Methodenartikel

Gedragstesten voor optogenetische manipulatie van neurale circuits in Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/67964

⸱

7 februari 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Neuroscience, Virginia Tech, 2Academy of Integrated Science, Virginia Tech, 3Fairfax County Public Schools, Westfield High School

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel presenteert methoden voor optogenetische manipulatie in Drosophila melanogaster, waarbij CsChrimson en GtACR2 worden gebruikt om specifieke neuronen te activeren en tot zwijgen te brengen. Er worden vier experimenten beschreven om optogenetica te gebruiken om thermotactisch en smaakgedrag te onderzoeken, en inzicht te geven in de onderliggende neurale mechanismen die deze processen beheersen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetica is een fundamentele techniek geworden in de neurowetenschappen, die een nauwkeurige controle van de neuronale activiteit mogelijk maakt door middel van lichtstimulatie. Deze studie introduceert eenvoudig te implementeren opstellingen voor het toepassen van optogenetische methoden in Drosophila melanogaster. Twee optogenetische hulpmiddelen, CsChrimson, een door rood licht geactiveerd kationkanaal, en GtACR2, een door blauw licht geactiveerd anionkanaal, werden gebruikt in vier experimentele benaderingen. Drie van deze benaderingen omvatten experimenten met één vlieg: (1) een optogenetische thermotactische positievoorkeurstest met blauw licht gericht op temperatuurgevoelige verwarmingscellen, (2) een optogenetische positievoorkeurstest met rood licht die bitter voelende neuronen activeert, en (3) een proboscis-extensieresponstest die de zoetgevoelige neuronen activeert. De vierde benadering (4) is een vliegendoolhofopstelling om vermijdingsgedrag te beoordelen met behulp van meerdere vliegen. Het vermogen om neurale activiteit tijdelijk en ruimtelijk te manipuleren biedt krachtige inzichten in sensorische verwerking en besluitvorming, en onderstreept het potentieel van optogenetica om onze kennis van neurale functie te vergroten. Deze methoden bieden een toegankelijk en robuust kader voor toekomstig onderzoek in de neurowetenschappen om het begrip van specifieke neurale paden en hun gedragsresultaten te vergroten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetica is naar voren gekomen als een krachtige techniek die optica en genetica in de neurowetenschappen combineert en nauwkeurige, niet-invasieve controle biedt over neurale activiteit door middel van lichtstimulatie1. In Drosophila melanogaster, een veelgebruikt modelorganisme, maken optogenetische hulpmiddelen de activering en remming van specifieke neuronen mogelijk, waardoor onderzoekers neurale circuits kunnen moduleren. Onder de gebruikte tools bieden CsChrimson en GtACR (Guillardia theta anionkanaal rhodopsines) complementaire benaderingen voor neuronale targeting. CsChrimson-kanrodopsine, een roodlichtgevoelig kationkanaal van groene algen, vergemakkelijkt neuronale activering door depolarisatie bij blootstelling aan rood licht, met piekactivering bij ongeveer 590 nm2. CsChrimson biedt een betere weefselpenetratie dan eerdere channelrhodopsines en vermindert door licht geïnduceerde gedragsartefacten in Drosophila-studies 2. Daarentegen is GtACR, dat varianten zoals GtACR2 omvat, een licht-gated chloridekanaal dat neuronen tot zwijgen brengt door middel van hyperpolarisatie 3,4. GtACR2 geleidt anionen en wordt geactiveerd door blauw licht met een piekactivering rond 470 nm4. CsChrimson en GtACR2 worden geactiveerd door verschillende golflengten van licht, wat zorgt voor een nauwkeurige en onafhankelijke controle van neuronale activiteit zonder kruisactivering5.

Drosophila is een effectief model voor neurowetenschappelijk onderzoek vanwege de kosteneffectiviteit, het kweekgemak en de robuuste gedragsreacties op omgevingsstimuli, waaronder aantrekkelijk en vermijdend gedrag6. Het kleine formaat en de semi-transparante cuticula verbeteren de penetratie van licht, met name rood licht met een lange golflengte, waardoor efficiënte optogenetische manipulatie mogelijk is 7,8. Hoewel Drosophila-cellen niet voldoende retinaal kunnen produceren, een cruciale cofactor voor de functionaliteit van channelrhodopsines, compenseert het toevoegen van retinal aan hun dieet deze beperking en zorgt voor een effectieve activering van optogenetische hulpmiddelen9.

