Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Identificatie van microglia en perifere infiltrerende macrofagen in het beschadigde ruggenmerg met behulp van flowcytometrie

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67967

⸱

24 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Laboratory Medicine, Bengbu Medical University, 3Anhui Province Key Laboratory of Immunology in Chronic Diseases, Bengbu Medical University, 4The Second Affiliated Hospital of South China University, 5Anhui Province Key Laboratory of Basic and Translational Research of Inflammation-related Diseases, Bengbu Medical University

In dit artikel

Samenvatting

Het identificeren van microglia (MG) en perifere infiltrerende macrofagen (Mø) in beschadigde ruggenmerg is moeilijk. In dit protocol werd flowcytometrie (FCM) gebruikt om respectievelijk M1-achtige MG, M2-achtige MG, M1-achtige Mø en M2-achtige Mø te identificeren. Deze technologie kan ook worden toegepast op andere ziekten van het centrale zenuwstelsel om de rol van MG en Mø te begrijpen.

Samenvatting

In een gezond ruggenmerg zijn perifere infiltrerende macrofagen bijna niet detecteerbaar, en microglia (MG) nemen deel aan het handhaven van de stabiliteit van de micro-omgeving van het ruggenmerg door fagocytose, het opruimen van cellulair puin en het produceren van neurotrofe factoren. Na een dwarslaesie (SCI) wordt MG geactiveerd en infiltreren perifere immuuncellen in het beschadigde ruggenmerg. Van deze immuuncellen spelen geactiveerde MG en perifere infiltrerende macrofagen (Mø) een cruciale rol in het pathologische proces van dwarslaesie. Deze cellen kunnen worden onderscheiden in pro-inflammatoire (M1-achtige) en ontstekingsremmende (M2-achtige) fenotypes; Het is echter een uitdaging om ze te onderscheiden vanwege hun gelijkenis in morfologie en veel cellulaire markers. Flowcytometrie (FCM), een veelgebruikte techniek op biomedisch gebied, kan tegelijkertijd meerdere cellulaire parameters detecteren, zoals celgrootte, deeltjesgrootte, celoppervlak en intracellulaire markers in één enkel experiment. Na jarenlang onderzoek werd geprobeerd FCM te identificeren en werd het continu geoptimaliseerd om uiteindelijk een stabiele detectiemethode te ontwikkelen. Deze methode maakt de identificatie van M1/M2-achtige MG en M1/M2-achtige Mø na SCI mogelijk door de expressieprofielen van CD45, CD11b, CD68, CCR7 en andere markers te detecteren. In dit protocol kunnen CD11b+CD45−/lageCD68+CCR7+, CD11b+CD45−/lageCD68+CCR7-, CD11b+CD45hogeCD68+CCR7+ en CD11b+CD45hogeCD68+CCR7-cellen worden geïdentificeerd als respectievelijk M1-achtige MG, M2-achtige MG, M1-achtige Mø en M2-achtige Mø.

Inleiding

Ruggenmergletsel (SCI) is het gevolg van schade aan het ruggenmerg die om verschillende redenen wordt veroorzaakt. SCI heeft een hoge mate van invaliditeit en momenteel zijn er geen effectieve behandelingsopties, waardoor het een van de ernstigste volksgezondheidsproblemen ter wereld is 1,2. Het pathofysiologische proces van SCI is complex en is verdeeld in twee fasen. Aanvankelijk veroorzaakt mechanisch trauma van het letsel onmiddellijk acute cellulaire disfunctie en celdood. Vervolgens leidt secundaire schade tot verdere cellulaire disfunctie en celdood gedurende dagen, weken of zelfs maanden. Binnen de secundaire verwondingsmechanismen is bewezen dat ontsteking een belangrijke bepalende factor is voor de ernst van secundaire schade, die uiteindelijk de celdood en celfunctionaliteit dicteert3. De kenmerken van ontstekingsreacties zijn de infiltratie en activering van ontstekingscellen in het beschadigde ruggenmerg, wat leidt tot een toename van ontstekingscellen en ontstekingsfactoren, het creëren van een inflammatoire micro-omgeving en uiteindelijk het veroorzaken van disfunctie van het ruggenmerg4.

