Methodenartikel

Chronische craniale venstertechniek voor herhaalde corticale opnames tijdens anesthesie bij varkens

DOI:

10.3791/67931

⸱

6 juni 2025

 ,  ,  ,  , 
1Center for Neuroplasticity and Pain, Department of health, science and technology, Aalborg University, 2Department of Cardiovascular Surgery, Department of Clinical Medicine, Aalborg University Hospital

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie presenteert een schaalbare, betrouwbare en reproduceerbare methode voor herhaalde chronische corticale opnames in een varkensmodel. De methode heeft toepassingen in verschillende gebieden van de neurowetenschappen, waaronder pijnonderzoek en diagnostiek van neurologische aandoeningen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Corticale opnames zijn essentieel voor het extraheren van neuronale signalen om verschillende toepassingen te informeren, waaronder hersen-computerinterfaces en ziektediagnostiek. Elke toepassing stelt specifieke eisen aan de opnametechniek en voor langdurige opnames wordt vaak gekozen voor invasieve oplossingen. Invasieve registratiemethoden worden echter uitgedaagd door apparaatfalen en ongunstige weefselreacties, die de signaalkwaliteit op lange termijn in gevaar brengen.

Om de betrouwbaarheid en kwaliteit van chronische corticale opnames te verbeteren en tegelijkertijd de risico's in verband met apparaatfalen en weefselreacties te minimaliseren, hebben we een craniale venstertechniek ontwikkeld. In dit protocol rapporteren we methoden om een schedelvenster te implanteren en te openen bij juveniele landrasvarkens, wat tijdelijke plaatsing van elektrocorticografie (ECoG) array op de dura mater mogelijk maakt. We beschrijven verder hoe corticale signalen kunnen worden geregistreerd met behulp van de cranial window-techniek. Toegang tot het craniale venster kan meerdere keren worden herhaald, maar een minimum van 2 weken tussen implantaat- en toegangsoperaties wordt geadviseerd om herstel en weefselgenezing te vergemakkelijken.

De craniale vensterbenadering minimaliseerde met succes gemeenschappelijke elektrodefaalmodi en weefselresponsen, wat resulteerde in stabiele en betrouwbare corticale opnames in de loop van de tijd. We hebben als voorbeeld event-related potentials (ERP's) uit de primaire somatosensorische cortex geregistreerd. De methode leverde zeer betrouwbare opnames op, waardoor ook het effect van een interventie (hoogfrequente stimulatie) op de ERP's kon worden beoordeeld. De afwezigheid van significante apparaatstoringen en het verminderde aantal gebruikte elektroden (twee elektroden, 43 opnamesessies, 16 dieren) suggereren een verbeterde onderzoekseconomie. Hoewel er een kleine chirurgische toegang nodig is voor het plaatsen van de elektrode, biedt de methode voordelen zoals een verminderd infectierisico en een beter dierenwelzijn.

Deze studie presenteert een schaalbare, betrouwbare en reproduceerbare methode voor chronische corticale opnames, met mogelijke toepassingen op verschillende gebieden van de neurowetenschappen, waaronder pijnonderzoek en diagnose van neurologische aandoeningen. Toekomstige aanpassingen kunnen het gebruik ervan uitbreiden naar andere soorten en registratiemodaliteiten, zoals intracorticale opnames en beeldvormingstechnieken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Over het algemeen is het doel van corticale opnames om informatie te extraheren uit neuronale signalering in de hersenen. Deze informatie kan op verschillende manieren worden gebruikt: het besturen van een extern apparaat, communicatie, ziektediagnose of revalidatie 1,2,3,4. Elke toepassing stelt unieke eisen aan de vereiste informatie-inhoud en ruimtelijke resolutie en de mate van invasiviteit die als acceptabel wordt beschouwd. Daarom zijn er sinds de ontdekking van het elektro-encefalogram in 1929 5 opnameoplossingen ontwikkeld met een scala aan invasiviteit en ruimtelijkeresolutie.

Over het algemeen kunnen deze worden onderverdeeld in elektro-encefalografie (EEG), elektrocorticografie (ECoG) en intracorticale opnames. EEG is een niet-invasieve registratiemethode die neurale oscillaties en gebeurtenisgerelateerde potentialen (ERP's) van de hele hersenen vastlegt. Het vermogen om de bronnen van deze activiteit te definiëren is echter beperkt vanwege de lage ruimtelijke resolutie. ECoG is een meer invasieve methode waarbij elektroden epi- of subduraal worden geplaatst, meestal een kleiner deel van de cortex bedekken. Het heeft een hogere ruimtelijke resolutie en kan ERP en surface local field potentials (LFP) registreren. Daarom kan het de bron van hersenactiviteit nauwkeuriger lokaliseren, waardoor het bijvoorbeeld nuttig is bij het identificeren van de oorsprong van focale epilepsie. De intracorticale registratie is de meest invasieve registratiemethode en kan piekactiviteit registreren van individuele neuronen die zich oppervlakkig of diep in de hersenen bevinden en LFP van het volume van neuronen rond de elektroden. Deze signalen hebben een zeer hoge ruimtelijke resolutie en informatie-inhoud, maar worden geproduceerd door een beperkte subset van neuronen (1-10 neuronen per kanaal)6.

