Een tweetalige computationele workflow voor het identificeren van potentiële PLK1-remmers in Amerikaanse gebarentaal en Engels

Samenvatting

Dit tweetalige protocol biedt een computationele workflow voor geneesmiddelenontdekking die eiwit-ligandinteracties van Polo-achtige Kinases 1 tot 3 (PLK1–3) en de eigenschappen van Absorptie, Distributie, Metabolisme, Excretie, Toxiciteit en Stabiliteit (ADMET-S) van in databases gebaseerde natuurlijke moleculen beoordeelt.

Samenvatting

Polo-achtige Kinase 1 (PLK1) speelt essentiële rollen in de S-, G2- en M-fasen van de celcyclus, en de overexpressie ervan wordt vaak waargenomen bij meerdere kankers, waaronder borstkanker, waar het bijdraagt aan genomische instabiliteit en ontregelde apoptose. In tegenstelling tot conventionele ATP-competitieve remmers die het kinasedomein aanpakken, biedt selectieve remming van het polobox-domein (PBD) van PLK1 een veelbelovende strategie om eiwit-ligandinteracties die cruciaal zijn voor mitotische progressie te verstoren, waardoor apoptose in kankercellen wordt getriggerd. De hoge structurele gelijkenis tussen PLK1 en zijn homologen (PLK2 en PLK3), die respectievelijk essentieel zijn voor neurologische functie en de stressrespons, vereist echter uitzonderlijke selectiviteit om off-target effecten te vermijden. Om deze uitdaging aan te pakken, omvat het protocol een tweetalige (Amerikaanse Gebarentaal en Engels) computationele workflow die virtuele screening, structurele clustering, eiwit-ligand koppeling, binding affiniteitsvoorspelling, ADMET-S-profilering en kwantummechanische (QM) stabiliteitsanalyse integreert. Beginnend met de SuperNatural 3.0 natuurlijke productdatabase werden verbindingen gefilterd met borstkankerrelevantie en medicijngelijkheidscriteria, geclusterd om chemische diversiteit te waarborgen, en hun interacties met PLK1-, PLK2- en PLK3-PBD-structuren geëvalueerd. Hoewel virtuele koppeling en in silico ADMET-S-beoordelingen de selectiviteit of werkingsmechanisme niet definitief kunnen bevestigen, genereert deze studie testbare hypothesen en geeft prioriteit aan een gerichte set van kandidaten op basis van natuurlijke producten voor toekomstige moleculaire dynamica-simulaties, biochemische validatie of experimentele screening.

Inleiding

Polo-achtige kinases (PLK's) zijn een familie van eiwitkinasen die structureel bestaan uit een N-terminal domein en een C-terminus bestaande uit één of twee polo-box domeinen (PBD)^1,2.  Het aantal en de functionele diversiteit van deze polobox-domeinen variëren tussen verschillende PLK-familieleden. PLK1 is betrokken bij de S-, G2- en M-fasen van celdeling. In de celcyclus functioneert PLK1 als controlepunt voor DNA-schade in de S-fase en als regelaar van chromosomale condensatie en centrosoomrijping in de G2-fase. PLK1 bevordert ook de mitotische ingang in de ^M-fase, gevolgd door spindelassemblage, anafase-ingang en cytokinese^3,4. Overexpressie van PLK1 leidt tot genetische instabiliteit door abnormale centrosoomvorming, wat resulteert in defecte celcycli waardoor cellen de apoptose niet kunnen reguleren.  Dergelijke overexpressie wordt waargenomen bij long-, hoofd- en hals-, slokdarm-, maag-, colorectale en borstkanker⁴. Daarom kan remming van PLK1 via middelen die zich richten op de PBD apoptose ^5,6 veroorzaken. Deze workflow is gericht op het bereiken van hoge selectiviteit om te voorkomen dat PLK2 en PLK3 worden geremd, die cruciaal zijn voor neurologische functies en het beheer van genotoxische stress³.

PLK2 functioneert in bepaalde contexten als tumorsuppressor, reguleert de G1/S-overgang en bevordert de afbraak van cycline E om ongecontroleerde celproliferatie te voorkomen. PLK3 speelt een complexe rol in zowel de regulatie van de celcyclus als de respons op genotoxische stress, en draagt bij aan het behoud van de integriteit van het genoom door betrokkenheid bij activatie van DNA-schadecontrolepunten en apoptose-inductie⁷. Belangrijk is dat, hoewel PLK1-inhibitie is uitgegroeid als een veelbelovende therapeutische strategie voor kankerbehandeling, de essentiële rollen van PLK2 en PLK3 in neurologische werking en stressrespons de ontwikkeling van zeer selectieve remmers noodzakelijk maken om off-target effecten op deze cruciale kinases^te minimaliseren 3. Deze biologische context en structurele overeenkomsten boven 38%³ onderstrepen het belang van het identificeren van verbindingen die specifiek het polo-box domein (PBD) van PLK1 aanpakken, zonder de beschermende functies van PLK2 en PLK3 in de normale cellulaire fysiologie te verstoren.

Bekende polo-achtige kinase (PLK)-remmers, met name die gericht zijn op PLK1, zijn uitgebreid bestudeerd vanwege hun potentiële therapeutische toepassingen in de kankerbehandeling. Verschillende verbindingen, waaronder BI 2536, volasertib (BI 6727), onvansertib (NMS-1286937) en GSK461364, zijn ontwikkeld en doorgewerkt in klinische proeven, vaak als ATP-competitieve remmers ^8,9,10. Andere typen remmers richten zich op de PBD, waaronder Thymoquinon (TQ)^11,12, Poloxine^13,14 en Allopole-A¹⁵. Hoewel het naar verluidt veelbelovend is, zijn er momenteel geen goedgekeurde PBD-specifieke remmers of klinische studies in een late fase vanwege uitdagingen, waaronder suboptimale ADMET-S-eigenschappen en off-target effecten⁶. Zo zijn verschillende PLK1-PBD-remmers naar verluidt niet-specifieke eiwitalkylatoren¹⁶, wat hun klinische toepasbaarheid beperkt. Daarom blijft het verbeteren van de selectiviteit en ADMET-S-profielen van potentiële PLK1-PBD-remmers een cruciaal doel in geneesmiddelenontdekking.

Het doel van deze studie is om potentiële PLK1-PBD-remmers met ADMET-S-eigenschappen te onderzoeken met behulp van virtuele screening, structurele gelijkheidsfiltering, docking, bindingsenergieberekeningen en ADMET-S-evaluatie. PLK2 en PLK3 werden onderworpen aan dezelfde protocollen om potentiële selectiviteit te beoordelen. Hoewel er talrijke computationele pijplijnen bestaan voor de ontdekking van kinase-inhibitoren, integreren weinig gelijktijdige selectiviteitsscreening over PLK1–3 PBD's met uitgebreide ADMET-S- en kwantummechanische stabiliteitsanalyses, met name met behulp van natuurlijke productbibliotheken. De workflow bouwt voort op gevestigde virtuele screeningsparadigma's, maar is afgestemd op toegankelijkheid van onderwijs en het genereren van hypotheses in een vroeg stadium. Het protocol vereist alleen een standaard laptop (8 GB RAM), gratis academische software en geen eerdere programmeerexpertise, waardoor het geschikt is voor middelbare school, bachelor- en masteropleidingen, inclusief cursusgebaseerde undergraduate onderzoekservaringen (CUREs).

De computationele pijplijn voor dit werk begint met eiwitvoorbereiding, waarbij structuren van PLK1-PBD, PLK2-PBD en PLK3-PBD worden opgehaald uit de Protein Data Bank (PDB) of gemodelleerd en verwerkt om structurele discrepanties op te lossen. Vervolgens werd een screening in de natuurlijke productdatabase uitgevoerd, waarbij verbindingen werden gefilterd op basis van potentieel anti-borstkanker en Lipinski's Rule of Five-naleving. De volgende stappen zijn clustering in 50 representatieve structuren op basis van moleculaire vingerafdrukken en gelijkenis. Deze vertegenwoordigers ondergingen eiwit-ligandenkoppeling en bindingsaffiniteitsberekeningen, waarbij interactiegegevens werden gegenereerd voor de drie PLK's. Vervolgens worden de eigenschappen van ADMET-S geëvalueerd met drie verschillende webservers om farmacokinetiek, geneesmiddelgelijkheid, toxiciteit en metabole stabiliteit te voorspellen. QM-berekeningen werden gebruikt om de moleculaire stabiliteit te beoordelen via Highest Occupied Molecular Orbital (HOMO) en Lowest Unoccupied Molecular Orbital (LUMO) analyses van de HOMO–LUMO-kloof. Ten slotte werden de ADMET-S-gegevens geanalyseerd om verbindingen te filteren en te rangschikken op basis van fysisch-chemische, absorptie-, distributie-, metabolisme-, uitscheidings-, toxiciteits- en stabiliteitscriteria als potentiële en selectieve PLK1-PBD-remmers.