Om de effecten van optogenetische manipulatie in Drosophila te onderzoeken, beschrijven we vier experimenten gericht op verschillende neurale circuits en gedragingen, elk met behulp van verschillende modaliteiten om vermijding of aantrekkelijke reacties te beoordelen, variërend van single-fly-assays tot groepsgebaseerde evaluaties. Verwarmingscellen (HC) in Drosophila zijn thermosensorische neuronen die zich in de arista bevinden en reageren op temperatuurstijgingen10. Deze neuronen brengen warmtegevoelige ionenkanalen tot expressie die vermijdingsgedrag veroorzaken en vliegen wegleiden van warmtebronnen10,11. In benadering 1 gebruikten we een single-fly blauwlicht optogenetische thermotactische positionele voorkeurstest om HC-neuronen te manipuleren. Door GtACR2 in deze neuronen tot expressie te brengen, remden we hun activiteit bij blootstelling aan blauw licht. Vliegen werden blootgesteld aan twee temperatuuropties: 25 °C en 31 °C. Onder kamerlicht vermeden vliegen de 31 °C-kant, wat een typische thermotactische respons vertoonde. De activering van GtACR2 door blauw licht bracht de HC-neuronen echter tot zwijgen. Als gevolg hiervan vertoonden vliegen geen significante temperatuurvoorkeur, wat wijst op succesvolle optogenetische remming. Naast het beoordelen van de functie van sensorische neuronen, maakt de expressie van GtACR2 in stroomafwaartse sensorische neuronen vergelijkbare optogenetische manipulaties mogelijk om de neurale circuits te bestuderen die nodig zijn voor specifieke sensorische modaliteiten5.

De smaakreceptor GR66a in Drosophila komt tot expressie in de labiale palpen aan het distale uiteinde van de proboscis en in de benen, waardoor bittere smaak wordt gedetecteerd12,13. Deze neuronen veroorzaken vermijdingsgedrag als reactie op bitterstoffen. In benadering 2 gebruikten we een single-fly roodlicht optogenetische positionele voorkeurstest om neuronen die GR66a tot expressie brengen te manipuleren. Door CsChrimson in deze neuronen tot expressie te brengen, activeerden we ze bij blootstelling aan rood licht. Vliegen werden in een arena geplaatst waarbij de ene helft werd blootgesteld aan rood licht en de andere helft rood licht filterde. Bij afwezigheid van rood licht vertoonden vliegen geen voorkeur. De activering van CsChrimson door rood licht stimuleerde echter de bitter aanvoelende neuronen, wat resulteerde in een significante vermijding van het verlichte gebied, wat een succesvolle optogenetische activering van GR66a-neuronen bevestigt. Vergelijkbare benaderingen zijn gebruikt om de stroomafwaartse circuits van verwarmingscellen te identificeren die voldoende zijn voor het vermijdingsgedrag5.

We richtten ons op optogenetische activering van eetlust in benadering 3. Neuronen die GR5a tot expressie brengen, gelokaliseerd in de smaaksensilla op het labellum en de poten, detecteren suikers en sturen het voedingsgedrag. Activering van deze neuronen triggert de proboscis extension response (PER)14. We gebruikten een optogenetische proboscis extension response assay met rood licht om GR5a-neuronen te activeren. Door CsChrimson in deze neuronen tot expressie te brengen, stimuleerden we ze met rood licht. Vliegen strekten hun slurf niet uit onder kamerlichtomstandigheden. Activering van CsChrimson door rood licht leidde echter tot uitbreiding van de slurf zonder een zoete stimulus, wat een succesvolle optogenetische activering van GR5a-neuronen aantoont. Deze benadering is gebruikt om het neurale circuit te onderzoeken, inclusief sensorische smaakneuronen, smaakprojectieneuronen en proboscis-motorneuronen 15,16.

In benadering 4 onderzochten we optogenetische activering van vermijdingsgedrag in groepen vliegen, met behulp van een optogenetische vliegendoolhoftest met rood licht gericht op GR66a-neuronen. Vliegen werden geplaatst op de kruising van twee buizen: de ene verlicht met rood licht en de andere in de schaduw. CsChrimson-expressie in GR66a-neuronen veroorzaakte vermijding. Bij afwezigheid van rood licht vertoonden vliegen geen voorkeur, maar activering door rood licht leidde ertoe dat GR66a-uitdrukkende vliegen rood licht vermeden, wat wijst op de succesvolle activering van de route. Vliegendoolhoftesten zijn op grote schaal gebruikt om verschillende sensorische modaliteiten te bestuderen, waaronder temperatuur, vochtigheid en reukzin. In combinatie met optogenetica is deze benadering krachtig voor het onderzoeken van zowel aantrekkelijk als vermijdend gedrag 17,18,19.

Deze methoden bieden een reproduceerbaar kader voor het bestuderen van optogenetische activering en remming van neurale circuits van Drosophila . Door gebruik te maken van een combinatie van verschillende kanalrhodopsines en toegankelijke gedragstests, toont deze proof-of-concept-studie de effectiviteit van optogenetische manipulatie aan, en biedt het eenvoudige methoden om neurale circuitfuncties te manipuleren met mogelijke bredere toepassingen in neurowetenschappelijk onderzoek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Belastingen, vliegenopfok en vliegenzuiger

