Methodenartikel

Schatting van telomeerherhalend RNA uit DNA/RNA hybride complexen

DOI:

10.3791/67984

⸱

5 december 2025

 ,  ,  ,  , 
1Betul-Ziya Eren Genome and Stem Cell Center, Erciyes University, 2Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 3INSERM-CNRS, Université de Nice

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol maakt de isolatie mogelijk van DNA:RNA-hybriden en hun bijbehorende RNA (inclusief TERRA) over meerdere weefsels heen. Hoewel onze aanpak een subset van hybride interacties omvat, zou aanvullende genomische mapping nodig zijn voor volledige genomale karakterisering.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomeer-herhalings-bevattend RNA (TERRA) is een lang niet-coderend RNA dat uit alle telomeren in hogere eukaryoten wordt getranscribeerd, en slechts een subset van deze moleculen vormt stabiele DNA/RNA-hybriden bij telomeren. We hebben een gedetailleerd moleculair protocol opgesteld om deze hybride schattingen te identificeren en te zuiveren. Deze gestroomlijnde methode maakt directe extractie mogelijk van DNA/RNA-hybride interacties die natuurlijk in vivo zijn gevormd en kan worden toegepast om al deze regio's te detecteren. Door procedurele stappen te minimaliseren, is deze techniek zeer efficiënt in het isoleren van RNA dat aan DNA is vastgebonden, en schat de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van downstream sequencing. Guanidine-isothiocyanaatreagens wordt gebruikt voor totale cellyse en homogenisatie, waarbij de integriteit van nucleïnezuren (DNA en RNA), met name DNA/RNA-hybriden, behouden blijft. Het toevoegen van chloroform initieert fase-scheiding via centrifugatie (drie verschillende lagen): een onderste fenol-chloroformfase, een interfase en een bovenste waterige fase. RNA, dat zowel uit de kern als het cytoplasma vrijkomt, blijft behouden in de waterige fase, terwijl hoog moleculair gewichtig DNA, inclusief de DNA/RNA-hybride regio's, beperkt blijft tot de interfase. Met isopropylalcohol, gevolgd door centrifugatie, worden de waterige fase (vrij RNA), interfase en DNA, met name DNA/RNA-hybriden, teruggewonnen. Om de resterende sporen van eiwitten te verwijderen, wordt het monster geïncubeerd met Proteinase K. Behandeling met DNase, fenol/chloroformextractie, isopropylalcohol en centrifugatie wordt gebruikt om RNA vrij te geven dat met DNA is gehybridiseerd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transcriptie van het genoom resulteert in de vorming van tijdelijke hybride moleculen, bekend als R-lussen, die bestaan uit driestrengige structuren. Deze structuren omvatten de niet-coderende en coderende DNA-strengen, waarbij de niet-coderende streng wordt verdrongen door de vorming van hybriden met het complementaire RNA1. Tijdens de transcriptie van het genoom wordt een groot aantal niet-coderende RNA's geproduceerd in wisselende snelheden uit beide DNA-strengen. De meeste van deze RNA's dienen als kortlevende intermediairen, maar sommige spelen een cruciale rol in de regulerende netwerken die genoombiologie beheersen, met name die afkomstig zijn uit niet-coderende regio's zoals telomeren en centromeren1. De verspreiding van DNA/RNA-hybriden in het genoom kan ook de transcriptieactiviteit van cellen op elk moment weerspiegelen.

Naarmate de interesse in de regulerende functies van niet-coderende RNA's toeneemt, is er toenemende nieuwsgierigheid om hun transcriptie en distributie door het genoom te volgen, met name in de vorm van tijdelijke DNA/RNA-hybriden. Om dit aan te pakken, ontwikkelden we een onafhankelijke assay voor de detectie van stabiele DNA/RNA-hybriden, toepasbaar op elke biologische cel of elk weefsel. Deze methode maakt het mogelijk om complementaire RNA's te isoleren die co-purificeren met het DNA, gevolgd door analyse via PCR-precipitatie of sequencing.