Om gedurende langere perioden (maanden-jaren) informatie uit de hersenen te halen, moet de interface stabiel en betrouwbaar zijn om ervoor te zorgen dat de verkregen signalen gedurende de hele periode dezelfde informatie blijven vertegenwoordigen. EEG-opnames vereisen frequente elektrodewisselingen, waardoor hun betrouwbaarheid variabel is van zeer laag tot zeer hoog 7,8,9,10. ECoG en intracorticale methoden worden daarom vaak gekozen voor langdurige opnames. Deze methoden vereisen echter beide dat de toestand van de opname-elektrode, evenals het weefsel, in de loop van de tijd stabiel moet blijven. Hoewel de elektrode meestal op dezelfde locatie blijft, kan de elektrode-weefselinterface veranderen als gevolg van weefselreacties of elektrodestoringsmodi 11,12,13,14. Weefselreacties omvatten neuronale dood, bloeding, biofouling, reactie van vreemde lichamen, gliose, inkapseling, infectie, meningitis en meningeale extrusie15. Deze reacties brengen de opnamemogelijkheden van de elektrodenin gevaar 12,13. Veel voorkomende defecten aan de elektrode zijn delaminatie of lekkage van de geïsoleerde onderdelen, delaminatie of barsten van de elektrode-oppervlaktecoating, draadbeschadiging en elektrodedislocatie11,12.

Om defecte elektrodemodi te overwinnen, hebben we de levensvatbaarheid overwogen van een tijdelijke oplossing voor het plaatsen van elektroden die ook veel van de uitdagingen aanpakt die verband houden met weefselreacties, namelijk neuronale dood, reactie van vreemde lichamen, gliose, inkapseling en meningeale extrusie. Bovendien was een consistente plaatsing van de elektroden een vereiste om betrouwbare en reproduceerbare neuronale opnames te verkrijgen. Aangezien de elektrode epiduraal op een afstand van enkele millimeters van het zenuwweefsel werd geplaatst, mag de beweging van de elektrode niet groter zijn dan 1 mm. Het schedelvenster is ontworpen met afmetingen om overmatige beweging tussen de plaatsingen van de elektroden te voorkomen. Met de ontwikkeling van de craniale venstertechniek willen we de betrouwbaarheid en kwaliteit van het signaal op de lange termijn verbeteren en het risico op elektrodefalen wegnemen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is goedgekeurd door de Deense Veterinaire en Voedseladministratie onder het Ministerie van Voedsel, Landbouw en Visserij van Denemarken (protocolnummer 2020-15-0201-00514). In totaal hebben 16 vrouwelijke landrasvarkens de procedures ondergaan. De dieren wogen ongeveer 20 kg bij aankomst in de faciliteit, wat betekent dat ze ongeveer 2 maanden oud waren. Ze wogen ongeveer 30 kg bij implantatie en 40-60 kg aan het einde van het onderzoek. De procedures bestaan uit implantatiechirurgie, toegangschirurgie en terminale chirurgie (Figuur 1).

figure-protocol-1
Figuur 1: Tijdlijn van de experimentele procedures. De toegangsoperatie (fase II) kan meerdere keren worden herhaald. Een scheiding van minimaal 2 weken wordt geadviseerd tussen operaties voor herstel en wondgenezing tussen operaties door. Afkorting: ERP = event-related potential. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Implantatiechirurgie (fase I)

OPMERKING: Een 3D-geprint polymelkzuur (PLA) schedelvenster (Figuur 2) wordt geïmplanteerd om herhaalde opnames van de primaire somatosensorische cortex van het varken mogelijk te maken. ERP's als gevolg van elektrische stimulatie van de nervus ulnaris worden geregistreerd. De operatie en wondsluiting worden uitgevoerd zodat het schedelvenster vervolgens kan worden betreden en gesloten.