  1. Spanningen en onderhoud
    1. De stammen die in de experimenten worden gebruikt, zijn onder meer HC-Gal410, Gr5a-Gal420 (Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC): 57592), Gr66a-Gal421 (BDSC: 57670), UAS-GtACR23, UAS-CsChrimson2 (BDSC: 55136). Achtervliegt bij 25 °C op een standaard maïsmeelmedium onder een 12-uur licht:12-uur donkercyclus.
      OPMERKING: 1 L maïsmeelmedium bevat 1 L dH2O, 79 g dextrose, 7,5 g agar, 24 g vlokkengist, 57 g maïsmeel, 2,1 g methyl-4-hydroxybenzoaat (opgelost in 11,1 ml ethanol), 6 g natriumkaliumtartraattetrahydraat en 0,9 g calciumchloride.
  2. Vliegenfokkerij en experimentele voorbereiding
    1. Sorteer vliegen van 0 tot 3 dagen oud. Tegen de tijd dat er wordt geëxperimenteerd, zijn de vliegen 3 tot 6 dagen oud, wat zorgt voor leeftijdsgebonden consistentie (Figuur 1A).
    2. Verdeel elk genotype 3 dagen voor het uitvoeren van experimenten in vier groepen: kamerlicht ATR -, kamerlicht ATR +, rood of blauw licht ATR - en rood of blauw licht ATR +.
    3. Bereid 80 mM ATR-voorraadoplossing door ATR op te lossen in 100% ethanol. Vul het voer aan met 400 μM ATR naar de ATR+ groepen.
    4. Vul het voer aan met dezelfde concentratie ethanol maar zonder ATR aan de ATR-groepen.
    5. Achterhoede alle groepen in het donker22.
    6. Starve Gr5a>CsChrimson vliegt 16-24 uur in injectieflacons die alleen vochtig weefsel bevatten. De ATR + flacons bevatten 400 μM ATR gemengd met water, terwijl de ATR-flacons dH2O bevatten gemengd met dezelfde concentratie ethanol.
  3. Vlieg aspirator
    1. Monteer de vliegenzuiger (Figuur 1B) met behulp van plastic slangen, insectengaas en twee transferpipetten van 3 ml.
    2. Knip de punten en bollen van de transferpipetten af en zorg ervoor dat de vliegenzuigpunt een comfortabele doorgang van een vlieg mogelijk maakt. Dit ontwerp maakt een zachte aspiratie van vliegen mogelijk door inademing, waardoor schade tot een minimum wordt beperkt en het efficiënt verzamelen en overbrengen van individuele vliegen wordt vergemakkelijkt.
    3. Drapeer insectengaas over de plastic slang en bevestig de boluiteinden van de pipet aan de slang met behulp van Parafilm.

2. Optogenetische thermotactische positievoorkeurstest met één vlieg in blauw licht

  1. Drosophila-stammen en het kweken van vliegen
    1. Kruis de HC-Gal410 driverlijn naar UAS-GtACR23, wat resulteert in het experimentele genotype HC>GtACR2. HC>GtACR2-vliegen brengen GtACR2 tot expressie in verwarmingscellen.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat voor elke aandoening een gelijk aantal mannelijke en vrouwelijke vliegen wordt gebruikt.
  2. Experimentele assay-opstelling en -uitvoering
    1. Lijn twee stalen platen uit op afzonderlijke kookplaten zodat hun randen samenkomen. Plaats er een plastic bladbeschermer op en zet deze vast met tape om beweging te minimaliseren. Plaats een stuk wit papier op de vellenbeschermer om achtergrondgeluidssignalen te verminderen (Afbeelding 1C).
      OPMERKING: Vervang het witte papier aan het begin van elk experiment of als het vuil is.
    2. Plaats een doorzichtige plastic hoes (2 mm hoogte × 58 mm breedte × 83 mm lengte) op het witte papier. Deze hoes zorgt ervoor dat de vlieg vrij kan lopen en voorkomt dat hij vliegt.
    3. Snijd een gat in de bodem van een doos van polystyreenschuim (27 cm hoogte × 22 cm breedte × 16 cm lengte) om ongeveer 12 cm boven het experimentele oppervlak aan de camera en het blauwe licht (1.000 mA) te hechten.
    4. Plaats de camera en het blauwe licht om schittering te minimaliseren terwijl activering wordt ingeschakeld.
      NOTITIE: Een pretest kan nodig zijn om het activeringsbereik van het blauwe licht te bepalen.
    5. Stel de camera in om op te nemen met de volgende instellingen: timelapse van 1 s, smal veld, 4000 × 3000 pixels.
    6. Pas de instellingen van de kookplaat aan om een oppervlaktetemperatuur van 25 ± 1 °C en 31 ± 1 °C op de respectievelijke stalen platen te behouden.
      OPMERKING: Voor omstandigheden die temperaturen onder de 25 °C vereisen, zijn alternatieve koelmethoden, zoals Peltier-apparaten of ijs, noodzakelijk. Als de temperaturen van de stalen platen de gewenste niveaus overschrijden, spuit het oppervlak dan met gedestilleerd water om de vereiste omstandigheden te bereiken en te behouden. Gebruik vervolgens een servet om overtollig vocht van de plastic bladbeschermer te absorberen.
    7. Bewaak voor en na elke proef de temperaturen met behulp van een oppervlaktetemperatuursonde.
      OPMERKING: Nauwkeurige temperatuurregeling is cruciaal, omdat fluctuaties de resultaten kunnen beïnvloeden.
    8. Plaats de plastic afdekking aan de 25 °C-kant. Gebruik een vliegenzuiger om voorzichtig een enkele vlieg onder het deksel los te laten. Plaats de doos boven het experimentele gebied om zwak licht te creëren (<10 lux) en laat de vlieg 1 minuut acclimatiseren.
    9. Na de acclimatiseringsperiode tilt u de doos op en past u snel de plastic afdekking aan, waarbij u deze plaatst met het midden van de afdekking uitgelijnd met de grens van de staalplaat om een gelijkmatige dekking van de zijden van 25 °C en 31 °C te garanderen.
      OPMERKING: Tijdens dit proces stijgen de luchttemperatuur en de temperatuur in het deksel aan de kant van 31 °C binnen 27 s tot ongeveer 5 °C (aanvullende afbeelding 1), voldoende om verwarmingscellen11 te activeren.
    10. Start de proef door de camera en blauw licht (20 kLux) in te schakelen.
      OPMERKING: Schakel het blauwe licht niet in bij kamerlicht. Zet de camera aan en neem een paar frames op voordat je het blauwe licht inschakelt in geval van beweging.
    11. Beëindig de proefperiode na meer dan 2 minuten door de camera en het licht uit te schakelen. Gooi de vliegen weg met behulp van de aspirator.
      OPMERKING: Neem een paar extra frames op in geval van beweging wanneer u de camera uitschakelt.
  3. Gedrags- en statistische analyse
    1. Analyseer alleen gegevens van vliegen die aan het begin van de proef aan de 25 °C-kant blijven.
      OPMERKING: Gooi gegevens weg van vliegen die beginnen met proeven aan de 31 °C-kant, die vaak gewijzigde voorkeuren vertonen23. Gooi proeven met vliegen die de rand van de 31 °C-kant niet naderen weg en zorg ervoor dat ze een keuze hebben gemaakt tussen temperaturen. Gooi gegevens weg van vliegen die langer dan 30 seconden stil blijven staan.
    2. Analyseer de resultaten met behulp van de eerder beschreven procedures23. Bereken de voorkeursindex (PI) als de verhouding tussen het verschil in tijd dat de vlieg in elke temperatuurzone heeft doorgebracht en de totale tijd, zoals weergegeven in de volgende formule:
      figure-protocol-1
      OPMERKING: Statistische details voor de experimenten worden verstrekt in de legenda's van de figuren. Gegevensanalyse wordt uitgevoerd met behulp van geschikte software voor gegevensanalyse.

