Dit protocol is ontworpen om de effectieve isolatie van extracellulaire blaasjes uit menselijke moedermelk met hoge zuiverheid te versnellen en mogelijk te maken.
Methodenartikel
Snelle isolatie van extracellulaire blaasjes afkomstig van menselijke moedermelk
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Extracellulaire blaasjes (EV's), nanodeeltjes van ongeveer 20-1000 nm groot, trekken snel de aandacht vanwege hun therapeutisch potentieel. In het bijzonder is aangetoond dat extracellulaire blaasjes uit menselijke moedermelk (HBMDEV's) bescherming bieden in experimentele modellen van necrotiserende enterocolitis, een darmziekte die voornamelijk premature baby's treft, resulterend in sterfte tot 50%. Traditionele extracellulaire vesikels isolatietechnieken, zoals differentiële ultracentrifugatie, chromatografie met uitsluiting van grootte, enz., zijn echter tijdrovend of vereisen gespecialiseerde instrumentatie, die geen van beide praktisch is in de klinische setting. Daarom is er behoefte aan een eenvoudige isolatiemethode die een snelle reactieve toediening van HBMDEV's aan patiënten mogelijk maakt. Hier wordt een combinatie voorgesteld van centrifugatie van menselijke moedermelk om vet en cellulair afval te verwijderen, in combinatie met snelle ultrafiltratie van de resterende magere melk die functionele extracellulaire blaasjes met een hoge opbrengst produceert. Het gebruik van deze techniek kan het gebruik van HBMDEV's mogelijk maken als een praktische therapeutische optie in de klinische setting.
Inleiding
Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn alomtegenwoordige nanodeeltjes van ongeveer 20-1000 nm groot, hetzij via endosomale routes (wanneer microvesiculaire lichamen versmelten met het plasmamembraan, wat het vrijkomen van cellulaire lading in de extracellulaire ruimte vergemakkelijkt) of plasmamembraanroutes (d.w.z. ontluiken). EV's bevatten gastheer cellulaire lading zoals lipiden, eiwitten, nucleïnezuren, verschillende metabolieten en andere inhoud, afhankelijk van hun bron. Bovendien zijn EV's belangrijk bij intercellulaire communicatie, angiogenese, immuunsuppressie, hermodellering van de micro-omgeving van tumoren, kankerprogressie, enz.1,2,3,4. Met name menselijke moedermelk (HBM) is EV-rijk en gemakkelijk toegankelijk voor moeders die borstvoeding geven5. Onlangs hebben van menselijke moedermelk afgeleide EV's (HBMDEV's) de aandacht getrokken als therapeutische vectoren voor de behandeling van ziekten 1,2. Premature pasgeborenen of pasgeborenen met een laag geboortegewicht zijn vatbaar voor verschillende infecties, waaronder necrotiserende enterocolitis. Necrotiserende enterocolitis, gekenmerkt door ileale of colonnecrose, varieert van milde darmontsteking tot multisysteemorgaanfalen met een kindersterftecijfer tot 50%6. Voorbehandeling met EV's op basis van moedermelk is voldoende om te beschermen tegen darmontsteking in experimentele modellen van NEC in vitro en in vivo 2,7. Daarom kan het gebruik van HBMDEV's een haalbare optie zijn voor de behandeling van NEC in klinische omgevingen.
Ondanks de therapeutische belofte van HBMDEV's, zijn er bekende beperkingen bij het gebruik van de huidige isolatietechnieken in die zin dat ze ofwel tijdrovend zijn of gespecialiseerde apparatuur vereisen, die geen van beide universeel praktisch zijn voor de klinische setting. De "gouden standaard" van EV-isolatie omvat verschillende rondes van differentiële ultracentrifugatie, die, hoewel het een bevredigende opbrengst van EV's oplevert, hun structurele integriteit en functionaliteit kan beïnvloeden 8,9. Bovendien kunnen ultracentrifugatietijden minimaal 2 uur zijn, een kostbare hulpbron in de klinische setting9. Isolatiekits hebben bewezen zowel tijdbesparend als enigszins kosteneffectief te zijn. Isolatie met behulp van dergelijke methoden resulteert echter ook in lage opbrengsten en dus lage schaalbaarheid. Daarom is er behoefte aan HBMDEV-isolatietechnieken die zowel tijdbesparend als kosteneffectief zijn zonder dat dit ten koste gaat van de EV-opbrengst.