Microglia in het centrale zenuwstelsel (CZS) en perifere infiltrerende macrofagen spelen een cruciale rol in de ontstekingsreactie na ruggenmergletsel (SCI)5,6. Als residente macrofagen van het CZS vormen microglia 5%-10% van de CZS-cellen en zijn ze essentieel voor het herstel van SCI 7,8. Microglia kunnen na SCI celresten opslokken en verwijderen, waardoor de vorming van genezende littekens wordt bemiddeld 9,10. Overmatige activering van microglia kan echter leiden tot een aanhoudende ontstekingsreactie en de vorming van glialittekens bevorderen, die axonale regeneratie belemmeren11. Na SCI vertonen geactiveerde microglia voornamelijk twee fenotypes: M1-achtig en M2-achtig 12,13. Het M1-achtige fenotype is pro-inflammatoir en bevordert de synthese van ontstekingsfactoren die bijdragen aan celapoptose en secundair letsel. M1-achtige microglia hebben ook neurotoxische effecten, verergeren letsel en neuronale apoptose14,15. Het M2-achtige fenotype daarentegen heeft ontstekingsremmende eigenschappen en bevordert angiogenese, remyelinisatie, axonale groei en weefselherstel16,17. M2-achtige microglia spelen een cruciale rol bij het moduleren van ontstekings- en herstelprocessen.

Perifere macrofagen infiltreren in de laesieplaats na SCI via beschadigde bloed-ruggenmergbarrières en vasculatuur17,18, waardoor de ontstekingsreactie, fagocytose, littekenvorming en regeneratie van neuraal weefsel verder worden gereguleerd19,20. Perifere infiltrerende macrofagen kunnen de ontstekingsreactie na dwarslaesie verminderen, fagocytose weefselresten21, neurale regeneratie en matrixremodellering bevorderen. Een aanhoudende ontstekingsreactie gemedieerd door perifere infiltrerende macrofagen kan echter leiden tot secundair letsel, wat schadelijk is voor herstel op lange termijn22,23. M1-achtige perifere infiltrerende macrofagen hebben sterke fagocytische en antigeenpresenterende eigenschappen, die in staat zijn necrotische cellen op te ruimen24. Hun overmatige afscheiding van pro-inflammatoire cytokines, reactieve zuurstofsoorten (ROS) en reactieve stikstofsoorten (RNS) kan echter neuronen en gliacellen beschadigen, wat leidt tot ernstigere neuronale apoptose25. Omgekeerd kunnen M2-achtige perifere infiltrerende macrofagen neuronale apoptose remmen en de ontstekingsreactie na dwarslaesie verminderen, waardoor het herstel van neuraal weefsel wordt bevorderd26.

Geactiveerde microglia en perifeer infiltrerende macrofagen na SCI vertonen morfologische en moleculaire expressieovereenkomsten waardoor ze moeilijk te onderscheiden zijn. Flowcytometrie (FCM), een algemeen aanvaarde techniek, wordt gebruikt om de expressie van celoppervlak en intracellulaire moleculen te analyseren, verschillende celsubpopulaties te identificeren en tegelijkertijd meerdere parameters van individuele cellen te beoordelen. Er is een stabiele FCM-test uitgevoerd om geactiveerde microglia te onderscheiden van perifeer infiltrerende macrofagen, waardoor het onderzoek naar hun rol bij SCI wordt vergemakkelijkt. In dit artikel wordt de stabiele detectiemethode beschreven die is ontwikkeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie is goedgekeurd door de Animal Care Ethics Committee van de Bengbu Medical University (nr. 2020-050). Dierenverzorging voldeed aan de voorschriften van het Ministerie van Wetenschap en Technologie van China. In totaal werden 18 acht weken oude vrouwelijke C57/BL6-muizen commercieel verkregen en gebruikt. De details van de gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Experimentele en dierlijke voorbereiding

  1. Huisvesting van de muizen in geventileerde kooien voor de operatie. Houd een licht/donker-cyclus van 12 uur aan en zorg voor vrije toegang tot voedsel en water. Houd de omgevingstemperatuur op 20-22 °C en de luchtvochtigheid op 30%-70% gedurende een week acclimatisatie.
  2. Steriliseer de chirurgische instrumenten voor de muizen door middel van autoclaveren en droog ze voor gebruik. Onderwerp de instrumenten en de operatiekamer voor dieren een half uur voor de operatie aan ultraviolette sterilisatie. Groepeer en label de muizen volgens het principe van willekeurige groepering. Registreer en registreer hun gewichten voor later gebruik.
  3. Verdoof de muizen met een cocktail van ketamine (80 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) door middel van intraperitoneale injectie (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Scheer het haar op de rug van de T8 tot T10 wervels.

