Methodenartikel

Celvrije dot blot als een praktisch en aanpasbaar immunoassayplatform voor de detectie van antilichaamrespons in menselijke en dierlijke sera

DOI:

10.3791/67973

⸱

23 mei 2025

 ,  ,  , 
1Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto, 2Department of Mechanical and Industrial Engineering, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een recent ontwikkeld immunoassayplatform gebaseerd op de principes van celvrije synthetische biologie en de dot-blot-techniek voor aanpasbare detectie van antilichaamrespons in menselijke en dierlijke sera.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De reeks wereldwijde pathogene uitbraken in de afgelopen twee decennia heeft het belang van serosurveillancestrategieën benadrukt. Immunoassayplatforms die dienen om ziektespecifieke antilichamen in de sera van patiënten te detecteren, vormen de kern van serosurveillance. Veelvoorkomende voorbeelden zijn enzymgekoppelde immunosorbenttesten en laterale flow-assays; Hoewel dit gouden standaardmethoden zijn, vereisen ze pathogeenspecifieke verbruiksartikelen en gespecialiseerde apparatuur, waardoor het gebruik ervan buiten goed uitgeruste laboratoria wordt beperkt.

We hebben onlangs een nieuw immunoassayplatform ontwikkeld met de naam Cell-Free Dot-Blot (CFDB) en dit gevalideerd met behulp van sera bij mens en dier tegen SARS-CoV-2. In tegenstelling tot conventionele immunoassays, worden CFDB-serummonsters van patiënten geïmmobiliseerd tot een vaste fase (nitrocellulosemembraan), terwijl het doelantigeen wordt gesuspendeerd in de mobiele fase van de test. Om de toegang tot serosurveillancemogelijkheden te verbeteren, worden CFDB-antigenen op aanvraag en met een infrastructuur met een lage belasting geproduceerd met behulp van in vitro eiwitexpressie. Hier wordt het antigeen gefuseerd met een peptide-tag die kan worden gedetecteerd met behulp van een enkel universeel reporter-eiwit voor elke CFDB-test. Het resultaat is dat de CFDB geen toegang nodig heeft tot een plaatlezer met meerdere putjes of gezuiverde commerciële moleculaire testcomponenten. Met deze ontwerpoverwegingen pakt CFDB de tekortkomingen van bestaande immunoassayplatforms aan door toegankelijkheid te bieden voor niet-gecentraliseerde laboratoria, aanpassingsvermogen voor opkomende ziekteverwekkers en betaalbaarheid voor gemeenschappen met lagere inkomens.

In dit artikel geven we een stapsgewijs protocol voor het voorbereiden en uitvoeren van een CFDB-immunoassay. Met ons recente werk aan SARS-CoV-2 CFDB als voorbeeld, zullen we het antigeen-DNA-ontwerp behandelen voor on-demand celvrije productie, gevolgd door de bereiding van het CFDB-reportereiwit, immobilisatie van serummonsters in de vaste fase en ten slotte antigeenbindings- en detectiestappen van de test. We verwachten dat onderzoekers door het volgen van deze instructies in staat zullen zijn om de CFDB-test aan te passen om immuunresponsen in menselijke en dierlijke sera op een bepaalde ziekteverwekker te detecteren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De COVID-19-pandemie heeft aangetoond dat er dringend behoefte is aan betaalbare, schaalbare diagnostische hulpmiddelen, met name voor omgevingen met weinig middelen1. Conventionele immunoassays zoals enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA's) zijn essentieel gebleken voor het detecteren van immuunresponsen 2,3. Hun hoge kosten, afhankelijkheid van complexe reagentia en afhankelijkheid van gespecialiseerde apparatuur beperken echter hun toegankelijkheid, vooral tijdens wereldwijde gezondheidscrises. Als antwoord op deze uitdagingen hebben we de Cell-Free Dot Blot (CFDB) ontwikkeld, een goedkoop, aanpasbaar immunoassayplatform dat is ontworpen voor de detectie van anti-SARS-CoV-2-antilichamen in menselijke en dierlijke sera.