Dit protocol is bedoeld om een stapsgewijze methode te schetsen voor het snel isoleren van EV's van HBM met behulp van bestaande klinisch beschikbare, door de FDA goedgekeurde tools. Om dit te bereiken, werden standaard centrifugatie en een filteruitbreidingssysteem van klinische kwaliteit gebruikt om EV's van HBM te isoleren. Deze blaasjes vallen binnen het verwachte groottebereik, vertonen een morfologie die consistent is met bekende EV's, zijn verrijkt voor EV-markers en functioneel vergelijkbaar met EV's die zijn geïsoleerd met behulp van traditionele ultracentrifugatie-isolatietechnieken. Dit HBM EV-isolatieprotocol kan dus praktische, snelle isolatie en toepassing van EV's geïsoleerd van HBM in de klinische setting mogelijk maken.
Protocol
Moedermelk werd verzameld in de regionale intensive care-afdeling van de Universiteit van Alabama in Birmingham (UAB). Weggevaagde monsters werden verzameld nadat de moedermelk was ontdooid voor gebruik door de patiënt en de patiënt niet in staat was om de hele voeding te nemen. Deze voedingen worden normaal gesproken weggegooid, maar zijn verzameld voor onderzoeksdoeleinden. Monsters werden verzameld van geanonimiseerde personen en bewaard bij -80 °C tot het moment voor de experimenten. De collectie werd goedgekeurd door de UAB Internal Review Board Protocol N160203002. De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Extracellulaire isolatie van blaasjes (differentiële ultracentrifugatie)
- Verdun moedermelk in een bioveiligheidskast 1:10 in steriel PBS in een conische tube van 15 ml.
- Centrifugeer de moedermelk op 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Na het centrifugeren moeten er 3 verschillende lagen zijn: melkvet (bovenste laag), wei- of magere melk (middelste waterige laag) en de cellen en ander vuil (gepelleteerd aan de onderkant). Filtreer in een bioveiligheidskast melkvet en weilagen door een filter van 70 μm (zorgt voor een gemakkelijkere verwijdering van vet) terwijl de pellet ongestoord blijft. Breng de doorstroom over naar een nieuwe buis.
- Centrifugeer het monster bij 2600 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Achtergebleven melkvet, cellen en vuil worden in deze stap verwijderd. Filtreer in een bioveiligheidskast het bovenstaande door een filter van 70 μm. Breng het bovenstaande over in een ultracentrifugebuis. Controleer of er ten minste 10 ml vloeistof in de buis zit vóór ultracentrifugatie.
- Ultracentrifugeer het monster bij 20.000 x g gedurende 45 minuten bij 4 °C. Na ultracentrifugatie kunnen er drie lagen zijn die lijken op stap 1.2: melkvet, wei of magere melk, en cellen en ander vuil. Filtreer in een bioveiligheidskast melkvet en weilagen door een filter van 70 μm zonder de pellet te verstoren. Breng het bovenstaande over in een conische buis van 15 ml.
- Filtreer de moedermelk met een spuit in een bioveiligheidskast met een filter van 0,22 μm. Breng het bovenstaande over in een nieuwe ultracentrifugebuis. Controleer of er ten minste 10 ml vloeistof in de buis zit vóór ultracentrifugatie.
- Ultracentrifugeer het monster bij 110.000 x g gedurende 70 minuten bij 4 °C. Zuig de supernatant op en suspendeer de pellet in 10 ml steriel PBS.
- Ultracentrifugeer het monster opnieuw bij 110,00 x g gedurende 70 minuten bij 4 °C.
- In een bioveiligheidskast suspendeer de pellet in 150-200 μL steriel PBS.
2. Extracellulaire isolatie van blaasjes (snelle filtratiemethode)
- Verdun de moedermelk in een bioveiligheidskast (1:10) in steriel PBS.
- Centrifugeer de moedermelk op 300 x g gedurende 10 minuten op 4°C. Na het centrifugeren moeten er drie verschillende lagen zijn: melkvet (bovenste laag), wei- of magere melk (middelste waterige laag) en de cellen en ander vuil (gepelleteerd in de bodem). Filtreer in een bioveiligheidskast melkvet en weilagen door een filter van 70 μm (zorgt voor een gemakkelijkere verwijdering van vet) terwijl de pellet ongestoord blijft. Breng de doorstroom over naar een nieuwe buis.
- Centrifugeer het monster bij 2600 x g gedurende 10 minuten bij 4°C. Achtergebleven melkvet, cellen en vuil worden in deze stap verwijderd. Filter in een bioveiligheidskast het bovenstaande door een filter van 70 μm. Breng het bovenstaande over in een buis van 15 ml.