figure-protocol-2
Figuur 2: Ontwerp van het schedelvenster. (A) Zijaanzicht van het schedelvenster dat de hoogte van de muren aangeeft en de basis die aan de schedel is bevestigd. (B) Bovenaanzicht met vermelding van de diameter van de schedelweduwe, de schroefgaten, de kapruimte en het raam. De schedelvensterkap is een cilinder met een diameter van 22 mm en een hoogte van 1 mm die precies in de kapruimte past. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Implantatie van schedelvenster
    1. Voorbereiding op een operatie
      OPMERKING: De gegevensverwerker (RZ2), het werkstation (WS8) en de pc worden ingeschakeld voordat de operatie wordt gestart. Operatienotities worden ten minste elke 15 minuten door een niet-steriele onderzoeker op een spreadsheet gemaakt om vitale functies (hartslag, spO2, end-tidal CO2, kerntemperatuur), anesthesieniveaus (propofol-infusiesnelheid, fentanyl-infusiesnelheid, sevofluraanpercentage), stadium van de operatie en eventuele onregelmatigheden te documenteren.
      1. Kalmeer het dier met behulp van een intramusculaire injectie van 5-7 ml Zoletil-mengsel (1 ml bevatte 8,3 mg tiletamine, 8,3 mg Zolazepam, 8,3 mg xylacine en 1,7 mg butofaan).
        OPMERKING: Voor deze specifieke studie werd ketamine weggelaten uit het Zoletil-mengsel om blokkering van NMDA-receptoren te voorkomen.
      2. Vervoer het dier naar de operatiekamer. Intubeer het dier en sluit het aan op een mechanische ventilator.
      3. Plaats een ooraderkatheter om propofol, fentanyl en zoutoplossing toe te dienen.
      4. Chirurgische anesthesie toedienen: Sevofluraan 1-2%, propofol (10 mg/ml toegediend in een dosis van 8 mg∙ kg-1∙h-1), fentanyl (50 μg/ml toegediend in een dosis van 20 μg∙ kg-1∙h-1).
      5. Markeer de incisieplaats met een steriele stift voordat u deze steriel drapeert. Identificeer het bregmapunt door rechte lijnen te trekken tussen elk oor en het contralaterale oog; het bregmapunt bevindt zich op het snijpunt van die lijnen (Figuur 3A). Zorg ervoor dat de incisie iets lateraal is ten opzichte van de middellijn aan de kant contralateraal van de gestimuleerde voorpoot.
      6. Plaats de metalen plaat onder de gordijnen en zorg voor een goede plaatsing en stabiliteit voordat u met de operatie begint.
    2. Toegang tot de schedel
      OPMERKING: In dit en de volgende delen van het protocol worden alle procedures uitgevoerd door een steriele chirurg, tenzij anders aangegeven.
      1. Maak de eerste incisie in de dermis met een scalpel iets lateraal van de middellijn, zoals aangegeven in stap 1.1.1.5. Ga verder met de incisie door de huid met een cauterizer.
        OPMERKING: Verleng de incisie niet te ver naar voren om de grote frontale sinussen van het varken te vermijden. Als er meer ruimte nodig is, verleng dan de incisie aan de achterzijde.
      2. Plaats het retractor en houd de huid omhoog met een tang en snijd het avasculaire bindweefsel tussen het periosteum en de subcutis door (Figuur 3B) om de huid meer flexibiliteit te geven en het hechten in stap 1.4 te vergemakkelijken. Pas het oprolmechanisme aan de gewonnen flexibiliteit aan.
      3. Snijd het periosteum in en maak het los van de schedel met behulp van een periosteumlift. Houd het botzakje opzij met behulp van het oprolmechanisme.
    3. Toegang tot de dura
      1. Boor een gat met een diameter van 10 mm aan de voorkant van de sagittale hechtlijn en lateraal aan de middellijn (Figuur 3C). Begin bij een diameter van 15 mm om een gat met een diameter van 10 mm op dura-niveau te krijgen, aangezien de afgeronde boor resulteert in een licht taps toelopend gat.
      2. Monteer het schedelvenster in een vroeg stadium op het gat om een goede pasvorm te garanderen.
      3. Schakel over op een kleinere boor wanneer de dura zichtbaar wordt om de maximale breedte van het gat op dura-niveau te bereiken. Knip de randjes af met Rongeurs.
    4. Implantatie van schedelvenster
      1. Controleer of het schedelvenster in en tot de bodem van het gat past en bepaal de diepte. Hoewel dit dierafhankelijk is, moet u ervoor zorgen dat de wanden van het schedelvenster de dura bereiken voor een goede pasvorm, maar op geen enkele locatie druk uitoefenen op de hersenen.
      2. Markeer de schroefgaten met de handboor terwijl u het schedelvenster op zijn plaats houdt.
      3. Verwijder het schedelvenster en boor de gaten minimaal 4 mm diep. Penetreer de schedel voor een van de schroeven om deze te gebruiken als aarde/referentie voor de corticale opnames.
      4. Plaats het schedelvenster (Figuur 3) en verwijder de naald uit de vlinderinfusieset. Meet de diepte van de schroefgaten door het schedelvenster met behulp van de stompe vlinder. Steek een schroef met een gelijke lengte in het gat en draai deze vast.
        OPMERKING: Een te lange schroef zal de kap van het schedelvenster niet goed bevestigen.
      5. Plaats een U-connector onder één schroef die de schedel perforeert en de dura raakt.
        OPMERKING: Het is belangrijk dat de lengte van deze schroef groter is dan de dikte van de schedel, zodat teruggroeiend bot contact met de dura niet verhindert.
  2. Implantatie van perifere draad
    OPMERKING: Deze procedure kan gelijktijdig met de implantatie van het craniale venster worden uitgevoerd. Dit is een steriele procedure. Om besmetting van de operatieplaats of de schedelplaats te voorkomen, moet steriele kleding worden gedragen.
    1. Implanteren van draden in de buurt van de nervus ulnaris
      1. Breng elektrische stimulatie met 5 mA aan op de huid door de huid aan het achterste distale deel van de voorpoot aan te raken met twee naalden (niet doordringend) of een ander steriel stuk metaal met een tussenpoos van 2 cm. Zoek naar een duidelijke hoefflexie, wat aangeeft dat de zenuw tussen deze twee punten loopt.
        OPMERKING: Het ledemaat moet mogelijk naar achteren worden gedraaid, zodat het achterste deel gemakkelijker toegankelijk is.
      2. Steek de twee naalden loodrecht op de loop van de zenuw ongeveer 2 cm uit elkaar. Prik opnieuw in de huid op ongeveer 3 cm van het inbrengpunt (figuur 4A).
      3. Controleer de locatie met behulp van een teststimulus die met 2 mA op de naalden wordt aangebracht; Zorg ervoor dat er een duidelijke beweging van de hoef zichtbaar is.
      4. Leid de Cooner-draden door de naalden en verwijder de naalden, waarbij de Cooner-draden gedeeltelijk onder de huid blijven. Zorg ervoor dat het niet-geïsoleerde deel in het midden van de draad zich voor beide draden onder de huid bevindt (Figuur 4B).
        OPMERKING: Als het ledemaat naar achteren is gedraaid, draai het dan voorzichtig naar voren.
      5. Bevestig elke krokodillenconnector aan een geïsoleerd uiteinde van de twee Cooner-draden.
    2. Motorische drempel vaststellen
      1. Zoek de motordrempel met behulp van de omhoog-omlaag-methode16,17; begin bij 100 μA, verhoog met stappen van 50 μA, terwijl u kijkt en voelt naar een motorische reactie in het hoefgebied. Een drempel onder de 1 mA is doorgaans haalbaar.
      2. Programmeer de STG om 100 rechthoekige bifasische symmetrische stimuli te leveren met een pulsbreedte van 200 μs bij 2x de motordrempel, gevolgd door 100 stimuli bij 10x de motordrempel.
  3. Registratie van corticale signalen
    1. Laat een niet-steriele onderzoeker de voorversterker op zijn plaats brengen en sluit deze met behulp van glasvezelkabels aan op de dataprocessor (RZ2).