CFDB maakt gebruik van celvrije synthetische biologie voor de snelle, on-demand productie van virale antigenen met behulp van lineaire DNA-sjablonen 4,5. Dit elimineert de noodzaak van traditionele celgebaseerde kloon-, expressie- en zuiveringsprocessen, waardoor de productie van antigeen aanzienlijk wordt versneld en de kosten worden verlaagd. De CFDB-methode vereenvoudigt de detectie van antilichamen door gebruik te maken van een dot blot-formaat, waarbij sera direct op nitrocellulosemembranen worden gesignaleerd. Dit systeem maakt dure platen met meerdere putjes en gespecialiseerde laboratoriumapparatuur overbodig, waardoor een eenvoudige "dipping"-workflow voor incubatie- en wasstappen mogelijk is. Het platform maakt ook gebruik van een SpyCatcher-SpyTag-systeem, waarbij een SpyCatcher2-Apex2 peroxidase-chimaera fungeert als een universeel secundair detectiereagens 5,6. Dit wordt geproduceerd met behulp van standaard op Escherichia coli gebaseerde expressie, waardoor de afhankelijkheid van dure commerciële antilichaamconjugaten wordt geëlimineerd. Als gevolg hiervan kan het CFDB-systeem serologische tests uitvoeren met prestaties die vergelijkbaar zijn met ELISA's tegen aanzienlijk lagere kosten - ongeveer $ 3 USD per 96 monstertest vergeleken met meer dan $ 300 USD voor een commerciële ELISA-kit5.

Om de effectiviteit van CFDB aan te tonen, hebben we het vermogen getest om antilichamen te detecteren in geprekarakteriseerde sera bij mensen en dieren. Onze resultaten correleerden nauw met ELISA bij het identificeren van COVID-19-positieve en -negatieve monsters. Naast menselijke diagnostiek hebben we het nut van CFDB in diermodellen geëvalueerd, waarbij sera zijn getest van met SARS-CoV-2 geïnfecteerde hamsters en hamsters die zijn gevaccineerd met recombinant nucleocapside-eiwit. Deze tests bevestigden het potentieel van CFDB voor gebruik in zowel menselijke als veterinaire diagnostiek, waardoor het een veelzijdig hulpmiddel is voor het monitoren van immuunresponsen bij verschillende soorten. Een van de belangrijkste voordelen van CFDB is de flexibiliteit. Door simpelweg de DNA-sjabloon aan te passen die codeert voor het antigeen van belang, kan het platform snel worden aangepast om antilichamen tegen verschillende ziekteverwekkers te detecteren, waardoor het waardevol wordt voor toekomstige paraatheid bij pandemieën. De lage kosten, eenvoudige workflow en minimale infrastructuurvereisten maken het bijzonder geschikt voor gedecentraliseerde laboratoria en omgevingen met weinig middelen, waar de toegang tot commerciële diagnostiek beperkt is.

In dit werk zullen we stapsgewijze instructies geven voor het voorbereiden en uitvoeren van een CFDB-test. Eerst behandelen we het ontwerp en de synthese van lineaire DNA-sjablonen voor celvrije productie van antigenen, de primaire detectiereagentia van de test. Vervolgens beschrijven we de stappen voor de voorbereiding van het secundaire detectiereagens SpyCatcher2-Apex2 van de test. Daarna geven we instructies voor de celvrije productie en kwaliteitscontrole van antigenen zelf. Ten slotte beschrijven we in detail het proces voor het uitvoeren van een CFDB-test op menselijke of dierlijke serummonsters.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle hamsterexperimenten werden uitgevoerd in het National Microbiology Laboratory (NML) van de Public Health Agency of Canada, goedgekeurd door het Canadian Science Centre for Human and Animal Health, en volgens de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care. Alle menselijke serum-/plasmamonsters werden commercieel verkregen voor interne tests of door klinische medewerkers aan de NML verstrekt voor onafhankelijke tests bij de NML.