- Vul in een bioveiligheidskast een 0,22 μm, 16-inch filteruitbreidingsset met 5,4 ml PBS.
- Neem voor het prime-systeem 5.4 ml steriele PBS in een spuit en spoel het systeem door totdat PBS uit het andere uiteinde van de slang is.
- Spuit filtreer de moedermelk door een 0,22 μm, 16-inch filteruitbreidingsset. Achtergebleven melkvet, cellen en vuil worden in deze stap verwijderd.
NOTITIE: Er kan meer dan één filteruitbreidingsset nodig zijn, afhankelijk van de hoeveelheid vuil die in het monster aanwezig is. - Vang de doorstroom op in een conische buis van 15 ml.
3. Nanosight tracking analyse
- Verdun het monster (1:1000) in steriel PBS. Snel gefilterde monsters kunnen onverdund worden gebruikt.
- Draai kort het monster voort. Laad 1 ml van het monster in een tuberculinespuit.
- Bevestig de spuit aan het injectieapparaat en zet de spuit vast.
- Zet de injectiepomp op 50. Zet de camera aan om ervoor te zorgen dat er niet te veel of te weinig deeltjes worden bekeken. Zorg ervoor dat de deeltjesstroom constant is en dat er geen invallen of plotselinge sprongen in de monsterstroom zijn.
- Zet de injectiepomp op 100. Voer het protocol uit.
OPMERKING: De software was ingesteld om eenmaal per minuut te worden gelezen voor een totaal van 5 leesbewerkingen. - Lees het voorbeeld.
- Spoel Nanosight tussen monsters door met PBS.
OPMERKING: Een analysesysteem voor het volgen van nanodeeltjes werd gebruikt om de deeltjesgrootte en deeltjesconcentratie per milliliter te bepalen. De gemiddelde concentratie van het ultragecentrifugeerde monster was 3,30 e+08 +/- 4,08 e+06 deeltjes/ml, terwijl de snelle filtratiemethode 5,50e+08 +/- 1,16e+08 deeltjes/ml was.
4. Negatieve kleuring van extracellulaire blaasjes en transmissie-elektronenmicroscopie
OPMERKING: Monsters met een exosoomconcentratie in het bereik van 108 werden gebruikt voor transmissie-elektronenmicroscopie (TEM).
- Gloeiontladingsvormv/met koolstoffilm beklede koperen EM-roosters voor 25 s bij 20 mA met behulp van het afvoerapparaat.
- Laad 7 μL van de EV-suspensieoplossing op het net en incubeer gedurende 1 min.
- Wick overtollig met Whatman-filterpapier door van onder het raster te wicken om het monster naar het rooster te "trekken" in plaats van ervan weg.
- Kleur het monster onmiddellijk met 7 μl gefilterde 1% uranylacetaat (UA)-oplossing op het oppervlak van het EM-rooster met een pipet.
- Na 15 s werd overtollige UA-oplossing uit het rooster verwijderd door met filtreerpapier in contact te komen met de roosterrand. Bekijk het monster onmiddellijk (binnen 24 uur) op de TEM op 80 kv.
5. Eiwitconcentratie
- Aceton slaat 250 μL gezuiverde EV's (1:4) neer gedurende 1 uur bij -20 °C.
OPMERKING: Gebruik 100 μL gezuiverde exosomen voor de ultracentrifugatiemethode. - Centrifugeer het monster gedurende 30 minuten op 16.000 x g .
- Laat de pellet aan de lucht drogen, gevolgd door opnieuw suspensie in 100 μL RIPA buffer.
- Volg het protocol van de BCA-eiwittestkit om de eiwitconcentraties te bepalen. De extinctie werd gemeten bij 562 nm met behulp van een microplaatlezer.
OPMERKING: 1 ml moedermelk levert normaal gesproken ongeveer 1.3 μg/ml eiwit op met behulp van ultracentrifugatie en ongeveer 0.2-1 μg/ml eiwit met behulp van snelle filtratie.
6. Westerse vlek
- Incubeer een eiwitmonster van 1 volume met een baanmarkering van 4 volumes, verminder de monsterbuffer en kook het 7 minuten op 90°C.
- Laad en laat 10 μg eiwit op een SDS 10% gel op 70 V draaien gedurende 15 min. Verhoog daarna de spanning tot 100 V en laat nog 90 minuten draaien.
