om de BM-matrix in een geltoestand te brengen.
- Ondertussen, om confluente HRTEC-primaire culturen los te maken, gooit u het kweekmedium uit de kolf en voegt u 1 ml 0,25% trypsine en 0,02% EDTA-oplossing toe.
- Verdeel de vloeistof over het gehele oppervlak van de kolf en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C in de celkweekoven.
- Kijk onder een omgekeerde microscoop of alle cellen zijn losgekomen.
- Resuspendeer de cellen in 10 ml kweekmedium of PBS, doe ze in een buis van 15 ml en centrifugeer ze gedurende 10 minuten bij 160 × g bij 4 °C.
- Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de celpellet opnieuw in een compleet kweekmedium dat dezelfde supplementen bevat die worden gebruikt voor primaire HRTEC-culturen.
- Tel het aantal cellen in een Neubauer-kamer.
- Zaad 4 × 104 cellen/150 μL per putje op de BM-matrix. Incubeer de celcultuur gedurende enkele dagen in een celcultuurincubator bij 37 °C, in een vochtige atmosfeer en 5% CO2 .
- Vervang het medium elke 2 dagen met fresh medium.
- Bewaak de celaggregatie en de vorming van buisvormige structuren onder een omgekeerde optische microscoop.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Confluente HRTEC primaire culturen vertoonden een vergelijkbare morfologie waargenomen onder lichtmicroscopie (Figuur 1). Cellen werden gekenmerkt door immunofluorescentie zoals beschreven in onze eerdere publicaties met behulp van antilichamen tegen aquaporine 1 (AQP1) en PECAM CD31 9,12,13. Immunofluorescentiestudies toonden aan dat meer dan 90% van de HRTEC posit...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Primaire kweken moeten op dezelfde dag van nefrectomie worden uitgevoerd. HRTEC primaire culturen kunnen worden gebruikt tussen 1-5 passages om de morfogenetische stabiliteit van de cellen te garanderen. Na de vijfde passage beginnen cellen hun morfologie te veranderen, vertonen ze een fibroblastachtig uiterlijk of een toename van vacuolen, en kunnen ze in rust worden.
Als een groter nierfragment wordt gebruikt, kan het DNA dat vrijkomt door cellyse na verteri...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Dankbetuigingen
We zijn het team voor pediatrische urologie van de "Sección de Cirugía Pediátrica, Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde", Buenos Aires, Argentinië, dankbaar voor het verstrekken van niermonsters. Dit werk werd ondersteund door subsidies aan C. Silberstein van de Universiteit van Buenos Aires (UBACYT20020190100072BA) en aan C Ibarra en C Silberstein van de Nationale Raad voor Wetenschappelijk en Technisch Onderzoek (CONICET: PUE 0041). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED) (via Red STEC/SUH Nº 224RT0152).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Collagenase type I | Sigma Merck, St Louis, MO, USA | 637958 | |
| Endotheelcel groeisupplement | Sigma Merck, St Louis, MO, USA | E2759 | |
| Matrigel basaal membraanmatrix | BD Biosciences, USA; Sigma Merck, St Louis, MO, USA | 356234 | |
| 70 μm porie mesh filter | BD Bioscience, MA, USA | css010070 | |
| RPMI 1640 medium met L-glutamine | Sigma Merck, St Louis, MO, USA | R8758-500ml | |
| Hanks' Balanced zout oplossing Ca2+ en Mg2+ vrij | Gibco Invitrogen, NY, USA | 14175046 | |
| Trypsine-EDTA oplossing | Sigma Merck, St Louis, MO, USA | T4049 |
Referenties
- Rivas, M., Chinen, I., Miliwebsky, E., Masana, M. Risk factors for Shiga toxin-producing Escherichia coli-associated human diseases. Microbiol Spectr. 2 (5), (2014).
- Gianantonio, C. A., Vitacco, M., Mendilaharzu, F., Gallo, G. E., Sojo, E. T. The hemolytic-uremic syndrome. Nephron. 11 (2), 174-192 (1973).