2. Voorbereiding van het SCI-muismodel

  1. Desinfecteer het operatiegebied met een jodiumstaafje van kop tot staart, gecentreerd op T9, gevolgd door desinfectie met een wattenstaafje met 75% alcohol. Maak een incisie van 1 cm in de huid gecentreerd op T9. Ontleed de fascia, spier en ligamenten rond T9 gedurende 1 cm.
    1. Maak de spier naast de processus spinosus T9 los om T9 bloot te leggen. Gebruik een oogheelkundige schaar om de lamina tussen T9 en T10 bloot te leggen en te verwijderen, waarbij het ruggenmerg op T9, dat een diameter van ongeveer 2 mm heeft, volledig bloot komt te liggen.
      OPMERKING: Zorg er bij het optillen van de T9-lamina voor dat de schaar het ruggenmerg niet raakt.
  2. Stabiliseer de wervelkolom door de doornuitsteeksels van T7 en T11 vast te klemmen. Maak een model met matige dwarslaesie met behulp van een staaf met een diameter van 1,3 mm en een kracht van 0,5 N. Observeer hoe de staart omhoog krult en de achterpoot trilt na dwarslaesie. Voer voor schijngeopereerde muizen alleen laminectomie uit zonder kneuzing.
  3. Bereik hemostase op de incisieplaats. Voer gelaagde sluiting uit met behulp van steriele 5-0 chirurgische hechtingen. Voor spierbenadering pakt u de diepe fascia vast met een Adson-tang met tanden en hecht u de panniculus carnosus-laag met behulp van 5-0 resorbeerbaar monofilament, waarbij u de naald loodrecht op 2 mm van de wondrand inbrengt om symmetrische beten over de volledige dikte te verkrijgen (2-3 mm diepte) op een afstand van 3 mm uit elkaar.
    1. Leg vierkante knopen met gecontroleerde spanning om de fasciale vlakken anatomisch uit te lijnen. Verplaats de huidranden met behulp van een micro Iris-schaar om epidermale eversie van 1 mm te creëren. Lijn de dermis precies uit met de tang van de horlogemaker en zet deze vast met eenvoudige onderbroken 5-0 niet-resorbeerbare hechtingen op een afstand van 2 mm uit elkaar, zodat een gelijkmatige coaptatie zonder onderhuidse dode ruimte wordt gegarandeerd.
    2. Desinfecteer de hechtlijn met jodiumstaafjes met behulp van unidirectionele bewegingen vanuit het wondmidden naar buiten. Dep het resterende bloed voorzichtig met met zoutoplossing bevochtigd gaasje en breng een dun laagje drievoudige antibiotische zalf aan langs de incisie.
  4. Plaats de muizen na de operatie in een kooi die op een geschikte temperatuur en vochtigheid wordt gehouden. Zorg tweemaal daags voor het plassen ('s ochtends en 's avonds) om de muizen te helpen totdat ze weer zelfstandig kunnen plassen.
  5. Injecteer elke muis dagelijks subcutaan met 0,5 ml zoutoplossing en antibiotica (gentamicine, 2000-2500 E/muis) om infectie te voorkomen.

3. Isolatie van ruggenmergweefsel van C57/BL6-muizen

  1. Verdoof de muizen voor de operatie (stap 1.3). Eenmaal volledig verdoofd, bevestigt u ze in rugligging op de operatietafel. Schijnmuizen worden op dezelfde manier behandeld.
  2. Maak een transversale incisie in de borstholte, onder het borstbeen en langs het middenrif om het hart bloot te leggen. Stabiliseer het hart voorzichtig met hemostaten en breng de perfusiecanule in de apicale linkerventrikel in, waardoor deze in de aorta terechtkomt.
    1. Snijd onmiddellijk de rechter oorschelp door en begin met perfusie met een snelheid van 250 ml/uur met 10 ml PBS-oplossing. Perfusie wordt als succesvol beschouwd wanneer de vloeistof die uit de rechter oorschelp stroomt, verandert van bloedrood naar helder en kleurloos, of wanneer de lever overgaat van rood naar wit27.
  3. Transecteer de stekel aan het uiteinde van de muis om het wervelforamen bloot te leggen. Ontleed met een oogheelkundige schaar voorzichtig het ruggenmergweefsel 0,5 cm boven en onder de plaats van de verwonding. Plaats het geïsoleerde ruggenmergweefsel in een steriele, enzymvrije kweekschaal met 5% kleuringsbuffer en bewaar het op ijs bij 4 °C voor later gebruik in colloïdale silica-gecoate polyvinylpyrrolidon (PVP) dichtheidsgradiëntcentrifugatie.
    OPMERKING: Bij het ontleden van het ruggenmerg in de buurt van het letselcentrum, zorg er dan voor dat het weefsel intact blijft om te voorkomen dat het ruggenmerg op de plaats van de verwonding scheurt of beschadigt. 5% kleuringsbuffer (SB) bestaat uit 2,5 ml foetaal runderserum (FBS) en 47,5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).