Protocol

De Research Resource Identifiers (RRIDs) en versienummers van alle gebruikte softwaretools worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Doeleiwitbereiding

1. Maak een werkmap aan voor dit project waar structurele bestanden en rekenresultaten kunnen worden opgeslagen.
2. Bezoek de Protein Data Bank om de identificatie van doeleiwit PLK1-PBD (4HCO¹¹) op te halen en volg op met Chemie bij HARvard Molecular Mechanics - Graphical User Interface (CHARMM-GUI ^17,18) om eventuele structurele discrepanties op te lossen.
   1. Bezoek CHARMM-GUI en registreer een academisch account. Na het registreren van een academisch account klik je op de invoergenerator, vervolgens PDB Reader, voer je de PDB ID 4HCO in en klik je op volgende stap.
   2. Zorg er op de volgende pagina voor dat alleen PROA – eiwitketen A is geselecteerd en klik op de volgende stap voor de volgende twee pagina's.
   3. Download step1_pdbreader.pdb naar een map, hernoem het bestand naar 4hco of preferred, en gebruik een teksteditor of code om voorkomsten van histidine (HSD) te hernoemen naar (HIS).
3. Herhaal de procedure voor de PLK2-PBD (PDB-identificatie: 4XB0¹⁹) met behulp van de CHARMM-GUI.
   OPMERKING: Voor structuren zonder PDB-identificaties, zoals de PLK3-PBD, gebruik homologiegemodelleerde structuren of Alphafold²⁰. Zorg voor sequentienauwkeurigheid vanuit Uniprot²¹.

2. Screening van natuurlijke productdatabases

1. Bezoek de SuperNatural 3.0 Library-database van natuurlijke producten en selecteer de ziekte-subpagina²².
   1. Selecteer borstkanker met of geen betrouwbaarheidslimieten, omdat alle resultaten programmatisch gefilterd moeten worden, en klik op Zoeken. Klik op Download het volledige resultaatbestand om de resultaten als .csv in een voorkeurmap op te slaan. Gebruik daarna code om te filteren voor degenen met betrouwbaarheidslimieten van 0,900–1,000 (n = 1.193 van de 73.406).
      OPMERKING: Alternatief kan de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) identificatie voor borstkanker worden ingevoerd op subpagina²³ van de pathways.
   2. Ga naar de FAQ-subpagina , onderaan, vind de volledige dataset die als .csv bestand beschikbaar is om te downloaden. Download dit en gebruik een script om Simplified Molecular Input Line Entry System (SMILES)-strings uit de dataset te koppelen aan SuperNatural-identificaties van de 1.193 moleculen en bereid een lijst voor van hun SMILES-strings (smiles.csv).

3. Clusterbemonstering

1. Download een Anaconda-distributie (https://www.anaconda.com/download) die bijna alle open-source pakketten bevat, of download individueel een geïntegreerde ontwikkelomgeving (IDE) zoals RStudio (RStudio Desktop - Posit) of Jupyter (Jupyter Notebook). Installeer RDKit²⁴, een open-source cheminformatica- en machine learning-pakket met behulp van Conda.
   OPMERKING: Instructies voor het installeren van Conda en het creëren van een Conda-omgeving zijn te vinden in de documentatie van conda 25.9.2.dev31. Voor RDKit-installatie en module-installatie in de omgeving, zie Installatie — De RDKit 2025.03.6 documentatie.
2. Plaats het script "Lipinski.py" in Supplemental File 1 in dezelfde map als "smiles.csv" en voer het uit. Het script opent de Conda-omgeving, laadt modules, leest het SMILES-stringsbestand, past een filter toe op basis van Lipinski's Regel van 5 voor de schatting van biobeschikbaarheid en absorptie (n = 999 van de 1.193), en slaat een lijst van SMILS-strings op als "all.csv".
   OPMERKING: Bevestig dat "all.csv" is gegenereerd en ~999 verbindingen bevat (gefilterde subset). Open het bestand om te controleren of elke invoer een geldige SMILES-string bevat. Python draait in RStudio nadat het volgende in de console is uitgevoerd: library(reticulate); reticulate::use_condaenv(naamvancondaenv)
3. Plaats het script "Clustering.py" (Supplemental File 1) in dezelfde map als "all.csv" en voer het uit in de voorkeurs-IDE. De scripts laden clusteringmodules, lezen het SMILES-stringsbestand en groeperen compounds in 50 clusters op basis van moleculaire vingerafdrukken en Tanimoto-overeenkomsten.
   OPMERKING: 50 representatieve structuren (rep_struct.csv, in het Supplemental File 1) worden opgeslagen in de map als een lijst van SMILES-strings. Tanimoto-gelijkenis (ook bekend als de Jaccard-index in de cheminformatica)²⁵ is een metriek die wordt gebruikt om de structurele gelijkenis tussen twee moleculen te kwantificeren op basis van hun moleculaire vingerafdrukken, waarbij de Tanimoto-coëfficiënt varieert van 0 (geen gelijkenis) tot 1 (identieke vingerafdrukken). Zorg ervoor dat "rep_struct.csv" precies 50 unieke SMILES-vermeldingen bevat die elk cluster vertegenwoordigen.

4. Berekening van eiwit-ligandkoppeling en bindingsaffiniteit

1. Bezoek de AutoDock Vina-gebaseerde holjesdetectie-geleide Blind Docking-webserver (CB-Dock2)²⁶.
   1. Ga naar het docking-tabblad en upload het 4HCO-eiwit.
   2. Om de ligand te uploaden, klik je op 'draw ligand ' en plak je een ligand uit de lijst met SMILES-strings (rep_struct.csv, Supplemental File 1). Voer een e-mailadres in in het volgende veld voor eenvoudiger gezippte gegevensverzameling en klik vervolgens op Auto Blind Docking. Herhaal dit voor de overige 49 kleine molecuulclustervertegenwoordigers, waarbij je ze lig1, lig2, ..., lig50 labelt.
2. Ga naar het geëmailde resultaat en download de zip-mappen naar een submap met de titel 4HCO, waarbij je ze ordinaal (4hco_lig1, 4hco_lig2, ..., 4hco_lig50) noemt.
   1. Pak de mappen uit en verwijder alle bestanden behalve eiwit-ligand complexe bestanden die eindigen op ".complex.pdb".
      OPMERKING: Controleer of elke ligandmap (4hco_lig1 naar 4hco_lig50) het bijbehorende bestand ".complex.pdb" bevat.
   2. Open een voorbeeld .complex.pdb-bestand met een teksteditor om zorgvuldig de eiwitketen-ID: P en de ligand-ID A:UNL te noteren en de mappen opnieuw te herpakken met een bestandscompressiehulpprogramma.
   3. Bezoek de PROtein binDing enerGY prediction (PRODIGY) webserver om selectiviteit en eiwit-ligandbinding affiniteit^{te beoordelen 27}.
      1. Klik op het tabblad PRODIGY-lig (eiwit-klein molecuul) om een gezipte map te uploaden met meerdere eiwit-ligandencomplexen tegelijk (zoals 4hco_lig1). Voer de eiwitketen- en ligand-ID's in, voltooi de captcha-verificatie en klik vervolgens op Submit Prodigy-Ligand.
      2. Zodra de data is verwerkt, klik je op het archiefbestand van alle uitvoer (.zip) om de resultaten te downloaden. Herhaal de vorige stap en de resultaatverzameling voor alle submappen tot 4hco_lig50.
   4. Herhaal alle stappen voor eiwitten 4XB0 en PLK3 met zorgvuldige aandacht voor de bestandsnomenclatuur (zoals 4xb0_lig1 of plk2_lig1).
      OPMERKING: Bevestig dat output-CSV's voor alle eiwit-ligandcomplexen zijn gedownload en zowel ΔG- als interfaceresidudatakolommen bevatten.