    2. Verlaag sevofluraan tot 0,5-1% (de helft van het chirurgische niveau) en controleer de hartslag, verlopen CO2 en bloeddruk (indien beschikbaar) om een adequate en stabiele diepte van de anesthesie te garanderen. Verhoog zowel propofol als fentanyl indien nodig.
    3. Laat een niet-steriele onderzoeker de headstage bevestigen aan de voorversterker (SI8) en plaats de headstage (ZIF-clip) in de headstagehouder, die op de magnetische standaard micromanipulator is gemonteerd.
    4. Plaats de steriele drapering rond de micromanipulator en bevestig het zelfklevende deel aan de hoofd- en hoofdpodiumhouder (Figuur 5A).
    5. Laat een niet-steriele onderzoeker de micromanipulator vastzetten met behulp van de magnetische standaard, dompel de μECoG-elektrode in alcohol en plaats deze op het hoofdpodium (ZIF-clip).
      NOTITIE: Laat de elektrode drogen voordat u deze op de dura plaatst. Zorg ervoor dat u alleen de steriele draperieën aanraakt die het hoofdpodium bedekken, aangezien de μECoG-elektrode niet steriel is.
    6. Breng de μECoG op zijn plaats met behulp van de micromanipulator en leid deze met een wattenstaafje. Sluit de aarddraden van de μECoG aan op de massaschroef met een krokodillenconnector.
    7. Verlaag sevofluraan tot 0%, controleer de hartslag, verlopen CO2 en bloeddruk (indien beschikbaar) om een adequate en stabiele diepte van de anesthesie te garanderen, verhoog zowel propofol als fentanyl indien nodig.
    8. Bekijk een voorbeeld van de signalen in de synaps; het typische signaalbereik is maximaal ±100 μV.
      1. Als het signaal eruitziet als een vetgedrukte lijn (indicatief voor lijnruis), laat dan een steriel persoon de volgende acties uitvoeren: onderzoek het aardingscircuit en houd de aardingsschroef en verbindingen droog en geïsoleerd van nabijgelegen weefsels. Onderzoek of andere bekabeling geïsoleerd is van het varkenslichaam en chirurgische instrumenten. Als dit niet het geval is, gebruik dan steriel gaas om de bekabeling van het lichaam of chirurgische instrumenten te isoleren.
      2. Als de amplitude van het signaal groter is dan ±100 μV (indicatie van bewegingsartefacten), zorg er dan voor dat de elektrode is opgehangen en op de hersenen rust en dat de bekabeling niet beweegt wanneer het varken beweegt als gevolg van ventilatie of elektrische stimulatie van de nervus ulnaris.
      3. Als de signaalamplitude kleiner is dan ± 20 mV (indicatie van slecht contact of diepe anesthesie), zorg er dan voor dat de μECoG op de hersenen rust en dat de dura en elektrode gehydrateerd zijn; Druppel indien nodig wat zoutoplossing op de elektrode. Zorg ervoor dat sevofluraan is uitgeschakeld en verlaag de infusiesnelheid van propofol (en mogelijk fentanyl). Voer een teststimulatie uit en controleer of er opgewekte reacties zichtbaar zijn. Zorg ervoor dat het niet-geïsoleerde deel van de randdraad zich volledig onder de huid bevindt.
        OPMERKING: Opgeroepen reacties kunnen meestal worden onderscheiden in enkele sweeps online, maar het is ook mogelijk om dit offline te evalueren, met een gemiddelde van 5-10 stimuli. Als er een piek zichtbaar is op het moment van de trigger, is dit een stimulatie-artefact. Het stimulatie-artefact zal de gegevensanalyse verstoren.
    9. Plaats een steriel gaasje op de elektrode om een goed weefselcontact te behouden. Druppel een zoutoplossing op de lichaamstemperatuur op het gaas om uitdroging van het weefsel te voorkomen.
      OPMERKING: Aangezien deze opnames epiduraal zijn, is de exacte temperatuur niet essentieel. Bij subdurale opnames is dit kritischer.
    10. Laat de elektrode tot rust komen (30 min) en documenteer de plaatsing van de elektrode en de opstelling van de massaconnector om vergelijkbare volgende opnamen te garanderen (Figuur 5B-D). Begin met opnemen en wacht 30 s voordat u het stimulatieprogramma elke 10 minuten start.
      OPMERKING: Controleer regelmatig tussen de opnames door of het gaasje op de elektrode gehydrateerd blijft en druppel indien nodig een zoutoplossing op lichaamstemperatuur.
    11. Voer een interventie uit na drie stimulatierondes (om als basislijn voor de interventie te dienen). Herhaal de stimulatie gedurende nog eens negen ronden.
      OPMERKING: Blijf tussen de opnames door regelmatig controleren of het gaas op de elektrode gehydrateerd blijft en druppel indien nodig een zoutoplossing in.
  4. Sluiting van de implantaatplaats
    1. Verwijder het gaasje van de elektrode en verwijder de elektrode met behulp van de micromanipulator terwijl u deze voorzichtig met een wattenstaafje geleidt.
    2. Laat een niet-steriele onderzoeker de micromanipulator, elektrode, hoofdstage en voorversterker verwijderen en opbergen en reinig de elektrode volgens de aanwijzingen van de fabrikant door snel af te spoelen met gedeïoniseerd water om weefselresten te verwijderen. Week de elektrode maximaal 4 uur in lenzenreiniger om weefsel en eiwitten van het elektrodeoppervlak te verwijderen, gevolgd door een tweede spoeling met gedeïoniseerd water om de lensreiniger van het elektrodeoppervlak te verwijderen. Voordat u het opbergt, dompelt u de elektrode in isopropylalcohol.
    3. Plaats de kap van het schedelvenster om het schedelvenster te sluiten en zorg ervoor dat deze precies in het schedelvenster past. Het vereist geen extra bevestiging; Druk van de huid op het implantaat houdt het op zijn plaats.
    4. Plaats het antibioticazakje op de kap van het schedelvenster en sluit de huid subcutaan af met enkelvoudige resorbeerbare hechtingen met behulp van de ingegraven verticale matrashechttechniek (Figuur 6A). Plaats hechtingen op een afstand van 5-10 mm, waardoor er ruimte is om de huidhechtingen te plaatsen. Knoop de laatste drie hechtingen niet vast na het plaatsen. Bind in plaats daarvan deze drie hechtingen vast wanneer alle hechtingen zijn geplaatst.
      LET OP: Het vastbinden van de laatste drie hechtingen na het plaatsen van alle drie zorgt ervoor dat er voldoende ruimte is om de laatste hechtingen te plaatsen.
    5. Plaats continue intradermale hechtingen op een continue manier in de huid. Begin de intradermale hechting 1-2 cm lateraal van de incisieplaats en tunnel onder de huid naar de huidlaag maar onder het oppervlak (Figuur 6B) om overmatig krabben en losraken van de hechtingen te voorkomen. Leg een knoop aan het laterale uiteinde van de hechtdraad.
      OPMERKING: Propofol en fentanyl kunnen tijdens deze procedure worden uitgeschakeld, omdat deze enkele minuten wakker worden.
    6. Plaats de doorlopende hechting tussen de onderhuidse hechtingen totdat de andere kant van de incisie is bereikt.
      LET OP: Het is belangrijk dat de hechting in de dermis naar buiten komt maar niet in de huid prikt zodat het dier minder goed aan de hechtingen kan krabben.
    7. Tunnel de hechtdraad 1-2 cm lateraal van de incisie naar een laterale uitgangsplaats en leg een knoop (Figuur 6B). Breng weefsellijm aan op de incisieplaats.
  5. Dieren terug naar huis pen
    1. Verwijder de steriele lakens van het dier en spenen het dier van de beademing zodra er beweging wordt waargenomen.
    2. Breng het dier over naar het thuishok en houd het een nacht gescheiden van het hok.
      OPMERKING: Varkens worden na de operatie gescheiden, omdat het normaal is dat ze gewelddadig proberen de hokgenoot wakker te maken, wat resulteert in bijtwonden. Varkens moeten snuitcontact kunnen hebben.

