Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Meting van de opname van de glucose-analoog, 6-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-6-deoxyglucose, in intact neuraal netvlies van muizen

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67921

⸱

14 maart 2025

 ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Meerdere celtypen in het netvlies, waaronder endotheelcellen, neuronen en gliacellen, brengen glucosetransporters (GLUT's) tot expressie om glucoseopname in cellen mogelijk te maken. Met behulp van ex vivo neurale retina van de muis en de fluorescerende glucose-analoog 6-NBDG beschrijven we een relatief snelle en goedkope methode om de glucoseopname in het hele netvlies van de muis te meten.

Samenvatting

Het netvlies is een zeer metabool weefsel met meerdere celtypen die glucose en zijn derivaten nodig hebben om energie te produceren in de vorm van ATP. Retinale cellen, waaronder endotheelcellen, neuronen, fotoreceptoren en gliacellen, brengen glucosetransporters (GLUT's; bijv. GLUT1-4) tot expressie om de opname van glucose voor energieproductie mogelijk te maken. GLUT1 is de meest tot expressie gebrachte glucosetransporter in het netvlies. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de opname van glucose in het neurale netvlies van muizen in ex vivo omstandigheden te meten met behulp van de fluorescerende glucose-analoog 6-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-6-Deoxyglucose (6-NBDG). Na netvliesdissectie kunnen de totale retinale 6-NBDG-waarden eenvoudig worden bepaald via fluorescentie-eindpuntmeting met behulp van een plaatlezer. Voor consistentie raden we aan om de resultaten te normaliseren naar het totale eiwitgehalte. Hoewel 6-NBDG zeer specifiek is voor GLUT1, wordt opname van dit analoog gedetecteerd in aanwezigheid van GLUT1-remmer BAY-876. Als zodanig biedt deze test een relatief snelle en goedkope methode om de glucoseopname ex vivo te meten in het hele neurale netvlies van de muis, dat gedeeltelijk wordt gemedieerd door GLUT1.

Inleiding

Glucose is een essentiële metaboliet voor het neurale netvlies, waar het wordt gebruikt om hoge glycolysesnelheden en mitochondriale ademhaling te voeden om energie te produceren in de vorm van adenosinetrifosfaat (ATP)1. Aangezien glucose het geprefereerde energiesubstraat is, brengen veel netvliescellen glucosetransporters (GLUT's) tot expressie om de opname van glucose uit het vaatstelsel en het omliggende weefsel te vergemakkelijken2. GLUT's omvatten een familie van intrinsieke membraanglycoproteïnen die verantwoordelijk zijn voor het glucosetransport naar zoogdiercellen3. GLUT transporter-1 (GLUT1) is de primaire glucosetransporter in het netvlies, die tot expressie komt in de netvlieslagen4 en door capillaire endotheelcellen die de bloed-retinale barrière (BRB)5 vormen. Interessant is dat bij neurodegeneratieve ziekten van het centrale zenuwstelsel (CZS), waaronder de ziekte van Alzheimer, een verlaging van de GLUT1-eiwitspiegels en glucoseopname voorafgaat aan hersenatrofie en neuronale disfunctie bij mensen 6,7. In een rattenmodel van oculaire hypertensie werden ook lagere niveaus van GLUT1 waargenomen in haarvaten8. Verminderd transport van glucose naar het buitenste netvlies is betrokken bij verlies van fotoreceptoren in diermodellen van menselijke retinitis pigmentosa en kan ook een rol spelen bij retinale neurodegeneratie, zoals waargenomen bij glaucoom. Daarom is een goed begrip van het glucosetransport in het neurale netvlies nodig om de rol ervan bij retinale neurodegeneratie vast te stellen.

Hier beschrijven we een nieuwe, goedkope en eenvoudige biochemische methode voor het meten van de opname van 6-NBDG in ex vivo muizen neurale retina, d.w.z. met uitzondering van retinaal gepigmenteerd epitheel en choroïde. Vergeleken met andere fluorescerende analogen zoals 2-NBDG, is 6-NBDG samengesteld uit een glucosegroep waarop een fluorescerende nitrobenzoxydiazoaminogroep de hydroxylgroep vervangt bij koolstof 6, waardoor fosforylering door hexokinase en verdere metabolischeafbraak 9 wordt voorkomen. Hoewel 6-NBDG een hoge specificiteit heeft voor GLUT1, met een bindingsaffiniteit die 300 keer hoger is dan glucose9, detecteren we opname van deze analoog in aanwezigheid van GLUT1-remmers10. Als zodanig biedt deze test een relatief snelle en goedkope methode om de glucoseopname ex vivo te meten in het hele netvlies van de muis, dat gedeeltelijk GLUT1-gemedieerd is.