4. Centrifugatie van de dichtheidsgradiënt met behulp van colloïdaal silica bedekt met polyvinylpyrrolidon

  1. Plaats het ruggenmergweefsel in een celzeef met 300 mazen en maal het met de zuiger van een wegwerpspuit van 5 ml/10 ml. Filtreer na het malen de celsuspensie door de zeef met 300 mazen in een centrifugebuis van 15 ml voor centrifugatie (5 min, 110 x g, kamertemperatuur).
    1. Voeg na het centrifugeren 1 ml trypsinecelverteringsoplossing toe aan het celsediment en incubeer dit in een celkweekincubator bij 37 °C gedurende 15 minuten. Stop de spijsvertering door 1,5 ml foetaal runderserum toe te voegen en centrifugeer vervolgens opnieuw (110 x g, 5 min, kamertemperatuur). Resuspendeer het celsediment in 1 ml 5% kleuringsbuffer (SB).
  2. Voeg achtereenvolgens 4 ml 70% colloïdaal silica gecoate polyvinylpyrrolidonoplossing, 4 ml 30% colloïdaal silica gecoate polyvinylpyrrolidonoplossing en 1 ml van de 5% SB-geresuspendeerde celoplossing toe aan een centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer het mengsel (300 x g, 30 min, 20 °C).
    OPMERKING: Bereid het met colloïdaal silica beklede polyvinylpyrrolidon scheidingsreagens voor als een 9:1 mengsel van met colloïdaal silica gecoat polyvinylpyrrolidon en 10× PBS. Verdun de 70% colloïdale silica-gecoate polyvinylpyrrolidon-oplossing met 1× PBS en de 30% colloïdale silica-gecoate polyvinylpyrrolidon-oplossing met DMEM of RPMI 1640 celkweekmedium.
  3. Na het centrifugeren vormen de cellen lagen in de centrifugebuis (Figuur 1). Gooi de celresten en bloedplaatjeslagen boven de kalibratiemarkering van 8 ml weg. Zuig de resterende oplossing voorzichtig op (tot aan de ijkmarkering van 1,5 ml) en gooi het sediment onder de markering weg.
    1. Breng de resterende oplossing over in een nieuwe centrifugebuis van 15 ml en voeg 1× PBS toe om het totale volume op 15 ml te brengen voor centrifugeren (400 x g, 5 min, 4 °C).
  4. Gooi het bovenstaande weg en resustrie van het celsediment in 5% SB. Breng de oplossing over in een flowcytometriebuis (FCM) om te wassen en te centrifugeren (110 x g, 5 min, 4 °C). Resuspendeer het celsediment in de FCM-buis met 200 μL 5% SB.

5. FCM-kleuring

  1. Verdeel 200 μL van de celsuspensie gelijkmatig over twee nieuwe flowcytometriebuisjes. Label de ene tube als "Isotype Control" en de andere als "Specifieke kleuring".
  2. Procedure voor het kleuren
    1. Voeg aan de buis "Isotype Control" de volgende isotype-gematchte antilichamen toe: PE-gelabelde Rat IgG2b kappa, FITC-gelabelde Rat IgG2b kappa, APC-gelabelde Rat IgG2b kappa en APC-eFluor 780-gelabelde Rat IgG2b kappa.
    2. Voeg aan de tube "Specifieke kleuring" het volgende paneel van fluorescerend gelabelde antilichamen toe volgens de aanbevolen verdunningsverhoudingen: Rat anti-muis CD45 APC, Rat anti-muis CD11b PE, Rat anti-muis CD68 FITC en Rat anti-muis CCR7 APC-eFluor 780.
    3. Incubeer de buisjes 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
  3. Was de bevlekte cellen twee keer door telkens 1 ml SB toe te voegen. Centrifugeer de cellen (110 x g, 5 min, 4 °C). Fixeer ten slotte de cellen met 2% paraformaldehyde (PFA) voor flowcytometrie-analyse.

6. FCM-detectie

OPMERKING: Voor details van de procedure, zie eerdere rapporten27,28.