1. Ontwerp en voorbereiding van lineaire antigeenexpressiesjablonen (LET's)

  1. Ontwerp de celvrije expressie-LET's voor het doelantigeen op basis van de instructies in Norouzi et al.7 en met een N/C-terminale SpyTag zoals beschreven in Norouzi et al.5.
    OPMERKING: Hier geven we details voor de bereiding van SARS-CoV-2 Nucleocapside-eiwit (NP, aminozuren 2-419).
    1. Zorg ervoor dat de LET voor de SARS-CoV-2 NP (Figuur 1 en aanvullend bestand 1) 5'- en 3'Ter-plaatsen bevat met een buffersequentie van 50 basenparen vóór de T7-promotor en na het stopcodon.
    2. Tag het NP-eiwit op de N-terminus met zijn 6-SpyTag-TEV.
    3. Haal de eiwitsequentie uit de UniProt-database (toetredingscode P0DTC9) en optimaliseer deze voor op E. coli gebaseerde expressie met behulp van de IDT-codonoptimalisatietool8. Bestel deze sequentie voor commerciële synthese als een enkelstrengs DNA-fragment geresuspendeerd in water bij 10 ng/μL.
      OPMERKING: De TEV-protease-splitsingssite en de His6-tag zijn geen essentiële functies in het LET-ontwerp.
  2. PCR amplificeert het DNA-fragment met de universele Ter FW (GGCTCCGAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCGGCC
    ACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCG) en Ter RV (CCGAGGCAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCTCAG
    CTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCC) primers met behulp van de high-fidelity DNA-polymerasekit (zie de materiaaltabel)
    1. Zet een reactie van 100 μL als volgt op: 75 μL nucleasevrij water, 20 μL 5x DNA-polymerasebuffer, 2 μL 10 mM dNTP's (eindconcentratie 200 μM), 0,5 μL 100 μM Ter-FW primer, 0,5 μL 100 μM Ter-RV primer, 1 μL 10 ng/μL enkelstrengs LET, 1 μL(2U) DNA-polymerase.
    2. Gebruik de volgende PCR-instellingen: eerste denaturatie bij 98 °C gedurende 30 s; 35 cycli: 98 °C gedurende 6 s, 60 °C gedurende 15 s, 72 °C gedurende 90 s; houden op 4 °C.
  3. Zuiver het PCR-product met behulp van een in de handel verkrijgbare PCR-zuiveringskit, controleer de kwaliteit door een monster uit te voeren op een 1% agarosegel en meet de concentratie op een UV/VIS-spectrofotometer.
    OPMERKING: Ruwe PCR-producten kunnen ook direct worden gebruikt voor celvrije expressie. Zuivering maakt echter een meer gestandaardiseerde procedure mogelijk.

figure-protocol-1
Figuur 1: Lineair expressiesjabloon voor SARS-CoV-2-NP. Een schema dat de kenmerken van de His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP lineaire DNA-sjabloon weergeeft. De belangrijkste elementen van de DNA-sjabloon zijn gelabeld. De coderende sequentie voor het eiwit van belang, hier de NP, wordt onder de transcriptionele controle van een T7-promotor geplaatst voor efficiënte expressie. Bij het N-eindpunt wordt het NP-eiwit toegevoegd met een SpyTag voor specifieke detectie met behulp van het SpyCatcher2-Apex2-detectiereagens. De x6His-tag en TEV protease sites, hoewel opgenomen als onderdeel van het algemene LET-ontwerp, zijn overbodig voor CFDB-doeleinden. Aan de uiteinden van de lineaire DNA-sjabloon zijn "stroomopwaarts" en "stroomafwaarts" Ter-sites, elk voorafgegaan door respectievelijk 50 basenpaarbuffersequenties, opgenomen voor Tus-gemedieerde bescherming tegen exonucleolytische DNA-degradatie in het celvrije lysaat. Afkortingen: NP = nucleocapside-eiwit; LET = sjabloon voor lineaire expressie; TEV = tabak etsvirus; CFDB = celvrije dot blot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Zuivering van het SpyCatcher2-Apex2 reportereiwit

