Methodenartikel

Een in-vitroblaasmodel van katheter-geassocieerde urineweginfectie

DOI:

10.3791/67966

⸱

24 juni 2025

 ,  , 
1The Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, The University of Liverpool, 2Department of Life Sciences, The University of Bath

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een in vitro model van de gekatheteriseerde urinewegen, dat kan worden gebruikt om zowel plankton- als biofilm-geassocieerde bacteriecelpopulaties te bestuderen bij gesimuleerde katheter-geassocieerde urineweginfecties. Dit model kan verder worden gebruikt om de werkzaamheid te bestuderen van antimicrobiële producten die gericht zijn op het beheersen van urineweginfecties.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Katheter-geassocieerde urineweginfecties (CAUTI's) behoren tot de meest voorkomende zorginfecties. Biofilmvorming op urinekatheters is een belangrijk aspect in de pathogenese van deze infecties en leidt vaak tot verstopping van katheters en ernstige complicaties zoals pyelonefritis en bloedvergiftiging. Benaderingen om de vorming van biofilm in deze setting te modelleren en te bestuderen zijn essentieel voor zowel een fundamenteel begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathogenese van CAUTI, als voor de ontwikkeling en robuuste preklinische evaluatie van effectieve therapeutische strategieën om CAUTI en katheterblokkade onder controle te houden. Dit protocol beschrijft een in vitro model van de gekatheteriseerde urinewegen, dat het gesloten afvoersysteem van de katheter repliceert zoals gebruikt in de klinische praktijk, waardoor de studie van CAUTI en katheterbiofilmvorming onder representatieve omstandigheden wordt vergemakkelijkt. Bovendien beschrijft dit protocol de toepassing van het in-vitroblaasmodel om de werkzaamheid van antimicrobiële katheteronderhoudsproducten te evalueren, inclusief producten die momenteel beschikbaar zijn in de NHS-toeleveringsketen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Urinekatheters behoren tot de meest gebruikte medische hulpmiddelen, met een geschatte prevalentie van 19% in acute zorginstellingen 1,2,3. Katheters worden voornamelijk ingezet om te helpen bij het beheer van de urineproductie in geval van blaasdisfunctie, en worden rechtstreeks in de blaas ingebracht, waardoor de urine via een centraal lumen 2,3 uit de blaas kan worden geloosd. Urinekatheters kunnen met tussenpozen worden gebruikt, waarbij ze periodiek in de blaas worden ingebracht om urine af te voeren, of verblijfskatheters kunnen worden gebruikt, waarbij katheters in situ in de blaas worden gelaten om continu urine af te tappen 3,4. Ondanks hun wijdverbreide gebruik zijn urinekatheters de grootste risicofactor voor de ontwikkeling van urineweginfecties (UTI's), die naar schatting een vijfde van de zorggerelateerde infecties uitmaken 5,6. De katheter zelf fungeert inderdaad vaak als de eerste plaats van microbiële kolonisatie en biedt een oppervlak voor uropathogenen om zich aan de urinewegen te hechten en deze verder te koloniseren 1,6,7,8. Vrijwel alle patiënten die langdurige continue katheterisatie ondergaan (waarbij de katheter ≥28 dagen op zijn plaats blijft) zullen bacteriurie ervaren, waarbij het risico met ~5% toeneemt voor elke dag dat de katheter in situ is 2,9,10,11. Evenredig is ongeveer 80% van de urineweginfecties geassocieerd met het gebruik van een urinekatheter6.

Katheter-geassocieerde urineweginfecties (CAUTI's) vormen een aanzienlijke belasting voor de gezondheidsdiensten en worden vaak geassocieerd met ernstigere symptomen van urineweginfecties in de bovenste kolom (zoals ureteritis en pyelonefritis) dan ongecompliceerde urineweginfecties, evenals een verhoogd risico op secundaire bloedbaaninfecties 1,7,12,13,14 . Standaardbehandelingen voor CAUTI's omvatten antibioticatherapie, maar deze infecties zijn vaak recalcitrant voor antimicrobiële behandeling als gevolg van de ontwikkeling van complexe biofilmgemeenschappen op het katheteroppervlak 15,16,17,18,19,20. Naar schatting is ~80% van de CAUTI's het gevolg van biofilmvormende urinewegpathogenen19. De vorming van biofilm wordt gekenmerkt door de aanhechting van bacteriële cellen aan katheteroppervlakken en de ontwikkeling van gemeenschappen die zijn ingebed in een uitgebreide matrix van extracellulaire polymere stoffen (EPS)21,22,23,24. De productie van het EPS is een bepalend kenmerk van biofilmgemeenschappen en is verantwoordelijk voor veel van de opkomende eigenschappen van biofilm-geassocieerde cellen, zoals verhoogde resistentie tegen antimicrobiële middelen en immuunklaring 21,22,24. De EPS kan een directe rol spelen in deze fenotypes door cellen fysiek af te schermen en ze te beschermen tegen antimicrobiële middelen of immuuneffectoren, maar ook indirect door de ontwikkeling van bredere aspecten van biofilmgemeenschappen te vergemakkelijken, zoals de fysisch-chemische micro-omgeving van de biofilm en de vorming van persisterende cellen 23,24,25,26. Bovendien bezitten sommige uropathogenen, waaronder Proteus spp., die goed zijn voor ~11% van de CAUTI's, krachtige urease-enzymen, waardoor ze het ureum in de urine kunnen hydrolyseren en resulteren in een algehele verhoging van de pH vande urine met 2,27,28,29,30. Deze pH-verhoging gaat gepaard met de neerslag van calcium- en magnesiumfosfaatkristallen, die kunnen worden opgenomen in de groeiende biofilm, wat resulteert in biomineralisatie en de vorming van dichte kristallijne biofilmstructuren die katheters kunnen blokkeren. Deze kristallijne biofilms maken de behandeling niet alleen problematisch, maar kunnen ook ernstige complicaties veroorzaken, zoals pyelonefritis en bloedvergiftiging 2,28,31,32,33,34.

De complexe omgevingsniche in de gekatheteriseerde urinewegen en de belangrijke rol van biofilmvorming bij deze infecties, vormen bijzondere uitdagingen bij de studie van de pathogenese van CAUTI. Eenvoudige en veelgebruikte laboratoriummodellen om de vorming van biofilm te bestuderen en te kwantificeren, zoals testopstellingen met 96 putjes, zijn ontoereikend voor de studie van biofilmvorming in CATUI, met name kristallijne biofilms. Dergelijke modellen houden bijvoorbeeld geen rekening met belangrijke aspecten van de CAUTI-niche, zoals de complexe voedingsomgeving die door urine wordt geboden, hoe het katheteroppervlak de hechting en de daaropvolgende biofilmproductie beïnvloedt, en de continue stroom van urinemedia 35,36,37,38,39,40. Bovendien weerspiegelen standaardtesten die worden gebruikt om de antimicrobiële gevoeligheid van uropathogenen te bepalen, vaak niet de klinische gevoeligheid in de echte wereld. Tests met minimale remmende concentratie en microbiële suspensietests worden vaak gebruikt om de antimicrobiële gevoeligheid van CAUTI-pathogenen af te leiden, maar simuleren doorgaans geen belangrijke variabelen van de CAUTI-omgeving, zoals het effect dat de aanwezigheid van een urinekatheter en eventuele daaropvolgende biofilmvorming kan hebben op de antimicrobiële gevoeligheid 41,42,43.

Deze studie beschrijft de opzet en werking van een in vitro blaasmodel dat de omgeving van de gekatheteriseerde urinewegen simuleert en een standaard katheter gesloten drainagesysteem repliceert zoals gebruikt in de klinische praktijk, voor het eerst beschreven door Stickler et al.44 in 1999 (Figuur 1). Dit model maakt gebruik van Foley-katheters van standaardformaat (die momenteel beschikbaar zijn in de NHS-toeleveringsketen) en kunstmatige urinemedia (AUM) zoals eerder beschreven door Nzakizwanayo et al.45om CAUTI- en biofilmvorming te simuleren. Het in-vitroblaasmodel bestaat uit een dubbelwandige glazen kamer die fungeert als de "blaas" en een uitlaat heeft waardoor een Foley-katheter in de centrale glazen kamer kan worden ingebracht. Aan de bovenkant van de centrale glazen kamer bevindt zich een inlaat waardoor AUM met een biologisch relevant debiet naar de "blaas" kan worden toegevoerd met behulp van een peristaltische pomp, die door de katheter via de drainage-ooggaten in een afvalzak stroomt. Bovendien is de buitenkamer aangesloten op een waterbadcircuit, waardoor de modellen op een constante temperatuur kunnen worden gehouden. Het in vitro blaasmodel kan via de centrale kamer worden geëoculeerd, waardoor CAUTI-pathogenen in een biologisch representatieve niche kunnen worden bestudeerd. Bovendien, aangezien modellen worden gekatheteriseerd en constant worden voorzien van verse AUM, kunnen de groei en populatiedynamiek van zowel plankton- als biofilm-geassocieerde cellen worden bestudeerd.

