Isolatie, fixatie en karakterisering van juveniele goudbrasemkop nierleukocyten door middel van flowcytometrie

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft de isolatie en fixatie van leukocyten geëxtraheerd uit de kopnier van goudbrasem en de beoordeling van hun levensvatbaarheid door middel van flowcytometrie. Dit werk draagt bij aan de standaardisatie van protocollen en maakt gebruik van de verwerking van een groter aantal monsters zonder afbreuk te doen aan de monsterkwaliteit, waardoor de vooruitgang in de kennis van visimmunologie wordt bevorderd.

Samenvatting

Immuniteit is cruciaal voor de fysiologische regulatie van organismen en dient als de primaire verdediging tegen ziekteverwekkers en omgevingsstressoren. De isolatie en analyse van immuuncellen bieden belangrijke inzichten in immuunresponsen op externe druk. Het gebrek aan geharmoniseerde protocollen voor minder bestudeerde soorten, zoals zeevissen, leidt echter vaak tot technische en analytische uitdagingen die de interpretatie van gegevens en een grondig begrip van soortspecifieke immuunresponsen belemmeren. Deze studie had tot doel een geoptimaliseerde analytische procedure op basis van flowcytometrie op te zetten om de levensvatbaarheid van leukocyten uit de kopnier (het belangrijkste hematopoëtische orgaan bij teleostvissen) van jonge goudbrasem (Sparus aurata) te karakteriseren en te bepalen. De procedure begon met de isolatie van leukocyten door middel van een homogenisatieproces met behulp van de uitgebalanceerde zoutoplossing van Hanks, gevolgd door een geoptimaliseerde Percoll-dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethode om hoge herstelpercentages van leukocyten te garanderen met minimale besmetting van erytrocyten die nodig is voor efficiënte daaropvolgende flowcytometrie-analyse. Bovendien werd een nieuwe techniek gebruikt met behulp van een celreactieve kleurstof (LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit) om levensvatbare van dode cellen te onderscheiden op basis van hun fluorescerende kleuringspatronen. Fixatie werd bereikt met 3,7% formaldehyde, waardoor de celmorfologie, levensvatbaarheid en kleuringsefficiëntie behouden bleven. Flowcytometrie-analyse identificeerde met succes drie overheersende leukocytenpopulaties: lymfocyten, monocyten en granulocyten. Deze methode maakte niet alleen levensvatbaarheidstests mogelijk, maar ook de nauwkeurige differentiatie van celtypen. De verbetering van de flowcytometrieprotocollen betekent een stap voorwaarts in de visimmunologie door de nauwkeurigheid en efficiëntie van de analyse van immuuncellen te vergroten. Door de fixatie van cellen voor latere analyse mogelijk te maken, vermindert dit protocol bovendien aanzienlijk de tijd en moeite die nodig is voor immuunbeoordelingen, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor zowel onderzoek als praktische toepassingen in verschillende onderzoeksgebieden.

Inleiding

Immuniteit speelt een centrale rol in de fysiologische regulatie van organismen en fungeert als een primaire verdediging tegen een breed scala aan ziekteverwekkers en omgevingsstressoren¹. Net als andere gewervelde dieren hebben vissen een complex, dynamisch en gecoördineerd immuunsysteem dat essentieel is voor hun algehele gezondheid en welzijn¹.

Teleostvissen bezitten zowel aangeboren als adaptieve immuunsystemen, die tegelijkertijd functioneren om schadelijke indringers te detecteren, erop te reageren en te neutraliseren². Het aangeboren immuunsysteem fungeert als de eerste verdedigingslinie en biedt onmiddellijke en niet-specifieke reacties op ziekteverwekkers², terwijl het adaptieve immuunsysteem zich in de loop van de tijd ontwikkelt en een meer gespecialiseerde respons biedt die vissen in staat stelt specifieke ziekteverwekkers te herkennen en immunologisch geheugen op te bouwen³. Het immuunsysteem van vissen vertrouwt op gespecialiseerde primaire lymfoïde organen (d.w.z. thymus en kopnier) en secundaire lymfoïde organen (bijv. milt en slijmvlies-geassocieerde lymfoïde weefsels (MALT)) om de immuunafweer te ondersteunen en de algehele gezondheid te behouden⁴. De kopnier is het primaire hematopoëtische orgaan bij teleostvissen en speelt een cruciale rol bij de ontwikkeling en rijping van immuuncellen, waaronder leukocyten⁵.

In de afgelopen jaren is er aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het bestuderen van de immuunresponsen van verschillende vissoorten². Een belangrijk aandachtsgebied was het begrijpen van leukocytenpopulaties en hun activiteit. Leukocyten, ook wel witte bloedcellen genoemd, worden over het algemeen ingedeeld in monocyten, lymfocyten en granulocyten en spelen een cruciale rol in de immuunafweer van vissen. Ze hebben fagocytische cellen, die verantwoordelijk zijn voor het opslokken en vernietigen van ziekteverwekkers en het vrijgeven van bacteriedodende reactieve zuurstofsoorten, wat bijdraagt aan de eliminatie van binnendringende micro-organismen⁶. Leukocyten zijn ook betrokken bij het ontstekingsproces, helpen infecties te isoleren en uit te roeien en bevorderen tegelijkertijd weefselherstel⁶. De overvloed en activiteit van leukocytenpopulaties zijn belangrijke indicatoren voor de immuunstatus bij diergezondheid en ziekten ^7,8.