  1. Gebruik het pET24b-SpyCatcher2-Apex2-plasmide, oorspronkelijk geconstrueerd in Norouzi et al.5 (volledige sequentie in aanvullend bestand 2 en plasmidekaart in aanvullende figuur S1) om het SpyCatcher2-Apex-2-reportereiwit te bereiden.
  2. Bereid agarplaten en lysogeniebouillon (LB) met 50 μg/ml kanamycine. Transformeer E. coli BL21 (DE3) cellen met het pET24b-SpyCatcher2-Apex2 plasmide. Inoculeer een enkele kolonie in een LB-startcultuur van 15 ml en laat 's nachts groeien bij 37 °C met schudden bij 250 RPM.
  3. Voeg de volgende dag 10 ml van de startercultuur toe aan 500 ml verse LB-media die 50 μg/ml kanamycine bevatten. Incubeer bij 37 °C met schudden bij 250 RPM totdat de cultuur een optische dichtheid bereikt bij 600 nm van 0,6-0,8 (~3 uur).
  4. Induceer de expressie van SpyCatcher2-Apex2 door de cultuur aan te vullen met 0,5 mM isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside en 1 mM 5-aminolevulinezuurhydrochloride. Verlaag de groeitemperatuur tot 30 °C en laat de cultuur nog 4 uur incuberen.
  5. Oogst de bacteriën door centrifugatie op 8.000 × g gedurende 15 minuten. Ga verder met cellyse of bewaar de pellet tot gebruik bij -80 °C.
  6. Resuspendeer de pellet in 20 ml lysisbuffer met 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 300 mM NaCl, 1 mg/ml lysozym, EDTA-vrije proteaseremmertablet en 1 mM dithiothreitol (DTT). Lyseer de cellen door middel van sonicatie met een amplitude van 50 % met intervallen van 5 s AAN en 10 s UIT voor een totale AAN-tijd van 3 minuten.
  7. Klar het lysaat door centrifugeren bij 20.000 g × gedurende 1 uur bij 4 °C. Haal het bovenstaande door een spuitfilter van 0,2 μm.
  8. Voeg heminchloride in een eindconcentratie van 250 μM toe aan het geklaarde lysaat en incubeer een nacht bij 4 °C. Ga verder met eiwitzuivering.
    OPMERKING: Incubatie met heminchloride maximaliseert de opname van heem in de Apex-2-peroxidase voor een optimale enzymactiviteit.
  9. Voeg 2,5 ml Ni-hars toe aan het geklaarde lysaat en incubeer bij 4 °C en schud gedurende 45 minuten zachtjes. Breng het mengsel aan op een zwaartekrachtkolom en was de hars met 50 ml Tris-buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 300 mM NaCl en 1 mM DTT).
  10. Elueer het SpyCatcher2-Apex2-eiwit in 25 ml Tris-buffer met 400 mM imidazool. Concentraat en buffer wisselen het eluaat uit in Tris-buffer met behulp van een centrifugaalfiltereenheid, waarbij wordt gestreefd naar een eindvolume van 0,5-1,0 ml.
  11. Gebruik de molaire extinctiecoëfficiënt van SpyCatcher2-Apex2 (27.390 M-1 cm-1) om de eiwitconcentratie op een UV-Vis-spectrofotometer te bepalen. Voeg glycerol toe tot een eindconcentratie van 40% en bewaar de aliquots bij -20 °C.
    OPMERKING: Dit protocol zal naar verwachting ongeveer 40 mg zeer zuivere en actieve SpyCatcher2-Apex2 opleveren, voldoende voor 400 CFDB-runs op een standaard blotgrootte van 96 monsters.
  12. Voor detectie van SpyGetagd-eiwitten met behulp van conventionele western blot9 en voor CFDB-experimenten, blokkeer altijd membranen in 5% magere droge melk in 1x Tris-gebufferde zoutoplossing die 0,05% Tween-20 (TBST) bevat. Gebruik het SpyCatcher2-Apex2-eiwit in een eindconcentratie van 10 μg/ml in blokkeeroplossing.
    OPMERKING: De SpyCatcher2-Apex2-reporter vereist een verbeterde chemoluminescentie (ECL)-oplossing voor signaalontwikkeling. De ECL-oplossing kan in de handel worden verkregen of in eigen huis worden bereid volgens de instructies in Mruk et al.10. De uiteindelijke ECL-oplossing bestaat hier uit 0,4 mM p-coumarinezuur, 2,5 mM luminol en 0,015% H2O2 in 100 mM Tris-HCl (pH 8,6).

3. Celvrije productie en kwaliteitscontrole van antigenen

  1. Bereid en monteer een E. coli BL21 celvrije expressielysaat en reactiecomponenten door de instructies in Levine et al.11 en Norouzi et al.5 te volgen. Vul het uiteindelijke reactiemengsel als volgt aan met 5 μM Tus-eiwit en 1,2 μM T7 RNA-polymerase voor een representatieve reactie van 100 μl: 14,6 μl oplossing A, 14 μl oplossing B, 33,3 μl E. coli BL21-lysaat, 2,5 μl 200 mM Tus-eiwit, 1,2 μl 100 mM T7 RNA-polymerase, 1 μL 1,5 μM lineaire DNA-sjabloon, 33,4 μL nucleasevrij water.
    OPMERKING: Zie aanvullend bestand 3 voor de belangrijkste instructies voor het bereiden van een E. coli BL21 celvrij lysaat en aanvullende tabel S1 voor een gedetailleerd recept van oplossingen A en B. Het E. coli-celvrije expressiesysteem kan ook worden bereid met behulp van alternatieve protocollen of commercieel worden verkregen, zolang de reactie wordt aangevuld met Tus en T7 RNA-polymerase.
  2. Voer een eerste expressietest op schaal van 5 μL uit door 10% (v/v) ruw PCR-product toe te voegen aan de celvrije reactie in een PCR-buisje. Incubeer zonder te schudden bij 30 °C gedurende 15 uur.
  3. Controleer de expressiekwaliteit van het NP-antigeen door 1 μL van de celvrije reactie te laden op een 12% natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegel (SDS-PAGE) en deze vervolgens over te brengen naar een nitrocellulosemembraan voor western blot zoals beschreven in stap 2.12. Gebruik het SpyCatcher2-Apex2 reporter-eiwit voor blot-labeling via de SpyTag, en optioneel een specifiek commercieel antilichaam (hier een anti-SARS-CoV-2-NP) tegen het doelantigeen.
  4. Stel een celvrije reactie op schaal 1 ml samen met een gezuiverd LET-product op 15 nM dat moet worden gebruikt voor de CFDB-test. Incubeer het expressiemengsel in een conische buis van 15 ml en schud het gedurende 15 uur bij 30 °C bij 80 tpm. Controleer de kwaliteit van de afkolving met behulp van western blot en bewaar 50 μl aliquots bij -20 °C.

