Een gestroomlijnde, labelvrije realtime 50% weefselcultuur infectieuze dosis (TCID50) assay met impedantie voor geautomatiseerde kwantificatie van virale titers

Samenvatting

De hier gerapporteerde TCID50-assay maakt gebruik van labelvrije realtime impedantiemetingen en de Virologiemodule van het systeem om objectief virus-geïnduceerde cytopathische effecten (CPE) in realtime te monitoren. Deze gestroomlijnde assay vermindert de hands-on tijd aanzienlijk, ondersteunt hoog-doorvoer, kwantitatieve kinetische CPE-metingen en maakt geautomatiseerde, realtime TCID50-berekeningen mogelijk.

Samenvatting

Het meten van de virale titer, de concentratie van een virus in een monster, is een fundamentele procedure in virologisch onderzoek. Hoewel essentiële methoden, zoals de plaque-assay en TCID50-assay, kunnen ze tijdrovend zijn, vereisen ze kleuring of labeling van reagentia, en vereisen ze vaak subjectieve interpretatie, vooral wanneer cytopathische effecten (CPE) subtiel of moeilijk te kwantificeren zijn via beeldvorming. TCID50-assays kunnen bijvoorbeeld levensvatbaarheidskleurstoffen zoals MTT of MTS gebruiken, terwijl plaque-assays vertrouwen op beeldvorming en kleuring om virale plaques te visualiseren, die beide variabiliteit kunnen introduceren. Bovendien bieden deze traditionele methoden slechts een statische momentopname van virale infectie, waardoor het vermogen om de dynamische interacties tussen virussen en permissieve cellen vast te leggen wordt beperkt. Om de huidige beperkingen in het meten van virustiter te overwinnen, is een gestroomlijnde TCID50-assay ontwikkeld met impedantie-gebaseerde technologie om CPE objectief, niet-invasief en in realtime te meten, waardoor labels niet nodig zijn. In deze studie werden twee viruspermissieve celmodellen gebruikt om de impedantie-TCID50-test te valideren: het GFP-gelabelde adenovirus (Adv-GFP) in HEK293A cellen en influenza A-virus (IAV) in MDCK-cellen. De workflow is eenvoudig en omvat celzaaien, virusinenting, realtime monitoring en automatische analyse van TCID50 door de software. Tijdens de infectie werden TCID50-waarden automatisch berekend door de software van het systeem met behulp van de Reed-Muench-formule op alle geregistreerde tijdstippen. TCID50-waarden van IAV, verkregen via impedantiemetingen, waren vergelijkbaar met die van de conventionele kristalvioletkleuringsgebaseerde TCID50-assay. Deze resultaten tonen aan dat viruskwantificatie nauwkeurig en efficiënt kan worden bereikt met impedantiemeting in combinatie met de Virologiemodule van de software van het systeem. De nieuwe assay stroomlijnt traditionele methoden en biedt verbeterde inzichten in virale dynamiek, waardoor geavanceerd virologisch onderzoek wordt ondersteund en de potentiële klinische toepassingen worden uitgebreid.

Inleiding

Naarmate virologisch onderzoek zich snel ontwikkelt, blijft nauwkeurige kwantificatie van virale infectie cruciaal voor het begrijpen van virale mechanismen, het ontwikkelen van antivirale therapieën en het beoordelen van de effectiviteit van vaccins. Een van de belangrijkste procedures is het meten van virale titer, de concentratie van virale deeltjes in een monster. De TCID50-assay, die het aantal infectieuze virusdeeltjes kwantificeert dat nodig is om CPE te produceren in 50% van de geïnënofiseerde cellen, is een van de meest gebruikte methoden om functionele virale titer te bepalen. Deze veelgebruikte eindtoets is vooral waardevol voor virussen die geen plaques vormen en kan dienen als alternatief voor de plaque-assay¹.

Over het algemeen duurt de TCID50-test 2-14 dagen, afhankelijk van het virus en de permissieve cellen. CPE, inclusief veranderingen in celproliferatie, morfologie en levensvatbaarheid, wordt beoordeeld door ofwel (1) colorimetrische metingen na toevoeging van reagentia, zoals MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide) assay en MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfofhenyl)-2H-tetrazolium) assay, met behulp van een plaatlezer², of (2) visuele evaluatie van morfologische of cultuurgerelateerde veranderingen met behulp van optische beeldvormingsplatforms – bijvoorbeeld het beoordelen van CPE door het meten van procentuele confluentie³, of (3) visuele detectie van CPE door kristalviolette kleuring na fixatie van virusbehandelde putten met formaline of paraformaldehyde (PFA). De positieve mate van virale infectie die is afgeleid van het aantal CPE-positieve replicaten bij elke virale verdunning, vormt de basis voor de TCID50-berekening. De verdunning waarbij 50% van de culturen CPE vertoont, wordt statistisch berekend met behulp van gevestigde formules⁴, zoals Reed-Muench, Spearman-Karber en Improved-Karber, en het resultaat wordt gerapporteerd als TCID50 per milliliter (TCID50/mL).

Traditionele TCID50- en plaque-assays worden algemeen erkend als de gouden standaard voor functionele virale kwantificatie en kunnen onschatbare inzichten bieden. Deze assays zijn echter vaak tijdrovend en vereisen handmatige kleuring om CPE te visualiseren, wat resulteert in een lage doorvoersnelheid, verhoogde risico's op menselijke fouten en subjectiviteit. Voor zeer besmettelijke of dodelijke virussen zijn het minimaliseren van de blootstellingstijd aan virussen en het verminderen van afval dat virussen bevat door extra stappen, zoals kleuring, belangrijke overwegingen om de bioveiligheid te verbeteren. Behalve de labelvrije, beeldvormingsgebaseerde TCID50-assay zijn de meeste TCID50- en plaque-assays ook eindpunt-assays, wat kan resulteren in suboptimale timing voor titerbeoordeling en het vermogen om dynamische interacties tussen virussen en gastheercellen te observeren kan beperken. Om deze beperkingen te overwinnen, werd een gestroomlijnde, labelvrije en realtime TCID50-assay ontwikkeld en opgezet. Hoewel conceptueel vergelijkbaar met de conventionele TCID50-assay, maakt de nieuwe methode gebruik van cellulaire impedantie-uitlezingen, vastgelegd en geanalyseerd door het RTCA MP-systeem, om infecties objectief en continu over tijd te monitoren.

