Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Superresolutiebeeldvorming van Proteus mirabilis Biofilm door uitbreidingsmicroscopie

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67932

⸱

18 juli 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Scientific Image Analysis SCIAN-Lab, Integrative Biology Program, Centro de Informática Médica y Telemedicina CIMT, Institute of Biomedical Sciences ICBM, Faculty of Medicine, University of Chile, 2Biomedical Neuroscience Institute BNI, 3Advanced Center for Chronic Diseases ACCDiS, 4Laboratorio de Biofilms Microbianos, Departamento de Microbiología, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 5Red de Equipamiento Científico Avanzado REDECA, Institute of Biomedical Sciences ICBM, Faculty of Medicine, University of Chile, 6National Center for Health Information Systems CENS, 7Centro de Modelamiento Matemático, Universidad de Chile

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel presenteert een uitgebreid protocol voor PmbExM, een expansiemicroscopietechniek die speciaal is ontworpen voor Proteus mirabilis-biofilms . PmbExM maakt gebruik van een stapsgewijze enzymatische behandeling van biofilmmonsters om een isotrope, 4,3-voudige expansie te bereiken, waardoor superresolutieanalyse van de ruimtelijke organisatie van cellulaire en subcellulaire structuren binnen deze sessiele microbiële gemeenschappen mogelijk is.

Samenvatting

Toegang tot gedetailleerde visuele informatie en kwantitatieve gegevens van microbiologische monsters met behulp van conventionele optische microscopie wordt beperkt door de diffractiebarrière. Een oplossing om de resolutie te verbeteren is uitbreidingsmicroscopie (ExM), een innovatieve en kosteneffectieve superresolutietechniek die monsters fysiek vergroot met ongeveer vier keer hun oorspronkelijke grootte. Voor een succesvolle expansie is het essentieel om de mechanische eigenschappen van het biologische materiaal te homogeniseren. Biofilms zijn bacteriële gemeenschappen, die zich aan een oppervlak hechten en ingebed zijn in een extracellulaire matrix die ze produceren; ze vereisen dat ExM-protocollen worden aangepast om plaats te bieden aan hun unieke structurele componenten. Dit artikel presenteert Proteus mirabilis biofilm ExM (PmbExM), een gespecialiseerde variant van ExM die superresolutievisualisatie mogelijk maakt van P. mirabilis biofilms die gedurende 48 uur worden gekweekt. Het protocol richt zich op de gerichte degradatie van belangrijke structurele componenten van monsters door middel van seriële enzymatische digesties, geoptimaliseerd in de buurt van hun theoretische omstandigheden. PmbExM maakt gebruik van een combinatie van enzymen, waaronder α-amylase, cellulase en lyticase-glycoside-hydrolasen voor polysaccharidehydrolyse; mutanolysine voor hydrolyse van peptidoglycaan; en proteïnase K voor eiwithydrolyse. Deze verteringsprocedures zijn onafhankelijk van het geleerproces, waardoor aanpassingen mogelijk zijn om te voldoen aan specifieke homogenisatie-eisen in verschillende biofilmmodellen. Dit aanpassingsvermogen biedt een groot potentieel voor toepassing bij verschillende bacteriesoorten en groeiomstandigheden. ExM is toegepast op verschillende biofilmsoorten met over het algemeen suboptimale expansiefactoren. Daarentegen bereikt PmbExM de theoretische maximale expansiefactor van de standaard acrylamide-acrylaat ExM-hydrogel, zonder significante vervorming van de morfologie of topologie. Het doel van dit werk is om een toegankelijk superresolutieprotocol te bieden voor het visualiseren van de architectuur, assemblage en cellulaire en intracellulaire kenmerken van P. mirabilis-biofilms .

Inleiding

Fluorescentiemicroscopie is een veelgebruikt hulpmiddel voor het bestuderen van de architectuur, samenstelling en functie van biofilm1. Het vermogen van optische microscopie om de structurele, cellulaire en subcellulaire kenmerken van biofilms op te lossen, wordt echter beperkt door de diffractiebarrière. Uitbreidingsmicroscopie (ExM) is een innovatieve, toegankelijke en gebruiksvriendelijke superresolutietechniek die een groot potentieel heeft om de biofilmstructuur te onthullen tot voorbij de diffractielimiet 2,3. ExM verbetert de resolutie door biologische exemplaren isotroop uit te breiden die ongeveer vier keer hun oorspronkelijke grootte hebben. De methode omvat de in-situ polymerisatie van een zwellende ionische hydrogel door het monster en het behoud van de relatieve ruimtelijke rangschikking van moleculaire doelen wanneer deze met zorg wordt toegepast 4,5.

Om ExM goed te laten werken, is het homogeniseren van de mechanische eigenschappen van het biologische materiaal een cruciale stap6. Standaard ExM-varianten werden ontwikkeld op celculturen en weefsels van zoogdieren, waar ze alleen efficiënt homogenisatie bereikten door proteïnase K proteolytische digestie 4,5 of denaturatie van zachte eiwitten met wasmiddelen en autoclaveren7, wat isotrope 4-voudige expansie opleverde. In het geval van bacteriën en bacteriële biofilms zijn de peptidoglycaancelwand en EPS-matrixelementen, zoals structurele polysachariden, echter obstakels tegen expansie 2,3,8,9.