Eerdere studies hebben in vitro blaasmodellen gebruikt voor verschillende toepassingen, waaronder de fundamentele studie van biofilmvorming bij prominente CAUTI-pathogenen, waaronder Proteus mirabilis en Escherichia coli 43,45,46,47,48,49. Bovendien is het in-vitromodel gebruikt om de werkzaamheid te evalueren van producten die bedoeld zijn om CAUTI te beheersen of verstopping te voorkomen 50,51,52. Meer recent zijn modellen gebruikt om te bepalen of aanpassingen en mutaties die verband houden met AMR invloed hebben op de vorming van biofilm en de pathogenese van CAUTI in P. mirabilis43,46. Het in vitro blaasmodel is ook gebruikt om nieuwe antimicrobiële behandelingen te bestuderen die gericht zijn op de behandeling van CAUTI, waaronder nieuw geformuleerde theranostische kathetercoatings en behandelingen met faagtherapie47,48. Dit protocol omvat het opzetten en uitvoeren van in vitro blaasmodellen, de telling van levensvatbare planktonische en biofilm-geassocieerde cellen van respectievelijk het model en het urinekatheteroppervlak, en de meting van de pH van de urine om de ureaseproductie te volgen. Er worden ook protocollen opgesteld voor de beoordeling van antimicrobiële producten die gericht zijn op het behandelen of voorkomen van CAUTI, waaronder blaasirrigatieoplossingen en antimicrobiële glijgels, die momenteel beschikbaar zijn in de NHS-toeleveringsketen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schematische weergave van de opzet van het in-vitroblaasmodel wordt weergegeven in figuur 1. In-vitroblaasmodellen zijn ontworpen om compatibel te zijn met standaard Foley-katheters (de afmetingen weergegeven in afbeelding 1 zijn compatibel met Franse katheters van standaard maat 14). Steriliseer alle in-vitroblaasmodelapparatuur en klem alle siliconenslangen die worden gebruikt vóór gebruik in het mediacircuit. Strikte naleving van de aseptische techniek is vereist bij het opzetten van in-vitromodellen , en het wordt aanbevolen om het model onder steriele omstandigheden te assembleren (d.w.z. in een microbiële veiligheidskast van categorie II of laminaire stromingskap). Een minimum van n = 5 replicaten wordt aanbevolen om de statistische significantie te bepalen voor in vitro blaasmodelexperimenten. De details over de gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Bereiding van kunstmatige urinemedia

OPMERKING: Kunstmatige urinemedia (AUM) worden aanbevolen voor gebruik in in-vitroblaasmodellen vanwege de grote hoeveelheden media die nodig zijn voor experimenten en de variabiliteit die gepaard gaat met menselijke urinemonsters. Dit protocol beschrijft de bereiding van AUM zoals eerder beschreven en geoptimaliseerd voor gebruik in het in-vitroblaasmodel door Nzakizwanayo et al. (5 L eindvolume) 43,45,46,48,53,54.

  1. AUM-oplossing 1 voorbereiden
    1. Weeg de volgende verbindingen af en voeg toe aan een fles borosilicaat van 1 L gevuld met 850 ml gedeïoniseerd water: 3,25 g magnesiumchloride-hexahydraat (MgCl2,6 H2 O), 23 g natriumchloride (NaCl), 11,5 g watervrij natriumsulfaat (Na2SO4), 3,25 g trinatriumcitraat (Na3C6H5O7), 0,1 g natriumoxalaat (Na2C2O4), 14 g monokaliumfosfaat (KH2PO4), 8 g kaliumchloride (KCl), 5 g ammoniumchloride (NH4Cl), 25 g gelatine en 5 g tryptonsojabouillon.
  2. Meet tijdens het roeren van de AUM-oplossing de pH met behulp van een pH-meter en stel deze aan op 5,75 (± 0,02) door naar wens 3 M NaOH of HCl toe te voegen.
    OPMERKING: NaOH/HCl voor het aanpassen van de pH moet druppelsgewijs aan de AUM worden toegevoegd om zoutneerslag uit de oplossing te voorkomen.
  3. Zodra de AUM is aangepast aan de pH, vult u de oplossing bij tot een eindvolume van 1 l met gedeïoniseerd water en steriliseert u de autoclaaf.
    OPMERKING: Eenmaal steriel kan de oplossing maximaal drie maanden bij kamertemperatuur worden bewaard (AUM-oplossing 1 moet worden weggegooid als neerslag of troebelheid wordt waargenomen).
  4. Bereid afzonderlijk AUM-oplossing 2 door 125 g ureum (CH4N2O) en 2,45 g calciumchloride (CaCl2) toe te voegen aan 400 ml steriel, gedeïoniseerd water in een steriel bekerglas van 500 ml.
    OPMERKING: Het bereiden van de calciumureumoplossing 2 resulteert in een endotherme reactie, daarom wordt aanbevolen om AUM-oplossing 2 te roeren en te verwarmen tot ~ 50 °C op een hete plaat/magnetische roerder terwijl de verbindingen oplossen om bevriezing te voorkomen.
  5. Zodra het ureum en calciumchloride zijn opgelost, filtert u oplossing 2 met behulp van een vacuümpomp en 0.45 μM nitrocellulosefiltereenheden in een steriele glazen fles van 500 ml. Eenmaal gesteriliseerd, is oplossing 2 drie maanden stabiel bij 4 °C of een maand bij kamertemperatuur
    OPMERKING: AUM-oplossing 2 moet worden weggegooid als neerslag of troebelheid wordt waargenomen.
  6. Combineer in een laminaire stromingskap of microbiologische veiligheidskast van categorie II aseptisch AUM-oplossingen 1 en 2 met 3,6 l steriel gedeïoniseerd water in een steriele glazen aspiratorfles van 5 l. AUM moet lichtgeel van kleur en transparant zijn.
  7. Verwijder met behulp van een serologische pipet 50 ml van het totale AUM-volume en aliquot in een centrifugebuis van 50 ml en bewaar voor later gebruik.
  8. Sluit de aspiratorfles af met een rubberen stop of aluminiumfolie en laat deze op kamertemperatuur staan totdat in-vitromodellen zijn gemonteerd.
  9. Verwijder aseptisch 10 ml AUM uit het aliquot van 50 ml en bewaar de rest van de oplossing voor de bereiding van het entmateriaal. Meet met behulp van een pH-meter de pH van de AUM van 10 ml, die ~pH 6.1 (±0.2) moet zijn. Bereide AUM is ongeveer een maand stabiel bij kamertemperatuur en moet worden weggegooid als er neerslag of bewolking optreedt.

2. Opstelling van het in-vitroblaasmodel

  1. Breng een Foley-katheter in de centrale glazen kamer van het in-vitroblaasmodel (schematisch beschreven in afbeelding 1). Zet de katheter op zijn plaats door de ballon op te blazen met de meegeleverde spuit met steriel water en bevestig de afvalzak aan de katheterpoort.
  2. Sluit het in-vitroblaasmodel 45 aan op het AUM-reservoir via een aansluitslang. Sluit de slangen van het mediacircuit aan op de peristaltische pomp volgens de instructies van de fabrikant en zorg ervoor dat de slang voldoende spanning heeft zonder te worden uitgerekt.
  3. Bevestig in-vitroblaasmodellen aan klemstandaards en bevestig afvalzakken in standaards onder de modellen om ervoor te zorgen dat de modellen via de zwaartekracht door de modellen stromen.
  4. Sluit de buitenkamer van het blaasmodel aan op een circulerend waterbad via siliconenslangen (Afbeelding 1B). Zet het waterbad op 37 °C en zet de tankthermostaten aan.
    1. Laat waterbaden 30 minuten draaien voordat u in vitro blaasmodellen inoculeert om ervoor te zorgen dat de temperatuur stabiel is op 37 °C en zorg ervoor dat het waterbad tijdens het experimenteren op het juiste waterniveau blijft.
  5. Verwijder eventuele klemmen van mediaslangen en stel peristaltische pompen in op een snelheid van ongeveer 0.75 ml/min om de productie van menselijke urine na te bootsen (~1080 ml/dag). Het werkelijke debiet wordt tijdens het experimenteren berekend.
  6. Laat AUM gedurende 30 minuten voorafgaand aan de inoculatie via de peristaltische pomp door de in-vitroblaasmodellen lopen om te bevestigen dat de mediastroom constant is en dat het steriele afvoersysteem intact is.
  7. Laat alle opgehoopte media uit de afvalzak lopen voordat u gaat experimenteren. Het volume van de media kan worden gemeten om het exacte debiet te berekenen (gedetailleerd in stap 4).

3. Inoculatie van in vitro blaasmodellen

  1. Bereid nachtculturen voor in vitro blaasmodellen voor door een lus vol bacteriekolonies gekweekt op vaste agar in 10 ml LB-bouillon te suspenderen. Incubeer een nacht bij 37 °C en schud.
    OPMERKING: Het in vitro blaasmodel kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan CAUTI-pathogenen te bestuderen, waaronder urease-positieve stammen zoals Proteus mirabilis, en de gebruikte groeimedia kunnen dienovereenkomstig worden aangepast.
  2. Centrifugeer het volledige volume van de nachtcultuur bij 4.500 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi het bovenstaande weg. Resuspendeer de pellet in 10 ml AUM en meet de extinctie bij OD595 nm met behulp van een spectrometer.
  3. Normaliseer de geresuspendeerde culturen tot een OD595 nm van 1,0 en een eindvolume van 10 ml in AUM met behulp van de volgende vergelijking:
    figure-protocol-1
    waarbij A1 de absorptie is bij OD600 nm van de nachtcultuur, A2 de gewenste absorptie bijOD 600 nm van het inoculum (1.0), V2 het gewenste volume van het inoculum is (10 ml) en V1 het vereiste volume van de nachtcultuur is voor normalisatie.
    OPMERKING: 10 ml van een OD595 nm 1.0-suspensie zorgt ervoor dat modellen worden geïnoculeerd met ongeveer 1010 CFU van de meeste bacteriestammen (gevalideerd voor Proteus mirabilis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus), waarbij een gevestigde infectie wordt gerepliceerd. Het starten van het inoculum kan worden aangepast, afhankelijk van de gebruikte soort of het infectiestadium dat wordt gemodelleerd (d.w.z. een lagere inoculumdichtheid kan worden gebruikt om infectie in een vroeg stadium te simuleren)47.
  4. Steriliseer in-vitroblaasmodellen met 70% ethanol en verwijder de stop (media-inlaat) zodat de binnenkamer toegankelijk is. Verwijder 10 ml AUM van het volume in het blaasmodel met behulp van een serologische pipet.
    OPMERKING: Zorg er bij het inoculeren en bemonsteren van in-vitromodellen uit de centrale kamer voor dat het werk snel en aseptisch is, draag altijd de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en ontsmet handschoenen en oppervlakken regelmatig met 70% ethanol.
  5. Inoculeer de in vitro blaasmodellen via de centrale kamer met behulp van de volledige genormaliseerde suspensie van 10 ml en meng grondig met een serologische pipet. Verwijder 10 ml uit de centrale kamer van de in-vitroblaasmodellen met behulp van een serologische pipet en aliquoot in een universele van 15 ml voor latere CFU/ml-berekeningen en pH-metingen.
  6. Ontsmet de externe oppervlakken van het blaasmodel en de stop grondig met 70% ethanol en plaats de stop terug. Hervat de mediastroom kort om ervoor te zorgen dat het AUM-niveau in de centrale kamer het ooggat bereikt, voordat u de stroom stopt.
  7. Laat culturen zich 1 uur in het blaasmodel vestigen voordat u de mediastroom via de peristaltische pomp inschakelt met ~0,75 ml/min.
  8. Terwijl het entmateriaal zich vestigt, worden verdunningen bereid van het monster dat uit de centrale kamer is genomen.
    1. Verdun 100 μL monster in serie in 900 μL steriel PBS totdat het monster is verdund tot 10-7. Verwijder 10 μl vlekken van de verdunningen in drievoud op geschikte vaste media en incubeer een nacht bij 37 °C.
    2. Tel na de incubatie de kolonies op elke verdunningsplaat en bereken de exacte CFU/ml van het initiële inoculum.
      OPMERKING: Als u soorten gebruikt die zwermen, d.w.z. Proteus mirabilis, gebruik dan MacConkey-agar zonder zout (pepton 20,0 g/L, lactose 10,0 g/L, galzouten 5,0 g/L, neutraal rood 0,075 g/L en agar 12,0 g/L) om ervoor te zorgen dat afzonderlijke kolonies nog steeds zichtbaar zijn om het tellen te vergemakkelijken.
  9. Schakel na 1 uur incubatie de mediastroom via de peristaltische pomp in om te beginnen met het draaien van in-vitroblaasmodellen , waarbij u het tijdstip noteert waarop de modellen worden ingeschakeld.