Het meten van de glucoseopname in weefsel in realtime is een uitdaging en vereist vaak radio-isotopenlabeling of beeldvormingsmethoden met hoge resolutie. Hier gebruiken we een fluorescerende biochemische test om snel de opname van 6-NBDG in meerdere retinale monsters in ex vivo omstandigheden te bepalen. Het protocol geeft informatie over de totale glucoseopname in het netvlies; het geeft geen informatie over retinale celspecifieke niveaus van 6-NBDG-opname.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Vanderbilt University Medical Center.

1. Voorbereiding voor test

OPMERKING: De voorbereiding moet worden uitgevoerd op de dag van de test onmiddellijk voorafgaand aan het uitvoeren van de test. Dit is nodig vanwege het tijdgevoelige karakter van het protocol.

  1. Algemene voorbereiding voorafgaand aan het experiment
    OPMERKING: 6-NBDG is lichtgevoelig en moet worden beschermd tegen licht. Dek alle 6-NBDG-oplossingen af met aluminiumfolie.
    1. Een stockoplossing van 5 mM 6-NBDG in 50% DMSO/1x PBS is stabiel bij -20 °C gedurende 6 maanden. Maak een voorraadoplossing en bewaar aliquots van 500 μL voor toekomstige analyses.
    2. Plaats een conische tube van 50 ml Neurobasal-A media (zonder glucose) op ijs.
    3. Zorg ervoor dat het waterbad op 37 °C is ingesteld.
    4. Label 4 × microcentrifugebuisjes van 1,5 ml per netvlies: 1) glucosehonger, 2) 6-NBDG-incubatie, 3) sonicatie en 4) verzamelbuisje voor monster voor Pierce-test (d.w.z. als u in totaal vier netvliezen heeft, heeft u 16 microcentrifugebuisjes nodig). Zie Figuur 1 voor een samenvatting van de opstelling van de buis.
    5. Voeg 200 μL neurobasaal A-medium uit de 50 ml conische buis op ijs toe aan de voorgelabelde sonicatiebuisjes en zet op ijs voor stap 2.5.4.
    6. Schakel de plaatlezer in.
    7. Stel plaatinformatie in in de plaatlezersoftware met behulp van de fluorescentie-eindpunttestfunctie met de volgende parameters: excitatie 483 nm, emissie 550 nm en cut-off 530 nm (parameters vooraf bepaald voor 6-NBDG).
  2. Preparaat van reagentia voorafgaand aan het experiment: 6-NBDG
    1. Maak een werkoplossing van 6-NBDG in neurobasale A-media met een eindconcentratie van 500 μM door de 5 mM-voorraad die in stap 1.1.1 is gemaakt, te verdunnen.
      NOTITIE: Vergeet niet om alle 6-NBDG-oplossingen af te dekken met aluminiumfolie. Maak een geschikt volume van 500 μM 6-NBDG werkoplossing voor de gehele test (heb 200 μL werkende 6-NBDG-oplossing per netvlies nodig; voeg extra volume toe voor fouten en hoeveelheden die nodig zijn voor het maken van standaardoplossingen in stap 2.4.).
    2. Pipetteer 200 μL 6-NBDG werkoplossing in de voorgelabelde buisjes die zijn gemaakt in stap 1.1.4 voor de 6-NBDG incubatiestap.

2. Uitvoeren van de 6-NBDG-opnametest

OPMERKING: Zie afbeelding 2 voor een stapsgewijs overzicht.