5. ADMET-S evaluatie

1. Bezoek het ADMETlab3 3.0 platform²⁸.
   1. Klik op START ONDER "ADMET Screening" en vul een lijst met SMILES in.
      1. Open rep_struct.csv in een map om de volledige lijst met de SMILS-strings in het tekstveld te plakken en in te dienen.
      2. Evalueer farmacokinetiek en geneesmiddelgelijkheidseigenschappen met behulp van het kleurgecodeerde scoresysteem van het platform en download de evaluatieresultaten als een .csv bestand voor verdere analyse.
      3. Navigeer naar de SwissADME-tool²⁹.
2. Plak de lijst met SMINS-reeksen voor alle 50 moleculen in het invoerveld.
   1. Klik op Run om biobeschikbaarheid en permeabiliteitseigenschappen te berekenen, inclusief BBB-penetratie.
   2. Download de uitvoer als een .csv bestand voor integratie met andere ADMET-resultaten.
3. Download en installeer ToxTree³⁰ (Toxic Hazard Estimation via een Decision Tree-benadering) compatibel met het besturingssysteem van de gebruiker.
   1. Open de software via de terminal met het commando: sh Toxtree.sh
   2. Voer de SMILS-strings individueel in ToxTree om toxiciteit te classificeren op basis van Cramers regels.
   3. Exporteer de resultaten als een .csv bestand voor integratie met andere ADMET-gegevens.
      OPMERKING: Controleer of ADMETLab3 en SwissADME output-CSV's overeenkomen met het aantal liganden (n = 50) en dat Toxtree-resultaten elke verbinding classificeren volgens de regels van Cramer (I–III).
4. Na installatie van ORCA³¹ maak je een map genaamd stability aan in de werkmap en submappen voor elk molecuul (bijvoorbeeld plk1_lig1, plk1_lig2, ..., plk1_lig50).
   1. Gebruik Avogadro (Avogadro) om elk molecuul te bouwen uit zijn SMILES-string: Ga naar het tabblad Uitbreidingen en klik op Geometrie optimaliseren om het molecuul te optimaliseren. Genereer ORCA-invoerbestanden via extensies > ORCA > Genereer ORCA-invoer en pas de volgende instellingen toe:
      ! B3LYP OPT FREQ def2-TZVP
      %maxcore 4000
      %pal
      NPROCS 1
      einde
   2. Pas het gedownloade .sh taakbestand voor elke ligand aan om unieke functienamen en een e-mailadres toe te voegen. Daarna zet u de "stability"-map over naar een high-performance computing (HPC) systeem met de volgende commando's:
      ssh xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu
      MKDIR ~/4hco
      SCP -r /local/path/to/stability xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu:~/4hco
   3. Voer de taken uit via Simple Linux Utility for Resource Management (SLURM workload manager voor HPC-clusters) met een loopscript:
      voor i in {1..50}; doe
      cd ~/4hco/stabiliteit/plk1_lig${i}
      chmod +x job_lig${i}.sh
      sbatch job_lig${i}.sh
      Gedaan
   4. Na ontvangst van e-mails over het voltooien van het werk ga je naar de ligandmappen en open je uitvoerbestanden om de data te bekijken en de HOMO- en LUMO-waarden te noteren:
      cd ~/4hco/stabiliteit/plk1_lig1
      nano lig1.out

6. Analyse van ADMET-S-gegevens

1. Combineer de fysisch-chemische eigenschappengegevens afkomstig van SwissADME-biobeschikbaarheids- en permeabiliteitsradarkaarten in een .csv bestand.
   1. Sla het .csv bestand op van SwissADME en noem het "Physiochemical.csv."
   2. Plaats het "Physiochemical.py"-script (Supplemental File 1) in dezelfde map als "Physiochemical.csv" en voer het uit.
   3. Pas de volgende criteria toe: nHD: 0–7, nHA: 0–12, nStereo: <2, LogP: 0–3, LogD: 1–3, LogS: –4 tot 0,5, Fsp3: >0,41, en nHet: 1–15.
2. Haal de absorptie- en distributiegegevens af van SwissADME.
   1. Maak een snapshot en sla de BOILED-Egg^32-tabel op in SwissADME.
   2. Pas de volgende criteria toe: moleculen moeten in het "ei"-gebied liggen en fungeren als p-glycoproteïne-remmers, omdat de rode punten de voorkeur hebben.
3. Haal de metabolismegegevens uit ADMETlab3.0 voor cytochroom (CYP) substraat en remmers.
   1. Sla .csv bestand op uit ADMETlab3.0 en noem het "Metabolism.csv".
   2. Bewerk het .csv-bestand en bewaar alleen de kolommen van CYP-inh en CYP-sub.
   3. Plaats het script "Metabolism.R" (Supplemental File 1) in dezelfde map als "Metabolism.csv" en start het.
   4. Pas de volgende criteria toe: CYP p450-remmer en niet-substraat als categorie 0 hebben de voorkeur.
4. Leid de uitscheidingsgegevens af van ADMETlab3.0 voor plasmaklaring en halfwaardetijd.
   1. Sla .csv bestand op van ADMETlab3.0 en noem het "Excretion.csv".
   2. Bewerk het .csv-bestand en bewaar alleen de kolommen cl-plasma en t0.5.
   3. Plaats het script "Excretion.py" (Supplemental File 1) in dezelfde map als "Excretion.csv" en start het.
   4. Pas de volgende criteria toe: plasmaklaring: 0,01–5 ml/min/kg.
   5. nToxiciteitsgegevens van Toxtree voor de klasse van toxiciteit en ADMETlab3.0 voor het aantal toxicoforen.
      1. Sla .csv op uit ADMETlab3.0 en noem het "Toxicity.csv."
      2. Bewerk het .csv-bestand, behoud alleen de kolom Toxicophore, en voeg een nieuwe kolom toe die de toxiciteitsklasse van elke ligand uit Toxtree registreert.
      3. Plaats het "Toxicity.py"-script (Supplemental File 1) in dezelfde map als "Toxicity.csv" en voer het uit.
      4. Pas het volgende criterium toe: het aantal toxicoforen moet 0–2 zijn.
   6. Haal de stabiliteitsgegevens uit ORCA-uitvoerbestanden. De ("ORBITALE ENERGIEËN", specifiek de HUMO en LUMO energiewaarden).
      1. Maak een Excel-grafiek aan waarin de HUMO- en LUMO-energieën van elke ligand als aparte kolommen worden geregistreerd.
      2. Voeg een nieuwe kolom toe die de Bandkloof berekent (HUMO–LUMO = Band Gap).
      3. Bewaar de Excel-grafiek als "Stability.csv."
      4. Plaats het "Stability.py"-script (Supplemental File 1) in dezelfde map als "Stability.csv" en voer het uit.
      5. Pas de volgende criteria toe: het bandverschil ligt tussen 3,6–5 eV.

Resultaten

Het target protein structure file protocol zorgt ervoor dat het target eiwitbestand geoptimaliseerd is voor analyse en structurele docking. Het resulterende structuurbestand, in PDB-formaat, is vrij van ontbrekende residuen en waterstoffen, ontbrekende atoomtypes en onnodige componenten zoals watermoleculen en co-gekristalliseerde liganden. Figuur 1A,B toont visuele verschillen (gevisualiseerd door Mol* Viewer³³) in structuren vóór en na de voorbereiding. Als er nog restformatteringsproblemen blijven (zoals niet-herkende atoomnamen of onvolledige residuen), zal CB-Dock2 doorgaans een foutmelding geven bij upload. Op dat moment kunnen kleine handmatige correcties, zoals het hernoemen van HSD naar HIS of het verwijderen van niet-standaard residuen, worden toegepast voordat de dockingstap opnieuw wordt geprobeerd.

Figuur 2 toont de resultaten van clustering via principal component analysis (PCA) op basis van moleculaire vingerafdrukken en Tanimoto-overeenkomst. In de afbeelding is elke cluster gegroepeerd door een grijs-gekleurde ovaal met stippen van vergelijkbare kleuren, die de moleculen in die clusters voorstellen.  PCA-componenten 1 en 2 op de assen bieden een tweedimensionale lineaire weergave van de reductie van hoogdimensionale elementen in Tanimoto-matrices. In deze studie wordt Tanimoto-gelijkenis gebruikt tijdens de clusterbemonsteringsstap om redundantie te verminderen en de chemische diversiteit tussen de 999 Lipinski-conforme natuurlijke producten te vergroten. Door paargewijze Tanimoto-overeenkomsten te berekenen met behulp van moleculaire vingerafdrukken, wordt de dataset opgedeeld in 50 clusters van structureel verwante verbindingen. Vervolgens wordt uit elke cluster één representatief molecuul geselecteerd, zodat de uiteindelijke set van 50 liganden een grote chemische ruimte inneemt, terwijl de rekenkundige redundantie bij downstream docking en ADMET-S-analyses wordt geminimaliseerd. Deze strategie verhoogt de efficiëntie en representativiteit van virtuele screening, vooral bij het werken met grote natuurlijke productbibliotheken zoals SuperNatural 3.0. (zie Figuur 2).

Optimale houdingen voor elk eiwit-ligandencomplex worden gesimuleerd, vergezeld van voorspelde affiniteiten in de vorm van Vina-scores tussen de vijf CurPocket-houdingen van het PLK1-eiwit in CB-Dock2, waarbij rekening wordt gehouden met van der Waals-krachten en waterstofbruggen.  Een voorbeeldsimulatie van ligand 1 in Figuur 3 toont de beste binding aan de tweede CurPocket-pose (C2), met de laagste Vina-score van –7,5 kcal/mol, vergeleken met de andere vier tophoudingen. Moleculaire koppeling met CB-Dock2 gebeurt via een scorefunctie gebaseerd op empirische parameters en een stochastisch globaal optimalisatie-algoritme. CB-Dock2 is grondig gevalideerd en heeft superieure prestaties aangetoond vergeleken met andere geavanceerde blinde dockingtools, waardoor het een uitstekende keuze is voor dockingstudies^26,34. De server behaalt een slagingspercentage van ongeveer 85% voor binding pose prediction (RMSD <2 Å), waarmee hij populaire tools overtreft, waaronder de eerste CB-Dock-versie, SwissDock, COACH-D en MTiAutoDock³⁴. Deze hoge nauwkeurigheid wordt toegeschreven aan CB-Dock2's innovatieve integratie van twee complementaire dockingschema's: structuurgebaseerde en template-gebaseerde benaderingen.