4. Serummonsters

  1. Verkrijg serummonsters van mensen/dieren (of plasma) van commerciële bronnen of klinische medewerkers of intern met behulp van standaardprocedures en volgens de richtlijnen van de institutionele ethische commissie voor menselijk onderzoek of de commissie voor dierenverzorging en -gebruik. Zorg ervoor dat de juiste voorbehandelingsmaatregelen voor monsters zijn genomen om het risico op besmetting te beperken.
    OPMERKING: Voorbehandelingsmaatregelen kunnen bestaan uit behandeling met oplosmiddelen, reinigingsmiddelen, warmte-inactivatie en testen op door bloed overgedragen virusmarkers. Er is een nuttig protocol beschikbaar voor serum- en plasma-isolatie uit volbloed12. Net als bij andere immunoassayplatforms, wordt niet verwacht dat serummonsters die vroeg (<3 weken) na de eerste infectie of het begin van de ziekte zijn verzameld, voldoende niveaus van antilichaamrespons bevatten en moeten de resultaten met voorzichtigheid worden behandeld.
  2. Gebruik voor kwaliteitsverificatie van de SARS-CoV-2 NP CFDB-reagentia het internationale referentiepanel van het National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) voor anti-SARS-CoV-2-immunoglobuline, dat x1 pre-COVID-19 en x4 SARS-CoV-2-positieve monsters bevat met verschillende niveaus van anti-NP-immunoglobulinen13. Als alternatief kunt u voorgekarakteriseerde gezonde en positieve serummonsters uit andere bronnen gebruiken.
  3. Voor CFDB-experimenten moet een negatief controlemonster worden verkregen of voorbereid door meerdere (>3) gezonde serummonsters samen te voegen om de nauwkeurigheid te vergroten en de analyse en interpretatie van de resultaten te vergemakkelijken.