Sommige onderzoeken hebben aangetoond dat stressfactoren, zoals ongunstige omgevingsomstandigheden, het aantal en de morfologie van erytrocyten en de samenstelling van circulerende leukocyten kunnen veranderen ^9,10. Bijvoorbeeld, zoals beoordeeld door Franke et al. (2024), is het van cruciaal belang om het immuunsysteem van vissen te bestuderen in klimaatveranderingsscenario's, aangezien omgevingsstressoren de immuniteit van vissen in gevaar kunnen brengen, de vatbaarheid voor ziekten kunnen vergroten en de besmettelijkheid van bepaalde ziekteverwekkers kunnen verbeteren, wat uiteindelijk de ziekteprogressie versnelt¹¹. Bovendien is het begrijpen van de immuniteit van vissen essentieel, niet alleen om fundamenteel biologisch onderzoek vooruit te helpen, maar ook om verschillende sectoren van de samenleving, zoals de aquacultuurindustrie, te ondersteunen. Naarmate de aquacultuur zich wereldwijd blijft uitbreiden, wordt het steeds belangrijker om de gezondheid en het welzijn van gekweekte vissoorten te waarborgen. Toch blijft het welzijn van vissen een relatief nieuw onderzoeksgebied en vereisen de immuunresponsen van gekweekte vissen nog steeds grondige en gestandaardiseerde beoordelingen. Prioriteit geven aan onderzoeken naar de immuunrespons is van het grootste belang, aangezien de verkregen informatie de duurzaamheid en productiviteit van de aquacultuur kan verbeteren door middel van effectieve en op maat gemaakte benaderingen die het welzijn en de veerkracht van landbouwhuisdieren verbeteren.

Kwantificering en identificatie van leukocyten worden meestal uitgevoerd met behulp van hematologische methoden, zoals handmatig tellen met Bürker-, Neubauer- of Thoma-hemocytometers, evenals gekleurde bloeduitstrijkjes ^7,10. Om te helpen bij de visualisatie en differentiatie van bloedcellen, worden vaak kleuringskits, zoals Wright, May-Grünwald-Giemsa en Hemacolor, gebruikt ^7,12. Deze handmatige technieken voor het tellen van cellen zijn echter vervelend, tijdrovend en vatbaar voor menselijke fouten ^8,10. Veelvoorkomende bronnen van fouten zijn onder meer onvoldoende menging of verdunning van het bloed, kleuringsproblemen en onjuiste belading van de hemocytometerkamer, die allemaal kunnen leiden tot onnauwkeurige celtellingen¹². Bovendien vereist handmatige hematologische analyse een hoog niveau van expertise en ervaring om de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de resultaten te garanderen⁷. Naarmate de vraag naar nauwkeurige en efficiënte diagnostische hulpmiddelen toeneemt, wordt de ontwikkeling van innovatieve methoden die een diepgaand inzicht bieden in de immuunstatus van vispopulaties een steeds belangrijkere stap in de vooruitgang van dit gebied.

Flowcytometrie is in deze context naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel en biedt een kwantitatieve benadering met hoge doorvoer voor het analyseren van leukocytenpopulaties en de levensvatbaarheid van cellen⁸. Deze moderne diagnostische technologie maakt het mogelijk om individuele cellen in gemengde populaties snel te detecteren, te tellen en te karakteriseren met opmerkelijke precisie¹³. Bovendien maakt flowcytometrie gelijktijdige multiparametrische metingen mogelijk voor zowel fenotypische als functionele karakterisering. Hoewel het veel wordt gebruikt in de klinische omgeving van de mens en in de diergeneeskunde, blijft de toepassing ervan in de studie van visleukocyten zeer beperkt⁸. Hoewel er enig onderzoek is gedaan naar verschillende vissoorten 1,6,8,13,14,15,16,17, moeten er nog verschillende kritieke uitdagingen worden aangepakt. Een grote uitdaging bij deze analyses is de noodzaak om suspensies van levende leukocyten te verkrijgen die zijn geëxtraheerd uit perifeer bloed of lymfoïde weefsels, zoals de hoofdnier¹. Isolatie van leukocyten is vaak moeilijk vanwege een unieke eigenschap van teleostvissen: de aanwezigheid van erytrocyten met kern. De onbedoelde besmetting met erytrocyten kan de analyse van leukocyten verstoren vanwege hun grootte, eivormige vorm en de aanwezigheid van een kern¹. Het is daarom absoluut noodzakelijk om erytrocyten uit leukocytensuspensies te verwijderen om een hoge leukocytenzuiverheid te bereiken en om de fenotypische en functionele kenmerken van leukocyten te bestuderen door middel van flowcytometrie-analyse. Bij zoogdieren omvat de isolatie van leukocyten meestal osmotische lysis van erytrocyten of scheiding van dichtheidsgradiënten met Ficoll of Percoll¹. Osmotische lysis is echter niet effectief voor zowel zee- als zoetwatervissen vanwege hun nucleaire erytrocyten, die niet goed kunnen worden gelyseerd¹. In plaats daarvan heeft scheiding van dichtheidsgradiënten de voorkeur voor vissen, omdat het de celstabiliteit in de loop van de tijd effectief behoudt¹. Hoewel sommige studies met succes leukocyten uit jonge vissen hebben geïsoleerd, richt veel onderzoek zich nog steeds voornamelijk op volwassen populaties¹⁷. Desalniettemin zijn vroege levensfasen niet alleen kwetsbaarder voor uitbraken van ziekten, maar ook kleiner in omvang, waardoor het bemonsteringsproces complexer en uitdagender wordt. Een andere beperking is dat de huidige methoden vaak beperkt zijn tot een beperkt aantal monsters of replicaten tegelijk, omdat het evalueren van de levensvatbaarheid van leukocyten onmiddellijke verwerking vereist. Vertragingen in de monsterverwerking kunnen de cellulaire levensvatbaarheid nadelig beïnvloeden, waardoor verdere complicaties in het bemonsteringsproces worden geïntroduceerd en mogelijk het hele werk in gevaar komt.

