Studie van door kopernanodeeltjes geïnduceerde geprogrammeerde celdood in bacteriën

Samenvatting

Koperen nanodeeltjes werken als antimicrobiële middelen door reactieve zuurstofsoorten te genereren. Hier worden procedures gepresenteerd die aantonen dat kopernanodeeltjes effectief zijn tegen drie klinisch relevante pathogenen en dat bepaalde geprogrammeerde celdoodroutes betrokken zijn bij dit bacteriedodende proces.

Samenvatting

Onlangs is de bezorgdheid over multiresistente ziekteverwekkers en ongeneeslijke infecties toegenomen als gevolg van overmatig gebruik en misbruik van antibiotica. Nanomaterialen, zoals nanodeeltjes van metalen en metaaloxiden, zijn populair geworden op biomedisch gebied als potentiële nieuwe strategieën om multiresistente ziekteverwekkers te bestrijden. Deze studie onderzocht het gebruik van koperen nanodeeltjes (CuNP's) als bactericide tegen drie veel voorkomende in het ziekenhuis verworven opportunistische pathogenen - Escherichia coli (E. coli), Acinetobacter baumannii (A. baumannii) en Staphylococcus aureus (S. aureus) - die in toenemende mate resistentie tegen geneesmiddelen ontwikkelen. Er worden gedetailleerde protocollen gepresenteerd voor het synthetiseren van CuNP's van twee groottes (20 nm en 60 nm) en het evalueren van hun bacteriedodende werkzaamheid door middel van kolonietesten. De mechanismen van antimicrobiële werking die ten grondslag liggen aan CuNP's werden onderzocht door veranderingen in de productie van reactieve zuurstofsoorten te beoordelen. Daarnaast werden vier modulatoren die menselijke eiwitfuncties remmen toegepast om de mogelijke betrokkenheid van geprogrammeerde celdood (PCD) routes bij het doden van bacteriën te bestuderen. Door deze benadering wordt de mogelijke opkomst van koperresistente stammen gesuggereerd, voortbouwend op onderzoek naar koperhomeostase-eiwitten, waaronder koperafhankelijke transcriptieregulatoren. Deze bevindingen bieden een uitgebreide methodologie voor het bestuderen van de bacteriedodende effecten van CuNP's en hun mogelijke rol bij het aanpakken van antibioticaresistentie.

Inleiding

Resistente bacteriën zijn een ernstige bron van zorg in de geneeskunde. Hun snelle opkomst heeft de werkzaamheid van conventionele antibiotica verminderd, wat resulteert in meer klinische complicaties. Ze vormen een grote bedreiging voor de volksgezondheid en creëren een dringende behoefte aan nieuwe antimicrobiële middelen. Een van de onderzoeksrichtingen zijn nanomaterialen. Nanomaterialen bezitten unieke fysisch-chemische eigenschappen waardoor ze kunnen interageren met microben op een manier die hun levensvatbaarheid in gevaar brengt. Zilveren nanodeeltjes (AgNP's) induceren bijvoorbeeld oxidatieve stress in bacteriën, wat resulteert in eiwitdisfunctie, membraanverstoring, DNA-schade en uiteindelijk celdood¹. Gouden nanodeeltjes (AuNP's) daarentegen staan bekend om hun schimmelwerende eigenschappen en kunnen het bacteriedodende effect van antibiotica versterken door als dragers te dienen².

Bovendien hebben koperen nanodeeltjes (CuNP's) ook veel aandacht getrokken vanwege hun krachtige antimicrobiële effect en lage productiekosten. Studies suggereren dat CuNP's een breedspectrum bacteriedodende activiteit vertonen door verstoring van de enzymatische activiteit en het genereren van reactieve zuurstofspecies (ROS)³. De positieve lading van CuNP's vergemakkelijkt hun penetratie in de bacteriën, waardoor hun cellulaire opname wordt verbeterd⁴. Dit mechanisme maakt CuNP's een veelbelovende optie voor oppervlaktecoating, zoals op implantaten, om infecties te voorkomen³. Een interessante bevinding is echter dat het bacteriedodende effect van CuNP's afhankelijk lijkt te zijn van de grootte. Sommige studies hebben aangetoond dat kleinere CuNP's een hogere antibacteriële activiteit vertonen, waarschijnlijk vanwege hun superieure oppervlakte-volumeverhouding⁵.