Onderzoek uit celkweekmodellen toonde aan dat tijdens DNA-replicatie en -transcriptie replicatiestress, DNA-schade, botsingen met replicatievorken en het pauzeren van RNA-polymerase II kunnen optreden door topologische, structurele en hybridisatiegebeurtenissen. Deze processen, met name het ontvouwen van de DNA-dubbelhelix, introduceren torsiespanning, wat kan leiden tot de vorming van abnormale structuren, zoals R-lussen, tijdens transcriptie1.

De meeste R-lusgegevens zijn gegenereerd met gist of gekweekte kankercellen, waarbij gebruik wordt gemaakt van het DNA-RNA hybride-specifieke monoklonale antilichaam S9.6. Structurele studies hebben aangetoond dat het antigeenbindende fragment (Fab) van S9.6 specifiek bindt aan een 13 bp RNA-DNA hybride duplex1. Antilichaam-gebaseerde detectie van R-lussen heeft voornamelijk hybriden geïdentificeerd die zich vormen in guaninerijke gebieden tijdens transcriptie, waar verhoogde RNA-DNA-hybridisatie waarschijnlijk zal optreden. In vitro-studies met het S9.6-antilichaam suggereren dat RNA's met vier of meer opeenvolgende guanines nabij hun 5′-uiteinde gemakkelijker worden gedetecteerd, wat correleert met een verhoogde R-lusvorming1. Verschillende enzymen, zoals helicasen, topoisomerases, RNase H1 en RNase H2, helpen de balans in de R-lus tijdens transcriptie te behouden. Verstoring van de R-lus homeostase wordt in verband gebracht met verhoogde genomische instabiliteit, wat bijdraagt aan ziekten zoals kanker en neurodegeneratieve aandoeningen2.

Telomeren, die ooit als transcriptieloos werden beschouwd, zijn ontdekt dat ze lange niet-coderende RNA's transcriberen, bekend als Telomeric Repeat-Containing RNA (TERRA)3. Deze transcripten komen uit subtelomerische regio's en bevatten telomerherhalingen, die een essentiële rol spelen in het handhaven van telomeerhomeostase4. In dit manuscript verwijzen we naar 'TERRA-hybride RNA' als de RNA-moleculen die vrijkomen uit DNA/RNA-hybride complexen via DNase I-behandeling, vermoedelijk TERRA-sequenties omvatten op basis van extractie-eigenschappen en primerspecificiteit.

TERRA-transcriptie vindt plaats in de richting van centromeer naar telomeer en varieert in lengte, variërend van 100 bp tot 9 kb, waarbij het merendeel van TERRA in de waterige fase wordt teruggewonnen als een vrij RNA-molecuul. Een klein deel blijft aan het DNA gehecht en wordt geassocieerd met belangrijke biologische processen, zoals kanker en verouderingvan 4,5 jaar. TERRA-niveaus variëren afhankelijk van de subtelomere loci en worden gereguleerd door de heterochromatische toestand van telomeren6. Celkweekstudies geven ook aan dat TERRA-transcripten uit verschillende subtelomerische regio's heterogeniteit in lengte vertonen. In sommige tumor-afgeleide celkweekstudies hebben onderzoekers ontdekt dat het 20q subtelomere gebied de primaire bron is van TERRA-transcripten, en dat dit gebied vaak gemethyleerd is op de CpG-eilanden 7,8,9. Bij muizen is het subtelomerische gebied van chromosoom 18 een belangrijke locatie van TERRA-productie10,11. Daarnaast werd aangetoond dat PAR-TERRA's, dat zijn TERRA-transcripten afkomstig uit pseudoautosomale subtelomerische regio's in embryonale cellen, tot 200 keer meer TERRA hebben vergeleken met chromosoom 1811,12.

De transcriptie van TERRA wordt gecontroleerd door DNA-methylering en histonmodificaties zoals H3K9- en H4K20-trimethylering, die TERRA onderdrukken, terwijl histonacetylering positief correleert met TERRA-transcriptie 6,13,14. TERRA bindt ook aan extratelomerische regio's, waaronder intergene sites en introns, wat wijst op een bredere rol in genoomregulatie2.