3. Optogenetische positievoorkeurstest met één vlieg rood licht

  1. Drosophila-stammen en het kweken van vliegen
    1. Steek de Gr66a-Gal421 driverlijn over naar UAS-CsChrimson2, wat resulteert in het experimentele genotype Gr66a>CsChrimson. Gr66a>CsChrimsonvliegen drukken CsChrimson uit in neuronen met een bittere smaak.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat voor elke aandoening een gelijk aantal mannelijke en vrouwelijke vliegen wordt gebruikt.
  2. Experimentele assay-opstelling en -uitvoering
    1. Voer de test uit in een donkere kamer of een verduisterde omgeving om een gecontroleerde activering van CsChrimson te garanderen (Figuur 1D).
    2. Plaats een camcorder ongeveer 45 cm boven het experimentele oppervlak.
      1. Gebruik een camcorder zonder infraroodfilter. Als een camcorder een intern kortdoorlaat-infraroodfilter heeft dat golflengten langer dan 700 nm blokkeert, verwijdert u dit.
      2. Plak een long-pass filter van 830 nm over de lens met behulp van superlijm om de infrarode golflengten vast te leggen. Deze aanpassing is essentieel voor het registreren van vliegbewegingen onder infrarood licht.
    3. Plaats een roodlichtbron24 ongeveer 45 cm boven het experimentele oppervlak en zorg voor een lichtintensiteit van ongeveer 2,5 kLux (1.000 mA).
      OPMERKING: Geschikte oogbescherming die rode laser/licht kan filteren, wordt aanbevolen. Laserveiligheidsbrillen helpen mogelijk oogletsel door directe blootstelling aan intens rood licht te voorkomen.
    4. Gebruik een infrarood licht om de vliegen in de opstelling te visualiseren. Houd het tijdens het experiment aan.
      OPMERKING: Vermijd verblinding in het experimentele gebied veroorzaakt door infrarood licht; Verblinding kan de gegevensanalyse bemoeilijken.
    5. Gebruik lijm om een 780 nm infrarood long-pass filter op de helft van de plastic hoes te bevestigen.
      OPMERKING: Gebruik een long-pass filter dat golflengten onder 780 nm blokkeert. De ongefilterde kant laat rood licht en infrarood door, terwijl de gefilterde kant alleen infrarood licht doorlaat.
    6. Plaats een zwart mat materiaal onder het experimentele gebied om achtergrondgeluid te minimaliseren.
    7. Plaats een enkele vlieg onder een doorzichtige plastic hoes (2 mm hoogte × 58 mm breedte × 83 mm lengte) met behulp van een vliegenzuiger en laat deze 1 minuut acclimatiseren.
    8. Wacht tot de vlieg zichtbaar is aan de ongefilterde kant. Start de proefperiode door de camcorder en het rode licht in te schakelen.
      OPMERKING: De camcorder is direct na het starten gevoelig voor beweging. Zet de camera goed vast tijdens het opnemen en zet de camera enkele seconden voor het opnemen aan om afwijkende bewegingen te voorkomen die de analyse kunnen bemoeilijken. Doe het rode lampje pas aan bij het begin van de proefperiode.
    9. Registreer de beweging van de vlieg gedurende 1 minuut.
      OPMERKING: Gooi proeven weg waarbij de vlieg de middellijn niet nadert of niet langer dan 15 s beweegt.
    10. Beëindig na 1 minuut de proefperiode door de camcorder en het licht uit te schakelen. Gooi de vliegen weg met behulp van de aspirator.
      OPMERKING: Neem een paar extra frames op om de effecten van beweging te voorkomen wanneer u de camera uitschakelt.
  3. Gedrags- en statistische analyse
    1. Analyseer de resultaten met behulp van de eerder beschreven procedures23. Bereken de voorkeursindex (PI) als de verhouding tussen de tijd die de vlieg in het gebied zonder filter en het gebied met het filter heeft doorgebracht tot de totale tijd, zoals weergegeven in de volgende formule:
      figure-protocol-2
      OPMERKING: Statistische details voor de experimenten worden verstrekt in de legenda's van de figuren. Gegevensanalyse wordt uitgevoerd met behulp van geschikte software voor gegevensanalyse.