Dit artikel beschrijft de procedures van Proteus mirabilis biofilm Expansion Microscopy (PmbExM), een op maat gemaakte ExM-variant die is ontworpen om biofilms van P. mirabilis uit te breiden, een klinisch relevante gramnegatieve bacil geassocieerd met hoge antibioticaresistentie en katheter-geassocieerde urineweginfecties10. PmbExM gebruikt een combinatie van enzymatische behandelingen met mutanolysine, α-amylase, cellulase, lyticase en proteïnase K om respectievelijk de peptidoglycaancelwand, polysacchariden en eiwitten te hydrolyseren. De resultaten tonen aan dat deze methode een 4,3-voudige isotrope expansie van 48 uur oude P. mirabilis-biofilms bereikt. De techniek maakt superresolutievisualisatie mogelijk van P. mirabilis biofilmarchitectuur, assemblage en intracellulaire kenmerken door middel van dubbele kleuring3. Bovendien kan PmbExM worden aangepast aan andere biofilmmodellen door de enzymbehandelingen aan te passen aan soortspecifieke biofilmcomponenten.

Het doel van dit artikel is om een gedetailleerde beschrijving te geven van de procedures die betrokken zijn bij geleer, vertering, expansie en montage van biofilmmonsters voor PmbExM. Bovendien schetst dit werk bacteriegroeiomstandigheden, monsterformaten en fluorescerende kleuringstechnieken die door de auteurs worden gebruikt, samen met een gegevensverwerkings- en analyseroutine die gemakkelijk kan worden toegepast door onderzoekers met beperkte ervaring in beeldverwerking. Voor een uitgebreidere en diepgaandere gids over beeldverwerking en -analyse verwijzen wij u naar Castagnini, D. et al.3.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het algemene proces van PmbExM is samengevat in Figuur 1. Raadpleeg aanvullend bestand 1 om de samenstelling te vinden van alle genoemde oplossingen (d.w.z. monomeeroplossing, proteïnase K-digestieoplossing, enz.) die in dit werk zijn gebruikt. Raadpleeg ook Aanvullend Bestand 2, Aanvullend Bestand 3 en Aanvullend Bestand 4 voor een vereenvoudigde gegevensverwerkings- en analyseroutine die kan worden gebruikt door onderzoekers zonder uitgebreide ervaring in beeldverwerking. Het protocol kan comfortabel worden uitgevoerd over een periode van 2,5-3 weken: de eerste week gewijd aan het reinigen en steriliseren van dekglaasjes, biofilmgroei en monsterfixatie; de tweede week voor het samplen van kleuringen en het PmbExM-protocol zelf, en de derde week voor het mounten van samples en het verkrijgen van afbeeldingen. Overweeg daarnaast 1 week voorafgaande voorbereidingen voor de benodigde materialen en oplossingen. Details over de reagentia, materialen, apparatuur en software die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.

figure-protocol-1
Figuur 1: Verankering, polymerisatie, digestie en dialyse van het PmbExM-protocol voor succesvolle expansie, observatie en analyse van P. mirabilis biofilm. De linkerkolom identificeert zes toestanden van de steekproef bij geselecteerde stappen tijdens het uitbreidingsprotocol. Het begint met het gefixeerde, gepermeabiliseerde en gekleurde biofilmmonster, volgt vier tussenliggende toestanden tot de uiteindelijke gegeleerde en geëxpandeerde toestand, klaar voor microscopie en beeldanalyse op superresolutie. De EPS-matrix van de biofilm wordt weergegeven in groen, de bacteriële celwand wordt weergegeven door paarse lijnen, de algemene eiwitcelstructuur wordt weergegeven in grijs en het acrylamide-acrylaat ExM-polymeer wordt weergegeven als golvende blauwe lijnen. Alle enzymen die bij het proces betrokken zijn, worden weergegeven door Pac-Man-symbolen: 3 glycoside-hydrolasen (groen) voor exopolysaccharidehydrolyse: α-amylase, cellulase en lyticase; mutanolysine (paars) voor afbraak van de peptidoglycaancelwand; en proteïnase K (grijs) voor algemene eiwitvertering. De kleuren van de Pac-Man-symbolen komen overeen met de respectievelijke doelstructuren. Alle objecten die worden weergegeven in een lage opaciteit of gestippelde randen vertegenwoordigen een toestand van enzymatische degradatie. Deze figuur is gewijzigd ten opzichte van Castagnini, D. et al.3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Reiniging en sterilisatie van glazen dekglaasjes voor biofilmvorming

  1. Ultrasoon: 12 mm glazen dekglaasjes in 1 M natriumhydroxide gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en daarna afspoelen met overvloedig gedeïoniseerd water.
  2. Ultrasooner de dekglaasjes in 70% (v/v) ethanol gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en spoel ze vervolgens af met 95% (v/v) ethanol.
  3. Laat de dekglaasjes bij kamertemperatuur aan de lucht drogen.
  4. Steriliseren door middel van autoclaveren.