  1. Dissectie van het netvlies
    1. Smeer de muis met behulp van geïnhaleerde isofluraan-anesthesie (2% isofluraan in 5% kooldioxide/95% zuurstof).
      NOTITIE: Controleer of de muis voldoende verdoofd is door het voetkussen op beide achterpoten samen te knijpen. Als u goed verdoofd bent, mag er geen schokkende beweging zijn (pedaalterugtrekkingsreflex). Als er sprake is van een reflexbeweging, keer dan terug naar stap 2.1.1.
    2. Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie gevolgd door onthoofding en verwijder vervolgens snel de ogen. Plaats de ontkernde ogen in een petrischaaltje gevuld met 5-10 ml ijskoude neurobasale A-media (zonder glucose) op ijs.
      OPMERKING: Hieronder vindt u basisrichtlijnen voor neurale retinale dissectie (met uitzondering van retinaal pigmentepitheel en choroïd); Raadpleeg voor meer diepgaande instructie en begeleiding een eerder gepubliceerd protocol11 en volg de sectie "Retinale dissectie bij muizen".
    3. Plaats de petrischaal onder een dissectiemicroscoop op ijs.
    4. Vouw een pluisvrij doekje tot een klein vierkantje en bevochtig het met Neurobasal A media.
    5. Breng een oog over op het vochtige, pluisvrije doekje met behulp van een plastic transferpipet waarvan het uiteinde is afgesneden.
      OPMERKING: Het pluisvrije doekje zorgt voor meer wrijving om te voorkomen dat het oog beweegt tijdens dissectie.
    6. Neem een naald van 26 G en prik de zijkant van het hoornvlies vóór de limbus door.
    7. Gebruik een Vannas-schaar om langs de limbus vanaf het punt van prik te knippen om het hoornvlies te verwijderen.
    8. Zodra het hoornvlies is verwijderd, pakt u de sclera halverwege tussen de limbus en de oogzenuwkop vast met een tang. Gebruik een andere tang in de andere hand om de lens vast te pakken en snel in één snelle beweging te verwijderen.
      OPMERKING: Als de lens langzaam wordt verwijderd, blijft het netvlies aan de lens zitten en wordt het moeilijk te ontleden.
    9. Breng de oogschelp over naar een petrischaaltje met koude Neurobasal A op ijs.
    10. Gebruik een tang in beide handen, neem de oogschelp en houd de beker voorzichtig vast bij de ora serrata.
      1. Om de netvliescup van de sclera los te maken, klemt u de sclera vast met een tang en zorgt u ervoor dat u het netvliesweefsel niet afklemt.
      2. Schuif de tang voorzichtig tussen het sclerale weefsel en het netvliesweefsel over de hele wereldbol totdat het hele netvlies is losgekomen van de limbus.
    11. Maak met een Vannas-schaar een kleine incisie in de sclera bij de limbus.
    12. Neem een tang om de randen van de incisie vast te pakken en pel het scleraweefsel uit elkaar tot aan het kopgebied van de oogzenuw. Pak de sclera vast met een tang in de niet-dominante hand en leid het netvlies voorzichtig weg van de sclera met behulp van een gesloten tang in de dominante hand.
    13. Knip de kop van de oogzenuw af met een schaar om het netvlies volledig los te maken van de sclera en eventuele oogzenuw die overblijft.
    14. Breng het netvlies met behulp van een bijgesneden transferpipet over in de vooraf voorbereide microcentrifugebuis van 1.5 ml voor glucosehonger vanaf stap 1.1.4, die 200 μL neurobasale A-media (zonder glucose)-1 retina per buis bevat.
  2. Glucose uithongering stap
    1. Breng de buisjes van stap 2.1.14 over in een waterbad van 37 °C en incubeer ze gedurende 20 minuten bij 37 °C.
  3. NBDG incubatie
    1. Breng elk netvlies over naar een nieuwe, vooraf gelabelde buis voor 6-NBDG-incubatie vanaf stap 1.1.4, die 200 μL 500 μM 6-NBDG bevat in neurobasaal-A-medium vanaf stap 1.2.2.
      OPMERKING: Het netvlies moet worden overgebracht met behulp van een transferpipet die is doorgesneden om de punt te vergroten zodat het netvlies met minimale schade wordt overgebracht. Bovendien kan dit met een pincet worden gedaan als men er zeker van is dat men het netvlies zonder schade kan overbrengen.
    2. Breng de buizen over naar een waterbad van 37 °C en incubeer gedurende 60 minuten bij 37 °C.
  4. Voorbereiding van 6-NBDG-normen (concentratiebereik 0 μM-40 μM)
    OPMERKING: Bereid de standaarden voor tijdens de 60 min 6-NBDG incubatietijd (stap 2.3.2.). Standaarden kunnen bij kamertemperatuur worden bereid. Bescherm oplossingen tegen licht.
    1. Label 1,5 ml microcentrifugebuisjes #1-8 voor de 8 standaarden (zie figuur 3).
    2. Voor standaard #1 (40 μM 6-NBDG) pipetteer 32 μL 500 μM 6-NBDG stockoplossing gemaakt in stap 1.2.1.
    3. Voeg 368 μL neurobasal-A media toe aan de microcentrifugebuis en meng grondig door op en neer te pipetteren.