5. Celvrije Dot Blot (CFDB) procedure

  1. Download en print het afbeeldingsbestand van het hoofdraster (aanvullende afbeelding S2). Het hoofdraster is een patroon van 6 x 6 cm met 12 x 12 cirkels van elk 2 mm diameter en biedt een spotting capaciteit die vergelijkbaar is met een plaat met 96 putjes.
  2. Klem het rooster stevig tussen twee lagen zelfklevende PCR-plaatafdichtfolie en snijd op maat langs de buitenste roosterranden. Gebruik een biopsiepons van 2 mm om elke gemarkeerde cirkel uit te hollen.
    OPMERKING: Dit hoofdrooster kan na het afvegen met 70% ethanol meerdere keren worden hergebruikt.
  3. Snijd een stuk nitrocellulosemembraan van 6.5 x 6.5 cm en plaats het onder het hoofdrooster op een schoon oppervlak, waarbij u de opstelling vastzet met plakband zoals weergegeven in afbeelding 2 en aanvullende afbeelding S3. Gebruik een markeerstift om de buitenste cirkelposities op het nitrocellulosemembraan te markeren die als richtlijn moeten worden gebruikt om het membraan te snijden na het spotten van monsters.
  4. Verdun de serummonsters 1/10 in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7,4). Gebruik een micropipet om in drievoud 0,4 μL van elk monster op het nitrocellulosemembraan te doseren op vooraf bepaalde roosterposities. Het duurt ongeveer 15 s per plek om te doseren.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u bij elke test zowel negatieve als positieve controlemonsters voegt, aangezien dit nodig is voor de analyse van de resultaten.
  5. Wacht 10 minuten bij kamertemperatuur totdat de gevlekte monsters zijn gebonden en drogen. Haal met een pincet voorzichtig het nitrocellulosemembraan op en snijd langs de gemarkeerde buitenste cirkels.
  6. Blokkeer het membraan in 10 ml blokkeeroplossing (5% magere melkpoeder in TBST) in een petrischaaltje van 10 cm gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, schud voorzichtig op 100 RPM.
  7. Ontdooi en voeg een aliquot van 50 μl van het celvrije antigeenexpressiemengsel toe aan 5 ml blokkeeroplossing in een petrischaaltje van 10 cm. Breng het membraan rechtstreeks over naar deze antigeenbevattende oplossing en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, schuddend met 100 RPM.
    OPMERKING: Dit is de primaire detectiestap waarbij het SpyGetagd-antigeen zich bindt aan antilichaambevattende spotposities, indien aanwezig.
  8. Spoel het membraan af, was gedurende 5 minuten en spoel opnieuw af in TBST voordat u doorgaat naar de secundaire detectiestap.
  9. Incubeer het membraan in 10 ml blokkeerbuffer met 10 μg/ml gezuiverd SpyCatcher2-Apex2-eiwit, gedurende 1 uur terwijl u schudt bij 100 RPM.
  10. Spoel het membraan uit en was 2 x 5 min in TBST, met een laatste spoeling in TBS.
  11. Plak en bevestig een stuk parafilm op een schoon werkgebied in de buurt van het blot-beeldvormingsinstrument. Verwijder overtollige vloeistof door met een pincet op het membraan te tikken en plaats het membraan op de parafilm.
  12. Voeg onmiddellijk 3 ml (100 μL/cm2) ECL-oplossing toe aan de bovenkant van het membraan en incubeer precies 90 s bij kamertemperatuur.
  13. Droog het membraan onmiddellijk en breng het over naar een chemoluminescentie-compatibel beeldvormingsinstrument voor visualisatie van de resultaten.
    OPMERKING: De optimale beeldvormingstijd kan variëren per instrument. Het wordt aanbevolen om de standaard instellingen voor de automatische acquisitietijd van het instrument te gebruiken en, indien afwezig, vooraf gekarakteriseerde serummonsters te gebruiken om de beeldacquisitietijd te optimaliseren.
  14. Gebruik de beeldanalysefunctie van het instrument om spotintensiteiten te verkrijgen, inclusief voor drie lege (achtergrond)posities op het nitrocellulosemembraan; Zorg voor een constant meetvolume per spot. Exporteer de gegevens naar een spreadsheet en vergeet niet om elke spotpositie correct te labelen.
  15. Bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie (SD) van drievoudige spotintensiteiten. Trek vervolgens de achtergrond van het nitrocellulosemembraan af van alle monsters.
  16. Gebruik de volgende vergelijking om een afkapwaarde te verkrijgen voor de interpretatie van -/+ resultaten:
    (Gemiddelde van de negatieve controles) + (3 x SD van de negatieve controles). Beschouw steekproeven als positief als hun gemiddelde intensiteit boven de afkapwaarde valt en negatief als hun gemiddelde intensiteit onder de afkapwaarde daalt.
    OPMERKING: Een schema van de CFDB-procedure wordt gegeven in figuur 3.

figure-protocol-2
Figuur 2: CFDB-assemblage. Een schema van het CFDB-masterraster en de opstelling van de NC-membraanassemblage. Het hoofdraster wordt over het NC-membraan gelegd om een regelmatig, adresseerbaar patroon te bieden voor het spotten en immobiliseren van serummonsters. Afkortingen: CFDB = celvrije dot blot; NC = nitrocellulose. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-3
Figuur 3: Een schematische weergave van de CFDB-workflow. In een CFDB-test wordt een kleine hoeveelheid (<0,4 μl) 10x verdunde serummonsters handmatig gedoseerd op een voorgesneden nitrocellulosemembraan (linkerpaneel) op discrete, adresseerbare locaties (middelste paneel). Het deponeren van één serummonster per plek op drievoudige plekken en het immobiliseren van het eiwitgehalte, inclusief het totale antilichaamreservoir van de sera, op het vaste NC-substraat (beige vlekken in het middenpaneel). In dit voorbeeld kunnen anti-NP-antilichamen in de serummonsters eerst worden gebonden door het CFDB primaire detectiereagens SpyTag-NP en ten slotte worden gedetecteerd door het CFDB secundaire detectiereagens SpyCatcher2-Apex2 (vergrote bubbel op het rechterpaneel). Dit cijfer is ontleend aan Norouzi et al.5. Afkortingen: CFDB = celvrije dot blot; NP = nucleocapside-eiwit; LET = sjabloon voor lineaire expressie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PCR-amplificatie van de lineaire expressiesjabloon voor doelwitantigeen
Om de SARS-CoV-2 NP LET PCR-amplificeren werden universele Ter voorwaartse en achterwaartse primers gebruikt zoals beschreven in protocol sectie 1.2 en 1 μL van het product werd gecontroleerd op een agarosegel (Figuur 4) alvorens over te gaan tot de zuivering van het PCR-product.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