2. Proteus mirabilis biofilm groei

  1. Kweek P. mirabilis in 10 ml Luria Bertani (LB) bouillon gedurende 24 uur bij 37 °C zonder te schudden.
    OPMERKING: Een in de handel verkrijgbare stam van het type P. mirabilis (zie tabel met materialen) werd verworven en gebruikt in deze studie, maar het gebruik van elke P. mirabilis-stam die direct beschikbaar is, wordt aangemoedigd.
  2. Neem 1 ml van de cultuur en voeg dit toe aan 9 ml verse en steriele LB-bouillon om een bacteriële suspensie van 1:10 verdunning te genereren.
  3. Controleer of de optische dichtheid (OD) bij 600 nm van de bacteriële suspensie van 1:10 0,1 is. Pas indien nodig aan door kleine hoeveelheden verse LB- of P. mirabilis-cultuur toe te voegen tot OD600 = 0,1 is bereikt.
  4. Breng 12 mm glazen dekglaasjes (eerder gereinigd en gesteriliseerd) aan in een steriele polystyreen 24 putje (één dekglaasje per putje).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het hele dekglaasje de bodem van de put raakt. De biofilm vormt zich aan de zijkant van het dekglaasje, die naar boven wijst.
  5. Bezaad de putjes van de plaat met 350 μL van de OD600 = 0,1 bacteriële suspensie.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om alleen de binnenste putjes van de plaat te zaaien, terwijl u de buitenste putjes (d.w.z. putjes in rijen A en D en in kolommen 1 en 6) vult met steriel water of LB-bouillon. Dit komt omdat de buitenste putten gevoelig zijn voor hogere vloeistofverdampingssnelheden dan de binnenste putten, wat de groei van biofilm beïnvloedt.
  6. Plaats de gezaaide plaat in een broedmachine en plaats deze met een helling van 45 graden.
    OPMERKING: Gebruik gewoon laboratoriummateriaal zoals centrifugebuisjes van 50 ml of micropipetdozen. De gekantelde positie maakt de vorming van een lucht-vloeistofinterface op het oppervlak van de dekglaasjes mogelijk, waarbij de P . mirabilis-biofilm zijn dikste gebied zal vestigen.
  7. Laat biofilms vormen gedurende 48 uur bij 37 °C, zonder te schudden.
    LET OP: Deze biofilm groei opstelling is niet geschikt voor incubatietijden langer dan 48 uur als gevolg van biofilm uitdroging door verdamping van het medium.

3. Fixatie en opslag van biofilmmonsters

  1. Verwijder voorzichtig het kweekmedium uit de putjes en was de biofilmhoudende dekglaasjes voorzichtig twee keer met 300 μL steriele fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met zeer milde agitatie.
    OPMERKING: Vermijd vernietiging van de biofilms door herhaalde vloeistofverversing door kleine hoeveelheden te gebruiken voor incubaties of wassen. 300-400 μL vloeistof is voldoende om de biofilms onder te dompelen in een plaat met 24 putjes. Langzaam en methodisch pipetteren wordt sterk aanbevolen, evenals het vermijden van het rechtstreeks raken van de biofilms met de uitgewisselde oplossingen.
  2. Verwijder de PBS voorzichtig en vervang deze door 400 μL 4% (w/v) paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur voor biofilmfixatie.
  3. Verwijder de PFA en vervang deze door 300 μL 1% PBST (1% v/v Triton X-100 in PBS) voor celpermeabilisatie. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Vervang de 1% PBST-oplossing door 300 μL 0,3% PBST (3% v/v Triton X-100 in PBS). Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Verwijder de 0,3% PBST en vervang deze door 300 μL van een 50:50 mengsel van methanol en 0,3% PBST voor uitdroging van het monster. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en vervang het mengsel vervolgens door 1 ml absolute methanol.
    OPMERKING: Voeg langzaam 1 ml methanol toe en richt het tegen de wanden van de put. Dit hogere volume methanol wordt gebruikt om volledige verdamping tijdens de opslag van monsters te voorkomen.
  6. Bewaar de monsters minimaal 1 dag en maximaal een maand bij -20 °C.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de platen af te dichten met een flexibele wasfilm om de verdamping en uitdroging van de monsters te vertragen.
  7. Rehydrateer de monsters na gebruik achtereenvolgens door de methanol te vervangen door 300 μl van een 50:50 mengsel van methanol en 0,3% PBST, en vervolgens door 300 μl 0,3% PBST, bij kamertemperatuur.

4. Biofilm fluorescerende kleuring

  1. Incubeer de gerehydrateerde biofilmmonsters met 300 μl 50 μg/ml tarwekiemagglutinine fluorescerend lectineconjugaat (hierna alleen WGA-conjugaat genoemd; zie materiaaltabel) in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur voor kleuring van celwand/capsule/exopolysachariden.
    OPMERKING: Zie relevante onderwerpen met betrekking tot fluorescerende vlekken in de sectie Discussie. Bescherm de monsters vanaf nu tegen licht.
  2. Verwijder de WGA-conjugatieoplossing en was voorzichtig twee keer met 300 μL PBS gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.