Het is aangetoond en bevestigd dat impedantie-gebaseerde biosensing een kwalitatieve en kwantitatieve samengestelde uitlezing van celaantal, morfologie en hechtingssterkte van cel-substraat levert op een labelvrije, niet-invasieve manier ^5,6. Eerdere studies hebben aangetoond dat virus-geïnduceerde CPE nauwkeurig in realtime gekwantificeerd kan worden met RTCA-impedantiemetingen ^7,8,9. In plaats van ruwe impedantiewaarden te rapporteren, gebruiken de systemen een eenheidsloze parameter genaamd Cell Index (CI) om veranderingen in impedantie als gevolg van cellulaire gebeurtenissen weer te geven. Bijvoorbeeld, terwijl cellen zich hechten aan, zich verspreiden en groeien op de bodem van de put, neemt het CI toe. Omgekeerd, wanneer cellen sterven, krimpen of loslaten, zoals tijdens een virale infectie, daalt het CI.

Gezien de veelbelovende rapporten waarin impedantie wordt gebruikt om CPE te meten, was deze studie bedoeld om aan te tonen dat de impedantie-gebaseerde TCID50-assay een betrouwbaar en nauwkeurig alternatief is voor conventionele virale kwantificatie. De Virologiemodule van de software van het systeem maakt geautomatiseerde TCID50-berekening mogelijk gedurende de gehele realtime CPE-meting, waardoor het assayproces wordt gestroomlijnd en verkort en waardevolle inzichten wordt gegeven in de kinetiek van virusreplicatie en hun interactie met permissieve cellen.

Protocol

De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Impedantie-gebaseerde TCID50-assay

OPMERKING: Zoals Figuur 1 illustreert, bestaat een impedantie-gebaseerde TCID50-assay uit vier stappen, waaronder permissieve celzaaiing op een biosensorplaat, virusverdunningsvoorbereiding en inoculatie, CPE-meting op het systeem, en tenslotte data-analyse en TCID50-berekening met behulp van de Virologiemodule van de software van het systeem.