Voor zover wij weten, heeft geen van de gepubliceerde methoden met succes leukocytencellen gefixeerd voor latere levensvatbaarheidsanalyse door middel van flowcytometrie. De huidige studie is baanbrekend, omdat het een efficiënte methode vaststelt voor het isoleren van leukocyten uit de kopnier van jonge goudbrasem (Sparus aurata), de belangrijkste vissoort die in Zuid-Europese landen wordt gekweekt, met behulp van een Percoll-dichtheidsgradiëntscheidingsmethodologie. We presenteren ook een verbeterde op kleuring gebaseerde techniek die levend onderscheidt van dode cellen, terwijl de belangrijkste leukocytenpopulaties (lymfocyten, monocyten en granulocyten) worden geïdentificeerd door middel van flowcytometrie. Het verbeterde protocol omvat celfixatie, waardoor levensvatbare celanalyse tot 1 maand na de procedure mogelijk is. De implementatie van dit flowcytometrieprotocol heeft het potentieel om de tijd en moeite die doorgaans nodig zijn voor immuunbeoordelingen aanzienlijk te verminderen, waardoor het een waardevolle techniek is voor zowel onderzoek als meer praktische toepassingen binnen de aquacultuursector. De toepassing van deze methodologie biedt voordelen voor het analyseren van een groot aantal monsters, het bewaren van de cellen en het mogelijk maken van vertraagde analyse door middel van flowcytometrie. Daarom kan het zeer nuttig zijn om waardevolle inzichten te verkrijgen in de immuunmechanismen van vissen en hoe de levensvatbaarheid van cellen wordt beïnvloed door verschillende omgevings- of experimentele omstandigheden. Bovendien kan deze levensvatbaarheidstest worden geïntegreerd met multiparametrische fenotypische en functionele karakterisering van specifieke immuuncelpopulaties. Deze benadering maakt een uitgebreidere analyse van verschillende immunologische parameters mogelijk, waarbij ze rechtstreeks worden gekoppeld aan de overeenkomstige celtypen en een beter begrip van immuunresponsen wordt verkregen. Deze bevindingen kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van effectievere strategieën, waaronder verbeterde benaderingen voor ziektebeheer in de aquacultuur.

Protocol

Dit protocol moet worden uitgevoerd door onderzoekers die gecertificeerd zijn in dierproeven (EU-functies A en B). Alle procedures met betrekking tot het omgaan met dieren en het verzamelen van monsters moeten voldoen aan de ARRIVE-richtlijnen (Animal Research: Reporting of in vivo Experiments) en voldoen aan ethische normen voor de verzorging en het gebruik van dieren in overeenstemming met de aanbevelingen van de Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA). De huidige studie volgde al deze normen, evenals de Portugese wetgeving voor proefdierwetenschappen (EU-richtlijn 2010/63; Wetsdecreet nr. 113/2013). Het onderzoek werd goedgekeurd door het Orgaan voor Dierenwelzijn en Ethiek van het IPMA (ORBEA, LABVIVOS-002-AquaClimAdapt), dat onder toezicht staat van de Nationale Autoriteit voor het Gebruik van Levende Dieren, bekend als het Directoraat-Generaal Voedsel en Diergeneeskunde (DGAV), onder het ethische goedkeuringsnummer 20596/25-S.

1. Bestudeer model en onderhoud van organismen

OPMERKING: Deze studie is speciaal ontworpen voor jonge goudbrasem (Sparus aurata), met een gemiddeld gewicht van 30,0 ± 5,0 g en een totale lengte van 12,0 ± 2,0 cm. Deze methode is mogelijk niet direct van toepassing op andere vissoorten, aangezien verschillende soorten unieke fysiologische en immunologische kenmerken hebben die de isolatie van leukocyten, celfixatie en levensvatbaarheidsbeoordeling kunnen beïnvloeden. Aanpassingen aan het protocol kunnen nodig zijn voor andere soorten, en voorbereidende studies worden aanbevolen om de omstandigheden voor elke doelsoort te optimaliseren.