4. Optogenetische proboscis-extensiereactie met rood licht

  1. Drosophila-stammen en het kweken van vliegen
    1. Steek de Gr5a-Gal420 driverlijn over naar UAS-CsChrimson2, wat resulteert in het experimentele genotype dat wordt aangeduid als Gr5a>CsChrimson. Gr5a>CsChrimson-vliegen brengen CsChrimson tot expressie in zoete smaakreceptorneuronen.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat voor elke aandoening een gelijk aantal mannelijke en vrouwelijke vliegen wordt gebruikt.
    2. Starve vliegt 16-24 uur met ATR (ATR +) of zonder (ATR -) voordat ze worden getest.
      OPMERKING: Langere hongerperioden kunnen nodig zijn om een sterke reactie uit te lokken.
  2. Experimentele assay-opstelling en -uitvoering
    1. Verdoving vliegen door af te koelen op ijs (Figuur 1E).
      OPMERKING: Vermijd het directe contact tussen vliegen en ijs. Beperk de afkoeltijd tot ongeveer 1 minuut; Langdurige afkoeling kan leiden tot herstelproblemen en sterfte.
    2. Gebruik de punt van een pipetpunt van 1000 μL om 7-10 kleine puntjes lijm op de glaasjes aan te brengen.
      OPMERKING: Kleine druppels lijm op de dia zorgen ervoor dat de vlieg niet onder water komt te staan en helpen voorkomen dat de lijm aan zijn slurf of poten blijft plakken.
    3. Plaats één gulp, ventrale kant naar boven, op elke lijmpunt. Zorg ervoor dat de thorax en vleugels in contact komen met de lijm om beweging te minimaliseren. Waaier de vleugels naar elke kant uit om het kleefoppervlak te vergroten.
      NOTITIE: Plaats vliegen niet te dicht bij elkaar, omdat dit onbedoeld meerdere vliegen kan activeren tijdens blootstelling aan licht.
    4. Laat de lijm ongeveer 10 minuten drogen.
    5. Breng de dia's over naar een vochtigheidsdoos (een plastic doos met natte papieren handdoeken) en laat de vliegen 2 uur herstellen.
    6. Plaats het glaasje onder de microscoop. Gebruik een spuit om een druppel water af te geven om de vliegen te verzadigen, waardoor door dorst veroorzaakte proboscis-extensies worden voorkomen.
    7. Houd handmatig een rode laserpointer vast om rood licht te laten schijnen op de slurf/kop van een enkele vlieg (700 lux) terwijl u de PER-respons door de microscoop observeert.
      OPMERKING: Oogbescherming die rode laser/licht kan filteren, is essentieel bij het waarnemen van het rode licht door de microscoop.
    8. Observeer en registreer de uitbreiding van de slurf binnen een venster van 30 seconden. Scoor elke vlieg met behulp van het volgende registratiesysteem: 0 geeft geen verlenging aan, 0,5 geeft 1-2 s verlenging aan, 1 geeft aan dat verlenging langer dan 3 s duurt.
    9. Na het testen van door licht geïnduceerde proboscis-extensie, onderzoekt u de respons op 4% sucrose met behulp van een spuit. Verdrijf een druppel sucrose aan het uiteinde van de naald en breng deze dicht bij de slurf.
      OPMERKING: Gooi de gegevens weg van vliegen die niet reageren op de sucrosedruppel.
  3. Gedrags- en statistische analyse
    1. Voer statistische analyses uit met behulp van de juiste software voor gegevensanalyse.
      OPMERKING: Statistische details voor de experimenten worden verstrekt in de legenda's van de figuren.