Figuur 4 illustreert een heatmap van de gemiddelde voorspelde affiniteiten voor elke eiwit-ligandcombinatie met behulp van PRODIGY-webservervoorspelde affiniteiten.  Hogere affiniteiten, geïdentificeerd door lagere molaire energieën (kcal/mol) en groenere heatmaptinten, zijn gunstige bindingsaffiniteiten. Daarentegen zijn lagere affiniteiten, gekenmerkt door hogere molaire energieën en roodere heatmaptinten, minder gunstig. Vanuit selectiviteitsoogpunt is het ideaal om verbindingen te hebben met gunstige affiniteiten voor het doeleiwit (PLK1) ten opzichte van homologen (PLK2–3). Ligand 27 is bijvoorbeeld een selectieve PLK1-PBD ligand ten opzichte van ligand 45, die vergelijkbare affiniteiten vertoont over alle drie de eiwitten. Hoewel de hits 3, 5, 6, 7, 27, 28, 34, 35 en 49 een hogere affiniteit voor PLK1-PBD vertonen dan PLK2/3, zijn ze chemisch divers in 2D-vingerafdrukruimte (gemiddelde ECFP4 Tanimoto ≈ 0,135, geen paar ≥ 0,50), wat suggereert dat bredere specificiteit waarschijnlijk wordt gedreven door geconserveerde PBD-pocketgeometrie en gedeelde 3D-farmacoforen/interactiepatronen in plaats van door de scaffoldidentiteit. Aanbevelingen omvatten interactie-vingerafdrukvergelijking en farmacoformapping om de structurele determinanten van PLK1-PBD-herkenning te identificeren.

De resultaten van de fysisch-chemische eigenschapsbeoordeling worden weergegeven in een radarkaart (Figuur 5). De beoordeelde eigenschappen omvatten atomaire interacties, oplosbaarheid en biobeschikbaarheid. Sommige verbindingen vallen op door hun meer wenselijke fysisch-chemische eigenschappen met de acceptabele bereiken: nHD = 0–7, nHA = 0–12, nStereo < 2, LogP = 0–3, LogD = 1–3, LogS = –4 tot 0,5, Fsp3 > 0,41, en nHet = 1–15. Deze radarkaart biedt een uitgebreide, multidimensionale visualisatie van de fysisch-chemische eigenschappen van de 50 representatieve liganden die zijn geïdentificeerd in de computationele screeningsworkflow. Het is ontworpen om te beoordelen hoe goed elke verbinding voldoet aan de vooraf gedefinieerde "medicijnachtige" criteria door de eigenschappen te plotten tegen vastgestelde onder- en bovengrenzen. De kaart toont tien belangrijke moleculaire descriptoren rond de polaire as, waaronder pKa zuur en pKa basisk. Het gearceerde gebied tussen de groene veelhoek (Ondergrens) en de blauwe veelhoek (Bovengrens) markeerde het ideale of acceptabele bereik voor elke eigenschap, gebaseerd op de drempels die in het protocol zijn gegeven. De boven- en ondergrenzen van pKa-zuur (2–12) en pKa-base (3–10)) werden toegekend op basis van literatuuroverzichten 35,36,37, aangezien er geen enkele boven- en ondergrens is voor pKa in geneesmiddelenontwikkeling. Elke gekleurde lijn vertegenwoordigt een van de 50 liganden. De vorm die wordt gevormd door de datapunten van een enkele ligand te verbinden, toont zijn profiel gelijktijdig over de geselecteerde tien eigenschappen. De overgrote meerderheid van de 50 liganden valt binnen of zeer dicht bij het acceptabele gebied dat wordt gedefinieerd door de groene en blauwe veelhoeken. Dit geeft aan dat de eerste filterstappen, met name de toepassing van Lipinski's Regel van Vijf en de clustering op basis van Tanimoto-gelijkenis, zeer effectief waren in het verrijken van de dataset met moleculen met gunstige geneesmiddelachtige eigenschappen. Het wordt aanbevolen om het volledige bereik van gedocumenteerde waarden voor alle parameters weer te geven.

Figuur 6A–C toont componenten van ADME-gegevens uit ADMETlab3.0 en SwissADME. Beginnend met absorptie en distributie geeft het BOILED-Egg model³⁸ in Figuur 6A van SwissADME de absorptie en distributie van de geneesmiddelen weer via lipofiliteit en permeabiliteit, zoals aangegeven door de gele en witte ellipsen in de grafiek. Het omvat P-gp-substraten en remmers, respectievelijk weergegeven door blauwe en rode punten, waarbij het remmen van P-gp cruciaal is voor hogere absorptiesnelheden. In Figuur 6B visualiseert de metabolisme-heatmap de remming en het substraat van ongeveer 7 varianten van CYP cytochroom p450-enzymen. Het gewenste resultaat voor de liganden is dat ze dienen als CYP niet-remmers en niet-substraten (groen), met voorkeursresultaten die een veilig geneesmiddelveiligheidsprofiel bevestigen met geen of lage interacties tussen geneesmiddel en geneesmiddel. Figuur 6C geeft uitscheidingsgegevens van de clearance en halfwaardetijd van het medicijn weer weer. Uitscheiding kan worden onderscheiden door de optimale plasmaklaring (<5 mL/min/kg). De halfwaardetijd van alle antikankermedicijnen hangt af van het werkingsmechanisme, de toxiciteit en het doelwit van het medicijn. De ideale halfwaardetijd balanceert het handhaven van de medicijnconcentraties binnen een therapeutisch venster, terwijl toxiciteit wordt geminimaliseerd en een handige doseringsschema^{mogelijk is.}

De combinatie van twee soorten toxiciteitsevaluaties wordt weergegeven. In Figuur 7A wordt het aantal toxicoforen geïdentificeerd door ADMETlab3.0 weergegeven voor elke ligand.  Er is geen definitieve drempel of informatie over de toegestane waarden van toxicoforen.  In Figuur 7B geeft de toepassing van Toxtree informatie over toxiciteitsklasse (I-III) evenals overtredingen en naleving van de Cramer's Rule. Het monsterresultaat voor ligand 1 toont de toxiciteitsresultaten en de SMILS-code bovenaan, met de structuur in het venster linksonder. De class-toxiciteitsidentificatie in het rechterbovenvenster geeft hoge toxiciteit (Klasse III) aan op basis van de Cramer's Rules voor ligand 1, in plaats van andere mogelijkheden zoals Klasse II (middelmatige toxiciteit) of Klasse I (lage toxiciteit).  Het venster rechtsonder toont de schriftelijke redenering van klasse-identificatie gebaseerd op Cramers regelbeslissingsboom.

ORCA QM-berekeningen van de vibratiefrequentie voor geoptimaliseerde structuren berekenen orbitale energiewaarden voor de bepaling van de bandgap. Figuur 8 toont de bandkloof (eV) van elke ligand die is afgeleid van het verschil tussen de HOMO en LUMO. Het drempelbereik wordt weergegeven in het schaduwgebied tussen 3,6 eV en 5,0 eV, waarbij elk punt in het schaduwgebied voldoet aan de energieniveaus die gepaard gaan met een wenselijkere stabiliteit en reactiviteit. Een overzicht van de volledige computationele workflow wordt samengevat in Figuur 9, die de sequentiële fasen illustreert van doeleiwitvoorbereiding en screening van natuurlijke producten tot ADMET-S-evaluatie, ontworpen om selectieve PLK1-PBD-remmers te identificeren terwijl geneesmiddelachtige eigenschappen en chemische stabiliteit worden gewaarborgd. Deze visuele roadmap benadrukt de modulariteit, toegankelijkheid en geschiktheid van het protocol voor onderwijsimplementatie.

Tabel 1 operationaliseert het protocol door het om te vormen van een lineaire reeks instructies tot een robuuste, foutbewuste pijplijn die geschikt is voor gebruik in de klas en zelfstandig onderzoek. Het behandelt expliciet reproduceerbaarheid, een bekende uitdaging bij computationele geneesmiddelenontdekking, door validatiecriteria in te bedden op belangrijke overgangspunten. Zo voorkomt het bevestigen dat histidineresiduen uniform als "HIS" worden gelabeld na CHARMM-GUI-verwerking stille storingen in downstream docking, terwijl het valideren van de integriteit van SMILES vóór clustering cascaderende fouten in ADMET-voorspelling voorkomt. De tabel benadrukt ook pedagogisch ontwerp, waarbij elke probleemoplossing met minimale rekenkundige achtergrond kan worden uitgevoerd (bijvoorbeeld "open .complex.pdb in een teksteditor om keten-ID's te controleren"), wat aansluit bij het doel van het manuscript om toegankelijkheid te bieden aan dove, bachelor/master en middelbare scholieren. Bovendien helpt de tabel gebruikers om aandacht en middelen te prioriteren door stappen te markeren waarbij uitkomsten onevenredig veel invloed hebben op de resultaten, zoals selectiviteitsbeoordeling via vergelijkende PRODIGY-scores.