4. Berekening van het debiet van het in-vitroblaasmodel

  1. Zodra de in-vitromodellen zijn geënt en de mediastroom op gang is gebracht, laat u de modellen 4 uur draaien. Pauzeer de mediastroom kort en verzamel het volledige volume resterende AUM uit de afvalzak in een maatkolf via de afvoerpoort. Noteer het verzamelde volume.
    OPMERKING: Het debiet kan worden berekend op basis van het volume media dat in stap 2.7 is verzameld, maar nauwkeurigere stroomsnelheden kunnen worden verkregen door modellen langer te laten draaien (d.w.z. aanbevolen 4 uur), omdat dit de kans verkleint dat restlucht in de slang van het mediacircuit het berekende debiet beïnvloedt.
  2. Hervat de mediastroom via de peristaltische pomp en zorg ervoor dat de afvoerpoort van de afvalzak gesloten is om een steriel afvoersysteem te behouden.
  3. Gebruik de volgende vergelijking om het werkelijke debiet van in-vitromodellen te berekenen:
    figure-protocol-2
    OPMERKING: Debieten in het bereik van 0,55-1,0 ml/min worden aanbevolen om de productie van menselijke urine na te bootsen.
  4. Als het mediadebiet buiten het acceptabele bereik wordt berekend, gooi u de replicatie weg en past u het toerental op de peristaltische pomp aan zodat het binnen het acceptabele bereik past.

5. Bemonstering van planktoncellen uit het in vitro blaasmodel

OPMERKING: In-vitroblaasmodellen moeten tijdens het experiment routinematig worden bemonsterd om de populatiedynamiek te volgen. Alle modellen moeten onmiddellijk na inoculatie worden bemonsterd, op het punt van activering van de AUM-stroom, 4 uur na inoculatie (wanneer de stroomsnelheid wordt berekend) en op het punt waar de modellen worden beëindigd (blokkering of een vooraf bepaald eindpunt). Als er modellen >24 uur worden gebruikt, wordt aanbevolen om elke 24 uur monsters te nemen om CFU/ml te controleren, en aanvullende monsters kunnen worden genomen zoals vereist door gebruikers.

  1. Ontsmet de stop van het blaasmodel met 70% ethanol en verwijder deze om toegang te krijgen tot de centrale kamer.
  2. Vermijd de kathetertip en ballon en meng de inhoud van de centrale kamer voorzichtig met behulp van een serologische pipet.
  3. Verwijder met behulp van een serologische pipet een monster van 10 ml uit de kamer en breng het over in een steriel buisje. Ontsmet de stop onmiddellijk met 70% ethanol en vervang deze, waarmee het steriele, gesloten afvoercircuit wordt voltooid.
  4. Verwijder 1 ml uit het monster met behulp van een pipet en aliquoot in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml voor seriële verdunningen.
  5. Meet de pH van het resterende monster met behulp van een pH-meter, zorg ervoor dat het monster grondig wordt gemengd en dat de pH-meter vóór gebruik wordt gekalibreerd.
  6. Verdun de gereserveerde 1 ml aliquoot van het monster achtereenvolgens en plaat op geschikte vaste media zoals eerder beschreven in stap 3.8, waarbij alle verdunningen worden uitgezet.
    OPMERKING: Planktonmonsters die uit het blaasmodel zijn genomen, zijn geschikt voor andere analyses, waaronder genomische of moleculair-biologische toepassingen (optioneel).

6. Bemonstering van biofilm-geassocieerde cellen uit het in vitro blaasmodel

  1. Verwijderen en voorbereiden van de katheter
    OPMERKING: Biofilmbemonstering van in vitro blaasmodellen is een eindpuntanalyse, waarbij modellen moeten worden gedeactiveerd en katheters moeten worden verwijderd voor verwerking.
    1. Koppel de afvalzak los van de kathete en laat eventuele resterende urine uit het model lopen door de ballon leeg te laten lopen. Verwijder de katheter vanaf de onderkant van het model met behulp van een steriele tang.
    2. Plaats de verwijderde katheter op een steriel bord en snijd met behulp van een steriel scalpel de katheter door op de vereiste punten voor secties (beschreven in afbeelding 2).
    3. Zorg ervoor dat de kathetersecties in de lengte zijn doorgesneden om het lumen bloot te leggen; dompel vervolgens met een steriele tang het kathetergedeelte 3 keer in steriel PBS om niet-aanhangende cellen te verwijderen.
      OPMERKING: Als de kathetersecties stroomafwaarts worden afgebeeld, d.w.z. met behulp van SEM, laat dan de secties van 1 cm intact (knip niet in de lengterichting) en verwijder in plaats daarvan overtollig vocht uit het lumen met een steriele papieren handdoek voordat u ze fixeert.
  2. Verstoring van biofilm voor CFU/ml-telling
    OPMERKING: Protocollen die de verstoring van biofilm-geassocieerde cellen beschrijven, kunnen verdere optimalisatie vereisen als biofilms uitgebreid kristallijn of mucoïde zijn.
    1. Incubeer het geprepareerde kathetergedeelte in 0,25% trypsine bij 37 °C gedurende 30 minuten. Het gebruikte trypsinevolume moet het minimum zijn dat nodig is om de katheter te bedekken; bijv. voor een kathetersectie van 1 cm die loodrecht is afgesneden, is 1 ml 0,25% trypsine voldoende.
    2. Sonificeer na de incubatie de oplossing met de katheter gedurende 10 minuten. Het kathetergedeelte kan dan worden verwijderd en weggegooid. Om de trypsine te deactiveren, moet de celoplossing onmiddellijk worden verdund in steriel PBS en op geschikte vaste media worden uitgelakt voor CFU-tellingen, zoals eerder beschreven in stap 3.8.
  3. Kwantificering van de biofilm van de katheter via kristalviolette kleuring
    1. Voeg de voorbereide kathetersecties toe aan putjes in een putplaat met platte bodem van de juiste grootte. Gebruik een geschikt volume van 0,1% kristalviolette oplossing om het kathetergedeelte volledig onder te dompelen en incubeer statisch bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Zorg ervoor dat er ook een steriel kathetergedeelte is meegeleverd als achtergrondcontrole.
    2. Verwijder de kathetersecties van de plaat en breng ze over naar een nieuwe plaat. Was elk kathetergedeelte twee keer in gedestilleerd water.
    3. Breng na het spoelen de kathetersecties over op een nieuwe plaat en bedek met 33% azijnzuur. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Verwijder het kathetergedeelte van de plaat en meet vervolgens met behulp van een plaatlezer een OD595 nm voor elke replicaat, waarbij de putjes met de steriele kathetersecties als achtergrondcontroles worden gebruikt.

7. Testen op antimicrobiële gevoeligheid in het in-vitroblaasmodel

OPMERKING: De meeste therapieën die gericht zijn op het beheersen van katheter-geassocieerde urineweginfectie zijn compatibel met standaard Foley-katheters, controleer de compatibiliteit voordat u begint met in-vitro-blaasmodelexperimenten .