  1. Analyseer monsters met behulp van de flowcytometer met de compatibele software (zie materiaaltabel).
    1. Analyseer eerst de isotype-regelbuis om de primaire grafiek vast te stellen (FSC op de x-as en SSC op de y-as). Pas de voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijverstrooiing (SSC) voltages aan om de celpopulatie binnen een geschikt bereik te plaatsen.
    2. Stel twee extra grafieken in: een met IgG-APC op de x-as en IgG-PE op de y-as. Een andere met IgG-FITC op de x-as en IgG APC-Cy7 (let op: APC-eFluor 780 werd gedetecteerd in dit kanaal) op de y-as.
    3. Pas de fluorescentiekanaalspanningen voor IgG-APC, IgG-PE, IgG-FITC en IgG APC-Cy7 aan om de celpopulatie binnen de 103 van het dubbelnegatieve gebied te plaatsen.
  2. Zodra de FSC- en SSC-spanningen, evenals de fluorescentiekanaalspanningen, zijn aangepast en geoptimaliseerd met behulp van de isotype-regelbuis, moeten deze instellingen ongewijzigd blijven. Ga verder met het analyseren van de met antilichamen bevlekte experimentele buisjes.
    1. Maak een primaire grafiek met CD11b-PE op de x-as en SSC op de y-as. Zet nog een grafiek op met CD68-FITC op de x-as en CCR7 APC-Cy7 op de y-as. Gebruik de isotype-controlebuis als referentie, stel de basislijnwaarden in en badig het "gebied" voor CD11b+ -cellen af. Poort in de primaire grafiek het CD11b+ -celgebied en definieer het als de "P1-poort ".
    2. Selecteer vervolgens de grafiek met CD68-FITC op de x-as en CCR7 APC-Cy7 op de y-as. Klik met de rechtermuisknop en kies Populatie weergeven en kies vervolgens P1. Dit geeft de celpopulaties binnen de CD11b+ -groep weer die CD68+/CCR7+ of CD68+/CCR7- tot expressie brengen. Verzamel 50.000 gebeurtenissen per steekproef.
    3. Pas na het verkrijgen van de gegevens de fluorescentiecompensatie indien nodig aan. Analyseer en bepaal het percentage CD11b+ , CD68+ , CCR7+ (M1-achtige) cellen en CD11b+ , CD68+ , CCR7- (M2-achtige) cellen. Het gemiddelde percentage positief gemarkeerde cellen wordt uitgedrukt als een percentage van de totale steekproefpopulatie.
  3. Gebruik de goed afgestelde spanningsparameters van de isotype-regelbuis om verder te gaan met de analyse van de experimentele buizen.
    1. Maak eerst een grafiek met CD45-APC en CD11b-PE, gevolgd door twee grafieken met CD68-FITC en CCR7 APC-Cy7. Verzamel 50.000 gebeurtenissen per monster en pas na het verkrijgen van de gegevens de fluorescentiecompensatie aan.
    2. Analyseer in de CD45/CD11b pseudokleurenplots de "regio's" voor CD11b+ CD45−/low en CD11b+ CD45hoge cellen voor elk monster. Analyseer vervolgens de CD68+ CCR7+-cellen en CD68+ CCR7-cellen binnen deze twee regio's.
    3. Integreer de analyses om de percentages van de volgende celpopulaties te bepalen: CD11b+ CD45−/lage CD68+ CCR7+ (M1-achtige microglia), CD11b+ CD45−/lage CD68+ CCR7- (M2-achtige microglia), CD11b+ CD45hoge CD68+ CCR7+ (M1-achtige macrofagen), CD11b+ CD45hoge CD68+ CCR7- (M2-achtige macrofagen).
      OPMERKING: Het gemiddelde percentage positief gemarkeerde cellen wordt uitgedrukt als een percentage van de totale steekproefpopulatie.