5. Optogenetische vliegendoolhoftest met rood licht

  1. Drosophila-stammen en het kweken van vliegen
    1. Steek de Gr66a-Gal421 driverlijn over naar UAS-CsChrimson2, wat resulteert in het experimentele genotype Gr66a>CsChrimson. Gr66a>CsChrimsonvliegen drukken CsChrimson uit in neuronen met een bittere smaak.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat elke groep een gelijk aantal mannelijke en vrouwelijke vliegen bevat.
  2. Fly-doolhof assemblage
    1. Maak het vliegendoolhof zoals weergegeven in figuur 1F.
      OPMERKING: U kunt ook de componenten van het vliegendoolhof 3D-printen en samenstellen zoals eerder beschreven25.
    2. Snijd drie plastic kweekbuizen van 5 ml op de juiste lengte om een laadbuis, een onbedekte doorzichtige testbuis en een met folie bedekte testbuis te maken. Bevestig buizen aan het vliegendoolhof zoals weergegeven in Figuur 1F.
      1. Snijd, afhankelijk van het doolhofmateriaal, de reageerbuizen om een gelijke afstand voor elke testconditie te garanderen. Op basis van de lengte van de wachtkamer, verkort u de onbedekte testbuis in een doorzichtig doolhof, terwijl u de met folie bedekte testbuis inkort als het doolhof ondoorzichtig is.
  3. Experimentele assay-opstelling en -uitvoering
    1. Plaats in donkere of weinig lichte omstandigheden 10 mannetjes en 10 vrouwtjes in de laadbuis. Sluit de laadbuis aan op de houderkamer. Kantel de lift en tik zachtjes op de buis om de vliegen in de wachtkamer te verplaatsen.
      OPMERKING: Laat de lift zakken zodat slechts de helft van de bewaarkamer open is. Deze manipulatie vergemakkelijkt de overdracht van vliegen van de laadbuis naar de wachtkamer.
    2. Nadat de vliegen zijn overgebracht naar de wachtkamer, gebruikt u de lift om de vliegen tussen de gaten van de laadbuis en de testbuis te laten zakken. Verwijder vervolgens de laadbuis.
    3. Plaats het vliegendoolhof op ongeveer 13 cm afstand van de roodlichtbron (1000 mA) zonder het licht aan te doen.
    4. Laat de lift zakken totdat de wachtkamer is uitgelijnd met de openingen van de reageerbuis, zodat de vliegen vrij kunnen bewegen tussen de in folie verpakte en de onbedekte testbuisjes. Doe tegelijkertijd het rode lampje aan om CsChrimson te activeren. Zorg ervoor dat de intensiteit van rood licht op het oppervlak van de onbedekte reageerbuis ongeveer 40 kLux is.
      NOTITIE: Doe het rode lampje pas aan als de bewaarkamer is neergelaten en is uitgelijnd met de openingen van de reageerbuis. Geschikte oogbescherming die rode laser/licht kan filteren, wordt aanbevolen vanwege de intense helderheid van het rode licht.
    5. Vliegen kiezen gedurende één minuut tussen de aan rood licht blootgestelde buis en de gearceerde buis.
    6. Breng na 1 minuut de lift omhoog tussen de gaten van de laadbuis en de testbuis. Tel de vliegen in elke buis.
      LET OP: Alleen actieve en niet-gewonde vliegen worden meegeteld.
    7. Reinig de vlieglift en het vliegendoolhof met dH2O na elke proef.
  4. Gegevensanalyse en statistieken
    1. Bereken de voorkeursindex (PI) als de verhouding tussen het verschil in vliegenaantallen tussen onbedekte en afgedekte buizen en het totale aantal vliegen, zoals weergegeven in de volgende formule:
      figure-protocol-3
      OPMERKING: Statistische details voor de experimenten worden verstrekt in de legenda's van de figuren. Gegevensanalyse wordt uitgevoerd met behulp van geschikte software voor gegevensanalyse

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Single-fly blauwlicht optogenetische thermotactische positievoorkeurstest
Er werden vier condities getest: kamerlicht zonder ATR-suppletie (kamerlicht, ATR -), kamerlicht met ATR-suppletie (kamerlicht, ATR+), blauw licht zonder ATR-suppletie (blauw, ATR -) en blauw licht met ATR-suppletie (blauw, ATR+). De eerste drie voorwaarden dienden als controles. In controle-experimenten vermeden vliegen de 31 °C-kant. In blauw licht met ATR-suppletie vertoonden vliegen geen voo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetische manipulatie heeft het gebied van de neurowetenschappen getransformeerd door nauwkeurige controle van neurale circuits met spatiotemporele nauwkeurigheid mogelijk te maken27. Een neuraal circuit omvat populaties van neuronen die met elkaar zijn verbonden door synapsen en die specifieke functies uitvoeren bij activering. Het Drosophila-connectoom voor het hele brein is voltooid en biedt uitgebreide inzichten in de synaptische routes in het