ROS-generatie veroorzaakt wijdverspreide schade aan cellen en bacteriën, waaronder lipideperoxidatie, eiwitdisfunctie, DNA-fragmentatie en remming van gluconeogenese/glycogenolyse, en is betrokken bij necrose of geprogrammeerde celdood (PCD)^6,7,8. Recente studies hebben aangetoond dat er PCD-systemen bestaan in bacteriën, met actiemodi en effectoren die vergelijkbaar zijn met die in eukaryote systemen⁹. Bacteriële gemeenschappen kunnen PCD induceren als reactie op stress, inclusief oxidatieve stress, via een toxine-antitoxine (TA) systeem¹⁰. Simpel gezegd, het toxine-antitoxinesysteem bestaat uit toxines die essentiële cellulaire processen kunnen verstoren en antitoxines die stabiele complexen kunnen vormen met de toxines om hun toxiciteit onder normale groeiomstandigheden te remmen. De meeste bacteriën en archaea bevatten TA loci in hun genomen, vaak aanwezig in meerdere kopieën van extrachromosomaal en chromosomaal DNA. Er zijn verschillende soorten TA-systemen, waarbij type II TA (bekend als MazE/MazF-module) van bijzonder belang is. Onder stressomstandigheden worden antitoxinen afgebroken, waardoor toxines hun cellulaire doelen kunnen remmen. In E. coli en S. aureus wordt het toxine MazF geactiveerd als reactie op stressomstandigheden zoals oxidatieve stress, hoge temperaturen en uithongering van aminozuren. Bijgevolg wordt de expressie van het antitoxine MazE verminderd, waardoor het toxine MazF¹⁰ vrijkomt. Studies hebben aangetoond dat MazF de synthese van eiwitten mogelijk maakt die een kleine subpopulatie in staat stellen te overleven onder ongunstige omstandigheden, terwijl het grootste deel van de populatie mazEF-gemedieerde celdood ondergaat. Deze celdood kan ROS-afhankelijk zijn, waarbij ROS transcriptionele of translationele remming induceert, of ROS-onafhankelijk, waarbij DNA-schade de doodsroutes activeert¹¹.

Deze studie onderzoekt de mechanismen waarmee CuNP's bacteriële dood induceren. In plaats van zich alleen te concentreren op het TA-systeem, werden vier PCD-modulatoren, die eerder in ons onderzoek ^7,12 werden gebruikt, gebruikt om mogelijke PCD-routes in bacteriën te onderzoeken.

Door de bacteriedodende effecten van CuNP's van twee verschillende groottes (20 en 60 nm) in verschillende concentraties te onderzoeken en gebruik te maken van methoden zoals kolonietesten, ROS-detectie en PCD-modulatoren (SBI, Z-VAD, NSA en Wortmannin), benadrukt dit onderzoek dat PCD niet exclusief is voor meercellige organismen, maar ook voorkomt in bacteriële gemeenschappen onder stress. Door gedetailleerde protocollen te verstrekken, wil dit werk onderzoekers in staat stellen de werkzaamheid van CuNP en bacteriedodende mechanismen in hun eigen systemen te evalueren. Bovendien bevorderen deze bevindingen het begrip van bacteriële PCD en ondersteunen ze de ontwikkeling van op CuNP gebaseerde therapieën om antibioticaresistente bacteriën te bestrijden.

Protocol

De reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Bereiding van kopernanodeeltje

1. Verkrijg commerciële koperen nanopoeders (25 nm en 60-80 nm) van een commerciële bron.
2. Gebruik 1,0 mM natriumdodecylsulfaat (SDS) als dispergeermiddel voor twee groottes van 1 mg/ml nanodeeltjes.
3. Verspreid de nanodeeltjes met behulp van een ultrasoonbad gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. De volledig gedispergeerde nanodeeltjes zijn dan klaar voor gebruik in volgende experimenten.

2. Bereiding van bacteriën

1. Verkrijg E. coli (Migula) Castellani en Chalmers stam 25922 en A. baumannii Bouvet en Grimont stam uit de American Type Culture Collection. Verkrijg S. aureus van het Bioresource Collection and Research Center.
2. Kweek de bacteriën in Luria-Bertani (LB) bouillon onder aërobe omstandigheden bij 37 °C.
3. Verdun de bacterieculturen in LB-medium tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD₆₀₀) van ongeveer 0,5.

3. Beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen

1. Kolonie test
   1. Gebruik voorraad CuNP-oplossingen (1 mg/ml) om verschillende concentraties van twee groottes CuNP's te bereiden, waaronder 0 μg/ml, 1 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml en 100 μg/ml.
   2. Verdeel de in stap 2.3 bereide bacterieculturen in microcentrifugebuisjes en centrifugeer bij 3300 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   3. Behoud de bacteriële pellets en voeg verschillende concentraties van respectievelijk twee maten CuNP's toe door voorzichtig te pipetteren.
   4. Behandel bacteriële pellets met PBS en 70% alcohol als respectievelijk de negatieve en positieve controles.
   5. Incubeer alle behandelde bacteriën door te schudden bij 200 tpm bij 37 °C gedurende 24 uur.
   6. Was na incubatie alle behandelde bacteriën met PBS en verdeel ze op LB-agarplaten. Plaats de platen 24 uur in een broedstoof van 37 °C.
   7. Tel de volgende dag het aantal kolonies in elke behandelingsgroep en voer een statistische analyse uit. Het wordt aanbevolen om dit in drievoud uit te voeren voor statistische nauwkeurigheid.
2. Onderzoek naar bacteriedodende mechanismen
   1. Bereid bacteriën voor zoals beschreven in stap 3.1.2 en behandel ze met 5 μM SBI-0206965 (SBI) gedurende 2 uur, 0,5 μM necrosulfonamide (NSA) gedurende 1 uur, 100 nM wortmannine (wort) gedurende 30 minuten, of 100 nM Z-VAD-FMK (Z-VAD) gedurende 30 minuten.
   2. Behandel de bacteriën samen met verschillende concentraties van twee maten CuNP-oplossingen, zoals beschreven in stap 3.1.1, in aanwezigheid of afwezigheid van 5 μM SBI, 0,5 μM NSA, 100 nM wort en 100 nM Z-VAD.
   3. Centrifugeer de bacteriën na modulatorbehandelingen (stap 3.2.1) en verwijder de supernatanten.
   4. Resuspendeer de bacteriepellets in de in stap 3.2.2 bereide oplossingen en incubeer ze door schudden bij 200 rpm bij 37 °C gedurende 24 uur.
   5. Behandel de bacteriën met 70% ethanol en PBS als respectievelijk de positieve en negatieve controles. Gebruik een oplossing zonder CuNP's als de CuNP-blancocontrole (0 μg/ml; mock) onder dezelfde remmercondities voor elke groep. Incubeer alle monsters gedurende nog eens 24 uur.
   6. Voeg na de incubatie een reagens voor de levensvatbaarheid van de cellen toe aan de culturen in een volumeverhouding van 1:10. Incubeer de culturen nog 2 uur en schud ze bij 37 °C.
   7. Centrifugeer de culturen (stap 3.1.2) na de incubatie van 2 uur. Breng de fluorescerende supernatanten over naar platen met 96 putjes. Meet fluorescentie met behulp van een excitatiegolflengte van 560 nm en een emissiegolflengte van 590 nm met een microplaatlezer.
   8. Verdun het resterende bovenstaande middel tot ^10-5 en ^10-4 en verdeel het over LB-agarplaten om te kweken.
   9. Tel de volgende dag enkele kolonies.