- Alconcher, L. F., et al. Hemolytic uremic syndrome associated with Shiga toxin-producing Escherichia coli infection in Argentina: update of serotypes and genotypes and their relationship with severity of the disease. Pediatr Nephrol. 36 (9), 2811-2817 (2021).
- Alconcher, L. F., Lucarelli, L. I., Bronfen, S., Meni Battaglia, L., Balestracci, A. Dynamic evolution of kidney function in patients with STEC-hemolytic uremic syndrome followed for more than 15 years: unexpected changes. Pediatr Nephrol. 40 (1), 143-150 (2025).
- Monteverde, M. L., et al. A decrease in the incidence of Shiga toxin-related hemolytic uremic syndrome as a cause of kidney transplantation at an Argentine Referral Center. Pediatr Transplant. 27 (4), e14489(2023).
- Sandvig, K., van Deurs, B. Entry of ricin and Shiga toxin into cells: molecular mechanisms and medical perspectives. EMBO J. 19 (22), 5943-5950 (2000).
- Obrig, T. G. Escherichia coli Shiga toxin mechanisms of action in renal disease. Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).
- Karpman, D., et al. Apoptosis of renal cortical cells in the hemolytic-uremic syndrome: in vivo and in vitro studies. Infect Immun. 66 (2), 636-644 (1998).
- Pistone Creydt, v, Silberstein, C., Zotta, E., Ibarra, C. Cytotoxic effect of Shiga toxin-2 holotoxin and its B subunit on human renal tubular epithelial cells. Microbes Infect. 8, 410-419 (2006).
- Silberstein, C., Pistone Creydt, V., Gerhardt, E., Nuñez, P., Ibarra, C. Inhibition of water absorption in human proximal tubular epithelial cells in response to Shiga toxin-2. Pediatr Nephrol. 23, 1981-1990 (2008).
- Márquez, L. B., et al. Effects of Escherichia coli subtilase cytotoxin and Shiga toxin 2 on primary cultures of human renal tubular epithelial cells. PLoS One. 9, e87022(2014).
- Márquez, L. B., Araoz, A., Repetto, H. A., Ibarra, F. R., Silberstein, C. Effects of Shiga toxin 2 on cellular regeneration mechanisms in primary and three-dimensional cultures of human renal tubular epithelial cells. Microb Pathog. 99, 87-94 (2016).
- Sánchez, D. S., et al. Eliglustat prevents Shiga toxin 2 cytotoxic effects in human renal tubular epithelial cells. Pediatr Res. 91 (5), 1121-1129 (2022).
- Sánchez, D. S., et al. Estradiol stimulates cell proliferation through classic estrogen receptors and GPER-1 in human renal tubular epithelial cell primary cultures. Biochem Biophys Res Commun. 512, 170-175 (2019).
- Fernandez Miyakawa, M., Zabal, O., Silberstein, C. Clostridium perfringens epsilon toxin is cytotoxic for human renal tubular epithelial cells. Hum Exp Toxicol. 30, 275-282 (2011).
- Chen, J., et al. Cooperative application of transcriptomics and ceRNA hypothesis: ln cRNA-00742/miR-116 targets CD74 to mediate vanadium-induced mitochondrial apoptosis in duck liver. J Hazard Mater. 480, 135904(2024).
- Chen, J., et al. Copper toxicity in the liver of broiler chicken: insights from metabolomics and AMPK-mTOR mediated autophagy perspective. Poult Sci. 103 (9), 104011(2024).
- Zhang, T., et al. Role of Caveolin-1 on the molybdenum and cadmium exposure induces pulmonary ferroptosis and fibrosis in the sheep. Environ Pollut. 334, 122207(2023).
- Fujiki, K., et al. Blockage of Akt activation suppresses cadmium-induced renal tubular cellular damages through aggrephagy in HK-2 cells. Sci Rep. 14, 14552(2024).
- Joun, J. I. H., et al. Antioxidative effects of molybdenum and its association with reduced prevalence of hyperuricemia in the adult population. PLoS One. 19 (8), e0306025(2024).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