1. Acclimatiseren van de vissen (quarantaineperiode)
   1. Verdeel de vissen gelijkmatig in aquaria met een grote inhoud (bijv. twee aquaria met een totale inhoud van 660 L per stuk - zie aanvullende figuur 1).
      OPMERKING: De te gebruiken tanks kunnen deel uitmaken van een recirculerend aquacultuursysteem (RAS), dat een efficiënt watergebruik en een betere controle over de waterkwaliteit mogelijk maakt. In een RAS wordt het water continu gerecycled en behandeld binnen het systeem, waardoor een stabiele en gecontroleerde omgeving voor de vissen wordt gecreëerd. Deze opstelling helpt bij het handhaven van optimale omstandigheden voor de gezondheid en groei van vissen, zorgt voor een uniforme verdeling en minimaliseert stress tijdens het onderzoek.
   2. Behoud optimale abiotische omstandigheden.
      1. Houd de vissen 3 weken in quarantaine onder omstandigheden die hun natuurlijke habitat nabootsen:
         temperatuur: 20,0 ± 0,5 °C;
         opgeloste zuurstof: 7,2 ± 0,2 mg/L;
         zoutgehalte: 35,0 ± 0,5 ‰;
         pH: 8,0 ± 0,1 eenheden;
         Fotoperiode: 14 uur licht/10 uur donker.
         OPMERKING: Ideale onderhoudsomstandigheden kunnen variëren tussen verschillende vissoorten. Andere soorten kunnen andere eisen stellen, dus het is belangrijk om deze omstandigheden aan te passen aan de specifieke behoeften van de doelsoorten om de gezondheid en het welzijn van de organismen te waarborgen. Bovendien kunnen de temperatuur en fotoperiode van het zeewater veranderen met de seizoenen, dus er moet rekening worden gehouden met seizoensvariaties bij het nabootsen van natuurlijke omstandigheden in het laboratorium.
2. Start het experimentele onderzoek.
   1. Definieer het aantal benodigde tanks en vissen op basis van het experimentele opstellingsontwerp van elke casestudy.
   2. Breng de vissen na de quarantaineperiode over naar onafhankelijke RAS (zie aanvullende figuur 2).
      1. Rust elk systeem uit met eiwitafschuimers om overtollige organische verbindingen uit het water te verwijderen; fysische filtratie (filterzak [400 μm], filterspons en glaswol); biologische filtratie (bioballen [1,5"], sterilisator met ultraviolet water en ondergedompelde luchtstenen); automatische koelsystemen voor zeewater en ondergedompelde digitale verwarmers, beide aangesloten op een geautomatiseerd besturingssysteem (ProfiLux) met temperatuursensoren om de temperatuur in elke tank aan te passen; Ondergedompelde luchtstenen in elke tank om opgeloste zuurstof te beheersen.
   3. Acclimatiseer de vissen gedurende 2 weken in de nieuwe systemen voordat ze verder gaan met het experiment.
   4. Dagelijks onderhoud uitvoeren
      1. Verwijder visuitwerpselen uit elke incubatietank en voer een verversing van het zeewater met 25% uit.
      2. Meet de temperatuur met behulp van een draagbare precisiethermometer.
      3. Bewaak andere abiotische parameters van zeewater (zoutgehalte, opgeloste zuurstof en pH) met behulp van een multiparametermeetinstrument.
      4. Pas de abiotische parameters van het zeewater zo nodig aan om de stabiliteit tijdens het experiment te garanderen.
         OPMERKING: De abiotische omstandigheden in de experimentele systemen kunnen variëren, afhankelijk van de specifieke vereisten van elke casestudy. Als het onderzoek bijvoorbeeld tot doel heeft seizoensveranderingen of hittegolven op zee te simuleren, moeten de temperatuur en fotoperiode dienovereenkomstig worden aangepast om natuurlijke seizoensvariaties na te bootsen. Evenzo, als het onderzoek zich richt op het simuleren van hypoxische omstandigheden of verzuring van de oceaan, moeten aanpassingen worden gemaakt aan het zuurstofgehalte en de pH van het zeewater. Dit zorgt ervoor dat de experimentele omstandigheden zo realistisch en relevant mogelijk zijn, waardoor de validiteit en toepasbaarheid van de bevindingen van het onderzoek worden vergroot.
      5. Beoordeel de gezondheid en het welzijn van de vissen, identificeer en beheer tekenen van stress of ziekte zoals beschreven in de stappen 1.2.4.6-1.2.4.8.
      6. Zoek naar abnormaal gedrag zoals onregelmatig zwemmen, verlies van eetlust, lethargie, agressie of isolatie.
      7. Controleer op tekenen van ziekte, waaronder laesies, zweren, verkleuring, vastgeklemde vinnen, overmatig slijm of snelle kieuwbewegingen.
      8. Noteer alle observaties, noteer de datum en de ondernomen acties.
   5. Voer wekelijkse waterkwaliteitstests uit.
      1. Meet het ammoniakgehalte (NH₃/NH₄), nitriet (NO₂^-) en nitraat (NO₃^-) met behulp van colorimetrische tests.
         OPMERKING: Zorg ervoor dat al deze parameters onder de detecteerbare niveaus liggen. Als de niveaus de limieten overschrijden, voer dan een extra waterverversing uit, verhoog de beluchting of pas de filtratie aan.
   6. Voer en controleer de voeding van vissen.
      1. Zorg voor een voer van hoge kwaliteit dat voldoet aan de specifieke voedingsbehoeften van jonge vissen (zie aanvullende tabel 1 voor een voorbeeld van de gedetailleerde samenstelling van het voer).
         OPMERKING: Zorg ervoor dat de grootte van de visvoerkorrels (2-3 mm) geschikt is voor de jonge dieren, zodat de opname en vertering worden vergemakkelijkt.
      2. Pas de voerhoeveelheid aan zodat deze overeenkomt met 2% van het gemiddelde lichaamsgewicht van de vis per dag.
      3. Voer de vissen twee keer per dag handmatig - één keer 's ochtends en één keer 's middags (stel een specifieke tijd in om een stabiele voerroutine te behouden).

2. Visbemonstering, euthanasie, dissectie en afname van de nieren van de kop

1. Proef de vissen uit de aquaria.
   1. Selecteer de vissen willekeurig uit de aquaria om bemonsteringsbias te voorkomen.
   2. Gebruik een net om de vissen voorzichtig over te brengen in een tijdelijke houder gevuld met aquariumwater.
      OPMERKING: Minimaliseer de verwerkingstijd om stress te verminderen.
2. Bereid de euthanasie-oplossing voor.
   1. Gebruik een geschikte bak (bijv. een emmer van 3 liter) die geschikt is voor het vasthouden van de vissen.
   2. Los de juiste hoeveelheid tricaïne (MS-222) op in zeewater om een eindconcentratie van 200-300 mg/L¹⁸ te bereiken (LET OP: zie aanvullende tabel 2 en aanvullend dossier 1).
   3. Buffer de oplossing met natriumbicarbonaat tot een pH van 7,2-7,5.
3. Beheer de euthanasie-oplossing.
   1. Plaats de vis gedurende ten minste 10 minuten in de euthanasieoplossing of totdat de operculaire beweging is gestopt en het verlies van reflexen is waargenomen (bevestig de euthanasie door te controleren of er niet wordt gereageerd op externe stimuli).
   2. Noteer het lichaamsgewicht (g) en de totale lengte (cm) van de vis.
4. Voer visdissectie uit.
   OPMERKING: Om een optimale monsterkwaliteit en levensvatbaarheid van de cellen te garanderen, moet het dissectieproces zo snel mogelijk worden voltooid, idealiter binnen 5 minuten na euthanasie.
   1. Zorg ervoor dat de laboratoriumtemperatuur op 19 °C wordt gehouden met behulp van airconditioning om fluctuaties tijdens bemonstering en verwerking tot een minimum te beperken.
   2. Steriliseer de dissectiegereedschappen (bij voorkeur autoclaaf metalen instrumenten indien mogelijk) en richt een schone werkruimte in met 70% ethanol (LET OP, zie aanvullende tabel 2).
   3. Leg de geëuthanaseerde vis op zijn zij op een steriele dissectiebak met de kop naar de niet-dominante hand gericht.
   4. Maak met een scalpel een voorzichtige incisie langs de ventrale middellijn van de vis vanaf de opening (anus) tot aan de kieuwen.
      OPMERKING: Pas op dat u niet te diep snijdt om beschadiging van inwendige organen te voorkomen.
   5. Gebruik voorzichtig een dissectieschaar om de incisie te verlengen en de inwendige organen bloot te leggen. Til de lichaamswandflappen voorzichtig op om een duidelijk zicht op de interne anatomie te krijgen.
   6. Lokaliseren van de hoofdnier: De hoofdnier bevindt zich net achter de kieuwen, nabij het voorste dorsale gebied van de lichaamsholte, en strekt zich uit langs de bovenkant van de lichaamsholte, onder de wervelkolom.
      OPMERKING: De hoofdnier is meestal donkerder van kleur in vergelijking met de omliggende weefsels (Figuur 1).
   7. Verwijder voorzichtig alle omliggende weefsels, zoals vet en bindweefsel, om de hoofdnier beter te visualiseren.
      OPMERKING: Deze stap vereist een delicate behandeling om beschadiging van de hoofdnier te voorkomen.
   8. Til met een tang en een schaar met een fijne punt voorzichtig de kop van de nier op en maak er nauwkeurige sneden omheen om deze te bevrijden van de omliggende weefsels.
      NOTITIE: Behandel het weefsel voorzichtig om schade te voorkomen. Bij een vis die ongeveer 30 g weegt, wordt verwacht dat de kopnier ongeveer 20-30 mg weegt.
   9. Plaats het uitgesneden orgaan onmiddellijk in een celzeef (100 μm nylon gaas) in een steriel petrischaaltje om steriliteit te garanderen en de volgende verwerkingsstappen te vergemakkelijken.
      OPMERKING: Vanaf dit punt moeten alle stappen zo snel mogelijk (binnen 5 minuten) worden uitgevoerd om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden. Om het monster koel te houden, voert u de volgende stappen uit met de petrischaal op een bak gevuld met ijs en afgedekt met aluminiumfolie.