Een belangrijke kracht van deze geïntegreerde workflow is het vermogen om discrepanties tussen complementaire computationele voorspellingen bloot te leggen, waardoor randgevallen aan het licht komen die de beperkingen van elke enkele methode onderstrepen. Zo vertoonde ligand 5 voor PLK1-PBD een sterke CB-Dock2 Vina-score (−7,9 kcal/mol) en een gunstige PRODIGY-affiniteit (ΔG = −9 kcal/mol, Figuur 4), maar faalde toch in verschillende ADMET-filters. Het voldeed niet aan het BOILED-Egg absorptie-distributiemodel, toonde een minder wenselijke plasmaclearancewaarde (9,3 mL/min/kg, Figuur 6), wat snelle eliminatie suggereert, en werd door Toxtree met vijf toxicoforen geclassificeerd als Cramer Klasse III (hoge toxiciteit). Omgekeerd vertoonde ligand 33 een matige door PRODIGY voorspelde PLK1-affiniteit (−5,4 kcal/mol), maar voldeed aan alle ADMET-criteria, met lage toxiciteit (Klasse I), optimale LogP (0,7) en gunstige absorptie-verdeling en plasmaclearance. Ondanks zijn zwakkere affiniteit is ligand 33 een meer medicijnachtig alternatief. Dit contrast illustreert een fundamenteel principe in de vroege geneesmiddelenontdekking: alleen een hoge bindingsaffiniteit is onvoldoende zonder gunstige farmacokinetica en veiligheid. Tegelijkertijd kunnen verbindingen zoals ligand 5, hoewel met een slechte ADMET-prestatie, nog steeds waardevolle ideeën bieden voor toekomstige optimalisatie om de veiligheid of metabole stabiliteit te verbeteren zonder de potentie te verminderen.

Hoewel vroege filters in deze workflow bedoeld zijn voor triage en prioritering, en niet voor permanente uitsluiting, betekent verdere stroomlijning van de 50 kandidaten dat sommige van hen worden aangewezen als "top hits" door wenselijke limieten toe te passen die beschikbaar zijn via ADMET-tools en de literatuur. Van de 50 gescreende liganden die werden geëvalueerd op basis van 114 ADMET-gerelateerde en elektronische beschrijvingen, voldeden er 13 aan minstens 95 van de gewenste eigenschappencriteria. Hiervan vertoonden zes verbindingen (10, 13, 14, 32, 43 en 47) zowel gunstige ADMET-S-profielen als een hogere bindingsaffiniteit voor PLK1-PBD dan voor PLK2/3 en worden daarom aangewezen als de belangrijkste kandidaat-remmers (Figuur 10). De vergelijkende structurele-functionele en kwantitatieve gelijkenisanalyses toonden aan dat de geïdentificeerde hits belangrijke farmacohorische kenmerken delen met bekende PLK1-PBD-remmers, wat wijst op mogelijke convergentie in bindingsgedrag. Alle hits bevatten aromatische of heteroaromatische steigers die de hydrofobe ringsystemen van TQ, Poloxine en Allopole-A weerspiegelen, waardoor π–π en hydrofobe interacties binnen de PBD-pocket mogelijk zijn. Functionele overlap was duidelijk door geconserveerde waterstofbindingsmotieven (carboxyl-, amide- en carbonylgroepen) die analoog zijn aan die welke belangrijke polaire contacten in de referentieremmers mediëren. Flexibele alifatische en cyclische linkers die in meerdere hits aanwezig zijn, lopen parallel met de conformationele adaptabiliteit van poloxine-analogen, wat de oriëntatie op essentiële bindingsresiduen vergemakkelijkt. Kwantitatief bevestigden Tanimoto-gelijkenisscores (0,36–0,54) matige structurele gelijkenis tussen de treffers en bekende remmers, waarbij de treffers 10, 13 en 14 het meest lijken op Poloxine, Hit 32 op TQ, en op 43 en 47 op Allopolie-A. Gezamenlijk benadrukken deze resultaten een duidelijke structurele en functionele overlap, wat aangeeft dat de treffers waarschijnlijk de bindingstopologie en interactiepatronen van gevalideerde PLK1-PBD-remmers nabootsen, terwijl ze voldoende nieuwheid behouden voor verdere optimalisatie (Figuur 10).

Om de robuustheid van de computationele workflow te evalueren, werden bekende PLK1-PBD-remmers (Poloxinpan¹⁴ en Allopole-A¹⁵) geanalyseerd als positieve controles, met Metformine en Imeglimin (twee structureel niet-verwante antidiabetica zonder gerapporteerde PLK1-PBD-activiteit) als negatieve controles over ADMET-S, docking en bindingsaffiniteitsanalyses. De positieve controles vertoonden bindingsaffiniteiten van respectievelijk –5,8 en –5,6 kcal/mol, terwijl de negatieve controles zwakkere affiniteiten van –5,1 kcal/mol (Metformine) en –4,8 kcal/mol (Imeglimin) vertoonden, wat consistent is met hun gebrek aan PBD-bindingsactiviteit. Interessant genoeg toonde de ADMET-S-evaluatie aan dat de negatieve controles aan meer wenselijke beschrijvingen voldeden (88 van de 114 eigenschappen) dan de positieve controles (80 van 114), waarmee het vermogen van de workflow werd gevalideerd om farmacokinetische gunstigheid te onderscheiden van doel-specifieke bindingspotentiaal. Deze bindingen benadrukken het belang van het behouden van een evenwichtig perspectief: verbindingen mogen niet voortijdig worden weggegooid uitsluitend op basis van suboptimale ADMET-voorspellingen als ze een sterke doelaffiniteit vertonen, aangezien dergelijke steigers nog steeds waardevolle uitgangspunten voor optimalisatie kunnen bieden. Omgekeerd kunnen moleculen met uitstekende farmacokinetische eigenschappen maar zwakke binding dienen als laag-risico sjablonen voor de ontwikkeling van analogen. Verdere biochemische en cellulaire validatie is nodig om deze computationele observaties te bevestigen en de prioriteringscriteria te verfijnen.