7. Analyse van FCM-gegevens

  1. Start de flowcytometrie-analysesoftware en sleep de bestanden van het flowcytometrie-experiment naar het gedeelte "Alle monsters" op de interface. De flowcytometrie-experimenten worden weergegeven onder "Alle monsters" op de interface. Begin met het analyseren van de isotype-regelbuis om de drempel tussen positieve en negatieve fluorescentiesignalen te bepalen.
    1. Dubbelklik op het voorbeeld van de isotype-regelbuis om een grafisch venster te openen met een tweedimensionale puntplot. Selecteer FSC-A voor de x-as en SSC-A voor de y-as. Klik op de knop Rechthoekige poort bovenaan de interface en gebruik de rechthoek om het gebied te selecteren na het verwijderen van cellulair puin (Afbeelding 2A).
    2. Dubbelklik op het geselecteerde gebied om een nieuw grafisch venster te genereren. Kies FITC voor de x-as en Histogram voor de y-as. Klik op de knop Regiopoort bovenaan de interface om een poort in te stellen in het histogram met één parameter om de drempel tussen negatieve en positieve fluorescentiesignalen te bepalen. De regiopoort definieert het positieve gebied (Figuur 2A).
      OPMERKING: Het gebied met kleinere FSC-waarden vertegenwoordigt cellulair afval.
    3. Bepaal voor elk van de vier fluorescerende antilichamen die in het experiment worden gebruikt de drempel tussen negatieve en positieve signalen met behulp van het isotype-controlebuismonster. Verander op de x-as achtereenvolgens de fluorochromen in PE, APC en APC-Cy7, terwijl de y-as als histogram behouden blijft.
    4. Gebruik de regiopoorttool in het histogram met één parameter om poorten in te stellen en de drempel tussen negatieve en positieve signalen voor elk van de vier fluorescerende antilichamen te bepalen (Figuur 2A).
  2. Om de verhoudingen van M1-achtige en M2-achtige cellen te analyseren:
    1. Dubbelklik op het experimentele buismonster om een tweedimensionale puntplot te openen. Selecteer FSC-A voor de x-as en SSC-A voor de y-as. Klik op de knop Rechthoekige poort bovenaan de interface en gebruik de rechthoek om het gebied te selecteren na het verwijderen van cellulair puin (Afbeelding 2B).
    2. Dubbelklik op het geselecteerde gebied om een nieuw grafisch venster te genereren. Kies CD11b-PE voor de x-as en SSC-A voor de y-as. Klik op de knop Rechthoekige poort bovenaan de interface en definieer de CD11b+ -poort met behulp van de PE-positief/-negatieve drempel die is ingesteld door de isotype-controle als referentie (Afbeelding 2B).
    3. Dubbelklik op het CD11b+ poortgebied om een nieuw grafisch venster te genereren. Selecteer CD68-FITC voor de x-as en CCR7 APC-Cy7 voor de y-as. Klik op de knop Cross Gate . Gebruik de FITC- en APC-Cy7 positieve/negatieve drempels die door de isotypecontrole zijn ingesteld als referenties, gebruik de kruispoort om de cellen te categoriseren en de verhoudingen van CD11b+ CD68+ CCR7+ (M1-achtige) cellen en CD11b+ CD68+ CCR7- (M2-achtige) cellen te bepalen (Figuur 2B).
      OPMERKING: De poortprincipes voor het analyseren van de verhoudingen van M1-achtige macrofagen (M1-achtige Mø), M2-achtige macrofagen (M2-achtige Mø), M1-achtige microglia (M1-achtige MG) en M2-achtige microglia (M2-achtige MG) komen overeen met die welke worden gebruikt voor het analyseren van M1-achtige en M2-achtige cellen. De drempels voor het onderscheiden van positieve en negatieve fluorescentiesignalen zijn gebaseerd op de isotype-regelbuis, die als referentie dient voor het instellen van de poorten. Het softwarebesturingsproces wordt geïllustreerd in figuur 2B en de markerexpressieprofielen die worden gebruikt voor het bepalen van de celverhoudingen worden in detail beschreven in de sectie met representatieve resultaten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De immuuncellen van het ruggenmergweefsel worden gescheiden met behulp van colloïdaal silica bedekt met polyvinylpyrrolidon dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Tijdens het centrifugatieproces worden cellen verdeeld in verschillende lagen op basis van hun opwaartse dichtheid, waardoor celscheiding wordt bereikt (Figuur 1). Van boven naar beneden is de verdeling als volgt: cellulair afval, mononucleaire celrijke laag, lymfocytrijke laag en onderaan de erytrocyt- ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De succesvolle creatie van een SCI-diermodel is essentieel. Het SCI-model werd opgesteld door het ruggenmerg in het T9-segment bloot te stellen aan een kracht van 0,5 N. Het succes van het diermodel werd aangetoond door het opkrullen van de staart van de muis, het ervaren van spasmen in beide achterpoten en het verlammen van de achterpoten, waardoor het voor de muis onmogelijk werd om na de dwarslaesie te lopen (zie stap 2.3). Postoperatieve zorg is van cruciaal belang voor het overleven...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Er werden geen belangenconflicten gemeld.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 82072416); en het fonds voor wetenschappelijke en technologische innovatie op hoog niveau van het First Affiliated Hospital van Bengbu Medical College (BYYFY2022TD001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1×PBS SolarbioP1020
10×PBS SolarbioP1022
18 acht weken oude vrouwelijke C57/BL6 muizen Cavens Laboratory Animal Ltd, Chang Zhou, China
APC-eFluor 780-gelabelde Rat anti-muis CCR7 (IgG2b kappa)Invitrogen47-1971-820.25μg/test
APC-eFluor 780-gelabelde Rat IgG2b kappa  isotype controlInvitrogen47-4321-820.25μg/test
APC-gelabelde Rat anti-muis CD45 (IgG2b kappa)Invitrogen17-0451-820.125μg/test
APC-gelabelde Rat IgG2b kappa  isotype controlInvitrogen17-4031-820.125μg/test
DMEMGibco11965092
Fetaal bovien serumLonseraS711-001
FITC-gelabelde Rat anti-muis CD68 (IgG2b kappa)Invitrogen MA5-166760.25μg/test
FITC-gelabelde Rat IgG2b kappa  isotype controlInvitrogen11-4031-820.25μg/test
Paraformaldehydebiosharp23319084
PE-gelabelde Rat anti-muis CD11b (IgG2b kappa)Invitrogen12-0112-810.25μg/test
PE-gelabelde Rat IgG2b kappa  isotype controlInvitrogen12-4031-820.25μg/test
Percoll SolarbioP8370
Trypsine oplossingbiosharpBL526A