Figuur 1: Positie van de hoofdnier: (A) Illustratie die de typische locatie van de hoofdnier achter de kieuwen en langs het voorste dorsale gebied van de lichaamsholte weergeeft; (B) Representatief beeld van de hoofdnier bij zeebrasem, met de nadruk op de donkerdere kleur in vergelijking met de omliggende weefsels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Isolatie van kop-nierleukocyten (figuur 2)

Figuur 2 — Illustratieve beschrijving van de isolatie van leukocyten uit de hoofdnier. Het protocol omvat verschillende stappen: beginnend met de homogenisatie van het weefsel, gevolgd door dichtheidsgradiëntcentrifugatie, verzameling van de leukocytenring, wassen van de leukocytenring en eindigend met de resuspensie en aanpassing van de celconcentratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

1. Homogeniseer het weefsel.
   1. Doe 2 ml Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) in een steriel petrischaaltje.
   2. Zorg ervoor dat het gaas van de celzeef (100 μm nylon gaas) in contact is met de HBSS, maar niet volledig ondergedompeld is.
   3. Macereer de hoofdnier op de celzeef met behulp van de zuiger van een spuit. Oefen lichte druk uit om de orgaanfragmenten door het nylon gaas te persen, waardoor een celsuspensie ontstaat.
      OPMERKING: Als er meerdere monsters worden verwerkt, kan het petrischaaltje met de celsuspensie enkele minuten in de koelkast bij 4 °C worden bewaard tot de volgende stap. Deze celsuspensie zal worden gebruikt voor de isolatie van leukocyten.
2. Voer dichtheidsgradiëntcentrifugatie uit.
   1. Bereid een oplossing van een dichtheidsgradiëntmedium met een dichtheid van 1,077 g/ml, een osmolariteit van 353 mOsm/kg en een pH van 7,4 (zie aanvullend bestand 1).
      OPMERKING: De osmolariteit kan variëren tussen verschillende vissoorten, dus het is van cruciaal belang om de osmolariteit van de oplossing voor dichtheidsgradiëntmedium aan te passen aan de specifieke vereisten van elke soort.
   2. Voeg in buisjes van 5 ml polystyreen met ronde bodem voorzichtig 600 μl van de oplossing van het dichtheidsgradiëntmedium toe.
   3. Neem de celsuspensie (2 ml) en voeg deze langzaam toe aan de buis met het dichtheidsgradiëntmedium. De eerste druppel is cruciaal - voeg deze heel voorzichtig toe om te voorkomen dat de dichtheidsgradiënt in de middenfase wordt gedestabiliseerd.
      OPMERKING: Dit moet worden gedaan in een verhouding van 3:10 (dichtheidsgradiëntmedium: celsuspensie). Gebruik een steriele pasteurpipet van 1 ml voor een nauwkeurige en voorzichtige toevoeging. Zorg ervoor dat de punt van de pipet de zijkant van de buis raakt om te voorkomen dat de gemiddelde laag met dichtheidsgradiënt wordt verstoord. Vermijd het mengen van het monster met het dichtheidsgradiëntmedium.
   4. Centrifugeer de buizen bij 400 x g gedurende 45 minuten bij 4 °C met uitgeschakelde rem. Dit zorgt ervoor dat de lagen intact blijven tijdens het proces.
      OPMERKING: Na centrifugatie moeten verschillende lagen zichtbaar zijn. Leukocyten vormen een ring op het grensvlak tussen het dichtheidsgradiëntmedium en de cellulaire puinpellet (Figuur 3).

Figuur 3: Leukocyten ringen op het grensvlak tussen het dichtheidsgradiëntmedium en de cellulaire puinpellet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

3. Verzamel de leukocytenring.
   1. Zuig met behulp van een steriele pasteurpipet voorzichtig de leukocytenring (~100 μL) op en breng deze over in een microcentrifugebuis van 2 ml.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de lagen niet sterk verstoort om besmetting te voorkomen. Als de leukocytenring vuil of donkere suspensies lijkt te bevatten, is het raadzaam om de verzamelde leukocytensuspensie door een nieuwe mini-celzeef (100 μm) te leiden om de zuiverheid te garanderen. Plaats de minicelzeef over de microcentrifugebuis van 2 ml en breng de leukocytensuspensie voorzichtig door de zeef.
4. Was de leukocytenring.
   1. Voeg HBSS toe aan de microcentrifugebuisjes met de leukocytenring tot het volume 2 ml bereikt en breng de cellen voorzichtig opnieuw.
      NOTITIE: Bewaar de buizen in een bak gevuld met ijs en afgedekt met aluminiumfolie om het monster op een lage temperatuur te houden. Zorg ervoor dat de buizen niet in direct contact komen met het ijs. Houd deze koelopstelling tijdens het wasproces aan.
   2. Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 400 × g bij 4 °C (rem kan worden ingeschakeld).
   3. Gooi na het centrifugeren het supernatant voorzichtig weg en laat de pellet op de bodem liggen (die bijna onzichtbaar kan zijn).
   4. Herhaal de wasstappen (HBSS toevoegen, opnieuw suspenderen, centrifugeren en het supernatant weggooien) totdat de pellet vrij is van onzuiverheden.
5. Resuspendeer en pas de celconcentratie aan.
   1. Resuspendeer de cellen in 1 ml HBSS in dezelfde microcentrifugebuisjes van 2 ml die voor de wasbeurten zijn gebruikt.
   2. Bereik een celconcentratie tussen 1 × 10⁴ en 1 × 10⁶ cellen per ml. Als de initiële pellet groot is, kan extra HBSS nodig zijn om de celconcentratie tot het gewenste bereik te verdunnen. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml en voeg indien nodig meer HBSS toe op basis van het verkregen aantal cellen.
      OPMERKING: Het gebruik van een geautomatiseerde cellenteller wordt aanbevolen om het proces te vergemakkelijken.