1. Assay-voorbereiding: revivieve en subcultuur van permissieve cellen
   OPMERKING: Deze stap moet een week voor de test worden uitgevoerd. Om variatie tussen experimenten te minimaliseren, wordt sterk aanbevolen een celbank van permissieve cellen met hetzelfde passagenummer voor gebruik in de assay te bereiden. Gebruik geen cellen ouder dan 15 gangen na aankoop bij de mobiele provider.
   1. Ontdooien cryopreserveerde permissieve cellen
      1. Warm celgroeimedium in een 37 °C waterbad voor minstens 30 minuten. Zo werd Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), aangevuld met 10% foetaal runderenserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine, gebruikt voor HEK293A kweek.
      2. Ontdooi een flesje met cellen uit de celbank die voor TCID50-assays is geconserveerd door voorzichtig te draaien in een 37 °C waterbad gedurende 1-2 minuten totdat er enkele ijskristallen aanwezig zijn; Doe de dop niet onder. Veeg het flesje af met 70% ethanol en plaats het in een laminaire kap.
      3. Breng de cellen voorzichtig over in een nieuwe 50 ml kegelvormige buis en voeg 9 ml verwarmd groeimedium toe aan de cellen.
      4. Centrifugeer de celsuspensie op 300 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
      5. Verwijder het supernatant en suspendeer de cellen opnieuw in 15 mL verwarmd groeimedium. Zet ze over in een nieuwe T75-fles.
      6. Kweek cellen tot 80%-90% confluentie in een incubator van 37 °C met 5%_CO2.
   2. Subcultuur van permissieve cellen.
      1. Monitor cellen totdat ze 80%-90% confluentie bereiken.
      2. Verwijder het serumhoudende medium uit de kolf en spoel de celmonolaag voorzichtig één keer met Mg- en Ca-vrije Dulbecco's fosfaatgebakken zoutoplossing (DPBS).
      3. Trypsiniseer cellen door 2 mL 0,05% trypsine/EDTA-oplossing gelijkmatig te verdelen per T75-kolf en de fles 1-3 minuten in een 37 °C incubator te laten staan.
         OPMERKING: Trippsiniseer de cellen niet te veel, want dit kan schadelijk zijn voor de cellen.
      4. Stop trypsinisatie door 8 mL serumhoudend medium toe te voegen om het oorspronkelijke trypsinvolume minstens vijf keer te verdunnen. Breng 2,5 mL celsuspensie over naar een nieuwe T75-kolf en voeg vervolgens 8 mL kweekmedium toe.
         OPMERKING: Vermijd het gebruik van vers ontdooide permissieve cellen voor de TCID50-assay. Gebruik in plaats daarvan gekweekte cellen met 80%-90% confluentie. Om interexperimentele variabiliteit te verminderen, moeten de herleefde cellen maximaal twee weken na ontdooien worden behouden. Om een hoge cellevensvatbaarheid en proliferatie tijdens de twee weken durende kweek te waarborgen: (1) het groeimedium minstens twee keer per week te veranderen; (2) subcultuurcellen wanneer ze 80%-90% confluentie bereiken. Voor verlengd onderhoud na meer dan twee weken is validatie vereist.
2. Virale titer
   OPMERKING: Deze stap moet op dag 1 worden uitgevoerd.
   1. Meting van de achtergrond van de biosensorplaat
      1. Breng zorgvuldig 50 μL voorverwarmd medium over naar elke put met een multikanaals pipet, waarbij de omgekeerde pipettechniek wordt gebruikt om bubbelvorming te minimaliseren en een consistente volumeafgifte te garanderen.
      2. Plaats de plaat in het plaatstation; Open de software van het systeem en selecteer de Virologiemodule voordat je het experiment start. Voer relevante notities in op het tabblad Exp Notes en voer celinformatie in, inclusief celnaam en nummer, in het subtabblad Cel van het tabblad Layout nadat je de bijbehorende putten hebt geselecteerd. Als alternatief kan celinformatie worden ingevoerd na het zaaien.
         OPMERKING: Plaatachtergrondmeting moet worden uitgevoerd voordat cellen in de putjes van de plaat worden toegevoegd. Achtergrondwaarden voor alle putten zouden tussen -0,063 en 0,063 moeten liggen.
      3. Klik op het tabblad Planning op de knop Stap Toevoegen om Stap 1 toe te voegen, die is aangewezen voor de meting van de plaatachtergrond. Start vervolgens de opname door op de Startknop te klikken.
      4. Haal de plaat van het station en plaats hem terug in de kap voor celzaaien.
   2. Permissieve celzaaiing naar de 96-put biosensorplaat
      1. Trypsiniseer de permissieve cellen uit de T75-kolf.
      2. Tel de cellen en stel de celsuspensie aan op de gewenste concentratie. In deze studie was de concentratie van HEK293A 60.000 cellen/mL.
      3. Voeg 100 μL celsuspensatie toe aan elke put van de plaat.
         OPMERKING: De juiste celdichtheid is essentieel. Suboptimale zaaidichtheid kan resulteren in een experimenteel artefact. Daarom moet de zaaidichtheid worden geoptimaliseerd voordat een TCID50-assay wordt uitgevoerd.
      4. Laat de plaat 30 minuten na celtoevoeging op kamertemperatuur in de kap staan, zodat de cellen gelijkmatig op de bodem van de put kunnen verdelen.
         OPMERKING: Het niet uitvoeren van deze stap kan leiden tot grote variaties van put tot put.
      5. Plaats de plaat in het plaatstation in een 37 °C incubator met 5%_CO2.
      6. Ga naar het tabblad Schema van de software en voeg Stap 2 toe met de standaard opname-instellingen: 100 Sweeps en een interval van 15 minuten. Dit zal impedantie/CI-monitoring elke 15 minuten initiëren, waardoor realtime beoordeling van celhechting en proliferatie mogelijk is als een celkwaliteitscontrole (QC) stap voorafgaand aan de virusinenting.
         OPMERKING: Dag 2 - Om de reproduceerbaarheid en consistentie van de assay over experimenten te maximaliseren, is het cruciaal om de celprestaties op het systeem te beoordelen voordat je naar de volgende stap gaat. Omdat BI de celhechting en groei weerspiegelt, dienen BI-waarden tijdens de periode van 20-28 uur na het zaaien als een belangrijke kwaliteitscontroleparameter. Zowel de waarde als de kinetiek van CI zijn celspecifiek. In deze studie zou voor HEK293A cellen die met 6.000 cellen per put zijn gezaaid en 20-28 uur worden gekweekt, de CI meer dan 2 moeten bedragen. Als de CI 2 niet bereikt binnen 20-28 uur na het zaaien, wordt de HEK293A celkweek als niet goedgekeurd door de kwaliteitscontrole (QC) beschouwd en zal de daaropvolgende TCID50-test niet worden uitgevoerd. Dit criterium zorgt voor een hoge reproduceerbaarheid van experimentele uitkomsten.
   3. Voorbereiding van virusseriële verdunningen
      1. Bereken het totale volume van het medium (DMEM + 2% FBS + 1% penicilline/streptomycine) dat nodig is om de verdunningen te bereiden, en verwarm het in een waterbad van 37 °C gedurende 30 minuten. Het medium zal voor de rest van het experiment worden gebruikt.
      2. Ontdooi snel een flesje met gealiquoteerde virusvoorraad in een waterbad van 37 °C gedurende 1-2 minuten totdat alle ijskristallen zijn gesmolten.
      3. Bereid 10-voudig seriëel verdunde virussen voor door 20 μL van de virusvoorraad over te brengen naar een 1,5 mL microcentrifugebuis met 180 μL voorverwarmd medium bij elke stap. Pipetteer op en neer om een grondige menging van het medium en virus te garanderen.
         OPMERKING: Douw de pipettip niet te diep in de virale oplossing om te voorkomen dat overtollig viraal deeltjesresidu buiten de tip wordt meegenomen, wat kan leiden tot onnauwkeurige verdunningen.
      4. Om schommelingen in impedantiewaarden door toevoeging van verkoudheidsvirusmonsters te voorkomen, moet je de virusverdunning in balans brengen door ze 20 minuten vóór de inenografie in de broedmachine te incuberen bij 37 °C met 5%_CO2 .
   4. Voer virusbehandelingsinformatie in via het tabblad Layout
      1. Op het tabblad plaatlayout van de software; selecteer de putten voor de virale titerbehandeling; klik op het subtabblad Behandeling en voer initiële verdunning in, bijvoorbeeld 0,001 (^10-3) in dit experiment; voer 10 in als de "Verdunningsfactor"; selecteer de verdunningsrichting , in dit geval van links naar rechts. De virale verdunning wordt automatisch berekend op basis van de invoer van de plaatindeling en weergegeven in elke bijbehorende put.
      2. Voer vervolgens het virus Inoculation Volume in en klik op de knop Apply om alle behandelinformatie op te slaan. Deze stap is essentieel voor het nauwkeurig berekenen van TCID50/mL tijdens data-analyse.
      3. Wijs de putten die niet met virussen behandeld worden toe als negatieve controles door de juiste putten te selecteren en vervolgens Negatieve Ctrl aan te vinken onder Puttype in het tabblad Behandeling .
         OPMERKING: Negatieve controleputten moeten worden aangewezen en toegevoegd aan de Layout-pagina; weglating zal de TCID50-berekening verhinderen.
   5. Virusinoculatie
      1. Wanneer klaar, druk dan op de pauzeknop in de software om de gegevensverzameling te stoppen. Haal de plaat uit het station en plaats hem in de laminaire kap.
      2. Verwijder voorzichtig het kweekmedium uit de gaten van de plaat met een multikanaals pipet.
      3. Voeg voorzichtig 50 μL virale verdunning toe met een multikanaals pipet aan de bovenkant van de celmonolaag, zodat de celcultuur niet wordt verstoord.
      4. Plaats de plaat terug in het station en voeg stap 3 toe met de standaard opname-instellingen (100 sweeps en een interval van 15 minuten) op het tabblad Schema om elke 15 minuten de opnameimpedantie gedurende 2 uur te hervatten, zodat het virus zich aan de cellen kan binden.
      5. Na 2 uur virusinenting pauzeer je de opname en verwijder je de plaat van het station naar de laminaire kap.
      6. Voeg langzaam 150 μL voorverwarmd medium toe aan de putten met een multikanaals pipet, zodat de celmonolaag niet wordt verstoord; Breng de plaat terug naar het station.
      7. Hervat Stap 3 door op Start te klikken op het tabblad Schedule. De impedantiesignalen worden continu elke 15 minuten gemeten gedurende de inentingsperiode.
   6. De berekening van TCID50 is tijdens of na voltooiing van de TCID50-assay
      1. Selecteer en voeg op het tabblad Data Analysis alle putten die in de assay zijn gebruikt toe aan de plotgrafiek. De y-as van de grafiek wordt bepaald door de optie die is geselecteerd in het Y-as keuzemenu.
      2. Navigeer naar het Parameter-gedeelte . Selecteer TCID50 uit de Parameter-dropdownlijst om de TCID50-berekening te starten.
      3. Kies staafdiagram voor TCID50-berekening op een specifiek tijdstip of kies Tijdsafhankelijke TCID50 om het TCID50-tijdsverloop te genereren over een gewenste periode tijdens de inenting. De TCID50/mL wordt berekend en weergegeven na het klikken op de uitvoerknop.