5. PmbExM stappen

  1. MA-NHS verankering en acrylamide-acrylaat polymerisatie
    1. Incubeer de gekleurde biofilmmonsters met 400 μL 1 mM methacrylzuur N-hydroxysuccinimidylester (MA-NHS) in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met milde agitatie.
      OPMERKING: MA-NHS is een geactiveerde ester die vatbaar is voor hydrolyse in een waterig medium, dus behandel de monsters onmiddellijk na het bereiden van de 1 mM in PBS-oplossing.
    2. Voer drie zachte wasbeurten van 10 minuten uit met 300 μL PBS op kamertemperatuur.
    3. Verwijder de PBS en vervang deze door 300 μL monomeeroplossing. Incubeer een nacht (O.N.) bij 4 °C.
    4. Bouw de geleringsvoorkamers. Gebruik een glasplaatje als basis en plaats er twee stukken gevouwen dubbelzijdig plakband op om als afstandhouders van 400 μm te fungeren. Plaats de afstandhouders 8-10 mm van elkaar.
      OPMERKING: Zie figuur 2A voor meer duidelijkheid over hoe de geleringsvoorkamer moet worden geconstrueerd. De dubbelzijdige tape die hier werd gebruikt, was ongeveer 100 μm dik, dus werd deze bijgesneden en op zichzelf gevouwen om afstandhouders van 3 mm x 5 mm x 0,4 mm te maken. Meet de dikte van de beschikbare dubbelzijdige tape en rangschik deze dienovereenkomstig. De absorptie van de geleeroplossing door de tape-afstandhouders is te verwaarlozen. Als alternatief voor dubbelzijdige tape kunnen 12 mm ronde glazen dekglaasjes met waterdruppels aan elkaar worden geplakt en tot de gewenste hoogte worden opgestapeld.
    5. Plaats natte kamers om monsters tijdens polymerisatie te beschermen tegen uitdroging.
      OPMERKING: Een gewone doos met micropipetpunten kan eenvoudig worden omgebouwd tot een natte kamer door de plastic steiger van de tips te verwijderen en te vervangen door natte papieren handdoeken.
    6. Bereid een vers voorraadvolume geleeroplossing door de hoeveelheden monomeeroplossing, 10 % (m/v) N, N, N', N'-tetramethylethyleendiamine (TEMED), 0,5 % (m/v), 4-hydroxy-TEMPO (4-HT) en 10 % (m/v) ammoniumpersulfaat (APS) grondig te mengen in een verhouding van respectievelijk 47:1:1:1. Meng de APS pas met de rest van de reagentia van de geleeroplossing als de stappen naar 5.1.5 zijn voltooid.
      OPMERKING: Het totale volume van de voorraad geleeroplossing om voor te bereiden, is afhankelijk van de hoeveelheid biofilmmonsters die worden verwerkt. Om bijvoorbeeld drie biofilmmonsters te verwerken, bereidt u 900 μl geleeroplossing door 846 μl monomeeroplossing te mengen met 18 μl 10 % (m/m) TEMED, 18 μl 0,5 % (m/m) 4-HT en 18 μl 10 % (m/m) APS. Om voortijdige polymerisatie te voorkomen, moet APS als laatste aan het mengsel worden toegevoegd en alleen wanneer de monsters, geleervoorkamers en natte kamers klaar zijn voor gebruik. Zorg ervoor dat alle genoemde reagentia en de onlangs bereide geleeroplossing tijdens deze stap zijn afgekoeld.
    7. Verwijder onmiddellijk na het bereiden van de geleeroplossing voorzichtig de monomeeroplossing en vervang deze door 300 μL van de eerste. Incubeer gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    8. Terwijl stap 5.1.7 aan de gang is, verwijdert u de resterende beschermkap van de dubbelzijdige tapestrepen die op de glasplaatjes zijn aangebracht en plaatst u in de ruimte ertussen 40 μL geleeroplossing.
    9. Nadat stap 5.1.7 is voltooid, verwijdert u elk biofilmhoudend dekglaasje uit het putje en plaatst u het op de druppel van 40 μl geleeroplossing die eerder op een glasplaatje is gelegd. Oriënteer het dekglaasje zo dat de biofilm op het oppervlak in contact komt met de geleeroplossing.
    10. Voltooi de constructie van de geleerkamer door met een pincet voorzichtig op het biofilmdragende dekglaasje te drukken om de hechting aan de dubbelzijdige tape-afstandhouders te bevestigen.
      OPMERKING: Deze sandwich-achtige opstelling bestaat uit wat de geleerkamer wordt genoemd (Figuur 2B).
    11. Laat de monsters polymeriseren in een natte kamer en incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C zonder te roeren.
    12. Visualiseer de monsters onder fluorescentiemicroscopie (zie stap 6.2.1) zonder de geleerkamers te demonteren voor het vastleggen van beelden vóór de expansie.
      OPMERKING: Laat de gegeleerde monsters niet langer dan een uur uit de natte kamer staan, aangezien voorgeëxpandeerde gels vatbaar zijn voor uitdroging, waardoor het monster onbruikbaar wordt. Zie stap SF2.3 (Aanvullend Dossier 2) voor relevante acquisitieprocedures voorafgaand aan de uitbreiding.