- Breng de gel over op een nitrocellulosemembraan met behulp van het halfdroge apparaat gedurende 30 minuten bij 15 V.
- Was het membraan 3 keer met TBS-0.1% Tween (TBS-T) gedurende elk 10 minuten.
- Blokkeer het membraan gedurende 30 minuten met behulp van Fast Blocking Buffer-oplossing (verdund tot 1x).
- Incubeer primair antilichaam (Hsp70-1:1000; CD63-1:1000 en CD9-1:1000) in 1x Bufferoplossing, 's nachts bij 4°C op een tuimelschakelaar 10,11,12.
- Was het membraan drie keer gedurende 10 minuten elk met TBS-T.
- Voeg (H+L) HRP-geconjugeerd anti-muis secundair antilichaam toe, in een verdunning van 1:1000 voor alle ondervraagde eiwitten (Hsp70, CD9 en CD63) in 2% melk in TBS-T en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een wip.
- Was het membraan drie keer gedurende 10 minuten elk met TBS-T.
- Ontwikkel met behulp van ECL (1:1) en film met ontwikkelaar.
7. In vitro cultuur van IEC-6 cellen
- Zaai 1,0 x 106 cellen in een T-25-kolf in 5 ml complete RPMI-media. Laat cellen een nacht hechten.
- Verwijder het volledige medium en was met 1-2 ml PBS.
- Zuig PBS aan en voeg 5 ml EV-vrije volledige RPMI toe.
- Voeg een eindconcentratie van 400 μM H2O2 per putje en 10 μg/ml EV's tegelijkertijd toe aan de cellen gedurende de nacht.
- Verwijder media en was de cellen met 1-2 ml PBS.
- Zuig de PBS op en voeg 1 ml trypsine toe.
- Plaats de cellen gedurende 5 minuten in de broedmachine op 37°C.
- Deactiveer trypsine door het dubbele volume van volledige RPMI toe te voegen. Breng de cellen over in een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten op 125 x g .
- Zuig het bovenstaande op en suspendeer de pellet in 1 ml PBS.
- Tel cellen met behulp van een cellenteller.
Resultaten
Isolatie van EV's met behulp van ultracentrifugatie en snelle isolatie
Dogmatisch gezien omvat EV-isolatie uit HBM centrifugeren om melkvet en andere grote deeltjes te verwijderen, gevolgd door filteren, verschillende rondes van ultracentrifugatie en resuspensie van het met EV verrijkte monster in PBS. De snelle filtratiemethode maakt gebruik van centrifugatie om melkvet en cellulair vuil te verwijderen, gevolgd door filtratie via een filterverlengingsfilter van 0,22 μm, waardoor achtergebleven vuil verder wordt verwijderd, wat een met EV verrijkt monster oplevert dat vergelijkbaar is met traditionele ultracentrifugatie (Figuur 1).
Karakterisering van HBMDEV's uit het snelle filtersysteem voor filterextensie
Nanosight tracking-analyse onthulde een vergelijkbare deeltjesgrootte tussen ultragecentrifugeerde (Figuur 2A) en snelle filter geïsoleerde HBMDEV's (Figuur 2B). Beide methoden geven aan dat geïsoleerde EV's een gemiddelde grootte hebben van ongeveer 100 nm. EV's vervoeren verschillende ladingen (d.w.z. eiwitten, lipiden, miRNA's, enz.) voor secretie van gastheercellen naar hun verschillende doelen. Daarom was het eerste onderzochte doeleiwit heat shock-eiwit 70 (Hsp70), een eiwit waarvan bekend is dat het via EV's13 wordt getransporteerd. Western blot-analyse toont aan dat EV's geïsoleerd met behulp van snelle filtratie een vergelijkbare expressie van Hsp70 vertoonden als EV's geïsoleerd met behulp van ultracentrifugatie (Figuur 3A en Aanvullende Figuur 1A). Bovendien kunnen EV's worden geïdentificeerd via oppervlakte-expressie van tetraspaninen zoals CD9 en CD6314. Western blot-analyse onthulde dat EV's geïsoleerd via snelle filtratie inderdaad CD9 (Figuur 3B en aanvullende figuur 2B) en CD63 (Figuur 3C en aanvullende figuur 3C) tot expressie brengen. Ten slotte onthulde morfologische analyse van HBMDEV's via transmissie-elektronenmicroscopie een vergelijkbare vesikelmorfologie tussen de twee isolatietechnieken (Figuur 4A-D).