4. Detectie van reactieve zuurstofsoorten

1. Bereid bacterieculturen voor zoals beschreven in stap 2.3 en verdeel ze in microcentrifugebuisjes.
2. Behandel de bacteriën met verschillende stresscondities als ROS-inducerende positieve controlegroepen (gegevens niet weergegeven in de resultaten). De behandelingen worden beschreven in stap 4.2.1-4.2.4.
   1. Stel de bacteriën gedurende 3 uur bloot aan 405 nm UV-licht. Incubeer de bacteriën gedurende 2 uur bij 45 °C.
   2. Incubeer vervolgens de bacteriën gedurende 2 uur bij 4 °C.
   3. Behandel bacteriën met 3% H₂O₂ gedurende 30 min.
   4. Houd de bacteriën op 37 °C in LB-bouillon als negatieve controle.
3. Bereid verschillende concentraties CuNP's voor zoals beschreven in stap 3.1.1 en behandel de bacteriën met CuNP's van 20 nm of 60 nm in concentraties van 1 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml en 100 μg/ml gedurende 24 uur.
4. Was de geïncubeerde bacteriën twee keer met PBS om eventuele resterende nanodeeltjes te verwijderen.
5. Bereid 2′,7′-dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (H₂DCFDA) kleurstof in PBS met een eindconcentratie van 5 μM.
6. Resuspendeer de bacteriële pellets in 5 μM H₂DCFDA en meet de fluorescentie-intensiteit bij 520/30 nm emissie met behulp van een flowcytometer.
   OPMERKING: De intensiteit van FL1 groene fluorescentie correleert met het ROS-niveau in de behandelde cultuur. Het wordt aanbevolen om dit in drievoud uit te voeren voor statistische nauwkeurigheid.

Resultaten

Antimicrobiële activiteiten van CuNP's van twee groottes in drie pathogenen
Drie opportunistische pathogenen (E. coli, S. aureus en A. baumannii) werden gebruikt om de bacteriedodende activiteiten van CuNP's te testen. De bacteriën werden behandeld met 0 μg/ml, 1 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml en 100 μg/ml van 20 nm of 60 nm CuNP's, en de bacteriedodende activiteiten werden bepaald met behulp van de minimale bacteriedodende concentratie ...

Discussie

Deze studie onderzocht de antimicrobiële effecten en mechanismen van CuNP's in twee groottes en verschillende concentraties tegen E. coli, S. aureus en A. baumannii. Met behulp van de vastgestelde protocollen werd waargenomen dat CuNP-geïnduceerde bacteriedodende effecten oxidatieve stress en mogelijke PCD-activering met zich meebrengen. De wisselwerking tussen metaalhomeostase en bacteriële stressreacties blijft echter grotendeels onontgonnen. Eerdere studies ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Acinetobacter baumannii Bouvet and Grimont strain	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA	17978	Bacterieën voor CuNP toxiciteitsexperiment
Bio-Rad iMark Microplate Reader	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA	168-1130	Gebruikt voor het meten van absorptie in bacteriële levensvatbaarheidstesten.
cell-permeant 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate  (H2DCFDA)	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA	D6883	Gebruikt voor het detecteren van reactieve zuurstofsoorten (ROS) in behandelde bacteriële cellen.
Koper nanodeeltjes (CuNPs) 25 nm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	774081	Gebruikt om CuNP-voorraadoplossing te bereiden
Koper nanodeeltjes (CuNPs) 60-80 nm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	774103	Gebruikt om CuNP-voorraadoplossing te bereiden
Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA	25922	Bacterieën voor CuNP toxiciteitsexperiment
Gallios flow cytometer	Beckman Coulter, Brea, CA, USA		Gebruikt voor flowcytometrische analyse in meerdere experimenten, inclusief detectie van reactieve zuurstofsoorten.
LB agar	FocusBio, Miaoli, Taiwan	LBA500	Gebruikt voor het kweken van bacteriën
Luria-Bertani (LB) bouillon	Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA	244620	Gebruikt voor het kweken van bacteriën
Necrosulfonamide (NSA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	480073	Gebruikt als modulator voor prebehandeling in studies over bacteriële doodsroutes.
PrestoBlue Cel Levensvatbaarheid Reagens	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	P50200	Gebruikt voor het beoordelen van cellevensvatbaarheid via fluorescentie.
SBI-0206965 (SBI)	BioVision, Milpitas, CA, USA	9580	Gebruikt als modulator voor prebehandeling in studies over bacteriële doodsroutes.
Natriumdodecylsulfaat (SDS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	L4509	Gebruikt als dispersiemiddel voor koper nanodeeltjes om aggregatie te verminderen.
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan	13567	Bacterieën voor CuNP toxiciteitsexperiment
Varioskan LUX multimode microplate reader	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	VLBLATGD2	Gebruikt voor het meten van fluorescentie in cel levensvatbaarheidstests
Wortmannin (Wort)	Abcam, MA, USA	ab120148	Gebruikt als modulator voor prebehandeling in studies over bacteriële doodsroutes.
Z-VAD-FMK (Z-VAD)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	V116	Gebruikt als modulator voor prebehandeling in studies over bacteriële doodsroutes.