    13. Demonteer de geleerkamers en snijd de overtollige gel rond het interessegebied in het biofilmmonster af met behulp van een chirurgisch mes.
      OPMERKING: Het bijsnijden van de gels wordt ten zeerste aanbevolen om het hanteren en monteren van geëxpandeerde monsters te vergemakkelijken. Om de ruimtelijke oriëntatie van het interessegebied in monsters bij te houden, snijdt u de gels bovendien in een asymmetrische vorm of laat u een karakteristieke uitsparing in de gel voor gemakkelijke herkenning van de juiste oriëntatie.
    14. Plaats de dekglaasjes met de bijgesneden gels in een nieuwe plaat met 24 putjes, met de gel naar boven.
      OPMERKING: In dit stadium moeten de gegeleerde monsters op hun originele glazen dekglaasje blijven plakken.
  2. Enzymatische spijsvertering I-III en DNA-kleuring
    OPMERKING: Homogenisatie van de mechanische eigenschappen van P. mirabilis biofilmmonsters volgt een reeks enzymatische verteringen die de auteurs hebben gecategoriseerd in 3 stappen, op basis van de biologische structuur die het doelwit is van afbraak: polysaccharidehydrolyse (Digestion I), peptidoglycaanhydrolyse (Digestion II) en eiwithydrolyse (Digestion III).
    1. Spijsvertering I
      1. Dompel de monsters onder in 1 ml α-amylase-digestieoplossing. Incubeer O.N. bij 50 °C.
        OPMERKING: Grote hoeveelheden (d.w.z. 0.5-1 ml) enzymatische oplossing worden gebruikt om uitdroging van het monster als gevolg van de hoge incubatietemperatuur te voorkomen.
      2. Verwijder de α-amylaseoplossing en was de gels 5 minuten op kamertemperatuur met 300 μL cellulaseverteringsbuffer.
      3. Verwijder de cellulaseverteringsbuffer en vervang deze door 500 μL cellulasedigestieoplossing. Incubeer gedurende 2 uur bij 45 °C.
      4. Verwijder de cellulase-digestieoplossing en was de gels 5 minuten op kamertemperatuur met 300 μL lyticase-digestiebuffer.
      5. Verwijder de lyticase-digestiebuffer en vervang deze door 500 μL lyticase-digestieoplossing. Incubeer gedurende 2 uur bij 30 °C.
    2. Spijsvertering II
      1. Verwijder de lyticase-digestieoplossing en was de gels 5 minuten op kamertemperatuur met 300 μL mutanolysine-digestiebuffer.
      2. Verwijder de mutanolysine-digestiebuffer en vervang deze door 1 ml mutanolysine-digestieoplossing. Incubeer O.N. bij 55 °C.
    3. Spijsvertering III
      1. Verwijder de mutanolysine-digestieoplossing en was de gels 5 minuten op kamertemperatuur met 300 μL proteïnase K-digestiebuffer. Verwijder de proteïnase K-digestiebuffer en vervang deze door 500 μL proteïnase K-digestieoplossing. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C.
    4. (OPTIONEEL) DNA-kleuring
      1. Verwijder de proteïnase K-oplossing en was de gels met 300 μL 10x PBS gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
      2. Verwijder de 10x PBS en vervang deze door 300 μL 5 μM rode fluorescerende nucleïnezuurkleuring in 10x PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
        OPMERKING: Zie de sectie Discussie voor opmerkingen over DNA-kleuring voor ExM-procedures.
  3. Expansie
    1. Verwijder de proteïnase K-oplossing (of de DNA-kleuringsoplossing als de optionele stap 5.2.4 is uitgevoerd) en breng de gels over in een petrischaaltje van 60 mm. Plaats één gel per petrischaaltje.
      OPMERKING: Gebruik een kleine platte kwast om de gel op het glazen dekglaasje te duwen. Pak met een laboratoriumpincet het glazen dekglaasje vast en gebruik het als platform voor de gel. Voorkom dat de gel van het dekglaasje valt met behulp van het borsteltje wanneer u het uit de put van de plaat tilt. Voorkom dat de gels zich op zichzelf vouwen.
    2. Vul de petrischaal met overtollig gedeïoniseerd water, dompel de gel volledig onder en incubeer onder zacht roeren bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Ververs het water 4-5 keer.
      OPMERKING: Merk op dat de expanderende gel vrijwel onzichtbaar wordt wanneer deze in water wordt ondergedompeld. Plaats de petrischaal tegen het licht om het lokaliseren van de gel te vergemakkelijken om te voorkomen dat deze wordt beschadigd door de zuigkracht van de pasteurpipet of micropipet tijdens het verversen van water.