  1. Antimicrobiële glijgels
    OPMERKING: Om het gebruik van smeermiddelen bij het inbrengen van de katheter te simuleren, moet deze stap worden uitgevoerd tijdens stap 2.1, onmiddellijk voorafgaand aan het inbrengen van de Foley-katheter. Na het inbrengen van de katheter moet het model onmiddellijk worden aangesloten en stap 2.6. moet worden weggelaten, zodat de gel niet wordt verdund en afgetapt voordat deze wordt geënt. De inoculatie moet op dezelfde dag plaatsvinden als het inbrengen van de katheter. Smeermiddelen die zijn ontworpen voor gebruik met katheters zijn verpakt als afzonderlijke, steriele spuiten voor eenmalig gebruik met een volume van 6 ml of 11 ml. Ongeveer 5 ml glijmiddel is voldoende om zowel de hals van het blaasmodel te vullen als de basis van het model te bedekken.
    1. Breng met behulp van de aseptische techniek het uiteinde van de spuit met het smeermiddel in de hals van het blaasmodel en breng 5 ml gel in om de hals te vullen en de bodem van de kamer binnen te dringen.
    2. Draai het model zodat de basis gelijkmatig bedekt is met gel, breng vervolgens een Foley-katheter in het model in door de kathetertip door de gel te duwen en zet vast door de ballon zoals gewoonlijk te vullen.
    3. Sluit het model aan op de rest van de opstelling en vul vervolgens het modellumen met urine totdat het begint af te tappen. Zodra de urine door het ooggat van de katheter begint weg te lopen, moet u de pomp stoppen om verlies van gel te voorkomen voordat u wordt ingeënt.
      1. Incubeer de modellen gedurende 30 minuten om de urine 37 °C te laten bereiken en inoculeer vervolgens de modellen zoals eerder beschreven om ervoor te zorgen dat de diffusietijd van de gelcomponenten gelijkmatig in het urinevolume is.
    4. Inoculeer het model zoals beschreven in stap 3.5 en laat het 1 uur incuberen voordat u de peristaltische pompen inschakelt. Neem op het moment dat de pomp wordt ingeschakeld een planktonmonster van 1 ml en verdeel de verdunningen voor CFU-tellingen zoals beschreven in stap 3.8.
  2. Irrigatie oplossingen
    OPMERKING: Irrigatieoplossingen zijn vaak verkrijgbaar in bulk of als individuele, steriele "zakjes" voor eenmalig gebruik. Als u individuele oplossingen gebruikt, zorg er dan voor dat deze compatibel zijn met de afvoerpoorten van de te gebruiken katheters voordat u gaat experimenteren. Als u bulkirrigatieoplossingen gebruikt, zorg er dan voor dat katheters met drie lumen worden gebruikt en dat de instructies van de fabrikant worden gevolgd om het volume/tijdsbestek van de producttoediening te bepalen.
    1. Voer voorafgaand aan de behandeling ten minste 4 uur in vitro-modellen uit om ervoor te zorgen dat biofilm-geassocieerde gemeenschappen voldoende tijd hebben gehad om zich te vestigen. Zodra de modellen 4 uur hebben gedraaid, pauzeert u de mediastroom en neemt u een voorbehandelingsmonster uit de binnenkamer van de in-vitromodellen , zoals beschreven in stap 5.
      NOTITIE: Als u bulkirrigatieoplossingen gebruikt, gaat u verder met stap 7.2.5.
    2. Als u een afzonderlijk irrigatiezakje gebruikt, koppelt u de afvalzak los van de katheter en gebruikt u de dop die bij het zakje is geleverd om de afvalzak af te sluiten. Bevestig het zakje met irrigatievloeistof onmiddellijk aan de katheter en knijp het product met lichte druk in het centrale lumen. Aanbrengen zoals aangegeven in de instructies van de fabrikant (d.w.z. 15 minuten aanbrengen).
    3. Zodra de aanbevolen behandeling is voltooid, laat u de resterende oplossing uit de binnenkamer via het ooggat van de katheter in het irrigatiezakje lopen en koppelt u vervolgens het zakje los. De resterende inhoud van het zakje kan worden weggegooid of worden gebruikt voor verdere downstream-toepassingen.
    4. Steriliseer de afvoerpoort van de katheter en de aansluitpoort van de afvalzak met 70% ethanol en sluit ze weer aan, waardoor een steriel, gesloten afvoersysteem wordt voltooid.
      OPMERKING: Ga verder met stap 7.2.7 als u irrigatiezakjes gebruikt.
    5. Als u een katheter met drie lumen gebruikt, desinfecteer dan de irrigatielumenpoort met 70% ethanol en begin onmiddellijk met irrigeren met een steriele spuit volgens de instructies van de fabrikant.
      NOTITIE: Meet het volume resterende urine in de afvalzak voordat u gaat irrigeren, zodat hiermee rekening kan worden gehouden bij eventuele stroomafwaartse blokkeringstijd of stroomsnelheidsberekeningen.
    6. Zodra de irrigatie is voltooid, gooit u de spuit en eventuele resterende irrigatieoplossing in de afvalzak weg.
    7. Neem een monster na de behandeling uit de centrale kamer van het in-vitroblaasmodel , zoals beschreven in stap 5, en hervat de AUM-stroom via de peristaltische pomp om het experiment voort te zetten.

8. Experimenten met in-vitroblaasmodellen beëindigen

OPMERKING: Urease-positieve organismen zoals P. mirabilis kunnen verstopping van urinekatheters veroorzaken via kristallijne biofilmvorming. Blokkade kan dus worden gebruikt als een biologisch relevant eindpunt voor in vitro blaasmodellen en wordt zichtbaar geïdentificeerd door volledige occlusie van katheterooggaten met kristallijne biofilms en een toename van het AUM-volume in de centrale kamer van de glazen "blaas" (Figuur 3).

  1. Zodra in-vitroblaasmodellen het vooraf bepaalde eindpunt hebben bereikt, wat een verstopping of een gedefinieerde looptijd kan zijn, schakelt u de AUM-stroom uit via de peristaltische pomp en neemt u een eindpuntmonster uit de centrale kamer zoals beschreven in stap 5.
  2. Schakel de waterbadstroom uit en koppel het mediacircuit en de slang van het waterbadcircuit los van in-vitroblaasmodellen .
  3. Verwijder de stoppen van in-vitroblaasmodellen en verwijder het volledige volume resterende urine met behulp van een serologische pipet. Gooi besmette media op de juiste manier weg (d.w.z. steriliseren in de autoclaaf).
  4. Laat de afvalzakken leeglopen en gooi het resterende medium weg. Koppel de katheterafvalzakken los van de katheterpoort en gooi ze weg.
  5. Gebruik een spuit om de katheterballonnen langzaam leeg te laten lopen voordat u de katheters van modellen verwijdert.
    OPMERKING: Bij gebruik van urease-positieve bacteriesoorten kunnen katheters "vast komen te zitten" aan de glazen wanden van in vitro modellen. Vermijd het uitoefenen van grote hoeveelheden kracht op katheters en ga in plaats daarvan verder met stap 8.6.
  6. Week in vitromodellen een nacht in een antimicrobiële reinigingsoplossing met 5% (zie materiaaltabel) en was vervolgens grondig met water om ervoor te zorgen dat eventueel achtergebleven desinfectiemiddel wordt verwijderd. Autoclaaf om te steriliseren.
    OPMERKING: Als u urease-positieve soorten gebruikt, voeg dan 5% w/v citroenzuur toe aan de desinfecterende oplossing om eventuele biomineralisatie in de centrale kamer op te lossen. Deze zure oplossing helpt ook bij het losmaken van katheters die aan de modellen vastzitten door kristallijne biofilmafzettingen af te breken.
  7. Koppel de slang van het mediacircuit los van het AUM-reservoir en gooi alle resterende media weg. Spoel de slang door met water om eventuele resterende AUM en autoclaaf te verwijderen.
  8. Om de exacte blokkeringstijd te berekenen, noteert u het uiteindelijke volume in de afvalzak en gebruikt u de vergelijking in stap 4.4 en het eerder berekende debiet om de tijd van verstopping te bepalen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een succesvolle werking van het in vitro blaasmodel is afhankelijk van het beoefenen van een goede aseptische techniek en zorgvuldige observatie van de troebelheid van de media tijdens het experimenteren (Figuur 3). Voorafgaand aan de inoculatie was de steriele AUM lichtgeel van kleur en transparant in de centrale kamer van het in vitro blaasmodel (Figuur 3A). De AUM in het mediareservoir moet tijdens het experiment helder blijven, aangezien eventuele veranderingen in de troebelheid die optreden kunnen duiden op neerslag van zouten uit oplossing of verontreiniging van media. Als de AUM in het mediareservoir of de slang van het mediacircuit troebel wordt of een drastische kleurverandering vertoont, moeten replicaties worden weggegooid en herhaald. Na inoculatie is een toename van de troebelheid van de AUM in de centrale kamer van het in-vitroblaasmodel duidelijk zichtbaar (Figuur 3B). Veranderingen in troebelheid zijn vaak meer uitgesproken in urease-positieve organismen zoals P. mirabilis, maar zouden na inoculatie nog steeds zichtbaar moeten zijn in urease-negatieve organismen. Nadat de AUM-stroom is gestart, wordt vaak een vermindering van de AUM-troebelheid waargenomen omdat planktoncellen worden weggespoeld, en dit duidt niet op een gebrek aan levensvatbare cellen in het model. Het observeren van het medianiveau in de centrale kamer kan ook worden gebruikt om de blokkeringstijd te bepalen bij gebruik van urease-positieve organismen (Figuur 3C). Terwijl modellen draaien, moeten het ooggat en de punt van de katheter volledig zichtbaar zijn om aan te geven dat de afvoer in de afvalzakken goed is. Bij blokkering zal het niveau van AUM in de centrale kamer boven de ooggaten en de tip van de katheter stijgen, wat aangeeft dat het experiment klaar is voor eventuele eindpuntmetingen en beëindiging. Tijdens experimenten kunnen drukeffecten in het in vitro mediacircuit van het blaasmodel ervoor zorgen dat modellen geblokkeerd lijken. Als een verstopping wordt vermoed, controleer dan of het AUM-circuit, de katheter en de slang van de afvalzak strak staan voordat u de test beëindigt, aangezien mogelijke luchtbellen of knikken in de slang "luchtsluizen" kunnen veroorzaken en voorkomen dat de katheter leegloopt.

Tijdens in vitro blaasmodelexperimenten kan planktonbemonstering waardevol inzicht verschaffen in de groeidynamiek binnen het model en de progressie van CAUTI. Celgroei, pH en biofilmvorming kunnen allemaal tijdens experimenten worden gevolgd zonder dat modellen hoeven te worden beëindigd (Figuur 4). Bij gebruik van urease-positieve organismen kunnen blokkadetijdberekeningen worden gebruikt als een maat voor de snelheid van biofilmvorming en worden gebruikt om de eigenschappen van verschillende bacteriestammen te vergelijken (Figuur 4). Vergelijking van een wild-type stam van P. mirabilis en een LPS-mutant (mini-tn5-insertie in waaC) toonde een verlenging van de tijd tot blokkering aan en dus verminderde biofilmvorming in de mutant (Figuur 4). Urease-negatieve organismen blokkeren doorgaans geen in-vitroblaasmodellen en daarom wordt aanbevolen om voorafgaand aan experimenten een bepaald eindpunt te bepalen. In sommige gevallen kunnen urease-negatieve organismen leiden tot verstopping van de katheter. Urease-negatieve stammen van Klebsiella pneumoniae kunnen bijvoorbeeld uitgebreide, slijmerige biofilms produceren, maar deze hebben doorgaans veel meer tijd nodig dan urease-positieve biofilms om de afvoer te blokkeren, dus een ingesteld eindpunt wordt nog steeds aanbevolen.

Meting van de pH tijdens experimenten met blaasmodellen kan ook inzicht geven in de verschillen tussen stam en stam, evenals de voortgang van CAUTI. Als urease-negatieve organismen worden gebruikt, zou de pH in de centrale kamer van het in vitro blaasmodel grotendeels stabiel moeten blijven tijdens het experiment, hoewel kleine schommelingen in de pH worden verwacht naarmate de populatiedynamiek in de loop van het experiment verandert. Inoculatie van in vitro modellen met urease-positieve organismen resulteert in een significante pH-verhoging in de loop van de tijd, waarbij de hoogste pH meestal wordt waargenomen op het moment van blokkering, waar pH-waarden tot ~8-9 kunnen worden waargenomen (Figuur 4B).