2. Kristalviolet-TCID50 assay

1. Zaad permissieve cellen in een 96-well microplaat bij de optimale zaaidichtheid zoals beschreven in de impedantie-gebaseerde TCID50-assay (stappen 1-2).
2. Voer virusseriële verdunning en inoculatie uit zoals gespecificeerd in de impedantie-gebaseerde TCID50-assay.
3. Fixatie en kleuring
   1. Na voltooiing van de assay verwijder je voorzichtig het supernatant uit elke put en voeg je 100 μL 4% formaldehyde toe om cellen te fixeren.
   2. Incubeer 1 uur op 4 °C en verwijder daarna het fixatiemiddel.
   3. Kleur de vaste cellen met 0,5% kristalviolet bereid in PBS. Incubeer op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
   4. Was het bord met kraanwater totdat de achtergrond weg is. Laat het bord volledig aan de lucht drogen voordat je het inroostert.
      OPMERKING: Kristalviolet afval wordt als gevaarlijk beschouwd onder zowel RCRA als de California Code of Regulations (CCR 66261.24). Verzamel alle gebruikte kristalvioletoplossingen, besmette materialen (bijv. keukenpapier, handschoenen) en spoel afval af in een aangewezen container voor gevaarlijk afval. Voer het afval af via de Environmental Health & Safety (EH&S) of erkende aannemer voor de verwijdering van gevaarlijk afval van uw instelling.
4. Scoring en TCID50-berekening
   1. Inspecteer elke put visueel op CPE. Een positieve put toont gedeeltelijke of volledige monolaagvernietiging en lichtere kleuring. Een negatieve put behoudt een intacte monolaag met donkerpaarse kleuring.
   2. Tel het aantal positieve en negatieve putten voor elke verdunning.
   3. Bereken handmatig TCID50/mL met de Reed-Muench-methode, gebaseerd op een inoculatievolume van 150 μL.

Resultaten

Labelvrije, realtime, dynamische monitoring van virusgemedieerde CPE met impedantie
Om te bevestigen dat virus-geïnduceerde CPE betrouwbaar en kwantitatief kan worden gemeten door impedantie, registreerden we eerst cellulaire veranderingen in HEK293A cellen na Adv-GFP-infectie met behulp van een RTCA eSight-systeem dat tegelijkertijd impedantie meet en live-celbeelden van dezelfde celpopulatie vastlegt, wat inzichtelijke informatie over celgedrag levert. HEK293A cellen werden gezaaid op een biosensorplaat met 96 putjes bij een zaaidichtheid van 6.000 cellen per put gedurende 24 uur en vervolgens geïnfecteerd met Adv-GFP bij 10⁴ IFU/mL. Impedantie en live-cel beeldvorming werden geregistreerd voor 250 uur na de inoculatie (Figuur 2A). Om variabiliteit door verschillen in celzaaiing te minimaliseren en relatieve veranderingen na behandeling te tonen, werd de Normalized Cell Index (NCI) gebruikt om de collectieve veranderingen in celgroei, hechting en levensvatbaarheid in de loop van de tijd weer te geven. NCI wordt berekend door CI op een bepaald tijdstip te delen door de CI op het normalisatietijdpunt (de tijd vóór de inenting). De NCI-kinetische spoor van de niet-geïnfecteerde controle (Figuur 2A, zwarte spoor) toont een geleidelijke toename over de eerste 48 uur, wat wijst op continue celproliferatie. Aan het einde van de test volgt een plateau, wat aangeeft dat de cellen samenvloeien en het volledige oppervlak van de gouden biosensoren bedekten. Daarentegen daalde de kinetiek van NCI uit de virusgeïnfecteerde putten onder de controlegrens 50 uur na de inoculatie en daalde geleidelijk tot het nul bereikte bij 100 uur.

Live-celbeeldvorming verkregen van dezelfde celpopulatie bevestigde visueel dat het impedantiesignaal betrouwbaar de fysieke conditie van de permissieve cellen weerspiegelt terwijl ze door het gehele CPE-continuüm bewegen. Zoals weergegeven in Figuur 2A, is er een omgekeerde correlatie tussen de NCI en de expressie van virale GFP in geïnfecteerde HEK293A cellen die binnen de eerste 100 uur vóór de volledige lysatie van de permissieve cellen worden waargenomen. Daarnaast tonen de live-celbeelden (Figuur 2B) die op de opgegeven tijdstippen zijn opgenomen, verder een permissieve celstatus tijdens virale infectie aan. Celgroei bleef bestaan gedurende de eerste 48 uur na infectie, terwijl virusdeeltjes op lage niveaus binnen cellen bleven. Naarmate de virusreplicatie en infectie vorderden, begon echter celdood, wat bleek uit verminderde confluentie en een verhoogd GFP-signaal in de gastheercellen. Ongeveer 100 uur na de inoculatie begon de virale GFP-expressie af te nemen door het aanzienlijke verlies van levensvatbare permissieve cellen. Deze geïntegreerde aanpak versterkt de betrouwbaarheid van het detecteren van virus-geïnduceerde CPE door impedantie, waarmee een solide basis wordt gelegd voor de impedantie-gebaseerde TCID50-assay.