Daarnaast leidt de uitputting van TERRA tot ontregeling van talrijke genen, vooral die nabij de bindingsplaatsen, wat wijst op de rol ervan in epigenetische regulatie van chromatine en genexpressie2. TERRA-accumulatie bij verkorte telomeren bevordert homologe recombinatie (HR)-gebaseerde telomeerextensie, wat bijdraagt aan telomeerlengtehomeostase15,16.

Om de rol van TERRA en andere DNA/RNA-hybriden aan te pakken, gebruikten we een assay die specifiek was ontworpen om RNA-moleculen te isoleren die stabiel met DNA gehybrideerd zijn. Kort gezegd werden kernen geïsoleerd en behandeld met DNase-vrije RNase om onbeschermd RNA te verwijderen. DNA/RNA-hybriden werden vervolgens geëxtraheerd met selectieve DNase-vertering, waarbij RNA vrijkomt dat oorspronkelijk met DNA was gehybridiseerd. Deze fractie, aangeduid als "DNA/RNA-hybride-geassocieerd RNA," werd vervolgens geanalyseerd door RNA-seq en vergeleken met totaal oplosbaar RNA verkregen met standaard fenol-chloroform-extractie17. Deze aanpak stelde ons in staat zowel telomeer- als niet-telomeerlocaties van RNA-DNA-hybride vorming te identificeren en de transcriptomische profielen van DNA-gebonden versus oplosbare RNA-pools te vergelijken. Ooit beschouwd als slechts een bijproduct van telomeertranscriptie, wordt TERRA nu erkend om zijn dubbele rol in het behoud van telomeeren, waarbij het telomeraseactiviteit en homologe recombinatie beïnvloedt, die cruciaal zijn voor de homeostase van telomeerlengte. Bovendien hebben vooruitgang in detectietests een gedetailleerder begrip mogelijk gemaakt van de dynamische interacties tussen RNA en DNA in het genoom. Deze kennis effent de weg voor verdere verkenning van de implicaties van DNA/RNA-hybriden, zoals TERRA, in cellulaire processen en hun mogelijke verbanden met ziekten zoals kanker en neurodegeneratieve aandoeningen. Het lopende onderzoek op dit gebied zal ongetwijfeld ons begrip van genomische regulatie en de relevantie daarvan voor gezondheid en ziekte verdiepen.

De methode die in deze studie wordt gebruikt om TERRA-moleculen en DNA/RNA-hybriden te identificeren, is hetzelfde geoptimaliseerde guanidiniumthiocyanaat-fenol-chloroform extractieprotocol als hierin beschreven. Dit protocol is ontwikkeld om gelijktijdige isolatie van RNA-DNA/RNA-hybriden, totaal RNA en genomisch DNA binnen een uniforme workflow mogelijk te maken. Door de klassieke driefasige scheidingsmethode strategisch aan te passen, faciliteert dit protocol het selectieve behoud van DNA/RNA-hybriden bij de fenolinterfase, waardoor hun verlies wordt geminimaliseerd – een inherente beperking van conventionele extractietechnieken.

Traditioneel was de detectie en isolatie van DNA/RNA-hybriden afhankelijk van immunoprecipitatie met het S9.6 monoklonale antilichaam, dat specifiek DNA/RNA-hybride structuren18,19 herkent. Deze op S9.6 gebaseerde benadering, hoewel veel gebruikt, kan beperkt worden door de toegankelijkheid van antistoffen, kosten en mogelijke kruisreactiviteit. Daarentegen biedt ons protocol een kostenefficiënt, antistofonafhankelijk alternatief dat gemakkelijk toepasbaar is op zowel cellulaire als weefselafgeleide monsters.