COVID-19 benadrukte het belang van toegankelijke en robuuste diagnostiek voor het beheersen van infectie-uitbraken en het optimaliseren van wereldwijde gezondheidsstrategieën. Serologische tests die beschermende antilichamen detecteren, bleken essentieel voor het volgen van overdraagbaarheidspatronen van nieuwe varianten, het identificeren van hotspots, het begeleiden van de ontwikkeling van vaccins, het triëren van verdachte gevallen en het beschermen van kwetsbare bevolkingsgroepen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.N. en K.P. zijn mede-uitvinders van de celvrije dot blot-methode. Er is een voorlopige octrooiaanvraag met betrekking tot dit werk ingediend (PCT/CA2024/050097, ingediend in januari 2024).

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.S. en R.Z. worden ondersteund door financiering van het Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA), contract nr. N66001-23-2-4042. De geuite standpunten, meningen en/of bevindingen zijn die van de auteurs en mogen niet worden geïnterpreteerd als vertegenwoordigers van de officiële standpunten of het officiële beleid van het ministerie van Defensie of de Amerikaanse regering. Dit werk werd ondersteund door fondsen aan K.P. van het CIHR Foundation grant program (201610FDN-375469), CIHR Canada Research Chair Program (950-231075 en 950-233107), University of Toronto's Medicine by Design Initiative, dat financiering ontvangt van het Canada First Research Excellence Fund en fondsen aan K.P., van Defense Research and Development Canada's, Canadian Safety and Security Program (contract 39903-200137). Afbeelding 1 en aanvullende afbeelding S1 zijn gemaakt met behulp van SnapGene Viewer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 kb DNA ladderNEBN3232Gebazig als maatstaf voor agarose gels
20 Amino acidsSigma-AldrichLAA21-1KTEen component van de celvrije reactie Oplossing B
2 mm biopsy punch Integra Miltex 33-31-P/25Voor bereiding van CFDB master grid
5-aminolevulinic acid hydrochloride Sigma-AldrichA3785Heem voorloper voor inductie van SpyCatcher2-Apex2
Agarose powderBioShopAGA002Voor elektroforetische analyse van DNA
Anti-SARS-CoV2-Nucleocapsid antibodySinobiological40588-T62Voor WB detectie van celvrij geproduceerde NP antigeen
Bio-Rad ChemiDoc  XRS+Bio-RadN/AGel beeldvorming instrument
Centrifugal concentratorsCytiva28-9323-60Voor concentratie en bufferuitwisseling van eiwitten
CentrifugeEppendorfEP022628257Voor het oogsten van bacteriële cultuur
Coenzyme A sodium salt hydrate (CoA)Sigma-AldrichC3144Een component van de celvrije reactie Oplossing A
Color pre-stained protein standard (broad range)NEBP7719Gebazig als maatstaf voor SDS-PAGE gels
Covid-19 serum panelRayBiotechCoV-PosSetVoor geverifieerde en geoptimaliseerde CFDB reagentia/condities
D-(−)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA)Sigma-AldrichP8877Een component van de celvrije reactie Oplossing B
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich10197777001Component van buffers
E. coli 5-alphaNEBC2987 voor plasmide bereiding
E. coli BL21 NEBC2530 Voor bereiding van celvrije lysaten
E. coli BL21 (DE3)NEBC2527 Voor expressie van SpyCatcher2-Apex2
EDTA-free protease inhibitor tabletSigma-Aldrich11836153001Een component van E. coli lysis buffer
Eppendorf New Brunswick Innova 43/43R Incubator ShakerEppendorfEPM1320Incubator voor groei van E. coli cellen voor eiwitexpressie en celvrije lysate bereiding
Folinic acidSigma-Aldrich47612Een component van de celvrije reactie Oplossing A
GlycerolSigma-AldrichG9012Component van SpyCatcher2-Apex2 opslagoplossing
Hemin chloride Sigma-AldrichH9039 Voor heem suppletie van SpyCatcher2-Apex2
Hydrogen peroxide 30%Sigma-AldrichH1009Voor het maken van ECL reagens
Image Lab SoftwareBio-Rad1709690Software voor ChemiDoc gel  beeldvorming instrument
Isopropyl-b-D-1-thiogalactopyranoside BioshopIPT001Voor inductie van SpyCatcher2-Apex2 expressikon
Kanamycin SulfateSigma-Aldrich60615Voor bereiding van SpyCatcher2-Apex2 bacteriële cultuur
LB agarBioShopLBL406Voor E. coli groei
LB brothBioShopLBL407Voor E. coli groei
luminol Sigma-AldrichA4685Voor het maken van ECL reagens
LysozymeSigma-AldrichL6876Voor lysis van bacteriële cellen
Magnesium AcetateSigma-AldrichM5661Een component van de celvrije reactie Oplossing B
NEBExpress Ni resin NEBS1428SVoor zuivering van SpyCatcher2-Apex2
Non-fat dry milkBioshopSKI400Voor het blokkeren van WB en CFDB membranen
ParafilmBemis2099-1337410Voor ECL-incubatie van CFDB blots
p-coumaric acid Sigma-AldrichC9008Voor het maken van ECL reagens
pET24b-SpyCatcher2-Apex2 plasmidPardee LaboratoryN/AGebazig voor de expressie van SpyCatcher2-Apex2 eiwit
Petri dishFisherbrandFB0875712Container voor WB en CFDB membraan incubatie 
Phosphate buffered saline 10%BioShopPBS405Component van buffers
Potassium GlutamateSigma-AldrichG1501Een component van de celvrije reactie Oplossing B
Potassium Oxalate Monohydrate (Oxalic acid)Sigma-Aldrich223425Een component van de celvrije reactie Oplossing A
Precast SDS-PAGE gelBioRad4561036EDUVoor elektroforetische analyse van eiwit
Q5 high-fidelity DNA polymerase NEBM0491 Voor PCR versterking van LETs
QIAquick PCR purification kit Qiagen28106Voor zuivering van LETs
Ribonucleotide Solution SetNEBN0450SEen component van de celvrije reactie Oplossing A
Skim milk powderBioShopSKI400Gebazig als blokkeringsmiddel voor western blot en CFDB
Sodium ChlorideSigma-AldrichS9625Een component van eiwitzuiveringsbuffers
SonicatorQsonicaQ500Voor lysis van bacteriële cellen
SpermidineSigma-AldrichS2626Een component van de celvrije reactie Oplossing A
Syringe filterSigma-AldrichSLGSR33SSVoor sterilisatie van buffers en oplossingen
ThermocyclerBioRadT100Instrument voor het incuberen van PCR reacties
Transfer RNA (tRNA)Sigma-AldrichR8759Een component van de celvrije reactie Oplossing A
Tris buffered salineThermo ScientificJ