Verschillende laboratoria hebben aangetoond dat EV's beschermende eigenschappen hebben die de overleving van cellen tijdens cellulaire stress bevorderen 2,3,7. Net als bij eerder gepubliceerde rapporten, zijn EV's geïsoleerd met behulp van de snelle filtratiemethode in staat om darmepitheelcellen (IEC-6) te beschermen tegen door waterstofperoxide geïnduceerde celdood2 (Figuur 5A,B). Deze gegevens suggereren dat HBMDEV's geïsoleerd met behulp van de snelle filtratiemethode niet alleen vergelijkbare eigenschappen bezitten als die geïsoleerd met behulp van differentiële ultracentrifugatie, maar ook functioneel vergelijkbaar zijn.
Figuur 1: Schematisch overzicht van de verschillen tussen ultracentrifugatie en snelle filtratiemethoden van EV's isolatie uit moedermelk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Nanosight tracking analyse van EV's geïsoleerd uit menselijke moedermelk met behulp van ultracentrifugatie en snelle filtratiemethode. (A) NTA van EV's in menselijke moedermelk (verdund 1:1000 in 1x PBS) geïsoleerd met behulp van ultracentrifugatie. De getoonde gegevens zijn een enkele weergave van 3-4 onafhankelijke onderzoeken. (B) NTA van EV's in moedermelk geïsoleerd met behulp van snelle filtratie. De getoonde gegevens zijn een enkele weergave van 3-4 onafhankelijke onderzoeken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Western blot-analyse van EV's geïsoleerd met behulp van ultracentrifugatie en snelle filtratie. (A) Blootstelling van één seconde van 10 μg heat shock-eiwit 70 (Hsp70). "L" staat voor ladder, "U" staat voor ultracentrifugatie en "R" staat voor snelle filtratie. Monsters verkregen door snelle filtratie werden verder geconcentreerd door centrifugatie bij 110.000 × g gedurende 70 minuten, tweemaal uitgevoerd. De getoonde afbeelding vertegenwoordigt een van de vier onafhankelijke onderzoeken. (B) Tweeëntwintigste belichting van 10 μg CD9. "L" staat voor ladder, "U" staat voor ultracentrifugatie en "R" staat voor snelle filtratie. Snelle filtratiemonsters werden geconcentreerd door centrifugatie bij 110.000 × g gedurende 70 minuten, tweemaal uitgevoerd. De getoonde afbeelding vertegenwoordigt een van de vier onafhankelijke onderzoeken. (C) Tweeëntwintigste belichting van 10 μg CD63. "L" staat voor ladder, "U" staat voor ultracentrifugatie en "R" staat voor snelle filtratie. Snelle filtratiemonsters werden geconcentreerd door centrifugatie bij 110.000 × g gedurende 70 minuten, tweemaal uitgevoerd. De getoonde afbeelding vertegenwoordigt een van de vier onafhankelijke onderzoeken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Transmissie-elektronenmicroscopie-analyse van EV's geïsoleerd met behulp van ultracentrifugatie en snelle filtratie. (A) Elektronenmicrofoto van EV's geïsoleerd met behulp van ultracentrifugatie met een vergroting van 8.000×. Schaal balk = 800 nm. De getoonde afbeelding vertegenwoordigt een van de drie onafhankelijke onderzoeken. (B) Elektronenmicrofoto van EV's geïsoleerd met behulp van ultracentrifugatie bij een vergroting van 20.000×. Schaal balk = 200 nm. De getoonde afbeelding vertegenwoordigt een van de drie onafhankelijke onderzoeken. (C) Elektronenmicrofoto van EV's geïsoleerd met behulp van snelle filtratie met een vergroting van 8.000×. Schaal balk = 800 nm. EV's werden geconcentreerd door centrifugatie op 110.000 × g gedurende 70 minuten, tweemaal uitgevoerd. De getoonde afbeelding vertegenwoordigt een van de drie onafhankelijke onderzoeken. (D) Elektronenmicrofoto van EV's geïsoleerd met behulp van snelle filtratie bij een vergroting van 20.000×. Schaal balk = 200 nm. EV's werden geconcentreerd door centrifugatie op 110.000 × g gedurende 70 minuten, tweemaal uitgevoerd. De getoonde afbeelding vertegenwoordigt een van de drie onafhankelijke