Om de zuiverheid en structurele integriteit van de geïsoleerde DNA/RNA-hybridfractie verder te verbeteren, hebben we proteïnase K-gemedieerde deproteïnisatie toegevoegd, gevolgd door behandeling met DNase I. De DNase I-stap verteert selectief de DNA-streng van de DNA/RNA-hybriden, waardoor het gehybridiseerde RNA vrijkomt voor latere isolatie en downstream moleculaire analyse20. Deze aanpak zorgt ervoor dat de teruggevonden RNA-soorten specifiek degenen zijn die stabiel gehybridiseerd met DNA in vivo. Dankzij de modulaire configuratie en schaalbaarheid is ons protocol breed aanpasbaar aan diverse biologische contexten, wat onderzoekers een robuust hulpmiddel biedt om DNA/RNA-hybride biologie in een breed scala aan experimentele systemen te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimentele protocollen met betrekking tot dieren zijn goedgekeurd door de Erciyes University Animal Ethics Committee (licentienummer 19-07-2019, besluit nr. 19/127). Balb/c-muizen werden in deze studie gebruikt: vijf gezonde vrouwtjes van 6 weken (25 g) en vijf mannetjes van 8 weken (30 g). Muizen werden verzorgd en behandeld volgens de Principes van de Laboratoriumverzorging (Europese regels). De hier gepresenteerde studie gebruikte bloedmonsters van 13 gezonde controlepersonen, afkomstig van een eerder onderzoeksproject dat ethische goedkeuring kreeg van het Human Ethics Committee van de Erciyes Universiteit (Besluit nr: 17/002). Een grafisch abstract van dit protocol is te vinden in Figuur 1. Gebruik RNase-vrije materialen en aseptische technieken in alle stappen om RNA-afbraak te minimaliseren.

1. Muizenhouderij

  1. Om de juiste verdovingsdosering voor euthanasie te bepalen, weeg je elke muis en dien je ketamine toe in een dosis van 60 mg/kg en xylazine bij 10 mg/kg via intraperitoneale injectie.
  2. Na het toedienen van de narcose bevestig volledige anesthesie door het ontbreken van de pedaalterugtrekkingsreflex (teenknypen) en het ontbreken van een reactie op tactiele stimulatie. Zodra de anesthesie is bevestigd, voer je euthanasie uit via cervicale dislocatie.

2. Menselijke monsters

  1. Selecteer deelnemers als gezonde controles na screening om elke geschiedenis van chronische ziekten (zoals diabetes, hart- en vaatziekten, hypertensie of kanker), acute infecties, auto-immuun- of ontstekingsaandoeningen, neurologische of psychiatrische aandoeningen en recent gebruik van voorgeschreven medicatie uit te sluiten17.
  2. Verzamel huidbiopsiemonsters van het gebied achter de knie (popliteale fossa) van elke vrijwilliger met een 2 mm ponstool. Dien lokale verdoving subcutaan toe voorafgaand aan de ingreep en neem alle biopten uit onder steriele omstandigheden.