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Cent Sci. 6, 591-605 (2020).
  2. Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nat Med. 26 (7), 1033-1036 (2020).
  3. Stadlbauer, D., et al. SARS-CoV-2 seroconversion in humans: A detailed protocol for a serological assay, antigen production, and test setup. Curr Protoc Microbiol. 57 (1), e100(2020).
  4. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259.e12 (2016).
  5. Norouzi, M., et al. Cell-free dot blot: an ultra-low-cost and practical immunoassay platform for detection of anti-SARS-CoV-2 antibodies in human and animal sera. Microbiol Spectr. 11 (2), e0245722(2023).
  6. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).
  7. Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synth Biol. 10 (7), 1615-1624 (2021).
  8. IDT codon optimization tool. , Integrated DNA Technologies. https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool (2025).
  9. General protocol for western blotting. , Bio-Rad. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2025).
  10. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Enhanced chemiluminescence (ECL) for routine immunoblotting. Spermatogenesis. 1, 121-122 (2011).
  11. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J Vis Exp. (144), (2019).
  12. Plasma and serum preparation. , ThermoFisher Scientific. https://www.thermofisher.com/ca/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/elisa-protocol/elisa-sample-preparation-protocols/plasma-and-serum-preparation.html (2025).
  13. Mattiuzzo, G., et al. WHO/BS.2020.2403 Establishment of the WHO International Standard and Reference Panel for anti-SARS-CoV-2 antibody. , (2020).
  14. Gong, F., Wei, H., Li, Q., Liu, L., Li, B. Evaluation and comparison of serological methods for COVID-19 diagnosis. Front Mol Biosci. 8, 682405(2021).
  15. Peeling, R. W., et al. Serology testing in the COVID-19 pandemic response. Lancet Infect Dis. 20 (9), e245-e249 (2020).
  16. Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage. Biotechniques. 56 (4), 186-193 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

AntilichaamdetectieserosurveillancestrategieeiwitexpressienitrocellulosemembraanWestern blotchemiluminescentie imagingserummonsteranalyseSARS CoV 2 antilichaam

Gerelateerde artikelen