Hier beschrijven we de protocollen voor het verkrijgen van primaire culturen van menselijke renale tubulaire epitheelcellen (HRTEC) uit de nierschors om monolagen en driedimensionale culturen te ontwikkelen op een extracellulaire matrix (3D-HRTEC).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ontwikkeling van primaire culturen van menselijke niertubulaire epitheelcellen in monolagen en driedimensionale omstandigheden
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Primaire culturen van menselijke niertubulaire epitheelcellen (HRTEC) worden geïsoleerd uit nieren die zijn verwijderd bij pediatrische patiënten die nefrectomieën ondergaan die zijn aangegeven door de afdeling Kindernefrologie van het Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde, Buenos Aires, Argentinië. Macroscopisch wordt de normale niercortex ontleed van het niermerg en in fragmenten gesneden. Corticale fragmenten worden vervolgens verteerd in Hank's oplossing aangevuld met 0,1% collagenase type 1 en gefilterd door een gaas van 70 μm poriën om de niertubuli van glomeruli te scheiden. Niertubuli ondergaan een tweede vertering met collagenase om epitheelcellen te isoleren. Ten slotte wordt de enzymvertering gestopt en worden de epitheelcellen gekweekt in kolven met RPMI 1640 met supplementen van minder dan 5% CO2bij 37 °C tot confluentie. HRTEC-cellen kunnen worden gekweekt als monolagen op platen met 96 putjes, glazen dekglaasjes tot platen met 24 putjes of celkweekhouders bedekt met collageen. Ook worden driedimensionale humane renale tubulaire epitheelcelculturen (3D-HRTEC) verkregen uit HRTEC-cellen die zijn gezaaid op een basaalmembraan (BM) matrix. Celaggregatie en vorming van buisvormige vormstructuren worden gemonitord. We gebruiken al vele jaren primaire HRTEC-culturen om de cytotoxische werking te bestuderen die wordt veroorzaakt door Shiga-toxine in de pediatrische nier, wat leidt tot pathofysiologische veranderingen die resulteren in hemolytisch-uremisch syndroom (HUS). Zowel HRTEC- als 3D-HRTEC-culturen kunnen worden gebruikt om de effecten van verschillende toxines, synthetische geneesmiddelen, biologische factoren, hormonen, enz. te evalueren, specifiek op het epitheel van de menselijke nierproximale tubulus.
Inleiding
In onze groep werden primaire culturen van menselijke renale tubulaire epitheelcellen (HRTEC) ontwikkeld in monolagen en in driedimensionale (3D-HRTEC) omstandigheden gebruikt om in de pediatrische nier de cytotoxische werking van Shiga-toxine type 2 (Stx2) te bestuderen die wordt veroorzaakt na gastro-intestinale infectie met Shiga-toxineproducerende Escherichia coli (STEC).
Stx1 en Stx2 (Stxs) zijn de belangrijkste virulentiefactoren van STEC die hemolytisch-uremisch syndroom (HUS) na diarree kunnen veroorzaken1. HUS is een systemische complicatie die ongeveer 5-10% van de....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De ethische commissie van het Hospital General de Niños Pedro de Elizalde heeft het gebruik van menselijk nierweefsel voor de ontwikkeling van primaire celculturen voor onderzoeksdoeleinden goedgekeurd. Voor het gebruik van niermonsters voor onderzoek is schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen van de nabestaanden of voogden namens de kinderen.
OPMERKING: De primaire culturen van menselijke renale tubulaire epitheelcellen (HRTEC) zijn afgeleid van pediatrische patiënten die nefrectomieën ondergaan, geïndiceerd voor de correctie van urologische aandoeningen of tumorresecties, in het Hospital General....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Confluente HRTEC primaire culturen vertoonden een vergelijkbare morfologie waargenomen onder lichtmicroscopie (Figuur 1). Cellen werden gekenmerkt door immunofluorescentie zoals beschreven in onze eerdere publicaties met behulp van antilichamen tegen aquaporine 1 (AQP1) en PECAM CD31 9,12,13. Immunofluorescentiestudies toonden aan dat meer dan 90% van de HRTEC posit.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Primaire kweken moeten op dezelfde dag van nefrectomie worden uitgevoerd. HRTEC primaire culturen kunnen worden gebruikt tussen 1-5 passages om de morfogenetische stabiliteit van de cellen te garanderen. Na de vijfde passage beginnen cellen hun morfologie te veranderen, vertonen ze een fibroblastachtig uiterlijk of een toename van vacuolen, en kunnen ze in rust worden.
Als een groter nierfragment wordt gebruikt, kan het DNA dat vrijkomt door cellyse na verteri.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Dankbetuigingen
We zijn het team voor pediatrische urologie van de "Sección de Cirugía Pediátrica, Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde", Buenos Aires, Argentinië, dankbaar voor het verstrekken van niermonsters. Dit werk werd ondersteund door subsidies aan C. Silberstein van de Universiteit van Buenos Aires (UBACYT20020190100072BA) en aan C Ibarra en C Silberstein van de Nationale Raad voor Wetenschappelijk en Technisch Onderzoek (CONICET: PUE 0041). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED) (via Red STEC/SUH Nº 224RT0152).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Collagenase type I | Sigma Merck, St Louis, MO, USA | 637958 | |
| Endotheelcel groeisupplement | Sigma Merck, St Louis, MO, USA | E2759 | |
| Matrigel basaal membraanmatrix | BD Biosciences, USA; Sigma Merck, St Louis, MO, USA | 356234 | |
| 70 μm porie mesh filter | BD Bioscience, MA, USA | css010070 | |
| RPMI 1640 medium met L-glutamine | Sigma Merck, St Louis, MO, USA | R8758-500ml | |
| Hanks' Balanced zout oplossing Ca2+ en Mg2+ vrij | Gibco Invitrogen, NY, USA | 14175046 | |
| Trypsine-EDTA oplossing | Sigma Merck, St Louis, MO, USA | T4049 |
Referenties
- Rivas, M., Chinen, I., Miliwebsky, E., Masana, M. Risk factors for Shiga toxin-producing Escherichia coli-associated human diseases. Microbiol Spectr. 2 (5), (2014).
- Gianantonio, C. A., Vitacco, M., Mendilaharzu, F., Gallo, G. E., Sojo, E. T. The hemolytic-uremic syndrome. Nephron. 11
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