    4. Voor normen #2-8 worden de monsters als volgt serieel verdund:
      1. Pipetteer 200 μL neurobasal-A media in buisjes #2-8.
      2. Neem 200 μL uit standaard tube #1 en pipetteer deze in tube #2, meng vervolgens grondig met de pipet door op en neer te pipetteren.
      3. Neem 200 μL uit standaard tube #2 en pipette in standaard tube #3. Meng grondig met de pipet door op en neer te pipetteren.
      4. Neem 200 μL uit standaard tube #3 en pipetteer het in tube #4, meng vervolgens grondig door het op en neer te pipetteren.
      5. Neem 200 μL uit standaard tube #4 en pipetteer het in tube #5, meng vervolgens grondig door het op en neer te pipetteren.
      6. Neem 200 μL uit standaard tube #5 en pipetteer het in tube #6, meng het vervolgens grondig door het op en neer te pipetteren.
      7. Neem 200 μL uit standaard tube #6 en pipetteer het in tube #7, meng het vervolgens grondig door het op en neer te pipetteren.
      8. Voeg geen extra oplossing toe aan buis #8 (d.w.z. het mag slechts 200 μL neurobasale A-media bevatten die in stap 2.4.4.1 zijn toegevoegd).
  5. Wassen, sonicatie en centrifugatie voor monsterafname
    1. Verwijder alle buisjes uit het waterbad van 37 °C zodra de 60 minuten durende 6-NBDG-incubatie is voltooid.
    2. Spoel elk netvlies zo snel en voorzichtig mogelijk met 500 μL ijskoude neurobasale A-media.
      1. Om te wassen, verwijdert u de 6-NBDG-oplossing met een pipet en zorgt u ervoor dat u het netvliesweefsel niet aanraakt of verstoort.
        OPMERKING: Er is ook de mogelijkheid om het netvlies met een pincet over te brengen van de 6-NBDG-incubatiebuis naar een verse buis met 500 uL neurobasale A-media. Dan hoef je nog maar 3 wasbeurten te doen. Doe dit als u vertrouwd bent met uw vermogen om het netvlies niet te beschadigen met een pincet.
      2. Gooi de oplossing vervolgens weg in een geschikte afvalcontainer. Piket onmiddellijk 500 μL koud neurobasaal-A-medium in hetzelfde buisje om de verwijderde oplossing te vervangen. Vervang de tubes op ijs tussen de wasbeurten door.
    3. Herhaal nog 3 keer voor een totaal van 4 wasbeurten.
    4. Breng met behulp van een transferpipet met bijgesneden rand of een pincet het netvlies voorzichtig over naar de sonicatiebuisjes met neurobasaal A-medium op ijs (zie stap 1.1.4).
    5. Snijd het netvlies in kleine stukjes met behulp van een kleine dissectieschaar.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u gereedschap in ethanol wast tussen het hakken van elk netvlies om andere monsters niet te besmetten.
    6. Sonificeer elk netvlies gedurende 5-10 s met een amplitude van 10 en plaats het onmiddellijk weer op ijs.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de sonicatiesonde tussen de monsters reinigt met 100% ethanol, gevolgd door ultrazuivere H2O. Koel de centrifuge nu voor tot 4 °C of gebruik de centrifuge in een inloopkoelruimte van 4 °C, indien beschikbaar.
    7. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 21130 x g ofde maximale snelheid indien deze minder is dan 21130 x g.
      OPMERKING: Tijdens de centrifuge van 15 minuten in stap 2.5.7 pipetteer u 100 μL van standaard #1-8 gemaakt in stap 2.4 in een zwarte, doorzichtige bodemplaat met 96 putjes.
  6. Voorbeelden lezen op een plaatlezer
    1. Nadat de centrifuge van 15 minuten is afgelopen, verwijdert u 100 μl supernatans en pipeteert u in de plaat met 96 putjes.
    2. Plaats de plaat in de plaatlezer.
      NOTITIE: De plaat moet 100 μL van elk monster en 100 μL van elke standaard bevatten.
    3. Selecteer in de plaatlezersoftware de fluorescentie-eindpunttest met parameters geselecteerd in stap 1.1.7.
    4. Voer de test uit en sla de resultaten op.
    5. Pipettemonsters van een plaat met 96 putjes in de voorgelabelde buisjes van 1.1.4 voor de Pierce-test.
      OPMERKING: Op dit punt kunnen de monsters onmiddellijk worden getest op eiwit (zie hieronder) of worden bewaard bij -80 °C.
  7. Pierce-test voor eiwitnormalisatie
    OPMERKING: De Pierce-test moet in tweevoud worden uitgevoerd (zowel standaarden als monsters) voor een grotere nauwkeurigheid.
    1. Met behulp van de Pierce-assay voorverdunde eiwitteststandaarden, pipetteer 10 μL van elk in tweevoud in een doorzichtige bodemplaat met 96 putjes.
    2. Pipetteer 10 μl van elk van de monsters in tweevoud uit stap 2.6.5 in de plaat met 96 putjes.
    3. Voeg 150 μl Pierce-reagens toe aan alle putjes die standaarden of monsters bevatten. Dek de plaat met 96 putjes af en meng op een bordschudder op gemiddelde snelheid gedurende 1 minuut.