figure-protocol-3
Figuur 3: Implantatie van het schedelvenster. (A) De verwachte locatie van het bregmapunt wordt geïdentificeerd en op het varken gemarkeerd voordat het steriel wordt gedrapeerd, omdat dit daarna moeilijk te onderscheiden kan zijn. (B) Na de incisie in de huid wordt de avasculaire subcutis met een schaar losgemaakt. (C) Er wordt een gat met een diameter van 15 mm in de schedel geboord en de randen worden verwijderd met behulp van rongeurs. De coronale en sagittale hechtlijnen zijn gemarkeerd. (D) Het schedelvenster wordt geïmplanteerd en bevestigd met schroeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-4
Figuur 4: Implantatie van randdraden. (A) Twee naalden van 23 G worden in de huid geplaatst en de Cooner-draden worden erdoorheen ingebracht. (B) De naalden worden verwijderd en de draden blijven in de huid zitten die met behulp van krokodillenklemmen met de stimulator is verbonden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-5
Afbeelding 5: Corticale opname-instelling. (A) De elektrode-array wordt op de dura geplaatst en de hoofdstagehouder en micromanipulator bevinden zich tijdens een implantatieoperatie in een steriele huls, waarbij de incisie langer en meer lateraal is. (B) Close-up van de μECoG in de opnameopstelling tijdens een toegangsoperatie, waarbij de incisie meer mediaal is. (C) De aardingsopstelling, waarbij alle aardings- en referentiedraden op de ECoG worden kortgesloten en via de U-connector worden aangesloten op de pericraniale schroef. (D) Close-up van de hoofdstage en de hoofdstagehouder tijdens een toegangsoperatie. De μECoG wordt op de dura geplaatst. Afkortingen: ECoG = elektrocortografie; μECoG = microECoG. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-6
Figuur 6: Hechttechniek. (A) Schema van de techniek van de onderhuidse begraven verticale matras. (B) Schema van de continue intradermale hechttechniek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Toegangschirurgie (fase II)