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn met betrekking tot de publicatie van dit artikel. Alle auteurs hebben mogelijke conflicten onthuld en bevestigen dat ze geen financiële of persoonlijke relaties hebben die van invloed kunnen zijn op het werk dat in deze studie wordt gepresenteerd.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematische diagrammen voor alle figuren zijn gemaakt met Biorender.com. Dit werk werd ondersteund door NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) aan L.N. De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek, het verzamelen en analyseren van gegevens, de publicatiebeslissing of de voorbereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1000 mA LED driverLuxeon Star3021-D-E-1000
5 mL VWR Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position CapsVWR60818-664
780 Longpass Filter / IR 780 nm 100 mm x 100 mmLee FiltersBH #LE8744Snijd tot ongeveer 47 x 100 past de plastic cover
Agfabric 6.5 ft. x 15 ft. Insect Bug Netting Garden Net for Protecting Plants Vegetables Flowers FruitsThe Home DepotEIBNW6515
All trans retinalSigma-Aldrich116-31-4
Aluminum Plate (30.5 cm x 30.5 cm x 0.6 cm)Amazonaangeschaft bij Amazon
Black Plastic BoxLI-COR929-97101
CALCIUM CHLORIDE ANHYDRO 25GRThermo Fisher Scientific AC297150250
CX405 Handycam with Exmor R CMOS sensorSONYHDR-CX405
Elmer’s “School Glue”Elmer
Ethyl alcohol, Pure (200 Proof)Sigma-AldrichE7023
Fisherbrand Isotemp Hot Plate StirrerFisher ScientificSP88850200
Fly line: Gr5a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center57592
Fly line: Gr66a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center57670
Fly line: HC-Gal4 (II)Dr. Marco Gallio LabEen vriendelijke gift
Fly line: UAS-CsChrimsonBloomington Drosophila Stock Center55136
Fly line: UAS-GtACR2/TM6BDr. Quentin Gaudry LabEen vriendelijke gift
Flystuff 62-101 Yellow Cornmeal (11.3 Kg), Yellow, 11.3 Kg/UnitGenesee Scientific62-101
Flystuff 62-107 Inactive Dry Yeast, 10 Kg, Nutritional Flake, 10 Kg/UnitGenesee Scientific62-107
Flystuff 66-103 Nutri-Fly Drosophila Agar, Gelidium, 100 Mesh, 5 Kg (11.02 lbs)/UnitGenesee Scientific66-103
FreeMascot OD 8+ 190 nm–420 nm / 600 nm–1100 nm Wavelength Violet/Red/Infrared Laser Safety Glasses FreeMascot B08LGMQ65Saangeschaft bij Amazon
GoPro Hero8 BlackGoPro6365359
LEE Filters 100×100 mm Infra Red #87 Infrared Polyester FilterB&H PhotoLE8744
Longpass Filter, Colored Glass, 50.8 x 50.8 mm, 830 nm Cut-on, RG830NewportFSQ-RG830
Methyl 4-hydroxybenzoate, 99%, Thermo Scientific ChemicalsThermo Fisher Scientific 126960025
MicroWell Mini Tray 60 Well, Low Profile NS PSThermal Scientific NUNC 439225De deksels worden gebruikt als de "plastic cover"
Olympus Plastics 24-160RS, 1000 µL Olympus Ergonomic Pipet Tips Low Binding, Racked, Sterile, 8 Racks of 96 Tips/UnitEppendorf24-160RS
Parafilm M Sealing FilmHeathrow ScientificHS234526B4 in x 125 feet
Potassium chloride, ACS, 99.0-100.5%, Thermo Fisher Scientific AA1159530
PrismGraphPadVersion 9data-analyse software
Samco Graduated Transfer PipettesThermo Fisher Scientific 2253 mL
SlidesFisher Scientific12-544-2 5 mm x 75 mm x 1.0 mm
Stereo microscopeOLYMPUSCZ61
Styrofoam box (27 cm height × 22 cm width × 16 cm length)
SucroseFisher Scientific225911
Surface temperature probeFluke80PK-3A
SyringeBD Integra305270
Tate & Lyle 457 Dextrose, Tate & Lyle, Pow, Tate & Lyle 457 Dextrose, Tate & Lyle, Powder, 50 lbs/UnitGenesee Scientific62-113
Traceable Calibrated Big-Digit Thermocouple ThermometerTraceable by cple-parmer UX-91210-07Fisherbrand Traceable BigDigit Type K Thermometer
Triple blue LED starboardLEDSupply07007-PB000-D470 nm
Triple red LED starboardLEDSupply07007-PD000-F627 nm
Tygon PVC Clear Tubing 1/4" ID, 3/8" OD, 5 ft. Length McMaster Carr Supply Company 6516T21 
Univivi IR Illuminator, 850nm 12 LEDs Wide Angle IR Illuminator for Night VisionUnivivi4331910725
Wakefield Thermal 25.4 mm Round Heatsink Star LED Board - 882-100ABWakefield-Vette882-100AB
Wireless PresenterDinoFire StoreB01410YNAMaangeschaft bij Amazon