onderzoeken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Functionele analyse van EV's geïsoleerd met behulp van ultracentrifugatie en snelle filtratie. (A) Cellevensvatbaarheid van IEC-6-cellen gekweekt in EV-vrij compleet RPMI-1640-medium. De cellen werden 's nachts behandeld met 400 μM H, 2O2 en 10 μg/ml EV's tegelijkertijd. De getoonde gegevens vertegenwoordigen een van de twee onafhankelijke onderzoeken. (B) Celtellingen van IEC-6-cellen gekweekt in EV-vrij compleet RPMI-1640-medium. De cellen werden 's nachts behandeld met 400 μM H, 2O2 en 10 μg/ml EV's tegelijkertijd. De getoonde gegevens vertegenwoordigen een van de twee onafhankelijke onderzoeken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Karakterisering van de Western blot van Hsp70 in EV's geïsoleerd met behulp van ultracentrifugatie en snelle filtratie. Blootstelling van één seconde van 10 μg heat shock-eiwit 70 (Hsp70). "L" staat voor ladder, "U" staat voor ultracentrifugatie en "R" staat voor snelle filtratie. Snelle filtratiemonsters werden geconcentreerd door centrifugatie bij 110.000 × g gedurende 70 minuten, tweemaal uitgevoerd. Elk monster vertegenwoordigt een enkele biologische replicaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Karakterisering van de Western blot van CD9 in EV's geïsoleerd met behulp van ultracentrifugatie en snelle filtratie. Vijf minuten belichting van 10 μg CD9. "L" staat voor ladder, "U" staat voor ultracentrifugatie en "R" staat voor snelle filtratie. Snelle filtratiemonsters werden geconcentreerd door centrifugatie bij 110.000 × g gedurende 70 minuten, tweemaal uitgevoerd. Elk monster vertegenwoordigt een enkele biologische replicaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Karakterisering van de Western blot van CD63 in EV's geïsoleerd met behulp van ultracentrifugatie en snelle filtratie. Tien minuten belichting van 10 μg CD63. "L" staat voor ladder, "U" staat voor ultracentrifugatie en "R" staat voor snelle filtratie. Snelle filtratiemonsters werden geconcentreerd door centrifugatie bij 110.000 × g gedurende 70 minuten, tweemaal uitgevoerd. Elk monster vertegenwoordigt een enkele biologische replicaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
EV's trekken de aandacht omdat uit de literatuur blijkt dat ze verschillende ontstekingsmechanismen kunnen reguleren en beschermende voordelen kunnen bieden 2,7. Een beperking van het praktische gebruik van EV's in klinische omgevingen is echter de tijd die nodig is om EV's te isoleren en een voldoende opbrengst te extraheren 8,15. Hier is een stapsgewijs protocol geschetst voor het snel en efficiënt isoleren van EV's van HBM met behulp van een door de FDA goedgekeurd filtersysteem. Het nut van deze methode halveert de traditionele EV-isolatiemethoden zonder dat dit ten koste gaat van de opbrengst. Daarom kan dit protocol praktische therapeutische toepassing van EV's op basis van menselijke moedermelk in een klinische setting mogelijk maken, mocht EV-therapie in de nabije toekomst worden goedgekeurd.
Bestaande EV-isolatieprotocollen hebben een consistente en effectieve opbrengst van EV's uit hun bronvloeistof aangetoond. Traditionele isolatiemiddelen, of het nu gaat om de gouden standaard, differentiële ultracentrifugatie of het gebruik van commerciële kits, zijn echter niet zonder hun beperkingen. Isolatie van EV's via differentiële ultracentrifugatie is weliswaar effectief, maar tijdrovend met protocollen met gecombineerde centrifugeertijden van minimaal ~3 uur 2,8,15. Isolatietijd in combinatie met protocollen om EV-nummers correct te kwantificeren, zou het gebruik ervan onder tijdsdruk in een klinische omgeving uitdagend maken. Bovendien zijn commerciële kits, hoewel effectief, duur. Daarnaast is het aantal samples dat per kit verwerkt kan worden laag, gezien de hoge kosten van deze kits 8,15.