Figuur 1: Structurele vergelijkingen tussen een onvoorbereide en een CHARMM-GUI voorbereide 4HCO-structuur. (A) 4HCO-structuur rechtstreeks geüpload vanuit de PDB, waarbij de ontbrekende residuen worden benadrukt. (B) 4HCO-structuur na het CHARMM-GUI voorbereidingsprotocol. 4HCO (PLK1-PBD gebonden aan TQ) werd gekozen omdat het een van de weinige PLK1-PBD-kristallen is met een organische ligand-gebondenheid, waardoor het direct toepasbaar is op deze ontdekking van structuurgebaseerde kleine-molecuul inhibitoren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Principal component analyse (PCA) van 999 Lipinski-conforme natuurlijke producten na K-means clustering op basis van moleculaire vingerafdrukken en Tanimoto-gelijkenis. Elke stip vertegenwoordigt een verbinding, gekleurd door de toegewezen cluster (1–50), met clusters gegroepeerd door grijze ellipsen om de chemische gelijkenis te benadrukken. De nauwe clustering binnen clusters en de scheiding tussen clusters geven aan dat Tanimoto-gebaseerde clustering met succes de structurele redundantie verminderde terwijl de chemische diversiteit in de dataset behouden bleef. Deze diversiteit zorgt ervoor dat de 50 representatieve liganden die voor downstream koppeling worden geselecteerd een breed gebied van chemische ruimte beslaan, wat de robuustheid en generaliseerbaarheid van de virtuele screeningsresultaten vergroot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: CB-Dock2 blind docking identificeert een hoog-affiniteit bindingshouding van ligand 1 binnen het PLK1 polo-box domein (PBD). De getoonde CurPocket C2-conformatie (Vina-score = −7,5 kcal/mol) vertegenwoordigt de optimale houding tussen vijf voorspelde bindingsplaatsen, gekenmerkt door gunstige van der Waals-contacten en waterstofbruggen met belangrijke PBD-residuen (Trp414, His538 en Lys540). Dit resultaat valideert het gebruik van structuurgebaseerde blinde koppeling om biologisch relevante bindingspockets te lokaliseren zonder een co-gekristalliseerde ligand, en laat zien hoe de workflow poses met de sterkst voorspelde bindingsenergie prioriteert voor downstream selectiviteitsanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Heatmap van PRODIGY-webservervoorspelde affiniteiten door eiwit-ligandcombinaties. De heatmap behandelt direct de overlap tussen liganden wanneer ze gebonden zijn aan PLK1, PLK2 en PLK3. Hoewel sommige liganden (waaronder ligand 45) vergelijkbare bindingsaffiniteiten vertonen over alle drie de PLK-isoformen, wat wijst op een slechte selectiviteit, vertonen anderen (met name liganden 3, 5, 6, 7, 27, 28, 34, 35 en 49) een sterke PLK1-voorkeur (ΔΔG ≥ 3,0 kcal/mol versus PLK2/PLK3), wat aansluit bij het doel van PBD-selectieve inhibitie. Kwantitatief vertonen 20 van de 50 liganden bijna tweevoudige selectiviteit voor PLK1 ten opzichte van zowel PLK2 als PLK3, gebaseerd op PRODIGY-voorspelde ΔG-waarden. Deze differentiële binding wordt toegeschreven aan subtiele variaties in de PBD-bindingspockets, die het blinde koppelingsprotocol vastlegt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Representatie van fysisch-chemische eigenschappen gecombineerd met ADMETlab3.0 en SwissADME. De parameters zijn nHD = aantal waterstofdonoren, nHA = aantal waterstofacceptoren, basische pKa, zure pKa, nStereo = aantal stereocentra, LogP = n-octanol/waterdistributiecoëfficiënt, LogD = n-octanol/waterverdelingscoëfficiënt bij pH=7,4, LogS = wateroplosbaarheidswaarde, Fsp3 = het aantal sp3 gehybridiseerde koolstofatomen/totaal aantal koolstofatomen, en nHet = aantal heteroatomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Een combinatie van ADME-resultaten van ADMETlab3.0 en SwissADME. (A) BOILED-Egg-grafiek van Wildman-Crippin LogP (WLOGP) vs. Topologische polaire oppervlakteoppervlakte (TPSA) van SwissADME vertegenwoordigt de absorptie- en distributie-bloed-hersenbarrière (BBB) permeabiliteit in het gele (dooier) gebied, absorptie via het maag-darmkanaal (HIA) in de witte ellips, P-glycoproteïnesubstraten en niet-substraten in respectievelijk blauwe en rode punten. Moleculen die buiten het "ei" liggen, worden beschouwd als slechte absorptie en distributie. (B) Warmtekaart van metabolisme met verschillende Cytochroom P450 (CYPs) identificaties die betrekking hebben op stabiliteit van het menselijk levermetabolisme (HLM), waarbij rood dient als remmers/substraten en groen als niet-remmers/niet-substraten, waardoor groen de wenselijkheid blijft. (C) Uitscheiding betreft de parameters, plasmaklaring en halfwaardetijd. De gestippelde rode lijn geeft de gewenste plasmaklaring aan (<5 mL/min/kg), terwijl 5-15 mL/min/kg en >15 mL/min/kg respectievelijk een matige en hoge clearance aanduiden.  Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Geïntegreerde toxiciteitsprofilering onthult kritieke veiligheidsrisico's bij gescreende liganden. (A) Verdeling van toxicoforaantallen over de 50 representatieve natuurlijke producten, zoals voorspeld door ADMETlab3.0. (B) Voorbeeldresultaten van toxiciteit voor ligand 1, met aanduiding van Klasse III-toxiciteit in rood, met een uitgebreide uitleg van gerelateerde Cramer's Rules in het tekstvak hieronder. Deze dual-evaluatiebenadering (toxicoforen + Cramer-klasse) maakt vroege triage van hoogrisicoverbindingen mogelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: HOMO–LUMO-bandgap-energieën (in eV) voor de 50 representatieve van natuurlijke product-afgeleide liganden, berekend met ORCA op het theoretische niveau van B3LYP/def2-TZVP. Het schaduwgebied (3,6 tot 5,0 eV) duidt het optimale stabiliteitsvenster aan: bandkloof onder 3,6 eV wijzen op een hoge chemische reactiviteit of mogelijke fotodegradatie, terwijl waarden boven 5,0 eV kunnen wijzen op slechte elektronische polariseerbaarheid en verminderde bindingsaanpassing. Liganden binnen dit bereik vertonen een gunstige balans tussen kinetische stabiliteit en moleculaire responsiviteit, wat hun prioriteit als potentiële PLK1-PBD-remmerkandidaten ondersteunt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Stroomdiagram van de tweetalige computationele geneesmiddelenontdekkingsworkflow. De pijplijn begint met de voorbereiding van PLK1-PLK3 PBD-structuren, gevolgd door ziektegerichte screening van de SuperNatural 3.0-database en filtering via Lipinski's Rule of Five (molecuulgewicht ≤ 500 Da, waterstofbindingsdonoren ≤ 5, acceptoren ≤ 10, LogP ≤ 5). Vertegenwoordigende verbindingen worden geselecteerd na clustering en vervolgens geëvalueerd via eiwit-ligandenkoppeling, binding affiniteitsvoorspelling en uitgebreide ADMET-S-profilering, inclusief absorptie, distributie, metabolisme, uitscheiding, toxiciteit en QM-stabiliteitsbeoordeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: Vergelijkende structureel-functionele overlap tussen topkandidaat-liganden en bekende PLK1-PBD-remmers. De figuur benadrukt de zes belangrijkste kandidaatverbindingen (10, 13, 14, 32, 43 en 47) die zijn geïdentificeerd uit de gecombineerde virtuele screening-, clustering-, bindingsaffiniteits- en ADMET-S-profielanalyses. Deze liganden voldeden aan minstens 95 van de 114 gewenste fysisch-chemische en farmacokinetische beschrijvingen en vertoonden een hogere bindingsaffiniteit voor PLK1-PBD ten opzichte van PLK2/3. Om potentiële structurele en functionele convergentie te evalueren, werd elke ligand vergeleken met bekende PLK1-PBD-remmers TQ, Poloxine en Allopole-A, op basis van gedeelde kernfarmacoforische motieven en paargewijze Tanimoto-gelijkeniscoëfficiënten (ECFP4-vingerafdrukken). Matige gelijkenisscores (0,36–0,54) en veelvoorkomende functionele groepen zoals aromatische of heteroaromatische ringen, waterstofbindingsdonor/acceptorparen en hydrofobe linkers duiden op gedeeltelijke overlap in bindingskenmerken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Workflowfase	Tussenliggende checkpoint (hoe bevestig je succes)	Kritieke stap (waarom het succes of falen bepaalt)	Veelvoorkomende problemen en richtlijnen voor probleemoplossing
1. Doelproteïnebereiding	• PDB-bestand laadt zonder fouten in Mol* View. • Geen ontbrekende residuen in de bindende pocket (visuele inspectie). • Histidineresiduen gelabeld als "HIS" (niet HSD/HSE)	Onnauwkeurige eiwitstructuur → valse bindingspockets → misleidende dockinghoudingen. CHARMM-GUI zorgt voor correcte protonatie, waterstofplaatsing en verwijdering van water/liganden.	Probleem: CB-Dock2 weigert het PDB-bestand. Oplossing: Verwijder niet-standaard residuen, zorg dat alleen de eiwitketen aanwezig is, en standaardiseer atoom- en residunamen met een teksteditor.
2. Natuurlijke productfiltering (Lipinski's Regel van 5)	• "all.csv" bevat alleen geldige SMILES (niet-blanco, chemisch parseerbaar). • Verwachte tellingsovereenkomsten (bijv. 999/1.193).	Ongeldige SMILES laat RDKit, dockingservers en ADMET-tools crashen. Filteren moet de chemische validiteit behouden.	Probleem: Script faalt tijdens clustering. Oplossing: Voeg SMILES validatie toe met Chem.MolFromSmiles(smiles, sanitize=True) in Python; Log en verwijder ongeldige vermeldingen voordat je verder gaat.
3. Clusterbemonstering	• 50 unieke SMILES in "rep_struct.txt". • PCA-grafiek (Fig. 2) toont duidelijke clusterscheiding.	Slechte clustering → redundante of niet-diverse vertegenwoordigers → inefficiënte screening.	Probleem: Alle moleculen clusteren in één groep. Oplossing: Verifieer het vingerafdruktype (bijv. Morgan/ECFP4), Tanimoto-drempel en SMILS-standaardisatie. Overweeg het aantal clusters te verhogen als de diversiteit laag is.
4. Eiwit-ligand koppeling (CB-Dock2)	• Elke ligand retourneert ≥1 ".complex.pdb" bestand. • Vina-scores zijn negatief (bijv. ≤ −5 kcal/mol). • Ligand wordt gepositioneerd in CurPocket (niet op het oppervlak).	Docking definieert bindingshouding en affiniteit. Verkeerde houding → valse WONDERKINDEREN-voorspellingen.	Probleem: Baan faalt, of ligand niet gedoken. Oplossing: Ligand opnieuw tekenen in CB-Dock2 met SMILES; zorg dat er geen speciale tekens in de bestandsnaam zijn; Controleer e-mail voor de functiestatus. Als het aanhoudt, probeer dan SwissDock als back-up.
5. Bindingsaffiniteit (PRODIGY)	• PRODIGY geeft ΔG-waarden terug voor alle complexen. • Affiniteiten correleren met CB-Dock (Vina) scores (trendconsistentie).	Selectiviteitsbeoordeling hangt af van nauwkeurige ΔG voor PLK1 versus PLK2/PLK3. Verkeerd toegewezen keten-/ligand-ID's → verkeerde voorspellingen.	Probleem: "Chain not found" foutmelding. Oplossing: Open .complex.pdb in een teksteditor; bevestig de identificatie van de eiwitketen (bijv. "P") en de naam van het ligandresidu (bijv. "UNL"); Voer correct in in PRODIGY.
6. ADMET-S Evaluatie	• Alle 50 SMILES geven resultaten terug in SwissADME, ADMETlab3.0 en ToxTree. • Geen "N/A" of "Error" rijen in uitvoer-CSV's.	Inconsistente ADMET-gegevens → gebrekkige kandidatenranglijst. Platforms kunnen falen op steigers voor exotische natuurlijke producten.	Probleem: ADMETlab3.0 wijst SMILES af. Oplossing: Canoniseer SMILES met RDKit (MolToSmiles(MolFromSmiles(...))). Voor ToxTree voer je één molecuul tegelijk in en verifieer je de structuurweergave.
7. Kwantumstabiliteit (ORCA)	• Elke ORCA-taak wordt voltooid zonder "SCF niet geconvergeerd" of "geometriefout". • HOMO/LUMO-waarden aanwezig in het uitvoerbestand (.out).	De bandkloof bepaalt de chemische stabiliteit/reactiviteit. Mislukte taken = ontbrekende gegevens voor sleutelfilter.	Probleem: ORCA-baan crasht. Oplossing: Geometrie opnieuw optimaliseren in Avogadro; zorg dat er geen dubbele atomen zijn; verhoog %maxcore of schakel over op DEF2-SVP basis voor grote moleculen.
8. Geïntegreerde ADMET-S Filtering	• De definitieve lijst van liganden voldoet aan alle criteria (bijv. LogP 0–3, bandkloof 3,6–5 eV, Cramer Klasse I/II). • ≥1 ligand vertoont PLK1-selectiviteit (ΔΔG ≥ 2 kcal/mol versus PLK2/3).	Te strenge of inconsistente drempels sluiten levensvatbare leads uit; Te soepele drempels bevorderen giftige/onstabiele stoffen.	Probleem: Geen enkele liganden komt door alle filters. Oplossing: Verslap één criterium tegelijk (bijvoorbeeld LogP ≤ 4 of 3 toxicoforen) en documenteer afwegingen. Vergelijk het met bekende medicijnen voor benchmarking.