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  2. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  3. Mauss, A. S., Busch, C., Borst, A. Optogenetic neuronal silencing in drosophila during visual processing. Sci Rep. 7 (1), 13823(2017).
  4. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Neuroscience. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
  5. Castaneda, A. N., et al. Functional labeling of individualized postsynaptic neurons using optogenetics and trans-tango in drosophila (flipsot). PLoS Genet. 20 (3), e1011190(2024).
  6. Fischer, F. P., et al. Drosophila melanogaster as a versatile model organism to study genetic epilepsies: An overview. Front Mol Neurosci. 16, 1116000(2023).
  7. Aragon, M. J., et al. Multiphoton imaging of neural structure and activity in drosophila through the intact cuticle. Elife. 11, e69094(2022).
  8. Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of drosophila behaviors through channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. Eur J Neurosci. 26 (9), 2405-2416 (2007).
  9. Kono, M., Goletz, P. W., Crouch, R. K. 11-cis- and all-trans-retinols can activate rod opsin: Rational design of the visual cycle. Biochemistry. 47 (28), 7567-7571 (2008).
  10. Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the drosophila brain. Cell. 144 (4), 614-624 (2011).
  11. Ni, L., et al. A gustatory receptor paralogue controls rapid warmth avoidance in drosophila. Nature. 500 (7464), 580-584 (2013).
  12. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  13. Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of drosophila. J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).
  14. Dethier, V. G. The Hungry Fly: A Physiological Study of the Behavior Associated with Feeding. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1976).
  15. Shiu, P. K., Sterne, G. R., Engert, S., Dickson, B. J., Scott, K. Taste quality and hunger interactions in a feeding sensorimotor circuit. Elife. 11, e79887(2022).
  16. Kim, H., Kirkhart, C., Scott, K. Long-range projection neurons in the taste circuit of drosophila. Elife. 6, e23386(2017).
  17. Sayeed, O., Benzer, S. Behavioral genetics of thermosensation and hygrosensation in drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 6079-6084 (1996).
  18. Coya, R., Martin, F., Calvin-Cejudo, L., Gomez-Diaz, C., Alcorta, E. Validation of an optogenetic approach to the study of olfactory behavior in the t-maze of drosophila melanogaster adults. Insects. 13 (8), 662(2022).
  19. Chu, L. A., Tai, C. Y., Chiang, A. S. Thirst-driven hygrosensory suppression promotes water seeking in drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (34), e2404454121(2024).
  20. Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. Drosophila gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (Suppl 2), 14526-14530 (2003).
  21. Dunipace, L., Meister, S., Mcnealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the drosophila gustatory system. Curr Biol. 11 (11), 822-835 (2001).
  22. Ratnayake, K., et al. Blue light excited retinal intercepts cellular signaling. Sci Rep. 8 (1), 10207(2018).
  23. Huda, A., Omelchenko, A. A., Vaden, T. J., Castaneda, A. N., Ni, L. Responses of different drosophila species to temperature changes. J Exp Biol. 225 (11), jeb243708(2022).
  24. Tyrrell, J. J., Wilbourne, J. T., Omelchenko, A. A., Yoon, J., Ni, L. Ionotropic receptor-dependent cool cells control the transition of temperature preference in drosophila larvae. PLoS Genet. 17 (4), e1009499(2021).
  25. Fu, Z., Huda, A., Kimbrough, I. F., Ni, L. Using drosophila two-choice assay to study optogenetics in hands-on neurobiology laboratory activities. J Undergrad Neurosci Educ. 22 (1), A45-A50 (2023).
  26. Joseph, R. M., Heberlein, U. Tissue-specific activation of a single gustatory receptor produces opposing behavioral responses in drosophila. Genetics. 192 (2), 521-532 (2012).
  27. Riemensperger, T., Kittel, R. J., Fiala, A. Optogenetics in drosophila neuroscience. Methods Mol Biol. 1408, 167-175 (2016).
  28. Dorkenwald, S., et al. Neuronal wiring diagram of an adult brain. Nature. 634 (8032), 124-138 (2024).
  29. Schlegel, P., et al. Whole-brain annotation and multi-connectome cell typing of drosophila. Nature. 634 (8032), 139-152 (2024).
  30. Talay, M., et al. Transsynaptic mapping of second-order taste neurons in flies by trans-tango. Neuron. 96 (4), 783-795.e4 (2017).
  31. Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (per) assay in drosophila. J Vis Exp. (3), e193(2007).
  32. Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. Optogenetics in the teaching laboratory: Using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in drosophila. Adv Physiol Educ. 35 (1), 82-91 (2011).
  33. Titlow, J. S., Johnson, B. R., Pulver, S. R. Light activated escape circuits: A behavior and neurophysiology lab module using drosophila optogenetics. J Undergrad Neurosci Educ. 13 (3), A166-A173 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CsChrimson activatieGtACR2 inhibitiepositionele voorkeurstestproboscis extensiereactievliegen doooltestsensorische verwerking

Gerelateerde artikelen