4. Kleuring en fixatie van leukocyten (Figuur 4)

OPMERKING: De LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kits bieden een verbeterde methode om de levensvatbaarheid van cellen in vaste cellen te evalueren met behulp van flowcytometrie. Deze tests maken gebruik van een fluorescerende reactieve kleurstof die interageert met cellulaire amines. Als de celmembranen worden aangetast, kan de kleurstof de cellen binnendringen en reageren met vrije aminen, zowel in als op het celoppervlak, wat resulteert in intense fluorescerende kleuring. Omgekeerd zijn in levensvatbare cellen alleen de aminen van het celoppervlak beschikbaar om met de kleurstof te reageren, wat leidt tot relatief zwakke kleuring. De kleuringsintensiteit blijft behouden na fixatie met formaldehyde, waardoor het monster ook behouden blijft door de groei van micro-organismen te voorkomen. De LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kits zijn identiek, behalve de fluorescerende kleurstof - verkrijgbaar in blauw, violet, aqua, geel, groen, rood, verrood of nabij-IR (infrarood). In deze studie hebben we de Near-IR fluorescerende reactieve kleurstof gebruikt. Bovendien maakt deze eenkleurige test het mogelijk om andere parameters parallel te testen in een meerkleurig experiment.

1. Bereid de kleurstof voor.
   1. Breng de reagentia op kamertemperatuur (RT): Laat een injectieflacon met de fluorescerende reactieve kleurstof en de injectieflacon met watervrij dimethylsulfoxide (DMSO) RT bereiken voordat u de doppen verwijdert.
   2. Reconstitueer de kleurstof: Voeg 50 μl DMSO toe aan de injectieflacon met de reactieve kleurstof. Meng goed en zorg ervoor dat de kleurstof volledig is opgelost.
   3. Gebruik de gereconstitueerde kleurstofoplossing zo snel mogelijk, bij voorkeur binnen enkele uren.
      OPMERKING: Elke kit bevat vijf afzonderlijke flesjes met reactieve kleurstof, die voldoende materiaal bevatten om ten minste 40 celmonsters te kleuren. Na reconstitutie is de DMSO-oplossing van de kleurstof echter relatief onstabiel, vooral bij blootstelling aan vocht. Ongebruikte porties kunnen tot 2 weken worden bewaard bij ≤-20 °C, beschermd tegen licht en vocht.
2. Kleurt en fixeert de cellen.
   OPMERKING: Buffers die geschikt zijn voor celkleuring zijn onder meer Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en Dulbecco's PBS (D-PBS), zolang ze geen vreemde eiwitten bevatten, zoals runderserumalbumine of serum. Wanneer u een amino-reactieve kleurstof gebruikt, vermijd dan Tris-buffers en -oplossingen met natriumazide of vreemd eiwit voor celresuspensie en wassen. In deze studie gebruikten we HBSS vanwege de uitgebalanceerde ionensamenstelling, die helpt om het osmotische evenwicht te behouden en essentiële ionen en glucose levert om het celmetabolisme en de levensvatbaarheid tijdens het kleuringsproces te ondersteunen. HBSS is ook vrij van vreemde eiwitten, waardoor interferentie met de reactieve kleurstof wordt voorkomen en een nauwkeurige beoordeling van de levensvatbaarheid wordt gegarandeerd.
   1. Na het tellen van de cellen en het aanpassen van de dichtheid naar 1 x 10⁶ cellen per ml met HBSS, brengt u 1 ml van deze celsuspensie over in microcentrifugebuisjes van 2 ml.
      1. Induceer voor elke dag celdood in ten minste één monster dat als controle moet worden gebruikt om de fluorescentie-intensiteitsdrempel tussen levende en dode cellen in te stellen. Bereid de monsters als volgt voor in microcentrifugebuisjes:
         Buis 1: Levende cellen - ongekleurd
         Buis 2: Levende cellen - gekleurd
         Buis 3: Dode cellen - onbevlekt
         Buis 4: Dode cellen - gekleurd
         OPMERKING: Deze vier buisjes hoeven slechts als bedieningselementen te worden voorbereid voor een enkel monster in elk experiment. Voor de overige monsters zijn slechts twee buisjes nodig (Buis 1: monster - ongekleurd en Buis 2: monster - gekleurd), omdat het informatie zal geven over de cellen die leefden en de cellen die dood waren.
   2. Positieve controle op celdood: Plaats de gelabelde tube Dead unstained (Tube 3) en Dead-stained (Tube 4) gedurende 7 minuten in een waterbad bij 50 °C om celdood te induceren door warmtebehandeling.
   3. Kleuring van de cellen: Voeg 1 μl van de gereconstitueerde fluorescerende reactieve kleurstof (vanaf stap 4.1.2) toe aan 1 ml van de celsuspensie in buisjes 2 en 4 (buisjes die gekleurd worden) en meng goed.
   4. Incubeer 30 minuten bij RT, beschermd tegen licht.
      OPMERKING: Als fixatie niet nodig is, kunt u de onderstaande stappen 4.2.5-4.2.7 overslaan. Was de cellen in plaats daarvan tweemaal met 1 ml HBSS met 1% runderserumalbumine (zie aanvullend dossier 1) en suspendeer opnieuw in 1 ml HBSS met 1% runderserumalbumine. Voer de analyse zo snel mogelijk uit op de flowcytometer; Anders kan de levensvatbaarheid van de cellen in het gedrang komen omdat de cellen niet gefixeerd zijn.
   5. Was de cellen twee keer met 1 ml HBSS en suspendeer de cellen opnieuw in 900 μl HBSS.
   6. Voeg 100 μL 37% formaldehyde toe (LET OP, zie aanvullende tabel 2).
   7. Incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
   8. Was tweemaal met 1 ml HBSS met 1% runderserumalbumine (BSA) en suspendeer vervolgens de cellen in 1 ml HBSS met 1% BSA.
   9. Bewaar de monsters in de koelkast bij 4 °C. Analyseer de cellen binnen 1 maand na fixatie.
   10. Analyseer de gefixeerde celsuspensie door middel van flowcytometrie met behulp van het juiste excitatie- en detectiekanaal.
       OPMERKING: De juiste excitatie- en detectiekanalen kunnen verschillen afhankelijk van het instrument dat wordt gebruikt (zie aanvullende tabel 3).