Geautomatiseerde berekening van TCID50 afgeleid van impedantie-uitlezing
Het nauwkeurig identificeren van de positieve CPE-putten is cruciaal voor een betrouwbare TCID50-berekening. Om te evalueren of de impedantie-gebaseerde TCID50-assay nauwkeurig en objectief kan onderscheiden tussen positieve en negatieve CPE met ondersteuning van de Virologiemodule van de systeemsoftware, werden de HEK293A cellen 24 uur voor inoculatie op 6.000 cellen/put geplant en behandeld met een reeks tienvoudige verdunningen van Adv-GFP, waarbij acht replicaten (putten) per verdunning werden gebruikt. De door Adverse geïnduceerde CPE werd in realtime geregistreerd op het RTCA-systeem. In Figuur 3A werden impedantiekinetische sporen, gepresenteerd als NCI, geregistreerd en automatisch uitgezet gedurende het hele experiment. De afname van de NCI na inoculatie toont een duidelijke dosisafhankelijke CPE, wat blijkt uit de sterke correlatie tussen de hoeveelheid toegevoegde virus en de snelheid waarmee het impedantiesignaal afneemt. De cellen die werden blootgesteld aan hoge virale ladingen, tussen ^10-3 en ^10-7 verdunning, vertoonden scherpe en consistente dalingen van NCI, wat een robuuste en uniforme CPE weerspiegelt over replicate putten. Daarentegen vertoonde bij een verdunning van het virus van ^10-8 de kinetische sporen vanaf het begin een grote variabiliteit, wat resulteerde in aanzienlijk grotere NCI-standaardafwijkingen, vooral na 100 uur na de inenting. Wanneer de virale lading verder werd verlaagd onder de drempel die nodig was om infectie te veroorzaken, in dit geval een verdunning van ^10-10 , werd de NCI niet meer te onderscheiden van de negatieve controles. Deze gegevens suggereren dat bij verdunning van ^10-8 het virus 1) niet CPE kon induceren in alle herhaalde putten met vergelijkbare kinetiek; 2) deze verdunning zou een scheidslijn zijn tussen concentraties die CPE veroorzaken in alle herhalingen en die die CPE alleen induceren in sommige of geen van de replicata; Deze binaire uitkomst, geïnfecteerd (aangegeven door CPE-geïnduceerde BI-veranderingen) of niet geïnfecteerd (geen CI-wijziging), vormt de basis voor het berekenen van TCID50 met statistische methoden in de systeemsoftware. Daarom is de diepgaande variatie in NCI die bij bepaalde virusconcentraties wordt waargenomen een cruciale indicator voor het optreden van gedeeltelijke infectie en kan cruciaal zijn voor de extrapolatie die nodig is om de TCID50 te berekenen.

Net als bij de klassieke TCID50-assay moet de drempel voor positieve CPE worden gedefinieerd voordat de ingebouwde software automatisch de CPE-positieve putten kan identificeren. Omdat verschillende virussen en permissieve celmodellen verschillende drempels kunnen vereisen, stelt de software gebruikers in staat deze criteria binnen de Virologiemodule te configureren en te verfijnen. Op basis van empirische gegevens werd de standaarddrempel van de software voor positieve CPE toegepast, gedefinieerd als de NCI-waarde van het met virus behandelde goed dat meer dan drie standaardafwijkingen lager lag dan het gemiddelde NCI van de negatieve (niet-geïnënteerde) controles, dat wil zeggen_{NCI-virusbehandelde} < (NCI-3 X SD) _{nege ctrl}. De individuele putten werden vervolgens beoordeeld als positief (+) of negatief (-) (Figuur 3B). In dit geval werd de TCID50/mL van Adv-GFP vervolgens berekend met behulp van de Reed-Muench-formule, een van de formules die in de software zijn opgenomen. Afgezien van het selecteren of definiëren van criteria voor positieve CPE, waren er geen handmatige handelingen nodig voor de TCID50-berekening, omdat de software het proces volledig heeft geautomatiseerd.

Dynamische tracking van TCID50 tijdens virusinfectie
Om de juiste duur van de TCID50-test te bepalen, werden de Adv-GFP TCID50-waarden geëxtraheerd op de gewenste tijdstippen na infectie, beginnend bij 30 uur en doorlopend in stappen van 30 uur tot 240 uur. Een toename van 30 uur werd bewust geselecteerd, aangezien adenovirusreplicatie ongeveer 30 uur^{en 10} uur duurt. De Adv-GFP TCID50-waarden werden uitgezet als functie van de tijd (Figuur 4). Een opmerkelijke observatie is de geleidelijke toename van TCID50-waarden, die aanhoudt tot ongeveer 150 uur na de inenting. Voorbij dit punt ontstaat een plateau, wat wijst op een evenwicht waar cytopathische effecten waarschijnlijk verzadigd zijn. De tijdsafhankelijke toename, gevolgd door stabilisatie, suggereert een typische virale replicatiecurve. De beginfase wordt gekenmerkt door actieve virale voortplanting, die culmineert in een piek die de maximale cytopathische impact onder de gegeven experimentele omstandigheden weerspiegelt. De plateaufase van de TCID50 kan een biologisch plafond weerspiegelen waarbij het virale infectieproces de meerderheid van de permissieve cellen heeft beïnvloed, wat leidt tot aanzienlijke celdood en het stoppen van verdere virusreplicatie. De kinetische tijdslijn van TCID50 suggereert dat de test zes tot zeven dagen na de inoculatie kan worden beëindigd voor het adenovirus-HEK293A model, aangezien een stabiele TCID50-waarde van 8,9 × 10⁹ TCID50/mL werd waargenomen al rond 150 uur.