    4. Incubeer de plaat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    5. Plaats de plaat in de plaatlezer. Selecteer de extinctie-eindpunttest en stel de golflengte in op 660 nm.
    6. Meet de absorptie van standaarden en monsters en sla de resultaten op. Bereken het totale aantal microgram-eiwitten in elk monster door een standaardcurve uit te zetten.
  8. Berekening van retinale 6-NBDG-opname.
    OPMERKING: 6-NBDG-resultaten moeten worden genormaliseerd naar het totale eiwitgehalte vanwege ongelijke afmetingen van het netvlies.
    1. Gebruik met behulp van de fluorescentie-intensiteitswaarden die in stap 2.6 zijn verkregen, de fluorescentiemetingen van vooraf bepaalde normen om een 6-NBDG-fluorescentiestandaardcurve uit te zetten en de 6-NBDG-concentratie (μM) in elk monster te kwantificeren.
    2. Normaliseer de monsterresultaten naar overeenkomstige eiwithoeveelheden om [6-NBDG] μM/μg-eiwit te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 4 toont representatieve glucosefluorescentiemetingen van WT-muizennetvlies geïncubeerd met 6-NBDG gedurende verschillende perioden. Na een incubatie van 30 minuten waren de 6-NBDG-niveaus gemiddeld 336 ± 27,91 AE, terwijl na 60 minuten de niveaus van 6-NBDG toenamen tot een gemiddelde van 616,3 ± 8,38 AE. Een verdere incubatie van 30 minuten leidde tot een verlaagd niveau van 6-NBDG (506,4 ± 5,3 AE). Na 60 minuten was de variabiliteit in de resultaten...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Samenvattend stelt de beschreven methode fundamentele wetenschappelijke onderzoekers in staat om de opname van het fluorescerende glucose-analoog, 6-NBDG, in ex vivo muizen neurale netvlies te meten. Glucose is een essentiële metaboliet voor het neurale netvlies, de opname ervan ondersteunt de hoge snelheid van glycolyse en mitochondriale ademhaling die nodig zijn om energie te produceren in de vorm van adenosinetrifosfaat (ATP)1. Aangezien glucose het ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door onbeperkte departementale fondsen die werden toegekend aan Lauren K. Wareham.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
# 5 forcepsKatenaK5-6550Gebruikt voor retina dissectie
1.5 mL microcentrifugebuizenThermo Fisher Scientific05-408-129
26 G x 5/8" naaldsol-M112658Gebruikt om hoornvlies te puncteren tijdens dissectie
5 mL buizenMTC bioc2540
50 mL buizenAvantor by VWR89039-656
6-NBDGInvitrogenN23106Fluorescente glucose analoog
96 well platen zwart met heldere bodemThermo Fisher Scientific265301
Anesthetisch koolstoffiltercartridgeReFreshEZ-258Gebruikt in anesthesieset-up
BAY-876Millipore SigmaSML1774Voor inhibitie van GLUT1.
Centrifuge bij 4 °CEppendorfEPP-5424
Gecomprimeerd gas (5% koolstofdioxide, 95% zuurstof)AirgasUN3156Gebruikt in anesthesieset-up
Gebogen forcepsRoboz chirurgisch instrumentRS-5137Gebruikt voor retina dissectie
DDH2OElga LabWaterElga PureLab UltraGebruikt na ethanol om sonicator schoon te maken tussen monsters
DissectiemicroscoopOlympusszX12Gebruikt voor retina dissectie
Ethanol 200 proofDecon laboratories2701Te gebruiken om sonicator schoon te maken tussen monsters
Schuimzwevende buisenkastThermo Fisher Scientific36-099-2328Voor buizen tijdens incubatie in waterbadstappen
Algemene schaarRoboz chirurgisch instrumentRS-680Gebruikt voor retina dissectie
Isofluraan 250 mL flesPiramal critical careNDC  6679401725Anesthesie
Isofluraan apparatuurVetequip verkocht door VWR89012-492Gebruikt om te anesthetiseren voorafgaand aan euthanasie
KimdoekjesVWR82003-820
MicroplaatlezerMolecular devicesSpectraMax M2 microplaatlezerGebruikt om monster te lezen
Neurobasal- A mediaGibco12349-015
Neuskoker (anesthesiemasker met laag profiel)Kent ScientificSOMNO-0801Gebruikt om anesthesie te leveren
Objectief op dissectiemicroscoopOlympusDF plapo 1x pfGebruikt voor retina dissectie
PetrischaalVWR25384-088Gebruikt tijdens retina dissectie
Pierce assay reagensThermo Fisher Scientific1861426
Pipettiptips P20Olympus Plastics26-404
Pipettiptips P200, P1000, P10 XLVWR76322-150, 76322-154, 76322-132
Pipetteman pipetten P200, P1000, P20, P10VWRF144055M, F144056M, F144058M, F144059M
SoftMax Pro software op computerMolecular devicesSoftMax Pro 7 softwareSoftware gebruikt om monster te lezen
Sonische desmembratorThermo Fisher ScientificFB50110Soniceer monster (retina)
OverdrachtpipettenFisherbrand13-711-9AMGebruikt om retina van de ene buis naar de andere over te brengen
Vannas veerschaarKatenaK4-5000Gebruikt voor retina dissectie
Waterbad ingesteld op 37 °CN/AN/AGebruikt voor incubatie