Referenties

  1. Rubiano, A. M., Carney, N., Chesnut, R., Puyana, J. C. Global neurotrauma research challenges and opportunities. Nature. 527 (7578), S193-S197 (2015).
  2. Fehlings, M., Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clin Epidemiol. 6, 309-331 (2014).
  3. Sterner, R. C., Sterner, R. M. Immune response following traumatic spinal cord injury: Pathophysiology and therapies. Front Immunol. 13, 1084101(2023).
  4. Sun, X., et al. Multiple organ dysfunction and systemic inflammation after spinal cord injury: A complex relationship. J Neuroinflammation. 13 (1), 260(2016).
  5. Brockie, S., Zhou, C., Fehlings, M. G. Resident immune responses to spinal cord injury: Role of astrocytes and microglia. Neural Regen Res. 19 (8), 1678-1685 (2024).
  6. Wang, Z., Zhou, W., Zhang, Z., Zhang, L., Li, M. Metformin alleviates spinal cord injury by inhibiting nerve cell ferroptosis through upregulation of heme oxygenase-1 expression. Neural Regen Res. 19 (9), 2041-2049 (2024).
  7. Li, F., et al. Lupenone improves motor dysfunction in spinal cord injury mice through inhibiting the inflammasome activation and pyroptosis in microglia via the nuclear factor kappa B pathway. Neural Regen Res. 19 (8), 1802-1811 (2024).
  8. Zhou, H. -Y., et al. Dynamic development of microglia and macrophages after spinal cord injury. Neural Regen Res. 20 (12), 3606-3619 (2024).
  9. Hakim, R., et al. Spinal cord injury induces permanent reprogramming of microglia into a disease-associated state which contributes to functional recovery. J Neurosci. 41 (40), 8441-8459 (2021).
  10. Brennan, F. H., et al. Microglia coordinate cellular interactions during spinal cord repair in mice. Nat Commun. 13 (1), 4096(2022).
  11. Zeng, F., et al. Microglia overexpressing brain-derived neurotrophic factor promote vascular repair and functional recovery in mice after spinal cord injury. Neural Regen Res. , (2024).
  12. Tang, Y., Le, W. Differential roles of M1 and M2 microglia in neurodegenerative diseases. Mol Neurobiol. 53 (2), 1181-1194 (2015).
  13. Butovsky, O., Weiner, H. L. Microglial signatures and their role in health and disease. Nat Rev Neurosci. 19 (10), 622-635 (2018).
  14. Wang, J., He, W., Zhang, J. A richer and more diverse future for microglia phenotypes. Heliyon. 9 (4), e14713(2023).
  15. Zeng, F., et al. Knockout of TNF-α in microglia decreases ferroptosis and convert microglia phenotype after spinal cord injury. Heliyon. 10 (17), e36488(2024).
  16. Prinz, M., Jung, S., Priller, J. Microglia biology: One century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
  17. Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
  18. Hao, D., et al. Trends of epidemiological characteristics of traumatic spinal cord injury in China, 2009-2018. Eur Spine J. 30 (10), 3115-3127 (2021).
  19. Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell Mol Life Sci. 72 (21), 4111-4126 (2015).
  20. Kong, X., Gao, J. Macrophage polarization: A key event in the secondary phase of acute spinal cord injury. J Cell Mol Med. 21 (5), 941-954 (2016).
  21. Lech, M., Anders, H. -J. Macrophages and fibrosis: How resident and infiltrating mononuclear phagocytes orchestrate all phases of tissue injury and repair. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1832 (7), 989-997 (2013).
  22. Mosley, R. L., et al. The glial scar-monocyte interplay: A pivotal resolution phase in spinal cord repair. PLoS One. 6 (12), e27969(2011).
  23. Zhu, Y., et al. Hematogenous macrophage depletion reduces the fibrotic scar and increases axonal growth after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 74, 114-125 (2015).