OPMERKING: Na 2-4 weken wordt het craniale venster geopend om vervolgopnames uit te voeren van corticale signalen van de S1. De operatie en het sluiten van de wond worden opnieuw op zo'n manier uitgevoerd dat het schedelvenster toegankelijk en weer gesloten kan worden.

  1. Voorbereiding op een operatie
    OPMERKING: Stappen 2.1.1-2.1.6 zijn vergelijkbaar met de stappen 1.1.1.1-1.1.1.6.
    1. Kalmeer het dier met een zoletilmengsel (5 ml zoletil [tiletamine 25 mg/ml en zolazepam 25 mg/ml], 6,25 ml xylazine (20 mg/ml) en 2,5 ml butorfanol (10 mg/ml)).
      OPMERKING: Voor deze specifieke studie werd ketamine weggelaten uit het zoletilmengsel om blokkering van NMDA-receptoren te voorkomen.
    2. Vervoer het dier naar de operatiekamer en intuber en ventileer.
    3. Plaats een ooraderkatheter. Dien propofol, fentanyl en zoutoplossing toe via de katheter.
    4. Chirurgische anesthesie toedienen: Sevofluraan 1-2%, propofol (10 mg/ml toegediend in een dosis van 8 mg∙ kg-1∙h-1), fentanyl (50 μg/ml toegediend in een dosis van 20 μg∙ kg-1∙h-1).
    5. Markeer indien nodig de incisieplaats met een steriele stift voordat u deze steriel drapeert. Identificeer het bregmapunt door rechte lijnen te trekken tussen elk oor en het contralaterale oog; bregma bevindt zich op het snijpunt van die lijnen (Figuur 3A).
      OPMERKING: De eerste incisie is meestal nog zichtbaar. De nieuwe incisie moet ten minste 30 mm van de eerste incisie worden geplaatst om het grootste deel van het littekenweefsel te voorkomen en het sluiten van de wond te vergemakkelijken.
    6. Plaats de metalen plaat onder de gordijnen en zorg voor een goede plaatsing en stabiliteit voordat u met de operatie begint.
  2. Toegang tot het schedelvenster
    OPMERKING: Stappen 2.2.1-2.2.3 zijn vergelijkbaar met de stappen 1.1.2.1-1.1.2.3.
    1. Maak de eerste incisie in de dermis met een scalpel iets lateraal van de middellijn, zoals aangegeven in stap 2.1.5. Ga verder met de incisie door de huid met een cauterizer.
      OPMERKING: In het geval van een terminaal experiment kan de incisie op dezelfde locatie worden gemaakt als de oorspronkelijke incisie.
    2. Plaats het retractor en houd de huid omhoog met een tang en snijd het avasculaire bindweefsel tussen het periosteum en de subcutis door (Figuur 3B) om de huid meer flexibiliteit te geven en het hechten in stap 1.4 te vergemakkelijken. Pas het oprolmechanisme aan de gewonnen flexibiliteit aan.
      OPMERKING: Als dit een terminaal experiment is, kan deze stap worden weggelaten.
    3. Snijd het periosteum in en maak het los van de schedel met behulp van de periosteumlift. Houd het botzakje opzij met behulp van het oprolmechanisme.
    4. Verwijder de kap van het craniale venster en verwijder het verbindingsmiddel uit de opening met zachte cirkelvormige bewegingen met een wattenstaafje totdat de dura is bereikt.
  3. Implantatie van perifere draad
    1. Herhaal stap 1.2.
  4. Registratie van corticale signalen
    1. Herhaal stap 1.3.
  5. Sluiting van de implantaatplaats
    1. Herhaal stap 1.4.
      OPMERKING: Als dit een terminaal experiment is, kan deze stap worden weggelaten.

3. Terminale chirurgie (fase III)

OPMERKING: Na 2-4 weken wordt het craniale venster geopend om vervolgopnames uit te voeren van corticale signalen van de S1. Stap 2.2-2.5 worden herhaald, zoals hierboven beschreven, gevolgd door stap 3.1.