Referenties

  1. Casson, R. J., Chidlow, G., Crowston, J. G., Williams, P. A., Wood, J. P. M. Retinal energy metabolism in health and glaucoma. Prog Retin Eye Res. 81, 100881(2021).
  2. Daniele, L. L., et al. Glucose uptake by GLUT1 in photoreceptors is essential for outer segment renewal and rod photoreceptor survival. FASEB J. 36 (8), e22428(2022).
  3. Fernandes, R., Hosoya, K. -I., Pereira, P. Reactive oxygen species downregulate glucose transport system in retinal endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C927-C936 (2011).
  4. Badr, G. A., Tang, J., Ismail-Beigi, F., Kern, T. S. Diabetes downregulates GLUT1 expression in the retina and its microvessels but not in the cerebral cortex or its microvessels. Diabetes. 49 (6), 1016-1021 (2000).
  5. Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15 (4), 261-273 (1999).
  6. Winkler, E. A., et al. GLUT1 reductions exacerbate Alzheimer's disease vasculo-neuronal dysfunction and degeneration. Nat Neurosci. 18 (4), 521-530 (2015).
  7. Mosconi, L., et al. Hypometabolism exceeds atrophy in presymptomatic early-onset familial Alzheimer's disease. J Nucl Med. 47 (11), 1778-1786 (2006).
  8. Moreno, M., et al. Morphological and morphometric changes in rat optic nerve microvessels in a glaucoma experimental model. Arch Soc Esp Oftalmol. 89 (12), 471-476 (2014).
  9. Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. J Neurochem. 109 (s1), 94-100 (2009).
  10. Hamilton, K. E., Bouwer, M. F., Louters, L. L., Looyenga, B. D. Cellular binding and uptake of fluorescent glucose analogs 2-NBDG and 6-NBDG occurs independent of membrane glucose transporters. Biochimie. 190, 1-11 (2021).
  11. Feigenspan, A., Babai, N. Z. Preparation of horizontal slices of adult mouse retina for electrophysiological studies. J Vis Exp. 119, e55173(2017).
  12. Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nat Commun. 6 (1), 6807(2015).
  13. Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64 (3), 207-215 (2005).
  14. Wareham, L. K., et al. Solving neurodegeneration: common mechanisms and strategies for new treatments. Mol Neurodegener. 17 (1), 23(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Glucoseopnamefluorescent glucose-analoog6-NBDG-opnamedissectie van het netvliesplate reader-assayglucosetransportersGLUT1-remmereiwitnormalisatieex vivo netvlies
Meting van de opname van de glucose-analoog, 6-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-6-deoxyglucose, in intact neuraal netvlies van muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.