Tabel 1: Kritieke kwaliteitscontrolepunten, beslissingspunten met hoge impact en probleemoplossingsstrategieën over de achtfasige tweetalige computationele workflow voor het identificeren van selectieve PLK1-PBD-remmers. Elke rij komt overeen met een belangrijke protocolfase van eiwitvoorbereiding tot geïntegreerde ADMET-S-filtering en specificeert (i) hoe succesvolle voltooiing te verifiëren (tussentijdse checkpoint), (ii) waarom de stap cruciaal is voor algemeen succes of falen (kritische stap redenering), en (iii) praktische oplossingen voor veelvoorkomende technische fouten (probleemoplossingsrichtlijnen). Deze tabel dient zowel als validatieroadmap als als leermiddel voor studenten en onderzoekers die het protocol implementeren in academische of beperkte omgevingen.

Aanvullend bestand 1: Python-scripts. Bevat het Python-script voor de Lipinski-regeltoepassing; het Python-script dat wordt gebruikt voor clusteringanalyse; het Python-script voor fysisch-chemische eigenschapsberekeningen; het R-script voor metabolisme-analyse; het Python-script voor uitscheidingsanalyse; het Python-script voor toxiciteitsvoorspelling; het Python-script voor stabiliteitsbeoordeling; en de SMILES-reeksen van de 50 geanalyseerde verbindingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Deze studie richt zich op een verkennende computationele workflow om potentiële PLK1-PBD-remmers te identificeren en te evalueren via virtuele screening, docking en ADMET-S-analyse. De pijplijn prioriteert effectief verbindingen op basis van voorspelde bindingstrends en farmacokinetische eigenschappen. In dit protocol wordt een reeks mogelijke PLK1-remmers geïdentificeerd en worden hun ADMET-eigenschappen en bindingsaffiniteiten voor PLK1–3-eiwitten geëvalueerd. Het protocol gebruikt een ziektegerichte benadering om 50 moleculen te identificeren uit een database van ongeveer 73.400 (Figuur 9). Vervolgens werden deze 50 moleculen onderworpen aan ADMET-S-evaluatie, waarbij hun farmacokinetische en farmacodynamische eigenschappen, geneesmiddelgelijkheid en stabiliteit werden berekend. Daarnaast werd hun bindingsaffiniteit voor PLK1–3-eiwitten berekend om hun remmende potentie tegen PLK1 en selectiviteit te beoordelen. Op basis van de resultaten vertoonden verschillende moleculen meer wenselijke eigenschappen. Latere geneesmiddelontdekkingsstudies kunnen ervoor kiezen om sommige moleculen te elimineren en zich op enkele te richten uit deze exploratie, of ze kunnen afzien van vroege eliminatie en deze resultaten later in het geneesmiddelontwerpproces gebruiken om de ADMET-eigenschappen te optimaliseren.

De biologische reden om zich te richten op PLK1, PLK2 en PLK3 terwijl PLK4 en PLK5 worden uitgesloten, is gebaseerd op zowel structurele als functionele overwegingen. PLK4 en PLK5 zijn uitgesloten van dit onderzoek vanwege hun duidelijke structurele en functionele verschillen ten opzichte van PLK1 en hun beperkte relevantie voor kankertherapie. PLK1, gekenmerkt door zijn kinase-domein en polo-box domein (PBD), speelt een cruciale rol bij het reguleren van mitotische gebeurtenissen, waardoor het een belangrijk doelwit is voor kankerbehandeling⁴¹. Daarentegen zijn PLK4 en PLK5 structureel verschillend: PLK4 bevat een cryptische polobox (CPB) in plaats van een canonieke PBD en functioneert voornamelijk in centrioolduplicatie. Tegelijkertijd mist PLK5 een functioneel kinasedomein en wordt het vrijwel uitsluitend tot expressie gebracht in de^{hersenen 3}. Gezien hun minimale structurele overlap met PLK1-PBD en beperkte relevantie voor mitotische disregulatie bij kanker, zou hun opname de selectiviteit voor PLK1-PBD-remmers niet betekenisvol informeren. De screeningsstrategie biedt dus een biologisch relevant en computationeel hanteerbaar kader om selectiviteit te beoordelen. Belangrijk is dat de zes belangrijkste kandidaat-liganden (10, 13, 14, 32, 43 en 47) zelfs gunstigere bindingsenergieën en ADMET-S-profielen vertoonden dan de bekende inhibitoren TQ en Allopolie-A, waardoor ze als potentiële PLK1-PBD-modulatoren werden benadrukt.

Om een robuuste implementatie te ondersteunen, vooral door studenten of onderzoekers die nieuw zijn met computationele geneesmiddelenontdekkingstools, wordt in Tabel 1 een samenvatting van belangrijke controlepunten (ook in het Protocolgedeelte), kritieke stappen en probleemoplossingsrichtlijnen voor de workflow verstrekt. De Tabel ondersteunt aanpassingsvermogen; bijvoorbeeld, als een gebruiker geen HPC-toegang heeft, kan hij opmerken dat ORCA-stabiliteitsanalyse uitstelbaar is, en als een webserver uitvalt, worden alternatieven zoals SwissDock voorgesteld. Deze flexibiliteit zorgt ervoor dat de workflow levensvatbaar blijft in diverse institutionele contexten, terwijl wetenschappelijke nauwkeurigheid behouden blijft en de nieuwheid van de studie als inclusieve, tweetalige en educatieve bijdrage aan vroege geneesmiddelenontdekking wordt versterkt. Hoewel de gehele workflow is ontworpen als een geïntegreerde pijplijn, bepalen verschillende cruciale stappen fundamenteel het succes of falen ervan (zie Tabel 1). Daarnaast bevat de bijbehorende video gesynchroniseerde Engelse ondertiteling en een American Sign Language (ASL) gebaren, ontworpen om gelijke toegang zonder afleiding te bieden. De instructies van de ondertekenaar zijn tijdelijk afgestemd op acties op het scherm, bijvoorbeeld het ondertekenen van "volgende" en vervolgens pauzeren terwijl de cursor op de knop "Volgende" klikt. Tijdens de 4HCO-voorbereidingsstap gebruikt de ondertekenaar vingerlabeling ("A" en "B") om de ketenselectie te begeleiden, precies gespiegeld in de schermopname. In het SuperNatural 3.0-screeningsegment verandert het venster van de ondertekenaar de grootte en beweegt naar rechtsboven, terwijl de aandacht wordt gericht op het "pad"-icoon, en pauzeert terwijl de cursor volgt. Deze ontwerpkeuzes zorgen ervoor dat dove en slechthorende kijkers dezelfde geïntegreerde, realtime begeleiding krijgen als horende gebruikers, waardoor een fysiek, door de instructeur geleide labervaring effectief wordt nagebootst.