Figuur 4 — Illustratieve beschrijving van de kleuring en fixatie van leukocyten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

5. Flowcytometrie

1. Gegevens verzamelen.
   OPMERKING: De procedures die op de flowcytometer moeten worden gevolgd, kunnen variëren, afhankelijk van de specifieke cytometer die wordt gebruikt. In deze studie werden gegevens verkregen met behulp van de Attune NTx-flowcytometer.
   1. Voer de samples uit.
   2. Plaats het monsterbuisje in de monsterpoort.
   3. Begin met acquisitie door op start te drukken en klik vervolgens op opnemen zodra de gebeurtenissnelheid (gebeurtenissen/seconde) is gestabiliseerd.
   4. Registreer minimaal 10.000 gebeurtenissen voor elk monster in de singletspoort voor een betrouwbare analyse.
   5. Sla alle gegevens voor elk monster op en maak er een back-up van op externe schijven of cloudopslag.
2. Analyseer de gegevens.
   OPMERKING: Voor flowcytometrie-analyse zijn verschillende software-opties beschikbaar. In dit onderzoek is data-analyse uitgevoerd met behulp van de FlowJo v10.8.1¹⁹.
   1. Gegevensbestanden laden: Start de flowcytometrie-analysesoftware en upload de verkregen .fcs-bestanden van het experiment.
   2. Visualiseer de gegevens (Figuur 5A): Zet voorwaartse verstrooiing (FSC-A) (XX) versus zijverstrooiing (SSC-A) (YY) uit om de celgrootte en granulariteit te beoordelen.
      OPMERKING: Deze grafiek wordt vaak gebruikt om celpopulaties te identificeren en puin uit te sluiten op basis van hun verstrooiingseigenschappen.
   3. Uitsluiting van singlet-celpoorten en veelvouden (Afbeelding 5B): Gebruik het voorwaartse spreidingsgebied (FSC-A) versus de voorwaartse spreidingshoogte (FSC-H) om veelvouden uit te sluiten. Teken een poort om alle uitgelijnde gebeurtenissen in de grafiek op te nemen (enkele cellen) en sluit de niet-uitgelijnde gebeurtenissen (veelvouden) uit. Als de steekproef gebeurtenissen heeft met een zeer lage FSC, sluit deze dan uit door ze niet op te nemen in de poort van de enkele cel, zodat er alleen singletcellen overblijven.
   4. Identificatie van leukocytenpopulaties (Figuur 5C): Onderscheid de 3 leukocytenpopulaties op basis van FSC-A/SSC-A-profiel: FSC-A^hoog/SSC-A^hoog zijn granulocyten, het FSC-A^medium/SSC-A^medium zijn de monocyten en FSC-A^laag/SSC-A^laag zijn de lymfocyten.
   5. Levensvatbaarheidspoort (Figuur 5D): Stel de drempel in voor kleurstofkleuring voor de levensvatbaarheid op het overeenkomstige fluorescentiekanaal (NIR, RL3-A). Levende versus dode cellen worden gedefinieerd op basis van de kleuringsintensiteit met LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain: zwak gekleurde cellen worden gedefinieerd als de levende cellen en de sterk gekleurde cellen worden gedefinieerd als dode cellen.
   6. Bevolkingsstatistieken: Bekijk de statistieken die door de software worden geleverd, inclusief het totale aantal gebeurtenissen (cellen) in elke poort en percentages van het totale aantal en omheinde cellen.
   7. Gegevens exporteren: Exporteer de gegevens naar een spreadsheet en gebruik geschikte statistische software (GraphPad Prism of R) voor verdere statistische analyse.
      OPMERKING: De keuze van analysemethoden hangt af van de doelstellingen van het onderzoek.

Figuur 5: Flowcytometrie-poortstrategie voor levensvatbaarheidsbeoordeling in niercellen in het hoofd: (A) Vertegenwoordigt het FSC-A/SSC-A-profiel van alle verzamelde gebeurtenissen. (B) Vertegenwoordigt uitsluiting van veelvouden op basis van de definitie van singletsgebied op basis van lineariteit op de grafiek Forward Scatter (FSC-A)/Forward Scatter (FSC-H). (C) Vertegenwoordigt de 3 belangrijkste populaties die zijn gedefinieerd op basis van FSC-A/SSC-A, na uitsluiting van veelvouden. (D) Vertegenwoordigt een histogram met kleurstofkleuring voor levende/dode levensvatbaarheid. Om de drempel in te stellen die het mogelijk maakt om levende en dode cellen te onderscheiden, werden leukocyten onderworpen aan een milde hitteschok (50 °C, 7 min) en vervolgens gekleurd met levensvatbaarheidskleurstof. Positieve cellen met een hoge kleuringsintensiteit (++) zijn de dode cellen en positieve cellen met een lage kleuring (+-) zijn de levende cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

Figuur 6 toont representatieve flowcytometriegegevens die leukocytenpopulaties tonen die zijn geïsoleerd uit de kopnier van jonge goudbrasem (Sparus aurata) en hun cellevensvatbaarheid met behulp van het protocol dat in deze studie is beschreven. De figuur vergelijkt twee monsters: een met een hoge cellulaire levensvatbaarheid, waarbij de vissen werden blootgesteld aan optimale omstandigheden (Fi...