Dit protocol biedt een oplossing voor deze beperkingen die tijd en geld bespaart zonder dat dit ten koste gaat van de opbrengst of zuiverheid van EV's. Om dit protocol effectief te laten zijn, zijn er belangrijke stappen die moeten worden gevolgd bij het uitvoeren van het protocol. Verdunning en eerste centrifugatie van de menselijke moedermelk zijn nodig voor het verwijderen van extracellulair afval en melkvet uit het melkmonster. Het verwijderen van dit vuil is van cruciaal belang om verstopping van het filterverlengingssysteem te voorkomen en voorkomt zo dat meerdere filters voor één monster moeten worden gebruikt. Bovendien is het van cruciaal belang om het filterverlengingssysteem met PBS te spoelen, omdat het het filter voorbereidt ter voorbereiding op het monster. Priming helpt ervoor te zorgen dat het monster niet verloren gaat tijdens het primingproces. Opgemerkt moet worden dat, afhankelijk van de inhoud van het moedermelkmonster, meer dan één filterverlengingsset nodig kan zijn, ongeacht het verdunnen en centrifugeren van het monster voorafgaand aan filtratie. In dit geval kan meer dan één filter worden gebruikt; De nieuwe filteruitbreidingsset moet echter worden geprimed voordat het monster wordt gefilterd.
Dit protocol is effectief en consistent bij het isoleren van EV's uit menselijke moedermelk, maar er zijn een aantal beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden. De centrifugestappen (~20 minuten totale tijd tussen beide spins) voorafgaand aan filtratie van het monster zijn noodzakelijk. Pogingen om het verdunde monster te filteren zonder centrifugatie zullen leiden tot herhaalde verstopping van het filteruitbreidingssysteem, verlies van monster en extra tijd toevoegen aan het EV-isolatieprotocol. Bovendien was de steekproef niet zuiver, zoals blijkt uit NTA- en TEM-analyse. Pogingen om monsters te gebruiken die niet zijn gecentrifugeerd voorafgaand aan filtratie, kunnen ongewenste verontreinigingen in het monster introduceren, wat off-target effecten kan veroorzaken, afhankelijk van de toekomstige downstream-toepassing van geïsoleerde EV's. Bovendien is dit protocol alleen geïmplementeerd met betrekking tot de isolatie van EV's uit menselijke moedermelk. Daarom is de werkzaamheid van dit protocol bij het isoleren van EV's van andere vloeistoffen niet onderzocht. Gezien de waterige aard van alle lichaamsvloeistoffen, wordt niet verwacht dat er verschillen zullen zijn in de zuiverheid en opbrengst van EV's als dit protocol wordt gebruikt om EV's uit andere bronnen te isoleren.
Er moet ook worden opgemerkt dat dit protocol efficiënt is bij het isoleren van kleine extracellulaire blaasjes (sEV). Volgens NTA waren HBM-afgeleide EV's ~100 nm groot, wat suggereert dat er geen grotere EV's in de steekproef aanwezig waren. De reden is dat monsters werden gefilterd met behulp van een filter van 0,22 μm, dat voornamelijk wordt gebruikt voor de isolatie van exosomen en andere kleinere EV's, een primaire focus van het lab op het moment van deze studie. In theorie kan het gebruik van een filter met grotere poriën het mogelijk maken om grotere EV's te isoleren. Deze vragen vallen echter buiten het bestek van deze studie.
EV's op basis van menselijke moedermelk vormen een natuurlijke therapeutische bron die gemakkelijk toegankelijk is voor klinisch gebruik. Een beperking van het brengen van EV-werk naar de klinische setting is het isoleren van EV's op een praktische manier die elke faciliteit mogelijk zou kunnen gebruiken. Dit protocol is ontworpen om die beperking te overwinnen en kan gemakkelijk worden toegepast in de ziekenhuisomgeving en worden geïmplementeerd met behulp van een bestaand door de FDA goedgekeurd filtersysteem van ziekenhuiskwaliteit, dat in de handel verkrijgbaar is of voor veel minder kan worden gekocht dan de standaard ultracentrifuge. Deze methode is kosteneffectief en produceert een EV-rijk en zuiver monster uit een filtersysteem dat al in de klinische setting wordt gebruikt.
Openbaarmakingen
De auteur(s) verklaarden geen mogelijke belangenconflicten met betrekking tot het onderzoek, het auteurschap en/of de publicatie van dit artikel.