Kwantificering van influenza A-virustiter met behulp van impedantie-gebaseerde TCID50-assay
Om te onderzoeken of de impedantie-gebaseerde TCID50-assay kan worden uitgebreid naar andere virus-hostmodellen, werd een TCID50-assay uitgevoerd in MDCK-cellen die geïnfecteerd zijn met IAV. Hoewel rekening werd gehouden met kleine variaties in het infectiemedium specifiek voor IAV, bleef de kernprocedure consistent met die voor adenovirus. Figuur 5A toont de NCI van MDCK-cellen over tijd na inoculatie met IAV-verdunningen variërend van 1 x ^10-2 tot 5 x ^10-9. Vergelijkbaar met de resultaten die werden waargenomen in de Adv-geïnfecteerde HEK293 A-cellen, vertoonden de niet-geïnfecteerde/negatieve controleputten een stabiele en consistente NCI over replicaten. De virusgeïnfecteerde putten toonden echter een dosisafhankelijke NCI-verandering. Bij de lage doseringen, 6,4 en 1,3 x ^10-7 verdunningen, werd een grote standaardafwijking waargenomen. Dit suggereert dat bij deze verdunningen de concentratie van het virus TCID50 naderde.

CPE-positieve putten werden geïdentificeerd met dezelfde criteria en drempel als in het Adv-HEK293A model, specifiek een drievoudige standaardafwijking onder het gemiddelde van de negatieve controleputten. De impedantie-gebaseerde TCID50-waarden voor IAV werden ook op verschillende tijdstippen na de inenting bepaald. Figuur 5B toont de gemiddelde TCID50-waarden van twee onafhankelijke experimenten. Behalve het vroege tijdstip van 60 uur toonden de TCID50-waarden van 90-150 uur na infectie goede stabiliteit en consistentie, wat aangeeft dat de impedantie-gebaseerde TCID50-test voor IAV betrouwbaar in vier dagen kan worden afgerond in plaats van vijf. Deze consistentie versterkt de robuustheid van de impedantie-gebaseerde methode en bevestigt de aanpasbaarheid en betrouwbaarheid ervan over verschillende virale pathogenen.

Validatie van impedantie-gebaseerde TCID50-assay met behulp van de conventionele TCID50-methode
Om de impedantie-afgeleide TCID50 te verifiëren voor IAV-concentratiemeting, werden TCID50-assays parallel uitgevoerd met twee alternatieve methoden: labelvrije beeldvorming en kristalvioletkleuring. Kort gezegd werden MDCK-cellen voorbereid en gezaaid in 96-put microtiterplaten. De volgende dag werden de cellen 5 dagen lang geïnëntificeerd met een reeks IAV-verdunningen. Voor de beeldvormingsgebaseerde TCID50-assay werd elke 4 uur de live-cel beeldvorming genomen. De concentraties van tien IAV-monsters werden beoordeeld in de validatiestudie. De celconfluentie van virusbehandelde putten werd vergeleken met die van de negatieve, niet-geïnfecteerde putten met behulp van de software van het systeem. De beeldvormingsanalyse voor MDCK-cellen was echter bijzonder uitdagend, zoals geïllustreerd in Figuur 6A. Nauwkeurige differentiatie tussen cellen en lege ruimtes was uitdagend vanwege de vlakke morfologie en slecht gedefinieerde randen van MDCK-cellen, waardoor de betrouwbare identificatie van CPE-positieve putten via beeldvormingsanalyse werd belemmerd. Het gebruik van geavanceerdere en geavanceerdere beeldvormingsanalysesoftware kan de nauwkeurigheid van TCID50-berekeningen in^{dergelijke gevallen verbeteren}. In dit geval was de labelvrije beeldvormingsbeoordeling op basis van TCID50 niet succesvol met de huidige systeemsoftware. Voor de kristalvioletkleuring-TCID50-test werden de cellen op dag 5 na de inoculatie gefixeerd en gekleurd, zoals beschreven in het protocolgedeelte. Figuur 6B toont een sterke lineaire correlatie tussen de impedantie-gebaseerde en kristalviolette kleuringswaarden TCID50, met een regressievergelijking van y = 0,9582x en een R² = 0,9979. Deze vergelijkende analyse benadrukt de betrouwbaarheid van de impedantiegebaseerde methode voor virale titermeting en de geschiktheid ervan voor TCID50-assays.