Discussie

De methode die in deze studie is ontwikkeld, vertegenwoordigt een aanzienlijke vooruitgang in het onderzoek naar visimmunologie en belooft het begrip van de immuunrespons van vissen en de duurzaamheid van mariene hulpbronnen te verbeteren. S. aurata is een waardevolle zeevissoort van de familie Sparidae die om verschillende redenen als een ideaal modelorganisme dient, waaronder zijn ecologische en economische relevantie, evenals zijn veelzijdigheid in laboratoriumonderzoek in ve...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Air Stones	N/A	N/A
Aquafeed	SPAROS, Lda., Portugal	N/A	Hoogwaardige voeding
Automatic Cell Counting Equipment	NanoEnteK, Korea	N/A	EVE automatische celteller (NanoEnteK)
Automatic Water Refrigeration Systems	Foshan Weinuo Refrigeration Equipment Co., Ltd, China	N/A
Bio balls 1.5" Aquarium Pond Filter	TMC Iberia, Portugal	N/A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, Germany	A7906
Bucket (3 L)	N/A	N/A	Om euthanasie voor te bereiden en uit te voeren
Buckets (5 L)	N/A	N/A	Om de dieren te vervoeren
Cell Strainers	Jetbiofil, China	CSS-013-100	Cell Strainer, 100 μm nylon mesh, steriele, geel
Centrifugue	Fisher Scientific, Germany	N/A	accuSpin Micro 17 R
Colorimetric Test Kit for Ammonia (NH4+/NH3)	Tropic Marin, USA	N/A
Colorimetric Test Kit for Nitrate (NO3-)	Tropic Marin, USA	N/A
Colorimetric Test Kit for Nitrite (NO2-)	Tropic Marin, USA	N/A
Computer	N/A	N/A	Om de gegevens te verzamelen en te analyseren die zijn verkregen van de flowcytometer
Computerized Control System (Profilux)	GHL, Germany	N/A	ProfiLux 3 Outdoor
Deionized water	N/A	N/A	Om de flowcytometer schoon te maken
Density Gradient Medium: Percoll	Cytiva, Sigma-Aldrich, Germany	17-0891-01
Digital scale	KERN & Sohn GmbH, Germany	N/A	KERN EMS 300-3
Ethanol 70%	Millipore, Supelco, Portugal	EX0281	Om de werkruimte schoon te houden
EVE Cell Counting Slides	NanoEnteK, Korea	N/A
Falcon Tubes (15 mL)	pluriSelect Life Science, Germany	05-00002-01	Steriele
Filter bag	TMC Iberia, Portugal	N/A	400 micron
Filter Sponge	N/A	N/A
Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific, USA	N/A	Attune flowcytometer
FlowJo v10.8.1 Software	BD Life Sciences	N/A
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich, Germany	8.18708
Glass Wool	N/A	N/A
Hanks' Balanced Salt Solution	Merck Life Science S.L, Portugal	H6648	Gemodificeerd, met natriumbicarbonaat, zonder fenolrood, calciumchloride en magnesiumsulfaat, vloeibaar, sterieel gefilterd, geschikt voor celkweek
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kits	Life Technologies Europe, Netherlands	L10119	Near-IR fluorescent reactieve kleurstof + DMSO
Main Water Pumps	EHEIM, Germany		Universal 1200
Microcentrifuge Tubes (2 mL)	BRAND, Merck, Germany	Z628034	Steriele
Micropipette Tips	Sartorius, Germany	790010, 790200, 791000	Compatibel met Sartorius, 1-10 µL, 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL
Micropipettes	Sartorius, Germany	728020, 728030, 728060, 728070	Sartorius ProlinePlus 1-10 µL, 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL
Mini Cell Strainers	pluriSelect Life Science Global Headoffice, Germany	43-10100-50	PluriStrainer 100 µm nylon mesh, steriele
Multi-Parameter Measuring Instrument	WTW, Germany		Multi 3420 SET G + IDS digitale geleidingscel (TetraCon 925) + Optische IDS DO-sensor (FDO 925) + IDS pH-elektrode (SenTix 940)
Pasteur Pipettes (1 mL, 5 mL)	Humeau Expert du laboratoire, France	248295	Steriele
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1194.500	60 x 15 mm, Polystyrene, steriele
pH Meter	Hanna Instruments Inc., Romania		HANNA HI2211
Polystyrene round-bottom Falcon tubes (5 mL)	Fisher Scientific, Germany	14-959-2A	Steriele
Portable Precision Thermometer	Ebro Electronic, Germany	N/A	TFX 430
Protein Skimmers	Mantis	N/A	Tornado 120
Quality control beads/Performance test beads	Thermofisher Scientific, USA	N/A
Quarantine Tanks	N/A	N/A	Tanks met een totaal volume van 660 L
Rectangular Glass Tanks/Aquariums	N/A	N/A	Tanks met een totaal volume van 200 L
Refrigerator	N/A	N/A	Om de monsters te bewaren bij 4 °C
Ruler 30 cm	N/A	N/A	Om de lengte van de vissen te meten
Sodium bicarbonate	Honeywell Fluka, Germany	31437	Natriumwaterstofcarbonaat (NaHCO3)
Sodium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	S9888
Sterile Dissection Tools	N/A	N/A	(bijv. scalpel, schaar, pincet met fijne punt, dissectielade/-bord)
Submerged Digital Heaters	TMC Iberia, Portugal		300 W, V2Therm Digital Heaters
Syringes 1 mL	IVFSTORE, USA	8300014579-MEA	Steriele, HSW Soft-Ject-spuiten om kop-nier te macereren
Temperature Sensors	GHL, Germany		PT 1000
Tricaine (MS-222)	ThermoFisher Scientific, Germany	118000