  1. Euthanasie
    OPMERKING: De slang van de ooraderkatheter moet worden gespoeld met zoutoplossing om oxidatie van het barbituraat te voorkomen.
    1. Spoel de oorveinkatheter door met zoutoplossing.
    2. Bevestig een spuit met de overdosis pentobarbital (10 ml, 400 mg/ml) en injecteer de pentobarbital via de ooraderkatheter.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van de cranial window-techniek werden corticale signalen geregistreerd in 43 sessies bij 16 dieren. De dieren genazen op de juiste manier na de operatie en werden tijdens het onderzoek in paren gehuisvest en dagelijks gecontroleerd met behulp van het welzijnsprogramma in aanvullende tabel S1. Alle dieren kregen te allen tijde een score 0, wat wijst op een uitstekend welzijn. Figuur 7 laat zien dat de vensters inderdaad over het S1...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het belang van de ontwikkeling van deze techniek ligt in het verwijderen van elektrodefaalmodi, het verminderen van weefselreacties en daardoor het verbeteren van de betrouwbaarheid van invasieve corticale registratietechnieken. Tijdens het onderzoek deden zich geen elektrodestoringsmodi voor en tijdens het onderzoek werden in totaal twee ECoG-arrays gebruikt, waaronder 16 dieren en 43 opnamesessies. Dit heeft een extra positieve impact op de onderzoekseconomie. Met behulp van traditione...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen de dierenverzorgers en technici van de proefdierfaciliteit van het Universitair Ziekenhuis van Aalborg bedanken. Het Centrum voor Neuroplasticiteit en Pijn (CNAP) wordt ondersteund door de Deense Nationale Onderzoeksstichting (DNRF121). Figuur 6 en Figuur 8 zijn gemaakt in BioRender.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cranial window implantation
Scalpel
Tweezers
Gauze
Cauterizer
Periosteum elevatorplat, 10 mm breedte
Weitlaner retractor3x4 punten, stomp, 16,5 cm
Midas Rex Legend EHS stylus chirurgisch boorsysteemMedtronic Powered Surgical Solutions, Fort Worth, VS
Legend Ball Fine boortje Medtronic Powered Surgical Solutions, Fort Worth, VS7BA40F-MN en 7BA60F-MNMedNext type 4 en 6 mm kopdiameter
Steriele afdekking voor de boor
Spuit5 ml
Zoutoplossing
Zuigpomp
Liniaal
Wattenstaafjes
Rongeurrechte kaken, 15 cm, 3 x 20 mm bitgrootte
2,5 mm handboor en handgreep
Butterfly infuusset
Zes M3 schroeven in 6-14 mm lengte
Schroevendraaier 
Drie maten 3D-geprinte craniale venster (4-, 5- en 6-mm diepte) en dop
Deisoleerd U-vormige connector
Krokodillenconnector
Genta-coll resorbeerbare antibioticumspons
VYCRIL resorbeerbare hechting Ethicon2-0 26 mm ronde lichaam
Monocryl niet-resorbeerbare hechtingEthicon3-0 24 mm omgekeerde snij
Naaldhaak
Schaar
Topisch zelfklevend weefsellijmLeukosan
Implantatie van perifere draad
Twee gedeeltelijk niet-geïsoleerde Cooner draden
OPMERKING: 1-2cm van de draden is niet geïsoleerd in het midden en aan een van de uiteinden
Twee 23-gauge naalden
Gauze
Programmeerbare stimulator bestuurd door een pc met MC_stimulusMultichannel Systems, Reutlingen, DuitslandSTG4008
Twee krokodillenconnectoren
Corticale opnamen
Metalen plaat voor de magnetische micromanipulator 
Magnetische micromanipulator stand
Micromanipulator
Headstage houder
32-kanaals ZIF-clip headstageTDT, Alachua, FL, VS
32-kanaals micro-elektrocorticografische (µECoG) array Neuronexus, Ann Arbor, VSE32-1000-30-200
TDT opnameapparatuur inclusief voorversterker SI8, dataprocessor RZ2 en werkstation WS8 TDT, Alachua, FL, VS
Anesthesie & Pijnbestrijding
Zoletil 50 VetVirbac, Carros, Frankrijk
Rompun (Zxylacin)Elanco Animal Health Monheim; Duitsland
Torbugesic (Butorphanol)Intervet International, Boxmeer, NederlandTegenwoordig wordt een andere formulering (dolorex) gebruikt
KetaminolIntervet International, Boxmeer, Nederland
PropofolBaxter Holding, Utrecht, Nederland
FentanylB. Braun, Melsungen, Duitsland
MetacamBorhringer Ingelheim Vetmedica, Ingelheim, Duitsland
NoromoxScanvet Animal Health, Fredensborg, Denemarken
PentobarbLeVet, Oudewater, Nederland