De telling van planktonische CFU/ml is een belangrijk onderdeel van in vitro blaasmodellering, waardoor operators kunnen beoordelen of de inoculatie succesvol is geweest en de voortgang van de experimenten kunnen volgen. Het meten van CFU/ml aan het einde van het experiment kan eventuele verschillen in blaaskolonisatie tussen verschillende bacteriestammen aan het licht brengen. Bij het vergelijken van de mini-Tn5 mutante stam van P. mirabilis met het wildtype, werd een significante vermindering van CFU/ml op het moment van blokkade waargenomen (Figuur 4C). Bovendien kan de telling van CFU's uit biofilms op het katheteroppervlak en de kwantificering van biofilmbiomassa inzicht geven in het vermogen van verschillende pathogenen om de gekatheteriseerde urinewegen te koloniseren. Kristalviolette kleuringen werden gebruikt om verschillen in biofilmvorming te bepalen tussen een wildtype P. mirabilis-stam HI4320 en isolaten die in chloorhexidine zijn gepasseerd (Figuur 5). Optische dichtheidsmetingen bij 595 nm toonden aan dat isolaten die in chloorhexidine werden gepasseerd, een vermindering van de biofilmvorming vertoonden in vergelijking met het wildtype en controles die werden gepasseerd in afwezigheid van chloorhexidine.

Aangezien het doel van het in vitro blaasmodel is om de CAUTI-niche nauwkeurig te repliceren, kunnen modellen ook worden gebruikt om de effecten te bestuderen van antimicrobiële therapieën die gericht zijn op de behandeling van CAUTI in een klinisch relevante omgeving. Voor urease-positieve organismen kan het vergelijken van de blokkadetijden van behandelde modellen met onbehandelde modellen nuttig inzicht geven in de effectiviteit van de behandeling. Behandeling van in vitro blaasmodellen die zijn geïnoculeerd met P. mirabilis met een 0,02% chloorhexidine blaasspoeloplossing verlengde de tijd tot verstopping aanzienlijk in vergelijking met modellen die onbehandeld bleven of behandeld waren met 0,9% zoutoplossing (Figuur 6A). Bovendien kan het in vitro blaasmodel worden gebruikt om de bacteriedodende activiteit van antimicrobiële therapieën te bestuderen. Het monitoren van veranderingen in CFU/ml van plankton- en biofilm-geassocieerde cellen na antimicrobiële behandeling kan aangeven of behandelingen effectief zijn. Behandeling van in vitro blaasmodellen die zijn geïnoculeerd met P. mirabilis toonde een vermindering van >7 log in planktonische CFU/ml onmiddellijk na de behandeling, vergeleken met onbehandelde en 0,9% zoutoplossing geïrrigeerde modellen wanneer toegepast volgens de instructies van de fabrikant (Figuur 6B).

figure-results-1
Figuur 1: Schema van de belangrijkste componenten van het in vitro blaasmodel. (A) Het blaasmodel (gesloten afvoersysteem): (1) dubbelwandige glazen kamer die de media-inlaat van de blaas simuleert, (2) AU wordt via een peristaltische pomp naar de binnenkamer van het blaasmodel gevoed (3) waterinlaat die via een circulerend waterbad naar de buitenkamer wordt gevoed (4) wateruitlaat (5) Foley-katheter, ingebracht in de binnenkamer (6) aansluitpunt voor drainlumen; Aansluitpunt voor afvalzak/irrigatiezakjes (7) Afvoerzak voor het opvangen van urineafvoer. (B) Schematisch voor de opstelling van het in-vitroblaasmodel en de richting van de stroming van media en water door het model. Kunstmatige urine wordt bij kamertemperatuur opgeslagen in een mediareservoir (1) en via een peristaltische pomp (2) aan het model geleverd met een constant debiet van ~ 0,75 ml min-1 voor de duur van het experiment. Het medium stroomt in de centrale kamer van het dubbelwandige glazen vat dat de blaas voorstelt (3) en mondt uit via het ooggat van een Foley-katheter (4) in een drainagezak (5), waardoor het steriele gesloten afvoersysteem wordt voltooid. Het in-vitroblaasmodel wordt op een constante temperatuur van 37 °C gehouden via een circulerend waterbad (6), dat door de buitenkamer van het dubbelwandige glazen vat stroomt. Stippellijnen staan voor siliconenslangen en pijlen voor de stroomrichting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Doorsnede van urinekatheters om biofilm-geassocieerde cellen te verwerken. Voorbeeldpunten op een urinekatheter voor dissectie voor stroomafwaartse kwantificering van biofilm. (A) Katheters worden eerst latitudinaal doorgesneden in het gebied van 8 cm proximaal van de punt/ooggaten (waar de meeste biofilmvorming wordt waargenomen). Secties van 1 cm worden verwijderd met een scalpel, waarbij over het algemeen het gebied waar de leeggelopen katheterballon zit, wordt vermeden vanwege problemen met de reproduceerbaarheid van de verwerking (1-3). (B) Nadat de katheters voor het eerst in stukken van 1 cm zijn gesneden, wordt er nog een longitudinale snede in het centrale lumen gemaakt om eventuele aanwezige biofilm bloot te leggen voor verdere kwantificering van de biofilm, d.w.z. CFU/ml-telling van kristalviolette kleuring. Stippellijnen geven dissectiepunten aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Stadia van een in vitro blaasmodelexperiment. Beelden van de centrale kamer van het in-vitroblaasmodel , in verschillende stadia van experimenten. (A) AUM in de centrale kamer van het in-vitroblaasmodel voorafgaand aan de inoculatie. De media in de centrale kamer zijn volledig transparant, wat wijst op een succesvolle sterilisatie, en de katheterpunt en ooggaten zijn zichtbaar boven de medialijn, wat aangeeft dat de katheter met succes leegloopt. (B) Media in de in vitro centrale kamer van het blaasmodel na inoculatie met P. mirabilis (4 uur na inoculatie). Succesvolle inoculatie wordt aangegeven door de verhoogde troebelheid van de media. De zichtbaarheid van de kathetertip en ooggaten geeft aan dat de AUM met succes door de katheter wordt gedraineerd en dat er geen verstopping is opgetreden. (C) Een voorbeeld van een geblokkeerd in vitro blaasmodel. Inoculatie met P. mirabilis en de daaropvolgende vorming en mineralisatie van biofilm hebben geleid tot verstopping van de ooggaten van de katheter, waardoor drainage wordt voorkomen en het niveau van de media in de centrale kamer boven de kathetertip stijgt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Eindpuntmetingen voor een in vitro blaasmodel lopen tot verstopping. Voorbeelden van eindpuntmetingen op het moment van blokkade van een in vitro blaasmodel dat is geïnoculeerd met een klinische stam van P. mirabilis, RS47 (WT), en een mutante stam met verzwakte biofilmvorming, RS47-2 (Mutant). (A) Blokkadetijd (h) van WT en mutante stammen van P. mirabilis. (B) pH van in vitro blaasmodellen op het moment van verstopping. (C) CFU/ml van planktoncellen in in vitro blaasmodelkamer op het moment van verstopping. Alle gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van vijf biologische replicaten. Foutbalken tonen de standaardfout van het gemiddelde (SEM). *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van Clarke et al.46. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Biofilm-geassocieerde celmetingen van het in vitro blaasmodel. Kwantificering van de biofilmvorming van P. mirabilis , waarbij wildtype stam HI4320 wordt vergeleken met aangepaste populaties die met of zonder chloorhexidine (CHD) zijn gepasseerd via kristalviolette kleuring en meting van optische dichtheid (OD) bij 595 nm. WT: P. mirabilis HI4320; 1, 3, 5: doorgangscontroles zonder blootstelling aan CHD; 2, 4, 6: HI4320 gepassageerd in 4 μg/ml CHD. Alle gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van vijf biologische replicaten. Foutbalken tonen SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Metingen van in vitro blaasmodellen na antimicrobiële behandeling. Planktonmonsters werden genomen van een in vitro blaasmodel dat was geënt met P. mirabilis, na irrigatie met een antimicrobiële oplossing van 0,02% chloorhexidine (100 ml) of een zoutoplossing van 0,9%. (A) Blokkeringstijd van in vitro blaasmodellen na irrigatie. (B) Planktonische CFU/ml onmiddellijk na irrigatiebehandeling. Alle gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van vijf biologische replicaten. Foutbalken tonen SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; *p ≤ 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gekatheteriseerde urinewegen vertegenwoordigen een complexe biologische niche die een uitdaging kan zijn om te repliceren in een laboratoriumomgeving. Het in-vitroblaasmodel is ontworpen om CAUTI te simuleren en maakt gebruik van standaard urinekatheters om het steriele, gesloten afvoersysteem te repliceren dat in de klinische praktijk wordt gebruikt. De gekatheteriseerde urinewegen zijn zeer vatbaar voor infecties, zoals blijkt uit het feit dat urinekatheters de grootste risicofactor zijn voor de ontwikkeling van CAUTI 6,55. Een zorgvuldige aseptische techniek is van cruciaal belang voor het succes van het uitvoeren van in-vitroblaasmodellen. Troebelheid van AUM is een duidelijke indicator van steriliteit, aangezien besmette of verlopen media na verloop van tijd troebel zullen worden, waardoor alle replicaten moeten worden weggegooid. Zorgvuldige aseptische techniek moet ook worden gebruikt bij het inoculeren en bemonsteren van het in-vitroblaasmodel, omdat het openen van de centrale kamer om het voorbereide inoculum toe te voegen het steriele, gesloten afvoersysteem verbreekt, waardoor het in-vitroblaasmodel vatbaar wordt voor besmetting. Om besmetting van de centrale kamer te voorkomen, kunnen katheters met drie lumen worden gebruikt om de planktoncelpopulatie te bemonsteren (door het afvallumen af te klemmen en af te tappen via het extra lumen). Enige uitspoeling wordt verwacht op het 4-uurs tijdstip, maar probleemoplossing kan nodig zijn als er op dit moment geen levensvatbare planktoncellen zijn opgesomd. Als er na 4 uur geen levensvatbare cellen zijn geteld, moet de gebruikte inoculumdichtheid of AUM-formulering mogelijk worden geoptimaliseerd om de bacteriële kolonisatie beter te ondersteunen. Bovendien kan het uitwassen van het inoculum duiden op een probleem met het mediacircuit; Knikken in de slang kunnen een adequate afvoer verhinderen, wat resulteert in de opbouw van giftige metabolieten die de bacteriegroei kunnen belemmeren, terwijl elk achtergebleven ontsmettingsmiddel dat wordt gebruikt om door mediaslangen te spoelen, een bacteriedodend effect kan hebben.