Dankbetuigingen
Afbeeldingen en figuren zijn gegenereerd met behulp van biorender.com. Het onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd ondersteund door de UAB High Resolution Imaging Facility. Dit werk werd ondersteund door NIH/NICHD 5R21HD104481.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| (H+L) HRP-conjugaat anti-muis | Bio-Rad | 1721011 | |
| (H+L) HRP-conjugaat anti-konijn | Bio-Rad | 1706515 | |
| 0,20 spuitfilter | Fisherbrand | 09-719C | |
| 0,70 um celstrainer | Corning | 431751 | |
| 1,5M Tris HCL | Gemaakt in huis | ||
| 15 mL buisjes | Falcon | 352096 | |
| 16-inch filterverlengset | B-BRAUN | FE2012F | |
| 1M Tris HCL | Teknova | T1068 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 50 mL buisjes | Falcon | 353070 | |
| 5x Reduceerende steekproefbuffer | Thermo Scientific | 39000 | |
| Acylamide | Fisher Scientifc | BP1410-1 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
| AMT NanoSprint43 Mark-II camera | AMT | ||
| Anti-Anti | Gibco | 15240-062 | |
| Anti-CD63 | Novusbio | NBP2-32830 | |
| Anti-CD9 | Invitrogen | 10626D | |
| APS | Thermo Scientific | 17874 | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23227 | |
| Beckman buisjes | Beckman coulter | 344059 | |
| BrightStar ECL Chemiluminescent | Alkali Scientific | XR92 | |
| Exosome Depleted FBS | Fisher Scientific | NC0464480 | |
| Fast Blocking Buffer | Pierce | 37575 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Hsp70 | Invitrogen | MA3-006 | |
| Human insulin | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-500 | |
| IEC-6 | ATCC | CRL-1592 | |
| JEOL 1400 FLASH TEM | JEOL USA Inc | ||
| Lane marker reducerende steekproefbuffer | Thermo Scientific | 39000 | |
| Melkpoeder | Bioworld | 30620074-1 | |
| Nanosight NS 300 | Malvern Instruments Ltd. | ||
| Nitrocellulose membraan | Life technologies | 88018 | |
| PELCO easiGlow ontladingsapparaat | Ted Pella | ||
| Protease inhibitor mini-tabletten | Pierce | A32955 | |
| RIPA-buffer | Pierce | 89901 | |
| RPMI 1640 | Fisher Scientifc | 11875119 | |
| SDS | Fisher Scientifc | BP2436-200 | |
| T-25 fles | Thermo Scientific | 156367 | |
| TBS | Gemaakt in huis | ||
| TEMED | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Trypsine EDTA | Gibso | 25200-056 | |
| Tween 20 | Thermo Scientific | J20605-AP |
Referenties
- Galley, J. D., Besner, G. E. The therapeutic potential of breast milk-derived extracellular vesicles. Nutrients. 12 (3), 745(2020).
- Martin, C., et al. Human breast milk-derived exosomes attenuate cell death in intestinal epithelial cells. Innate Immun. 24 (5), 278-284 (2018).
- Hock, A., et al. Breast milk-derived exosomes promote intestinal epithelial cell growth. J Pediatr Surg. 52 (5), 755-759 (2017).
- Alexander, M., et al. Exosome-delivered microRNAs modulate the inflammatory response to endotoxin. Nat Commun. 6, 7321(2015).
- Lasser, C., et al. Human saliva, plasma, and breast milk exosomes contain RNA: Uptake by macrophages. J Transl Med. 9, 9(2011).
- Chan, C. C., et al. Type I interferon sensing unlocks dormant adipocyte inflammatory potential. Nat Commun. 11 (1), 2745(2020).
- Miyake, H., et al. Human breast milk exosomes attenuate intestinal damage. Pediatr Surg Int. 36 (2), 155-163 (2020).
- Gao, J., et al. Recent developments in isolating methods for exosomes. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1100892(2022).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Sci Rep. 9 (1), 5335(2019).
- Gandhi, J., Naik, M. N., Mishra, D. K., Joseph, J. Proteomic profiling of Aspergillus flavus endophthalmitis-derived extracellular vesicles in an in vivo murine model. Med Mycol. 60 (9), myac064(2022).
- Palinski, W., et al. Lysosome purinergic receptor p2x4 regulates neoangiogenesis induced by microvesicles from sarcoma patients. Cell Death Dis. 12 (9), 797(2021).
- Tantengco, O. aG., Radnaa, E., Shahin, H., Kechichian, T., Menon, R. Cross talk: Trafficking and functional impact of maternal exosomes at the feto-maternal interface under normal and pathologic statesdagger. Biol Reprod. 105 (6), 15621576(2021).
- Caruso Bavisotto, C., et al. Exosomal hsp60: A potentially useful biomarker for diagnosis, assessing prognosis, and monitoring response to treatment. Expert Rev Mol Diagn. 17 (9), 815-822 (2017).
- Feng, X., et al. Latest trend of milk-derived exosomes: Cargos, functions, and applications. Front Nutr. 8, 747294(2021).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
Herprints en machtigingen