figure-protocol-2
Figuur 2: Geleerkamer en monstermontage. (A) Pre-gelatiekamer. Plaats op een dia 2 dubbelzijdige tape-afstandhouders (geel). Bovenop de plaat zit een glazen dekstrookje (figure-protocol-3 = 12 mm) als afstandsreferentie. (B) Geleerkamer. De bacteriële biofilm (groen) wordt gevormd op het onderste dekglaasoppervlak. 400 μm dikke afstandhouders (oranje) zijn gemaakt van 100 μm dikke dubbelzijdige tape-uitsparingen. Afstandhouders zorgen ervoor dat de gel het hele monster kan inbedden en voorkomen dat de geleeroplossing van de randen van de kamer overstroomt, waardoor wordt voorkomen dat het monster tussen het glaasje en het dekglaasje wordt geplet. (C) 3D-geprinte beeldvormingskamers (bezoek de volgende link om toegang te krijgen tot de .stl-bestanden https://github.com/scianlab/ExM). Een geëxpandeerd gelmonster (links) en een geëxpandeerd gelmonster ondergedompeld in gedeïoniseerd water (rechts). Geëxpandeerde gels worden vrijwel onzichtbaar wanneer ze worden ondergedompeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Observatie en analyse

  1. Montage van geëxpandeerde monsters
    1. Bereid de beeldvormingskamers voor met een poly-lysinecoating voor immobilisatie van het monster tijdens beeldvorming11: Week het glasoppervlak van de beeldvormingskamer (zie materiaaltabel) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met 0,1% (w/v) poly-L-lysine.
    2. Verwijder de poly-L-lysineoplossing en voer twee wasbeurten uit met overtollig gedeïoniseerd water. Laat 1 uur aan de lucht drogen of plaats in een broedmachine bij 37 °C om het droogproces te versnellen.
    3. Verwijder na de vijfde dialysecyclus vanaf stap 5.3.2 het water dat de gels bedekt en gebruik een kleine platte borstel om het monster op een glazen dekglaasje van 24 mm x 50 mm te duwen. Gebruik het rechthoekige dekglaasje als platform voor de gel en til het uit het petrischaaltje.
    4. Verwijder het overtollige water uit de gel met tissuepapier om te voorkomen dat water het directe contact tussen het oppervlak van de gel en de polylysinecoating op het glasoppervlak van de beeldkamer blokkeert.
    5. Plaats de gel voorzichtig op het glazen oppervlak van de beeldkamer en vermijd het vasthouden van luchtbellen tussen de gel en het glas.
      OPMERKING: Het glazen oppervlak van de beeldkamer moet volledig droog zijn. Als er pre-expansiebeelden zijn gemaakt, overweeg dan een juiste oriëntatie van de geëxpandeerde gel om het vinden van de eerder vastgelegde gezichtsvelden in het vooraf geëxpandeerde monster te vergemakkelijken.
    6. Voeg gedeïoniseerd water toe totdat de gel volledig is ondergedompeld (zie afbeelding 2C).
      OPMERKING: De geëxpandeerde gels moeten tijdens het gehele beeldvormingsproces gehydrateerd blijven om krimp tijdens het vastleggen te voorkomen.
  2. Acquisitie van afbeeldingen
    1. Visualiseer en leg afbeeldingen van de monsters vast op een beschikbare diffractiebeperkte fluorescentiemicroscoop.
      OPMERKING: De auteurs gebruikten een confocale microscoop met draaiende schijf, met een 63x wateronderdompelingsobjectief van 1,2 numeriek diafragma (NA). Voor fluorofoorexcitatie werd een vastestoflaserlijn bij 488 en 647 nm gebruikt. De opnames werden gemaakt met een 16-bits digitale CMOS-camera die werd bestuurd door eigen software (zie materiaaltabel). De voxelgrootte is ingesteld op 64,4 mm x 64,4 mm x 200 nm (XYZ-assen ).
  3. Beeldverwerking
    1. Raadpleeg aanvullend bestand 2 voor een digitale beeldverwerkingsroutine voor de segmentatie van bacteriën (sectie SF2.1), celbreedtemeting (sectie SF2.2), EF-bepaling (sectie SF2.3) en beeldmatching voor vooraf geëxpandeerde en uitgebreide omstandigheden (sectie SF2.4).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

PmbExM breidde de P. mirabilis-biofilm 4,3-voudig uit en behield de morfologie en topologie
Figuur 3A-D toont de fysieke vergroting van P. mirabilis biofilmcellen en de verhoogde resolutie die door de techniek wordt veroorzaakt. Bovendien werd dit niet alleen waargenomen in dunne biofilmgebieden waar cellen zich organiseren in een monolaagachtige lay-o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Kritieke stappen van PmbExM
Zoals bij elke ExM-variant, is een van de meest kritische stappen van het protocol de homogenisatie van de mechanische eigenschappen van het monster. In het geval van PmbExM wordt dit bereikt door een reeks enzymatische behandelingen. Onvoldoende vertering kan leiden tot lage EF's en mogelijke schade aan de morfologie en/of topologie van biofilm, wat leidt tot een suboptimale resolutie en onbetrouwbare resultaten. Omgekeerd kunnen te agress...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen financiële of persoonlijke belangenconflicten met betrekking tot dit werk.