Figuur 1: Impedantie-gebaseerde TCID50 assay-workflow. Stap 1: Permissieve celzaaiing op de biosensorplaat. Zaai de toegestane cellen op een plaat met een optimale zaaidichtheid. De celgroei wordt vervolgens in het systeem gemonitord als onderdeel van de celkwaliteitscontrole (QC)-procedure. Stap 2: virusvoorbereiding en inoculatie. Bereid seriële verdunde virusvoorraden voor met behulp van een door de gebruiker gedefinieerde verdunningsfactor. Verwijder de plaat uit het systeem en voeg de virussen toe aan de putten van de plaat in een laminaire kap. Stap 3: CPE-meting en scoren van CPE-positieve putten met behulp van de Virologiemodule-software. Plaats de plaat terug in het systeem en hervat de realtime opname van virus-geïnduceerde CPE. De software identificeert automatisch CPE-positieve putten op basis van de door de gebruiker ingestelde drempel voor CPE-detectie. Stap 4: TCID50-berekening. Met de realtime scoring van CPE-positieve putten boven virusinenting kan de Virologiemodule-software TCID50-waarden op elk gegeven tijdstip gedurende de hele assay berekenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Adenovirus-geïnduceerde CPE werd beoordeeld met zowel impedantie- als beeldvormingsgebaseerde methoden (A) Dynamische profilering van impedantie (linker y-as) en groene fluorescentie (rechter y-as) in HEK293A cellen over tijd na infectie met Adv-GFP. De genormaliseerde celindex voor adenovirus-geïnfecteerde cellen (NCI Adv-geïnfecteerd, rode lijn), negatieve controlecellen (NCI NC, zwarte lijn) en GFP totale geïntegreerde intensiteit (GFP Adv-geïnfecteerd, groene lijn) worden als functie van de tijd uitgezet. De totale geïntegreerde GFP-intensiteit weerspiegelt GFP-expressie in permissieve cellen en dient als indicator van virale infectie. De getallen (1-6) langs de Normalized Cell Index komen overeen met specifieke tijdstippen tijdens het infectieproces. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (N = 8). (B) Sequentiële beelden van HEK293A cellen voor en na infectie met Adenovirus-GFP. (1) Het basisbeeld (0 uur) wordt gevolgd door snapshots op 48 uur (2), 72 uur (3), 96 uur (4), 120 uur (5) en 200 uur (6) na infectie, die de verandering in celgroei, levensvatbaarheid en adenovirus-GFP-fluorescentie in de loop van de tijd illustreren. Schaalbalken = 160 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Dosisafhankelijke CPE van adenovirus-GFP in HEK293A cellen, gemeten door impedantie. (A) HEK293A cellen werden gezaaid in een biosensorplaat met een dichtheid van 6.000 cellen per put, en 24 uur later werden ze geïnfecteerd met een reeks 10-voudig verdund adenovirus-GFP. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (N = 8). Inset: Genormaliseerde celindex van de putten die geïnfecteerd zijn met adenovirus-GFP bij verdunning van ^10-8 . De gegevens van verdunningen ^10-9, ^10-11 en ^10-12 zijn weggelaten voor de duidelijkheid. (B) De individuele putten/replicaten bij elke virusverdunning werden beoordeeld als CPE-positief (+) of CPE-negatief (-). Elke kolom van de plaat werd behandeld met een andere virusverdunning, waarbij de verdunningsgradiënt varieerde van het laagste in kolom 1 tot het hoogste in kolom 10. Kolommen 11 en 12 waren negatieve controleputten, zonder virusbehandeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: De tijdsloop van TCID50-waarden afgeleid uit impedantiemetingen van CPE in HEK293-cellen na infectie met adenovirus-GFP. TCID50/mL adenovirus-GFP werd berekend op specifieke tijdstippen met behulp van de Virologiemodule uit vijf experimenten. Hoewel de Virologiemodule drie TCID50-berekeningsformules biedt, werd de Reed-Muench-formule geselecteerd voor TCID50-berekening. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (N = 5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Influenza A-virustiterbeoordeling met behulp van de impedantie-gebaseerde TCID50-assay. (A) Dosisafhankelijke CPE van IAV in MDCK-cellen gemeten via impedantie. MDCK-cellen werden in een biosensorplaat geplant bij 8.000 cellen per put en 24 uur later geïnfecteerd met een vijfvoudige seriële verdunning van het influenzavirus. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD (N = 8). Gegevens uit de 2,6 × 10⁻⁸ verdunning zijn weggelaten voor de duidelijkheid. (B) Tijdsverloop van TCID50-waarden afgeleid uit impedantiemetingen in met IAV geïnfecteerde MDCK-cellen. De Reed-Muench-methode werd gebruikt voor TCID50-berekeningen. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (N = 2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Correlatie tussen impedantie-gebaseerde en kristalviolet-kleuringsgebaseerde TCID50-assays. (A) Afbeelding van MDCK-cellen geïnënënteerd met IAV. Schaalstaaf = 160 μm. (B) Een vergelijking van TCID50/mL-waarden verkregen met impedantie-gebaseerde en kristalviolet-kleuringsmethoden werd uitgevoerd met tien IAV-monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: De representatieve interfaces van de virologiemodulesoftware van het systeem. De software stroomlijnt het impedantie-gebaseerde TCID50-assayproces. (1) Plaatindeling voor het vastleggen van het experimentontwerp; (2) Celindex of genormaliseerde celindex werd automatisch uitgezet en weergegeven door de software tijdens de virusinenting; (3) de software biedt flexibiliteit bij het bepalen van positieve CPE-criteria en keuzes voor de TCID50-berekeningsformule; (4) TCID50/mL kan op elk gegeven moment tijdens de assay worden bepaald. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

In deze studie werd de toepasbaarheid van impedantie voor het bepalen van virale titer aangetoond met behulp van adenovirus-HEK293A en influenza A-virus-MDCK-modellen. Anderen hebben ook de robuuste en betrouwbare detectie van virus-geïnduceerde CPE gevalideerd met behulp van RTCA-systemen bij een breed scala aan virussen, waaronder orthopoxvirus¹², West Nile Virus (WNV) en St. Louis encephalitis virus (SLEV)¹³, chikungunyavirus¹⁴, infectieus bursal virus⁸, chimerische gele koorts dengue¹⁵, hepatitis A-virus¹⁶, SARS-CoV-2¹⁷ en het denguevirus⁹.

Realtime CPE-registratie via impedantie maakt het mogelijk om virusspecifieke tijdsafhankelijke dalingen in CI-waarde in bepaalde viruspermissieve celmodellen te ontdekken. Fang et al. toonden als eerste aan dat een kinetische parameter die flavivirus-geïnduceerde CPE karakteriseert, CIT50—gedefinieerd als de tijd tot een 50% afname van celimpedantie—omgekeerd evenredig is met de virale infectiedosis binnen een specifiek bereik. Ze toonden ook aan dat CIT50 evenredig is met het omgekeerde van de neutraliserende antistoftiter¹³. Sindsdien hebben Charretier et al. van Sanofi Pasteur deze impedantie-gebaseerde real-time celanalyse (RTCA) methode onderzocht voor het bepalen van virale infectieuze titers tijdens de ontwikkeling van het chimerische gele koorts (CYD) vaccinproduct en proces¹⁵. Charretier et ^al.15 valideerden deze impedantie-gebaseerde celcultuur infectieuze dosis 50% (CCID50) verder met een immunokleuringsgebaseerde CCID50-assay. Zij toonden aan dat de impedantie-gebaseerde RTCA-methode ongeveer vijf keer minder arbeidsintensief en 3,5 keer kostenefficiënter is dan de standaard CCID50-assay in een industriële omgeving. In onze studie werd de validatie van impedantie-gebaseerde TCID50 tegen de traditionele Crystal Violet TCID50-test aangetoond voor IAV-geïnduceerde CPE. Daarnaast werd de Virologie-softwaremodule in de RTCA-software gebruikt. De CPE-positieve putten werden automatisch geïdentificeerd op basis van door de gebruiker gedefinieerde criteria voor CPE-positieve putten in de software; in ons geval daalt de mate van CI vergeleken met de negatieve controles. De TCID50 werd vervolgens door de software berekend, waardoor nauwkeurige titerbepaling mogelijk werd zonder te vertrouwen op CIT50 of het risico te lopen dat het testmonster buiten het optimale bereik viel. Het instellen van een passende drempel voor CPE-positieve putten is cruciaal omdat dit direct invloed heeft op de gevoeligheid en specificiteit van de assay. Het wordt aanbevolen dat gebruikers virusspecifieke criteria bepalen door veranderingen in de celindex te vergelijken met resultaten van hun gevalideerde conventionele methode. Deze empirisch afgeleide drempels kunnen vervolgens worden geconfigureerd en verfijnd binnen de Virologiemodule van de software.