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitchell, P., et al. Assessment of safety of a fully implanted endovascular brain-computer interface for severe paralysis in 4 patients: the Stentrode with thought-controlled digital switch (switch) study. JAMA Neurol. 80 (3), 270(2023).
  2. Steinmetz, N. A., et al. Neuropixels 2.0: a miniaturized high-density probe for stable, long-term brain recordings. Science. 372 (6539), eabf4588(2021).
  3. Neuralink's first-in-human clinical trial is open for recruitment. , Neuralink. https://neuralink.com/blog/first-clinical-trial-open-for-recruitment/ (2023).
  4. Duun-Henriksen, J., et al. A new era in electroencephalographic monitoring? Subscalp devices for ultra-long-term recordings. Epilepsia. 61 (9), 1805-1817 (2020).
  5. Szostak, K. M., Grand, L., Constandinou, T. G. Neural interfaces for intracortical recording: requirements, fabrication methods, and characteristics. Front Neurosci. 11, 665(2017).
  6. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
  7. Morand-Beaulieu, S., Perrault, M. -A., Lavoie, M. E. Test-retest reliability of event-related potentials across three tasks. Journal of Psychophysiology. 36 (2), 100-117 (2022).
  8. Ip, C. -T., et al. Pre-intervention test-retest reliability of EEG and ERP over four recording intervals. Int J Psychophysiol. 134, 30-43 (2018).
  9. Qin, H., Ding, L., Duan, W., Lei, X. Test-retest reliability of EEG: a comparison across multiple resting-state and task-state experiments. Xin Li Xue Bao. 55 (10), 1587(2023).
  10. Höller, Y., et al. Reliability of EEG measures of interaction: a paradigm shift is needed to fight the reproducibility crisis. Front Hum Neurosci. 11, 441(2017).
  11. Colachis, S. C., et al. Long-term intracortical microelectrode array performance in a human: a 5 year retrospective analysis. J Neural Eng. 18 (4), 0460d7(2021).
  12. Barrese, J. C., et al. Failure mode analysis of silicon-based intracortical microelectrode arrays in non-human primates. J Neural Eng. 10 (6), 066014(2013).
  13. Szymanski, L. J., et al. Neuropathological effects of chronically implanted, intracortical microelectrodes in a tetraplegic patient. J Neural Eng. 18 (4), 0460b9(2021).
  14. Meijs, S., et al. Influence of fibrous encapsulation on electro-chemical properties of TiN electrodes. Med Eng Phys. 38 (5), 468-476 (2016).
  15. Kim, A., et al. Investigating immunomodulatory biomaterials for preventing the foreign body response. Bioengineering. 10 (12), 1411(2023).
  16. Janjua, T. A. M., et al. The effect of peripheral high-frequency electrical stimulation on the primary somatosensory cortex in pigs. IBRO Neurosci Rep. 11, 112-118 (2021).
  17. Meijs, S., Andreis, F. R., Janjua, T. A. M., Graven-Nielsen, T., Jensen, W. High-frequency electrical stimulation increases cortical excitability and mechanical sensitivity in a chronic large animal model. Pain. 166 (2), e18-e26 (2025).
  18. Branco, M. P., Geukes, S. H., Aarnoutse, E. J., Ramsey, N. F., Vansteensel, M. J. Nine decades of electrocorticography: a comparison between epidural and subdural recordings. Eur J Neurosci. 57 (8), 1260-1288 (2023).
  19. Meijs, S., Andreis, F. R., Janjua, T. A. M., Jensen, W. Reliability of a cranial window for chronic epidural recordings from the pig primary somatosensory cortex. Annu Int Conf IEEE Eng Med Biol Soc. 2024, 1-4 (2024).
  20. García, A., Calleja, J., Antolín, F. M., Berciano, J. Peripheral motor and sensory nerve conduction studies in normal infants and children. Clin Neurophysiol. 111 (3), 513-520 (2000).
  21. Thomas, J. E., Lambert, E. H. Ulnar nerve conduction velocity and H-reflex in infants and children. J Appl Physiol. 15 (1), 1-9 (1960).
  22. Liu, X. -G., Sandkühler, J. Characterization of long-term potentiation of C-fiber-evoked potentials in spinal dorsal horn of adult rat: essential role of NK1 and NK2 receptors. J Neurophysiol. 78 (4), 1973-1982 (1997).
  23. Sandkühler, J., Liu, X. Induction of long-term potentiation at spinal synapses by noxious stimulation or nerve injury: LTP in spinal cord induced by noxious stimulation. Eur J Neurosci. 10 (7), 2476-2480 (1998).
  24. van den Broeke, E. N., et al. The effect of high-frequency conditioning stimulation of human skin on reported pain intensity and event-related potentials. J Neurophysiol. 108 (8), 2276-2281 (2012).
  25. van den Broeke, E. N., Lambert, J., Huang, G., Mouraux, A. Central sensitization of mechanical nociceptive pathways is associated with a long-lasting increase of pinprick-evoked brain potentials. Front Hum Neurosci. 10, 531(2016).
  26. Fallegger, F., Trouillet, A., Lacour, S. P. Subdural soft electrocorticography (ECoG) array implantation and long-term cortical recording in minipigs. J Vis Exp. (193), e64997(2023).
  27. Palma, M., et al. Chronic recording of cortical activity underlying vocalization in awake minipigs. J Neurosci Methods. 366, 109427(2022).
  28. Salatino, J. W., Ludwig, K. A., Kozai, T. D. Y., Purcell, E. K. Glial responses to implanted electrodes in the brain. Nat Biomed Eng. 1 (11), 862-877 (2017).
  29. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J Neurosci Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
  30. Meijs, S., et al. Biofouling resistance of boron-doped diamond neural stimulation electrodes is superior to titanium nitride electrodes in vivo. J Neural Eng. 13 (5), 056011(2016).
  31. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: a review of cranial window technology for optical access to the brain. J Neurosci Methods. 354, 109100(2021).
  32. O'Sullivan, K. P., Orazem, M. E., Otto, K. J., Butson, C. R., Baker, J. L. Electrical rejuvenation of chronically implanted macroelectrodes in nonhuman primates. J Neural Eng. 21 (3), 036056(2024).
  33. Holdgraf, C., et al. iEEG-BIDS, extending the Brain Imaging Data Structure specification to human intracranial electrophysiology. Sci Data. 6 (1), 102(2019).
  34. Mercier, M. R., et al. Advances in human intracranial electroencephalography research, guidelines and good practices. Neuroimage. 260, 119438(2022).
  35. Löscher, W., Worrell, G. A. Novel subscalp and intracranial devices to wirelessly record and analyze continuous EEG in unsedated, behaving dogs in their natural environments: a new paradigm in canine epilepsy research. Front Vet Sci. 9, 1014269(2022).
  36. Waziri, A., et al. Intracortical electroencephalography in acute brain injury. Ann Neurol. 66 (3), 366-377 (2009).
  37. Hartings, J. A., et al. Prognostic value of spreading depolarizations in patients with severe traumatic brain injury. JAMA Neurol. 77 (4), 489(2020).
  38. Takara, S., Kida, H., Inoue, T. Development of implantable devices for epilepsy: research with cats, dogs, and macaques in biomedical engineering. Advanced Robotics. 38 (14), 983-1007 (2024).
  39. Gierthmuehlen, M., et al. Mapping of sheep sensory cortex with a novel microelectrocorticography grid. J Comp Neurol. 522 (16), 3590-3608 (2014).
  40. Thielen, B., Meng, E. A comparison of insertion methods for surgical placement of penetrating neural interfaces. J Neural Eng. 18 (4), 041003(2021).
  41. MaassenVanDenBrink, A., Chan, K. Y. Neurovascular pharmacology of migraine. Eur J Pharmacol. 585 (2-3), 313-319 (2008).
  42. Costine-Bartell, B. A., et al. 2-photon imaging of fluorescent proteins in living swine. Sci Rep. 13 (1), 14158(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Elektrocorticografie VarkensChronische OpnamesGebeurtenisgerelateerde PotentialenToegang tot de Dura MaterHoogfrequente StimulatieNeurowetenschappelijke TechniekenDierenwelzijnHersen computerinterface

Gerelateerde artikelen