Dit protocol beschrijft de bereiding van AUM zoals eerder beschreven door Nzakizwanayo et al., zoals het eerder is gevalideerd voor gebruik in het in vitro blaasmodel met prominente CAUTI-pathogenen, waaronder Proteus mirabilis en Escherichia coli 43,45,46,48 . Er is echter ruimte om de AUM-formulering die in het protocol wordt gebruikt, aan te passen om te selecteren op de groei van andere pathogenen. Er zijn tal van diverse AUM-formuleringen gepubliceerd die in plaats daarvan kunnen worden gebruikt in het mediacircuit 28,56,57,58,59,60. Bovendien kan AUM in het mediareservoir worden aangevuld met voedingsstoffen of antibiotica om te selecteren op de groei van specifieke pathogenen. Historisch gezien werden in-vitroblaasmodellen ook voorzien van gepoolde menselijke urine, maar de grote hoeveelheden media die nodig zijn om een in-vitroblaasmodel te repliceren, kunnen het verzamelen van menselijke monsters onpraktisch maken53,54. Bovendien kan de samenstelling van menselijke urine sterk variëren tussen patiëntmonsters, wat de reproduceerbaarheid van het experiment beïnvloedt, aangezien is aangetoond dat verschillen in de concentratie van hormonen, zouten en eiwitten, evenals de hydratatiestatus, de bacteriegroei en biofilmvorming beïnvloeden 38,39,61,62.

Het bovenstaande protocol beschrijft de inoculatie van het in vitro blaasmodel met ~1010 CFU/ml die CAUTI in een laat stadium repliceert. De inoculatieplaats van het in vitro blaasmodel zou echter in toekomstige tests kunnen worden gewijzigd om de eerdere stadia van CAUTI beter te repliceren, d.w.z. initiële kolonisatie van de urinekatheter en ascensie in de blaas. Het handmatig besmetten van Foley-katheters met een bekend bacterieel inoculum voorafgaand aan het opzetten van in-vitromodellen zou inzicht kunnen geven in de vroege stadia van CAUTI. De inoculumdichtheid is inderdaad in eerder werk gewijzigd om infectie in een eerder stadium na te bootsen; bijvoorbeeld Nzakizwanayo et al. geïnoculeerde in vitro blaasmodellen met een lagere CFU/ml (ca. 103 CFU/ml) om infectie in een eerder stadium te repliceren47. Het is echter vermeldenswaard dat het wijzigen van de inoculumdichtheid kan leiden tot een langere tijd tot blokkering en aanvullende validatie vereist voorafgaand aan experimenten.

Bovendien, hoewel het protocol de inoculatie van het in vitro model met bacteriële monocultuur beschrijft, is er ruimte om modellen met schimmelpathogenen te inoculeren. Eerder werk heeft gesuggereerd dat tot 8% van de CAUTI's het gevolg is van infectie met Candida spp., die in staat zijn om biofilms te produceren die vaak recalcitrant zijn voor antischimmelbehandeling27,63. Bovendien kan het in vitro blaasmodel worden aangepast om de studie van polymicrobiële CAUTI mogelijk te maken. Er is inderdaad gesuggereerd dat tot 86% van de CAUTI's polymicrobieel zijn, en deze infecties gaan vaak gepaard met ernstigere symptomen en een hoger sterftecijfer dan infecties met monospecies 27,64,65,69. In vitro modellen kunnen worden geënt met meerdere soorten om de vorming van polymicrobiële biofilms en de progressie van CAUTI te bestuderen, maar zorgvuldige validatie van polymicrobiële gemeenschappen en wijziging van de inoculumdichtheid moeten worden uitgevoerd voorafgaand aan inoculatie. Eerdere studies hebben het in vitro blaasmodel gebruikt om verschillen in biofilmvorming in enkele soorten P. mirabilis CAUTI te monitoren in vergelijking met dubbele soorten CAUTI met E. faecalis, waarbij het metabolische samenspel tussen de stammen werd benadrukt, wat resulteerde in verbeterde biofilmvorming in vergelijking met infectie met één soort70.

Een groot voordeel van het gebruik van het in vitro blaasmodel om CAUTI te bestuderen, is de mogelijkheid om biofilmvorming op het oppervlak van een standaard urinekatheter te observeren. De vorming van biofilms in CAUTI wordt vaak geïnitieerd door de vorming van conditioneringsfilms op het katheterlumen, bestaande uit organische componenten van urine waaraan uropathogenen zich kunnen hechten, voordat ze zich vermenigvuldigen en rijpe biofilms vormen 2,18,71,72,73. Standaardtesten die worden gebruikt om de vorming van biofilm te bestuderen, maken vaak gebruik van standaard bacteriegroeimedia in plaats van AUM en zijn vaak gebaseerd op hechting aan polystyreenmicroplaten of pinnen, d.w.z. het Calgary-apparaat; eerder werk heeft echter gesuggereerd dat de nutriëntenomgeving, pH en zuurstofniveaus van het systeem, evenals fysische eigenschappen zoals stroming en verschil in oppervlaktestructuur (siliconen versus kunststoffen), de vorming van biofilm kunnen beïnvloeden 36,37,74,75,76,77,78. Bovendien kan het kweken van bacteriën met uitgebreide urease-activiteit, zoals P. mirabilis in een gesloten systeem in AUM, resulteren in de opbouw van toxische metabolieten, wat kan leiden tot celdood78,79. Dit wordt verzacht in het in vitro blaasmodel, aangezien de AUM in de centrale kamer voortdurend wordt vervangen door verse media via het mediacircuit, waardoor de studie van CAUTI-biofilms onder meer klinisch relevante omstandigheden mogelijk is45. De dagelijkse werking van het in vitro blaasmodel en het eindpunt dat voor de modellen wordt geselecteerd, hangt grotendeels af van het feit of de modellen worden geïnoculeerd met urease-positieve of negatieve organismen. Theoretisch zouden in-vitromodellen voor onbepaalde tijd kunnen werken als ze worden voorzien van een voldoende hoeveelheid AUM en als de steriliteit van het model behouden blijft; Het wordt echter aanbevolen om voorafgaand aan het experimenteren een eindpunt te selecteren, of dat nu een blokkade is of een willekeurig aantal dagen. Over het algemeen wordt aanbevolen om in-vitromodellen die zijn geïnoculeerd met urease-negatieve organismen gedurende ≤7 dagen te laten draaien om de klinische omgeving te simuleren, aangezien dit doorgaans voldoende is om de vorming van biofilm in de meeste organismen waar te nemen, terwijl dit in overeenstemming blijft met klinische interventies, aangezien standaard beste praktijken aangeven dat katheters moeten worden vervangen zodra ze zichtbaar geïnfecteerd zijn 1,2, 3,47,48. Hoewel urease-positieve organismen waarschijnlijk kristallijne biofilms produceren, is er veel variatie binnen urease-positieve stammen in de tijd tot in vitro blaasmodelblokkade, waarbij sommige stammen van Proteus mirabilis katheterblokkering veroorzaken in minder dan 10 uur, en andere meer dan 30 uur nodig hebben om39,46 te blokkeren. Voorafgaand aan in-vitro-experimenten met blaasmodellen kan een standaard ureasetest worden gebruikt om te bepalen of modellen moeten worden uitgevoerd op blokkering of op een vooraf gedefinieerd eindpunt80.

Misschien wel de belangrijkste beperking van het gebruik van het in vitro blaasmodel om de vorming van biofilm te bestuderen, is dat biofilmmetingen een eindpunt zijn, omdat ze de verwijdering en dissectie van de urinekatheter noodzakelijk maken. Omgekeerd kunnen planktonmonsters op elk moment tijdens het experimenteren uit het in-vitroblaasmodel worden genomen. Zodra biofilmmonsters zijn genomen van de in vitro blaasmodellen, kunnen bovendien tal van extra stroomafwaartse technieken worden gebruikt om de biofilmproductie beter te kwantificeren. Eerdere studies hebben vlamfotometrie gebruikt om de hoeveelheid calcium en magnesium in kristallijne biofilms te kwantificeren, en complexere kleuringen kunnen worden gebruikt om componenten van de EPS-matrix van urease-negatieve biofilms 45,73,81,82,83,84 nauwkeurig te identificeren.