Net als bij andere celgebaseerde assays is de toestand van de permissieve cellen die worden gebruikt in impedantie-gebaseerde TCID50-assays cruciaal om het succes van de test en de kwaliteit van de resultaten te bepalen. Om een hoge celproliferatie en levensvatbaarheid te waarborgen, worden verse, laagdoorgangbare cellen aanbevolen. Daarnaast kan het maken van een celbank van permissieve cellen in hetzelfde passage de reproduceerbaarheid tussen experimenten verbeteren. Zoals aangegeven in Figuur 3A, genereerden de permissieve cellen tijdens optimale omstandigheden stabiele en consistente impedantiesignalen in de niet-geïnfecteerde controles gedurende de gehele test. Het bood een betrouwbare referentie om een drempel vast te stellen voor CPE-positieve putten, wat resulteerde in een precieze virale titerbepaling. Daarnaast is de impedantie-gebaseerde TCID50-test uniek in staat om kwaliteitscontrole uit te voeren op permissieve cellen vóór virale titerbeoordeling. Het karakteristieke kinetische CI-profiel van gezonde permissieve cellen dient als een betrouwbare kwaliteitscontrolemaatstaf, die ervoor zorgt dat alleen levensvatbare en consistente celpopulaties worden gebruikt voor virale kwantificering, waardoor de reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid van de assay worden verbeterd.

Voor elk nieuw virus moet ook impedantie-TCID50 assay-optimalisatie en validatie worden uitgevoerd vóór implementatie. Belangrijke factoren, zoals celkweekcondities, waaronder het basale medium en de concentratie van FBS, zijn cruciaal voor het verkrijgen van reproduceerbare cellulaire impedantiegegevens en het verhogen van de gevoeligheid van CPE-detectie, zoals benadrukt door eerdere studies ^6,16. In dit opzicht is labelvrije, realtime impedantie-gebaseerde technologie een eenvoudig, efficiënt en waardevol hulpmiddel gebleken om celkweekcondities tijdens assayontwikkeling^{te optimaliseren 16}.

Een beperking van de impedantie-TCID50-assay doet zich voor bij virussen die geen CPE veroorzaken, omdat de assay afhankelijk is van CPE om veranderingen in impedantie-uitlezingen te genereren, wat de basis vormt voor de TCID50-berekening. In dergelijke gevallen kan het nodig zijn een alternatief permissief celmodel te identificeren dat virus-geïnduceerde CPE kan vertonen, of een immunokleuringsmethode te hanteren, mits er een geschikt antilichaam tegen het specifieke virusantigeen beschikbaar is. Desalniettemin toonde deze studie het vermogen van het RTCA MP-systeem aan om dosisafhankelijke CPE vast te leggen en effectief onderscheid te maken tussen geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde celpopulaties via een objectieve en gevoelige impedantie-uitlezing.

De introductie van TCID50 tijdsafhankelijke analyse vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang ten opzichte van traditionele eindpuntmetingen. Het vereenvoudigt het TCID50-assayoptimalisatieproces, omdat het optimale tijdstip om virale titer te berekenen en te rapporteren eenvoudig kan worden verkregen met één realtime assay. Hoewel beeldvormingsgebaseerde labelvrije TCID50-assays ook tijdsgebonden TCID50-waarden kunnen leveren, is hun toepasbaarheid beperkt tot viruscelmodellen die CPE vertonen die herkenbaar is door de beeldvormingssoftware-algoritmen, zoals aangetoond in het IAV-MDCK-model (Figuur 6A). Bovendien elimineert het gebruik van labelvrije impedantie voor CPE-detectie de complicaties van het gebruik van verschillende reagentia en meerstapsworkflows, die mogelijk de risico's van menselijke fouten verhogen. Naast het vereenvoudigen van de workflow stroomlijnt de Virologiemodule van de software van het systeem ook de assay. Ten eerste begint het met een eenvoudige experimentschema-installatie voor automatische systeemgestuurde opname. Daarna volgt na elke meting een realtime, spontane CPE-positieve scoring en wordt afgesloten met een geautomatiseerde TCID50-berekening voor een eenvoudige kwantificering van infectieuze virusdeeltjes (Figuur 7). Deze automatisering vermindert de hands-on tijd aanzienlijk, een cruciale verbetering, vooral bij het omgaan met zeer besmettelijke virussen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.05% Trypsin 0.53 mM EDTA  (1x )	Corning	25-052-CI
12 Channel reagent reservoirs	VistaLab Technologies	3054-1011
Adenovirus-GFP	Vector Biolabs	1060
DMEM medium	ATCC	30-2002
E-Plate VIEW 96	Agilent	300601020
Fetal bovine serum	Avantor	97068-085
Hek293A cell	Thermo Fisher Scientific	R70507
Penicillin-Streptomycin solution	HyClone	SV30010
Phosphate buffer saline (1x)	HyClone	SH30256.01
Seaplaque agarose	Lonza	50101
xCELLigence RTCA eSight system	Agilent	S2833AA
xCELLigence RTCA MP system	Agilent	380601040