  24. Hou, C., et al. Mono-macrophage-derived MANF protects against lipopolysaccharide-induced acute kidney injury via inhibiting inflammation and renal M1 macrophages. Inflammation. 44 (2), 693-703 (2020).
  25. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. -S. Microglia-mediated neurotoxicity: Uncovering the molecular mechanisms. Nat Rev Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  26. Zhang, J., et al. The effects of the M2a macrophage-induced axonal regeneration of neurons by arginase 1. Biosci Rep. 40 (2), BSR20193031(2020).
  27. Li, J. L., et al. The polarization of microglia and infiltrated macrophages in the injured mice spinal cords: A dynamic analysis. PeerJ. 11, e14929(2023).
  28. Gratama, J. W., et al. Analysis of variation in results of flow cytometric lymphocyte immunophenotyping in a multicenter study. Cytometry. 30 (4), 166-177 (1997).
  29. Delarasse, C., Fontaine, B., El-Behi, M., Martin, E. Analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry. J Vis Exp. (124), e55781(2017).
  30. Chen, Y. J., et al. Temporal kinetics of macrophage polarization in the injured rat spinal cord. J Neurosci Res. 93 (10), 1526-1533 (2015).
  31. Chen, Y. -Q., et al. CRID3, a blocker of apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ameliorates murine spinal cord injury by improving local immune microenvironment. J Neuroinflammation. 17 (1), 255(2020).
  32. Vijay, S., Nair, R. R., Sharan, D., Jakkala, K., Ajitkumar, P. Percoll discontinuous density gradient centrifugation method for the fractionation of the subpopulations of Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis from in vitro cultures. MethodsX. 11 (7), 102344(2023).
  33. Sharma, A., et al. Successful transplantation of transfected enriched buffalo spermatogonial stem cells to homologous recipients. Theriogenology. 142, 441-449 (2020).
  34. Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nat Protoc. 3 (7), 1228-1239 (2008).
  35. Maurer, F., et al. Continuous Percoll gradient centrifugation of erythrocytes: Explanation of cellular bands and compromised age separation. Cells. 11 (8), 1296(2022).
  36. Gamboa-Suárez, B. A., Lotta-Arévalo, I. A., Sarmiento-Salazar, F., Matta, N. E. Finding a needle in a haystack: DNA Haemoproteus columbae enrichment using percoll density gradient and flow cytometry. Vet Parasitol. 328, 110170(2024).
  37. Cao, Y., et al. Paeoniflorin suppresses kidney inflammation by regulating macrophage polarization via KLF4-mediated mitophagy. Phytomedicine. 116, 154901(2023).
  38. Nishihara, T., et al. Chronic constriction injury of the sciatic nerve in rats causes different activation modes of microglia between the anterior and posterior horns of the spinal cord. Neurochem Int. 134, 104672(2020).
  39. Durafourt, B. A., et al. Comparison of polarization properties of human adult microglia and blood-derived macrophages. Glia. 60 (5), 717-727 (2012).
  40. Wachholz, S., et al. Microglia activation is associated with IFN-alpha induced depressive-like behavior. Brain Behav Immun. 55, 105-113 (2016).
  41. Chen, X., et al. Correlations between macrophage polarization and osteoinduction of porous calcium phosphate ceramics. Acta Biomater. 103, 318-332 (2020).
  42. Guo, S. D., et al. Nasal delivery of Fasudil-modified immune cells exhibits therapeutic potential in experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurosci Ther. 25 (6), 783-795 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Microglia identificatieruggenmergletseldichtheidsgradi ntcentrifugatieisolatie van immuuncellenCD11b markerCD68 markerCCR7 markerM1 M2 fenotypes
Identificatie van microglia en perifere infiltrerende macrofagen in het beschadigde ruggenmerg met behulp van flowcytometrie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.