Dit werk beschrijft ook de toepassing van het in vitro blaasmodel om de effecten te bestuderen van therapieën gericht op de behandeling van CAUTI. Het in vitro blaasmodel simuleert belangrijke aspecten van de CAUTI-niche, zoals het gebruik van AUM, evenals klinisch relevante biofilmvorming en verhoogde organische belasting die wordt waargenomen in CAUTI. Therapieën zoals antibiotica kunnen rechtstreeks aan de AUM-tank worden toegevoegd om de klinisch relevante biologische beschikbaarheid van geneesmiddelen te simuleren, en eerdere studies hebben hergebruikte geneesmiddelen zoals thioridazine en fluoxetine gebruikt om een antibiofilmeffect aan te tonen81. Bovendien worden tests met minimale remmende concentratie en bacteriële suspensietests vaak gebruikt om de antimicrobiële activiteit van biociden af te leiden, hoewel er weinig bewijs is dat suggereert dat tests correleren met gevoeligheid voor biociden in de echte wereld 41,85,86,87,88. Het in-vitroblaasmodel is gunstig voor het testen van biociden die gericht zijn op het behandelen of voorkomen van CAUTI, aangezien de aanwezigheid van de urinekatheter en de meer representatieve simulatie van de CAUTI-niche betekenen dat producten zoals antimicrobiële glijgels en irrigatieoplossingen kunnen worden getest volgens de instructies van de fabrikant. Eerdere studies hebben ook het in vitro blaasmodel gebruikt om de effectiviteit van faagtherapie te bepalen, en hebben aangetoond dat faagbehandeling de tijd van P. mirabilis kan verlengen om het in vitro blaasmodel met meer dan 100 uur47 te blokkeren. Het gebruik van een Foley-katheter van standaardformaat in het in-vitroblaasmodel betekent ook dat nieuwe, gecoate katheters kunnen worden getest op antimicrobiële activiteit. Eerder werk van Slate et al. toonde aan dat katheters gecoat met een theranostische ciprofloxacine-coating de tijd van P. mirabilis tot verstopping met ~60 uur konden verlengen in een in vitro blaasmodel48. Dit benadrukt de potentiële toepassing van het in vitro blaasmodel in de studie van nieuwe therapieën gericht op de behandeling van CAUTI, waardoor een nauwkeurigere beoordeling van antimicrobiële middelen in een biologisch relevante gesimuleerde CAUTI-niche mogelijk wordt.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Dr. Jonathan Nzakizwanayo en Dr. Anthony J. Slate voor hun gedeelde expertise bij het ontwikkelen van dit protocol. Het werk aan de Universiteit van Bath werd gefinancierd door The Medical Research Council GW4 Biomed DTP als studentschap van V.B. (MR/N0137941/1). B. V. J. wordt ook ondersteund door financiering van de Dunhill Medical Trust (RPGF1906\171). Onderzoek door O.E.C. werd gefinancierd door Kidney Research Northwest (RCN: 1144798). Figuur 1 is gemaakt met Biorender.com.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
313 Rapid-Load Pumphead ExtensionWatson-Marlow313Peristaltische pomp - extra pompkopverlenging 
323S/D handmatige snelheidsregelingWatson-Marlow323S/DPeristaltische pomp
3L Bed bags, steriele met hefboomkraan Great Bear Healthcare GDW173
3mm binnendiameter platina genezen siliconen slangFisher10111801Kleine AUM circuit slang (verbind pompslang naar modellen)
5mm binnendiameter platina genezen siliconen slangFisher10539201Medium AUM circuit slang (verbind pompslang naar AUM reservoir)
ammoniumchloride (NH4Cl)Fisher11473713
watervrij natriumsulfaat (Na2SO4)Fisher11498717
Azlon Taper connector Fisher10712807Gebruikt om verschillende lengtes slang in AUM circuit te verbinden
Bed bag hangers Great Bear Healthcare 10705P
Bochem pinch cock tube klemmen, 25 mm diameterFisher11805101
calciumchloride (CaCl2)Fisher10021681
Citroenzuur monohydraat MerckC1909-500GGebruikt om kristallijne biofilm uit modellen na experimenten te verwijderen 
Fisherbrand Glas Gegradueerde Klasse B Type 1 PipettenFisher11992168Gebruikt om in vitro blaasmodellen te voorzien van AUM via een doorboord prop
gelatineVWR24360.233
Graphpad prism 10GraphPadV10.0Analytische software gebruikt voor het weergeven van in vitro blaasmodenresultaten en statistische analyse. 
Hanna HI 2211-02 pH benchtop meterPhillip Harris PP00057414
In vitro blaasmoden --Beschikbare apparatuur zoals eerder beschreven door Nzakizwanayo et al. (2019).
Instillagel 6 mL smeergelmydoctorshop.co.uk40-006Smeergels gebruikt in sectie 7.1.; andere leveranciers zijn beschikbaar.
Kartell Plastilab Ongelijke Taper connectorFisher 11914289Gebruikt om slangen van verschillende diameters te verbinden
MacConkey agar zonder zout (gedehydrateerd)Fisher10472643Voor de telling van enkele kolonies van zwermbacteriën d.w.z. Proteus mirabilis
magnesiumchloride hexahydraat (MgCl2.6H2O)Fisher10386743
monokaliumfosfaat (KH2PO4)Fisher10573181
Nalgene Y-vormige connectorFisher10186070Gebruikt om meerdere AUM circuits vanuit een AUM reservoir te laten lopen (1-4 modellen per tank) 
kaliumchloride (KCl)Fisher10375810
Pyrex Aspirator fles met gegrond glas zijde sleuf, capaciteit: 5000 mLFisher11347884AUM reservoir
Rubber Stoppers Met een Boor, Buitendiameter: 37mm, Rood, Diameter: 37mmFisher11517612Gebruikt in AUM reservoir en om in vitro modellen te voorzien van AUM
Size 14 French 100% silicone Foley katheter met steriele spuit water voor opblazing Great Bear Healthcare 4833-0514
natriumchloride (NaCl)Fisher10735921
natriumoxalaat (Na2C2O4)Fisher10442211
Teknon Biocleanse concentraat biocide reiniger 5L Fisher12447580Gebruikt om modellen na experimenten te steriliseren
trinatriumcitraat (Na3C6H5O7)Fisher11434993
trypton sojabroodFisher10198002
ureum (CH4N2O)Fisher10404185
Uro-Tainer M NaCl 0,9%B.BraunFB99833Salinairblaas irrigatie pouch gebruikt in sectie 7.2. 
Watson-Marlow Pumpsil 1.6mm binnendiameter platina genezen siliconen slangFisher12406280Dikke AUM circuit slang (voor gebruik in perstaltische pomp)
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, D. R., et al. Epidemiology and health-economic burden of urinary-catheter-associated infection in English NHS hospitals: A probabilistic modelling study. J Hosp Infect. 103 (1), 44-54 (2019).
  2. Stickler, D. J. Bacterial biofilms in patients with indwelling urinary catheters. Nat Clin Pract Urol. 5 (11), 598-608 (2008).
  3. Feneley, R. C., Hopley, I. B., Wells, P. N. Urinary catheters: History, current status, adverse events and research agenda. J Med Eng Technol. 39 (8), 459-470 (2015).
  4. Lapides, J., Diokno, A. C., Silber, S. J., Lowe, B. S. Clean, intermittent self-catheterization in the treatment of urinary tract disease. J Urol. 107 (3), 458-461 (1972).
  5. Suetens, C., et al. Prevalence of healthcare-associated infections, estimated incidence and composite antimicrobial resistance index in acute care hospitals and long-term care facilities: Results from two European point prevalence surveys, 2016 to 2017. Euro Surveill. 23 (46), 1800516(2018).
  6. Nicolle, L. E. Catheter associated urinary tract infections. Antimicrob Resist Infect Control. 3, 23(2014).
  7. Jacobsen, S. M., Stickler, D. J., Mobley, H. L., Shirtliff, M. E. Complicated catheter-associated urinary tract infections due to Escherichia coli and Proteus mirabilis. Clinical Microbiol Rev. 21 (1), 26-59 (2008).
  8. Trautner, B. W., Darouiche, R. O. Role of biofilm in catheter-associated urinary tract infection. Am J Infect Control. 32 (3), 177-183 (2004).
  9. Garibaldi, R. A., Burke, J. P., Dickman, M. L., Smith, C. B. Factors predisposing to bacteriuria during indwelling urethral catheterization. N Engl J Med. 291 (5), 215-219 (1974).
  10. Warren, J. W., et al. Fever, bacteremia, and death as complications of bacteriuria in women with long-term urethral catheters. JInfect Dis. 155 (6), 1151-1158 (1987).
  11. Walker, J. N., et al. High-resolution imaging reveals microbial biofilms on patient urinary catheters despite antibiotic administration. World JUrol. 38 (9), 2237-2245 (2020).
  12. Chant, C., Smith, O. M., Marshall, J. C., Friedrich, J. O. Relationship of catheter-associated urinary tract infection to mortality and length of stay in critically ill patients: A systematic review and meta-analysis of observational studies. Crit Care Med. 39 (5), 1167-1173 (2011).
  13. Clarke, K., et al. Catheter-associated urinary tract infections in adults: Diagnosis, treatment, and prevention. J Hosp Med. 15 (9), 552-556 (2020).
  14. Tambyah, P. A., Maki, D. G. The relationship between pyuria and infection in patients with indwelling urinary catheters: A prospective study of 761 patients. Arch Intern Med. 160 (5), 673-677 (2000).
  15. Flemming, H. C., et al. Biofilms: An emergent form of bacterial life. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 563-575 (2016).
  16. Stewart, P. S., Costerton, J. W. Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. Lancet. 358 (9276), 135-138 (2001).
  17. Stewart, P. S. Mechanisms of antibiotic resistance in bacterial biofilms. Int J Med Microbiol. 292 (2), 107-113 (2002).
  18. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  19. Sabir, N., et al. Bacterial biofilm-based catheter-associated urinary tract infections: Causative pathogens and antibiotic resistance. Am JInfect Control. 45 (10), 1101-1105 (2017).
  20. Touzel, R., Sutton, J., Wand, M. Establishment of a multi-species biofilm model to evaluate chlorhexidine efficacy. JHosp Infect. 92 (2), 154-160 (2016).
  21. Luo, Y., Yang, Q., Zhang, D., Yan, W. Mechanisms and control strategies of antibiotic resistance in pathological biofilms. J Microbiol Biotechnol. 31 (1), 1-7 (2021).
  22. Dincer, S., Uslu, F. M., Delik, A. Antibiotic resistance in biofilm. Bacterial biofilms. , IntechOpen. (2020).
  23. Soto, S. M. Importance of biofilms in urinary tract infections: New therapeutic approaches. Adv Biol. 2014 (1), 543974(2014).
  24. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends Microbiol. 13 (1), 34-40 (2005).
  25. Otto, S. B., et al. Privatization of biofilm matrix in structurally heterogeneous biofilms. MSystems. 5 (4), e00425-e00520 (2020).
  26. Wood, T. K., Knabel, S. J., Kwan, B. W. Bacterial persister cell formation and dormancy. Appl Environ Microbiol. 79 (23), 7116-7121 (2013).
  27. Gaston, J. R., Johnson, A. O., Bair, K. L., White, A. N., Armbruster, C. E. Polymicrobial interactions in the urinary tract: Is the enemy of my enemy my friend. InfectImmun. 89 (4), (2021).
  28. Griffith, D. P., Musher, D. Á, Itin, C. Urease. The primary cause of infection-induced urinary stones. Invest Urol. 13 (5), 346-350 (1976).