Naast de voordelen zijn er talloze manieren om de workflow te verbeteren. Ten eerste kan de initiële filtering worden aangepast; In plaats van ziektegerichte en clustermonstermethoden zou men kunnen beginnen met dockingsimulaties van alle moleculen in de Natural Product database om te bepalen welke verbindingen het beste geschikt zijn voor binding van ligand-doeleiwitten. Daarnaast zijn meer gedetailleerde schattingen noodzakelijk voor een nauwkeurige voorspelling van de bindingsaffiniteit.  PRODIGY's "geen elektrostatische" berekeningen van eiwit-ligand affiniteit omvatten het passen van de tellingen van gecategoriseerde typen atomaire contacten die betrokken zijn bij de interactie (koolstof-koolstof, stikstof-stikstof, zuurstof-zuurstof en andere atomen) in een getraind meervoudig lineair regressiemodel met viervoudige kruisvalidatie, en deze methode correleerde significant met experimentele affiniteiten op verschillende momenten^42,43.  Alternatieve benaderingen, zoals FoldX⁴⁴, fastDRH⁴⁵, deep learning modellen⁴⁶ en MD met geavanceerde steekproefneming, kunnen worden toegepast, en er worden verschillende mate van overeenstemming in voorspellingen verwacht afhankelijk van de nauwkeurigheid van elke methode⁴⁷.

Een ander aspect is dat de verschillende softwaretools die in de ADMET-S-evaluatie worden gebruikt, talloze meetwaarden genereren, en het begrijpen van elke meetwaarde die wordt gebruikt om de geschiktheid voor geneesmiddelen te beoordelen is van vitaal belang. Een manier om nauwkeurigheid te waarborgen zou kunnen zijn om verschillende geneesmiddelen op de markt aan het protocol te onderwerpen om te bepalen hoe ze aan de drempels voldoen.  In die context vereist toxiciteit verder onderzoek, omdat moleculen niet uitsluitend worden verwijderd op basis van toxiciteitsprofielen uit genuanceerde beslissingsbomen zoals de Cramer's Rules, aangezien veel beschikbare medicijnen vergelijkbare classificaties hebben.  Het aantal toxicoforen is ook niet volledig informatief over toxiciteit, zelfs niet in combinatie met toxiciteitsprofielen.  In deze context zou een uitbreiding van deze workflow het uitvoeren van vergelijkende reviews zijn van kleine-molecuulmonsters met beschikbare medicijnen om interpretaties te ondersteunen.  Zo verwezen onderzoekers naar eerdere literatuur over de toepassing en observaties van DFT-berekeningen in huidige borstkankermedicijnen zoals Tamoxifen⁴⁸, Letrozole⁴⁹ en Cisplatin⁵⁰bij het interpreteren van stabiliteit bepaald door QM-berekeningen van HOMO–LUMO-bandgap-waarden. Eerder werden vergelijkbare workflows toegepast om potentiële remmers voor verschillende ziekte-/stoornisdoelen⁵¹ te identificeren. Onlangs hebben Stafford et ^al.6 strategieën voor het ontwerp van PLK1-PBD-remmers en therapeutische mogelijkheden bij kanker besproken. De meest recente studies hebben dual-targeting remmers geïdentificeerd tegen PLK1-PBD en PLK4-PB3 met behulp van structuurgeleide farmacoformodellering, virtuele screening, moleculaire koppeling, moleculaire dynamica (MD) simulatie en biologische evaluatie⁵². Zhou et al. identificeerden ook PLK1-PBD-remmers uit de mariene natuurlijke productenbibliotheek met behulp van 3D QSAR-farmacofore, ADMET, scaffold hopping, moleculaire docking en MD⁵³.

Al met al is de nieuwigheid van deze studie viervoudig. Ten eerste is het een tweetalig computationeel protocol, aangeboden in zowel Amerikaanse Gebarentaal als Engels, waarmee toegankelijkheid en inclusie in STEM wordt bevorderd, vooral voor doven en slechthorende studenten en onderzoekers. Deze tweetalige levering is zeldzaam in de computationele geneesmiddelenontdekking en sluit aan bij de missie van Gallaudet University om eerlijk wetenschappelijk onderwijs te pionieren. Ten tweede, hoewel PLK1 een overtuigend antikankerdoelwit blijft, zijn rigoureuze computationele studies die selectiviteit evalueren tussen PLK1, PLK2 en PLK3 met behulp van geïntegreerde structurele, energetische en ADMET-S criteria schaars. De meeste eerdere pogingen richten zich uitsluitend op remming van het kinase-domein of missen vergelijkende selectiviteitsprofilering. Dit werk vult deze kloof aan door een initiële verkennende gelijktijdige screeningsprotocol te bieden tegen drie PLK-PBD's, met filters die verbindingen prioriteren op basis van hoge PLK1-affiniteit en minimale off-target binding. Ten derde is de workflow ontworpen met efficiëntie en gebruiksvriendelijkheid in gedachten, vooral voor educatieve en beperkte omgevingen. De volledige pijplijn van databasefiltering tot ADMET-S-evaluatie kan binnen twee weken worden afgerond op standaard academische hardware (een laptop met 8 GB RAM), met gebruik van gratis webgebaseerde software (CB-Dock2, PRODIGY, SwissADME, ADMETlab). Docking- en bindingsaffiniteitsberekeningen zijn geen tijdrovende stappen (~30 seconden per ligand). De meest tijdrovende stap is de QM-stabiliteitsanalyse met ORCA, die kan worden uitgesteld naar latere fasen of uitgevoerd kan worden op high-performance computings, zoals aangetoond is. De scripts zijn modulair en vereisen alleen basisbewerkingen via de commandoregel of Jupyter Notebook, waardoor naadloze integratie in bestaande curricula mogelijk is. De runtime is bescheiden, met databasefiltering en Lipinski-compliance die minuten in beslag nemen; clustering van ~1.000 moleculen wordt voltooid in minder dan 30 minuten op een typische desktop. Alle softwaretools zijn vrij beschikbaar voor academisch gebruik, cross-platform (Windows, macOS, Linux) en vereisen geen commerciële licenties, waardoor de toegangsdrempels aanzienlijk worden verlaagd. Ten vierde tonen de geïdentificeerde liganden veelbelovende bindingsaffiniteiten die overeenkomen met interacties tussen nanomolairen bereik, gecombineerd met gunstige geneesmiddelgelijkheid, metabole stabiliteit en lage toxiciteitsprofielen. Verschillende kandidaten komen tevoorschijn als sterke, selectieve PLK1-PBD-binders met wenselijke ADMET-S-eigenschappen, wat verdere validatie vereist via moleculaire dynamica-simulaties of in vitro-assays .

Daarom laat deze studie, naast het methodologische nut, zien hoe toegankelijke, open source en efficiënte computationele tools kunnen worden ingezet als uitgangspunt om een biomedische uitdaging van hoge waarde aan te pakken, terwijl inclusieve wetenschappelijke training wordt bevorderd. Naarmate PLK1-PBD-remmers steeds meer aan populariteit winnen in de oncologie, biedt deze workflow een reproduceerbare, educatieve blauwdruk voor vroege geneesmiddelenontdekking. De veelzijdigheid maakt het geschikt voor middelbare school, bachelor en master, en het biedt een uitstekende basis voor CUREs die studenten authentieke, praktische onderzoeksmogelijkheden bieden. In tegenstelling tot pijplijnen die uitsluitend vertrouwen op kinase-domeinkoppeling of single-protein screening, evalueert deze benadering gelijktijdig PBD-selectiviteit over PLK1–3, een noodzaak gezien hun >38% structurele homologie en divergente biologische rollen. Bovendien werden door clustering, ADMET-S en QM-stabiliteit te combineren in een open-access framework, het risico op redundantie en uitval verminderd ten opzichte van brute-force virtuele screening.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
ADMETLab3	Simulations Plus. Inc	V3.0	ADMET eigenschappen
Alphafold	Google DeepMind & Isomorphic Labs (Alphabet-dochterondernemingen)	V3.0.1	3D-eiwitmodellering
Anaconda/Conda	Anaconda, Inc.	V24.9.2	Open source pakketbeheersysteem
CB-Dock2	Yang Cao Lab	V2.0	Blinde docking van eiwit-ligand
CHARMM-GUI	Lehigh University	V3.8	Biomoleculaire manipulatie en simulatie
DARWIN on ACCESS	University of Delaware	N/A	Hoogwaardige computing
ORCA	FAccTs GmbH	V6.1.0	Kwantumchemiepakket
Protein Data Bank	Worldwide Protein Data Bank	RRID:SCR_006555	Eiwitdatabase
RDKit	Open source	RRID:SCR_014274	Chemoinformatics-programmering
SuperNatural 3.0	Institute of Physiology and Science-IT (Berlijn)	V3.0	Bibliotheek van natuurlijke moleculen
SwissADME	Swiss Institute of Bioinformatics	RRID:SCR_017865	ADME-eigenschappen
Toxtree	Ideaconsult Ltd	V3.1.0	Toxiciteitindeling