Dankbetuigingen

De auteurs betuigen hun dank aan Dr. Juan Eduardo Rodríguez en Prof. Dr. Ulrich Kubitschek (U-Bonn) voor hun bijdrage aan de implementatie van de expansietechnieken bij SCIAN-Lab. Dit werk werd gefinancierd door ANID-projecten ICM P09-015-F (SH, DC, KP, JJW), FONDECYT 1211988 (SH, DC, KP), FONDECYT 3220832 (JJW), FONDEQUIP EQM210020 (DC, KP, JJW, JT, NCH, PS, SH); Núcleo SELFO NCN2024_068 (SH, KP, JJW), CORFO 16CTTS- 66.390, MINEDUC grant RED 21994 (SH), BASAL FB210005 (SH), DAAD 57519605 (SH, NC), Centro CTI230006 (SH), FONDEF ID 23I10337 (SH), en Regionale Binationale Projectcooperación SUR-SUR AUCI / AGCID BIL-URY-2019-661 (SH, NCH, PS, MJG).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
α-Amylase uit Bacillus sp.Sigma-Aldrich 10070Polysaccharide-vertering
0,1% (w/v) poly-L-lysine water oplossing Sigma-AldrichP8920Sample immobilisatie voor beeldvorming
12 mm glazen dekpottenChemglass Life SciencesCLS-1760Component voor gelatiekamer
16-bits C13440-20CU cameraHamamatsu PhotonicsNiet beschikbaarCMOS digitale camera voor beeldacquisitie
24 mm x 50 mm glazen dekpottenChemglass Life SciencesCLS-1764Sample manipulatie/hantering
3D-geprinte beeldvormingskamerIn-house design-Optie voor beeldvormingskamer
4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl (4-hydroxy-TEMPO)Sigma-Aldrich176141Component voor geleeroplossing
6-Well glasbodemplaat met zwarte wandenCelVisP06-1.5H-NOptie voor beeldvormingskamer
Azijnzuur Sigma-Aldrich818755Component voor enzymbuffer
Acrylamid Sigma-AldrichA4058Component voor monomeeroplossing
AmmoniumpersulfaatSigma-AldrichA3678Component voor geleeroplossing
Axiovert 200 microscoopZeissNiet beschikbaarConfocale microscoop
CalciumchlorideSigma-AldrichC8106Component voor enzymbuffer
C-Apochromat 63x 1,2 NA water immersie objectiefZeissNiet beschikbaarMicroscoopobjectief
Cellulase uit Aspergillus nigerSigma-Aldrich 22178Polysaccharide-vertering
Chamlide CMB 35 mm schaal magnetische beeldvormingskamerLive Cell InstrumentNiet beschikbaarOptie voor beeldvormingskamer
DimethylsulfoxideSigma-Aldrich472301MA-NHS verankeringsreagens stockoplossing 
DisodiumfosfaatSigma-AldrichS3264Component voor enzymbuffer
EthanolSigma-AldrichE7023Reiniging en sterilisatie
EthyleendiaminetetraazijnzuurMerck324503Component voor enzymbuffer
Falcon polystyreen 24-wellplatenCorning351147Platform voor algemene procedures
FIJI SoftwareNational Institutes of Health-Software voor beeldverwerking
GlycerolSigma-AldrichG7893Component voor enzymbuffer
GuanidinehydrochlorideThermo Scientific24115Component voor enzymbuffer
Huygens SoftwareScientific Volume Imaging-Deconvolutiesoftware voor beeldherstel
ZoutzuurSupelco1.00317Bereiding van buffer
Kimwipes tissuepapierFisher Scientiffic06-666Verwijdering van overtollig water
LaboratoriumpincetElectron Microscopy SciencesM5EAlgemene sample manipulatie/hantering
Luria Bertani bouillonInvitrogen12795-027Biofilm groeimedium
Lyticase uit Arthrobacter luteusSigma-Aldrich L4025Polysaccharide-vertering
MagnesiumchlorideSigma-AldrichD5652Component voor enzymbuffer
Methacrylzuur N-hydroxysuccinimidesterSigma-Aldrich730300Ankerreagens
MethanolSigma-Aldrich32213Sample dehydratie & opslag
MicrobeJ --Plugin voor beeldverwerkingssoftware
MicroscoopglasplatenChemglass Life SciencesCG-8221Component voor gelatiekamer
MononatriumfosfaatSigma-AldrichS9638Component voor enzymbuffer
Mutanolysine uit Streptomyces globisporusSigma-Aldrich M990Peptidoglycaan-vertering
N, N, N', N'-tetramethylethyleendiamineSigma-AldrichT7024Component voor geleeroplossing
N,N′-methyleenbisacrylamideSigma-AldrichM1533Component voor monomeeroplossing
Nunc 40,4 mm glasbodem Petri-schotelsThermo Fisher12-567-400Optie voor beeldvormingskamer
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127Sample fixatie
FosfaatbufferoplossingSigma-Aldrich79383Component voor monomeeroplossing, Wassen, Enzymbuffer
Proteinase K uit Engyodontium albumInvitrogen25530-031Proteïne-vertering
Proteus mirabilis ATCC 12453Microbiologics0440POnderzoeksobject
Kleine platte verfkwastPlaatselijke bouwmarkt-Sample manipulatie/hantering
NatriumacetaatSigma-Aldrich241245Component voor enzymbuffer
NatriumacrylaatSigma-Aldrich408220Component voor monomeeroplossing
NatriumbicarbonaatSigma-AldrichS5761Component voor enzymbuffer
NatriumchlorideSigma-AldrichS9888Component voor monomeeroplossing, Component voor enzymbuffer
NatriumhydroxideSigma-Aldrich221465Reiniging van glasplaten
Solid-state laserlijnOmicronNiet beschikbaar488, 568 en 647 nm Excitatielaserlijn
SYTO 61 nucleïnezuurkleuringInvitrogenS11343Fluorescente kleurstof
Tris(hydroxymethyl)aminomethaanhydrochlorideSAFC108219Component voor enzymbuffer
Triton X-100Sigma-AldrichX100Sample permeabilisatie, Component voor enzymbuffer
Volocity 7.0.0 opnamesoftwareQuorum Technologies-Software voor microscoop aansturing
Volocity ViewVox spinning disk systeemPerkin-