  29. Armbruster, C. E., Mobley, H. L. T., Pearson, M. M. Pathogenesis of Proteus mirabilis infection. EcoSal Plus. 8 (1), 1128(2018).
  30. Jacobsen, S. M., Shirtliff, M. E. Proteus mirabilis biofilms and catheter-associated urinary tract infections. Virulence. 2 (5), 460-465 (2011).
  31. Mobley, H. L., Warren, J. W. Urease-positive bacteriuria and obstruction of long-term urinary catheters. J Clin Microbiol. 25 (11), 2216-2217 (1987).
  32. Wasfi, R., Hamed, S. M., Amer, M. A., Fahmy, L. I. Proteus mirabilis biofilm: Development and therapeutic strategies. Front Cell Infect Microbiol. 10 (414), (2020).
  33. Broomfield, R. J., Morgan, S. D., Khan, A., Stickler, D. J. Crystalline bacterial biofilm formation on urinary catheters by urease-producing urinary tract pathogens: A simple method of control. J Med Microbiol. 58 (10), 1367-1375 (2009).
  34. Stickler, D. J. Clinical complications of urinary catheters caused by crystalline biofilms: Something needs to be done. J Intern Med. 276 (2), 120-129 (2014).
  35. Coffey, B. M., Anderson, G. G. Biofilm formation in the 96-well microtiter plate. Pseudomonas methods and protocols. , 631-641 (2014).
  36. Ceri, H., et al. The Calgary biofilm device: New technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clin Microbiol. 37 (6), 1771-1776 (1999).
  37. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J Microbiol Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  38. Bouatra, S., et al. The human urine metabolome. PloS one. 8 (9), e73076(2013).
  39. Holling, N., et al. Elucidating the genetic basis of crystalline biofilm formation in Proteus mirabilis. Infect Immun. 82 (4), 1616-1626 (2014).
  40. Lawrence, E., Turner, I. Materials for urinary catheters: A review of their history and development in the UK. Med Eng Phys. 27 (6), 443-453 (2005).
  41. Stickler, D. J. Chlorhexidine resistance in Proteus mirabilis. J Clin Pathol. 27 (4), 284-287 (1974).
  42. Fraise, A. P. Biocide abuse and antimicrobial resistance-a cause for concern. J Antimicrob Chemother. 49 (1), 11-12 (2002).
  43. Pelling, H., et al. Derepression of the smvA efflux system arises in clinical isolates of proteus mirabilis and reduces susceptibility to chlorhexidine and other biocides. Antimicrob Agents Chemother. 63 (12), e01535(2019).
  44. Stickler, D. J., Morris, N. S., Winters, C. Simple physical model to study formation and physiology of biofilms on urethral catheters. MethodsEnzymol. 310, 494-501 (1999).
  45. Nzakizwanayo, J., Pelling, H., Milo, S., Jones, B. V. An in vitro bladder model for studying catheter-associated urinary tract infection and associated analysis of biofilms. Proteus mirabilis: Methods and Protocols. , 139-158 (2019).
  46. Clarke, O. E., et al. Lipopolysaccharide structure modulates cationic biocide susceptibility and crystalline biofilm formation in Proteus mirabilis. Front Microbiol. 14, 1150625(2023).
  47. Nzakizwanayo, J., et al. Bacteriophage can prevent encrustation and blockage of urinary catheters by proteus mirabilis. Antimicrob Agents Chemother. 60 (3), 1530-1536 (2015).
  48. Slate, A. J., et al. Infection-responsive coatings to reduce biofilm formation and encrustation of urinary catheters. J Appl Microbiol. 134 (6), lxad121(2023).
  49. Maierl, M., Jörger, M., Rosker, P., Reisner, A. In vitro dynamic model of a catheterized bladder and biofilm assay. Bio Protoc. 5 (2), e1381(2015).
  50. Stickler, D., Clayton, C., Chawla, J. The resistance of urinary tract pathogens to chlorhexidine bladder washouts. J Hosp Infect. 10 (1), 28-39 (1987).
  51. King, J., Stickler, D. An assessment of antiseptic bladder washout solutions using a physical model of the catheterized bladder. J Hosp Infect. 18 (3), 179-190 (1991).
  52. King, J., Stickler, D. The effect of repeated instillations of antiseptics on catheter-associated urinary tract infections: A study in a physical model of the catheterized bladder. Urol Res. 20, 403-407 (1992).
  53. Morris, N., Stickler, D. Encrustation of indwelling urethral catheters by Proteus mirabilis biofilms growing in human urine. J Hosp Infect. 39 (3), 227-234 (1998).
  54. Stickler, D., Morgan, S. Observations on the development of the crystalline bacterial biofilms that encrust and block foley catheters. J Hosp Infect. 69 (4), 350-360 (2008).
  55. Stamm, W. E. Catheter-associated urinary tract infections: Epidemiology, pathogenesis, and prevention. Am J Med. 91 (3, Supplement 2), S65-S71 (1991).
  56. Sarigul, N., Korkmaz, F., Kurultak, I. A new artificial urine protocol to better imitate human urine. Sci Rep. 9 (1), 20159(2019).
  57. Brooks, T., Keevil, C. A simple artificial urine for the growth of urinary pathogens. Lett Appl Microbiol. 24 (3), 203-206 (1997).
  58. Ipe, D. S., Horton, E., Ulett, G. C. The basics of bacteriuria: Strategies of microbes for persistence in urine. Front CellI Infect Microbiol. 6 (14), 3389(2016).
  59. Ipe, D. S., Ulett, G. C. Evaluation of the in vitro growth of urinary tract infection-causing gram-negative and gram-positive bacteria in a proposed synthetic human urine (SHU) medium. J Microbioll Methods. 127, 164-171 (2016).
  60. Chutipongtanate, S., Thongboonkerd, V. Systematic comparisons of artificial urine formulas for in vitro cellular study. Anal Biochem. 402 (1), 110-112 (2010).
  61. Saude, E. J., Adamko, D., Rowe, B. H., Marrie, T., Sykes, B. D. Variation of metabolites in normal human urine. Metabolomics. 3, 439-451 (2007).
  62. Andersen, S., et al. Proteomes of uropathogenic Escherichia coli growing in human urine and in j82 urinary bladder cells. Proteomes. 10 (2), 15(2022).
  63. Uppuluri, P., Dinakaran, H., Thomas, D. P., Chaturvedi, A. K., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of Candida albicans biofilms grown in a synthetic urine medium. J Clin Microbiol. 47 (12), 4078-4083 (2009).
  64. Gaston, J. R., et al. Enterococcus faecalis polymicrobial interactions facilitate biofilm formation, antibiotic recalcitrance, and persistent colonization of the catheterized urinary tract. Pathogens. 9 (10), 835(2020).
  65. Warren, J. W., Tenney, J. H., Hoopes, J. M., Muncie, H. L., Anthony, W. C. A prospective microbiologic study of bacteriuria in patients with chronic indwelling urethral catheters. The JI Infect Dis. 146 (6), 719-723 (1982).
  66. Armbruster, C. E., et al. Genome-wide transposon mutagenesis of Proteus mirabilis: Essential genes, fitness factors for catheter-associated urinary tract infection, and the impact of polymicrobial infection on fitness requirements. PLoS Pathog. 13 (6), e1006434(2017).
  67. Armbruster, C. E., et al. The pathogenic potential of Proteus mirabilis is enhanced by other uropathogens during polymicrobial urinary tract infection. Infect Immun. 85 (2), e00808(2017).
  68. Siegman-Igra, Y., Kulka, T., Schwartz, D., Konforti, N. Polymicrobial and monomicrobial bacteraemic urinary tract infection. J Hosp Infect. 28 (1), 49-56 (1994).
  69. Nye, T. M., et al. Microbial co-occurrences on catheters from long-term catheterized patients. Nat Commun. 15 (1), 61(2024).
  70. Hunt, B. C., et al. Metabolic interplay between Proteus mirabilis and Enterococcus faecalis facilitates polymicrobial biofilm formation and invasive disease. mBio. 15, e02164(2024).
  71. Stickler, D., Ganderton, L., King, J., Nettleton, J., Winters, C. Proteus mirabilis biofilms and the encrustation of urethral catheters. Urol Res. 21, 407-411 (1993).
  72. Donlan, R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  73. Habash, M., Reid, G. Microbial biofilms: Their development and significance for medical device-related infections. J Clin Pharmacol. 39 (9), 887-898 (1999).
  74. Ommen, P., Zobek, N., Meyer, R. L. Quantification of biofilm biomass by staining: Non-toxic safranin can replace the popular crystal violet. J Microbiol Methods. 141, 87-89 (2017).
  75. Wilson, C., et al. Quantitative and qualitative assessment methods for biofilm growth: A mini-review. Research and Reviews: J Eng Technol. 6 (4), 30214915(2017).
  76. Niebergall, A. K., et al. Influence of polymerized siloxane coating on growth and biofilm formation of aerobic grown nosocomial bacteria. J Cell Biotechnol. 3 (2), 107-115 (2018).
  77. Ionescu, A., Brambilla, E., Sighinolfi, M. C., Mattina, R. A new urinary catheter design reduces in vitro biofilm formation by influencing hydrodynamics. J Hosp Infect. 114, 153-162 (2021).
  78. Pelling, H., et al. Bacterial biofilm formation on indwelling urethral catheters. Lett Appl Microbiol. 68 (4), 277-293 (2019).
  79. Schaffer, J. N., Pearson, M. M. Proteus mirabilis and urinary tract infections. Microbiol Spectr. 3 (5), 1128(2015).
  80. Konieczna, I., et al. Bacterial urease and its role in long-lasting human diseases. Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 789-806 (2012).
  81. Nzakizwanayo, J., et al. Fluoxetine and thioridazine inhibit efflux and attenuate crystalline biofilm formation by Proteus mirabilis. Sci Rep. 7 (1), 12222(2017).
  82. Strathmann, M., Wingender, J., Flemming, H. C. Application of fluorescently labeled lectins for the visualization and biochemical characterization of polysaccharides in biofilms of Pseudomonas aeruginosa. J Microbiol Methods. 50 (3), 237-248 (2002).
  83. Van Den Driessche, F., Rigole, P., Brackman, G., Coenye, T. Optimization of resazurin-based viability staining for quantification of microbial biofilms. J Microbiol Methods. 98, 31-34 (2014).
  84. Trafny, E. A., Lewandowski, R., Zawistowska-Marciniak, I., Stępińska, M. Use of MTT assay for determination of the biofilm formation capacity of microorganisms in metalworking fluids. World J Microbiol Biotechnol. 29, 1635-1643 (2013).
  85. Chapman, J. S. Biocide resistance mechanisms. Int Biodeterior Biodegrad. 51 (2), 133-138 (2003).
  86. Cloete, T. E. Resistance mechanisms of bacteria to antimicrobial compounds. Int Biodeterior Biodegrad. 51 (4), 277-282 (2003).
  87. Maillard, J. Y. Resistance of bacteria to biocides. Microbiol Spectr. 6 (2), 1128(2018).
  88. Maillard, J. Y. Bacterial resistance to biocides in the healthcare environment: Should it be of genuine concern. J Hosp Infect. 65, 60-72 (2007).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Biofilmvormingurinekathetersantimicrobi le resistentieFoley katheterkatheterobstructiecolony forming unitskristalvioletkleuringchloorhexidinespoeling

Gerelateerde artikelen