Referenties

  1. Franklin, M. J., Chang, C., Akiyama, T., Bothner, B. New technologies for studying biofilms. Microbiol Spectr. 3 (4), 10(2015).
  2. Valdivieso González, D., Jara, J., Almendro-Vedia, V. G., Orgaz, B., López-Montero, I. Expansion microscopy applied to mono- and dual-species biofilms. NPJ Biofilms Microbiomes. 9 (1), 92(2023).
  3. Castagnini, D., et al. Proteus mirabilis biofilm expansion microscopy yields over 4-fold magnification for super-resolution of biofilm structure and subcellular DNA organization. J Microbiol Methods. 220, 106927(2024).
  4. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging- Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  5. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nat Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  6. Gao, R., Asano, S. M., Boyden, E. S. Q&A: Expansion microscopy. BMC biology. 15 (1), 50(2017).
  7. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nat Biotechnol. 34 (9), 987-992 (2016).
  8. Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLoS biology. 17 (10), e3000268(2019).
  9. Kunz, T. C., et al. The expandables: Cracking the staphylococcal cell wall for expansion microscopy. Front Cell Infect Microbiol. 11, 644750(2021).
  10. Jacobsen, S. M., Shirtliff, M. E. Proteus mirabilis biofilms and catheter-associated urinary tract infections. Virulence. 2 (5), 460-465 (2011).
  11. Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: Protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. 80 (1), e56(2018).
  12. Yokogawa, K., Kawata, S., Nishimura, S., Ikeda, Y., Yoshimura, Y. Mutanolysin, bacteriolytic agent for cariogenic streptococci: partial purification and properties. Antimicrob Agents Chemother. 6 (2), 156-165 (1974).
  13. Hurst, P. L., Nielsen, J., Sullivan, P. A., Shepherd, M. G. Purification and properties of a cellulase from Aspergillus niger. Biochem J. 165 (1), 33-41 (1977).
  14. Scott, J. H., Schekman, R. Lyticase: Endoglucanase and protease activities that act together in yeast cell lysis. J Bacteriol. 142 (2), 414-423 (1980).
  15. Bano, S., Qader, S. A. U., Aman, A., et al. Purification and characterization of novel α-amylase from Bacillus subtilis KIBGE HAS. AAPS PharmSciTech. 12, 255-261 (2011).
  16. Kaplan, J. B., et al. Genes involved in the synthesis and degradation of matrix polysaccharide in Actinobacillus actinomycetemcomitans and Actinobacillus pleuropneumoniae biofilms. J Bacteriol. 186 (24), 8213-8220 (2004).
  17. Kaplan, J. B., et al. Recombinant human DNase I decreases biofilm and increases antimicrobial susceptibility in staphylococci. J Antibiot. 65 (2), 73-77 (2012).
  18. Schlapp, G., Scavone, P., Zunino, P., Härtel, S. Development of 3D architecture of uropathogenic Proteus mirabilis batch culture biofilms: A quantitative confocal microscopy approach. J Microbiol Methods. 87 (2), 234-240 (2011).
  19. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nat Cell Biol. 21 (1), 72-84 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Biofilmarchitectuurseri le enzymatische digestiegelatiekamerProteinase K digestiepolysacharidehydrolysebehoud van morfologiesubcellulaire visualisatie
Superresolutiebeeldvorming van Proteus mirabilis Biofilm door uitbreidingsmicroscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.