3. DNA/RNA-hybride extractie uit alle celtypen

  1. Weefselverzameling en -lyse
    1. Voor elke extractie gebruik je 500 μL hartbloed, heel hypothalamus-hypofysecomplex, hele bijnier of een spermamonster van één muis.
    2. Breng alle verzamelde monsters over in steriele 1,5 mL buizen. Voeg 500 μL fenol toe aan elke buis. Vortexbloedmonsters grondig om te mengen.
      1. Voor weefselmonsters homogeniseer je volledig met een 2 mm spuit totdat er geen zichtbare fragmenten meer overblijven.
    3. Plaats de buizen op een koelblok om de integriteit van het monster te behouden.
      OPMERKING: Volg altijd de veiligheidsrichtlijnen van het laboratorium bij het hanteren van gevaarlijke reagentia zoals fenol, chloroform en ammoniumacetaat.
  2. Faseafscheiding
    1. Voeg 180 μL chloroform toe aan elke buis en vortex kort om te mengen. Incubeer buizen 15 minuten op ijs om fase-scheiding mogelijk te maken.
    2. Inspecteer de monsters – zorg dat de waterige fase helder lijkt. Als de fase bewolkt is, vortex je opnieuw en keer je nog eens 5 minuten terug naar het ijs.
    3. Centrifugemonsters op 12.000 × g, 4 °C gedurende 15 minuten.
  3. RNA-precipitatie
    1. Breng voorzichtig de heldere waterige fase over in een nieuwe steriele 1,5 mL microcentrifugebuis die op een koelblok is geplaatst.
    2. Voeg een gelijke hoeveelheid (1:1) isopropanol toe aan de waterige fase, draai kort om te mengen en broede 15 minuten op ijs.
    3. Centrifugeer op 12.000 × g, 4 °C gedurende 15 minuten.
      OPMERKING: De RNA-pellet moet zichtbaar zijn aan de onderkant van de buis.
  4. Het wassen van de RNA-pellet
    1. Draai de buis voorzichtig om om het supernatant weg te gooien zonder de pellet te verstoren.
    2. Voeg 1,5 mL 70% ethanol toe aan de pellet. Tik voorzichtig 5 seconden op de tube om te wassen.
    3. Centrifugeer op 7.500 × g, 4 °C gedurende 5 minuten.
    4. Draai de buis om om het supernatant weg te gooien. Herhaal de ethanolwas twee keer (in totaal drie wasbeurten).
  5. RNA-zuivering
    1. Na de laatste ethanolwasbeurt draai je de buis om en laat je eventueel restanten van ethanol aan de lucht drogen of verwijder je voorzichtig met een pipet.
    2. Voeg 100 μL RNase-vrij water toe aan de RNA-pellet en pipetteer voorzichtig op en neer of tik de buis om het RNA volledig te laten ophangen.
      OPMERKING: Bewaar RNA-monsters altijd op ijs of een gekoeld rack/koelblok om degradatie te voorkomen.
  6. RNA-kwantificering en opslag
    1. Plaats de buis met geresuspendeerd RNA op ijs.
    2. Meet de RNA-concentratie en zuiverheid met een spectrofotometer. Noteer de absorptie bij 260 nm (A260) om de RNA-concentratie te bepalen. Beoordeel de zuiverheid door de A260/A280- en A260/A230-verhoudingen te rekenen.
    3. Gebruik alleen RNA-monsters met A260/A280-verhoudingen tussen 1,9 en 2,1 voor downstream toepassingen.
      OPMERKING: In deze studie varieerden typische RNA-concentraties van 100 tot 180 ng/μL.
    4. Bewaar RNA-monsters bij −80 °C tot verder gebruik.
  7. Eiwitverwijdering en isolatie van DNA
    1. Na RNA-isolatie wordt de interfase van de fenolextractiestap behouden.
      OPMERKING: Deze stap is noodzakelijk omdat de interfase DNA bevat, dat verder kan worden verwerkt voor DNA-isolatie na fenoltoevoeging en centrifugatie.
    2. Ga verder met DNA-extractie door stappen 3.2.1-3.4.1 te volgen, beginnend met de interfase als uitgangsmateriaal. Breng voorzichtig de gehele interfase (met DNA) van de fenolextractie over naar een steriele 1,5 mL microcentrifugebuis die op een koelrand wordt geplaatst.
    3. Eiwitvertering: Voeg 0,5 mL lysisbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM EDTA; 0,1% SDS; 400 μg/mL Proteïnase K) toe aan de buis. Incubeer een nacht op 56 °C om eiwitten te verteren.
    4. Zoutprecipitatie van DNA
      1. Voeg de volgende dag 100 μL 5 M ammoniumacetaat toe aan elk monster en meng kort. Centrifugeer op 1.788 × g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
      2. Breng de heldere waterige fase voorzichtig over in een nieuwe steriele microcentrifugebuis van 1,5 mL. Voeg een gelijk volume moleculairbiologische isopropanol (1:1 verhouding) toe aan de waterige fase, meng door zachte inversie en centrifugeer op 1.788 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg zonder de DNA-pellet te verstoren.
      3. Was de DNA-pellet met 1 ml 70% ethanol en centrifugeer dan 10 minuten op 1.788 × g .
      4. Verwijder en gooi de ethanolwash weg. Laat de DNA-pellet even droog lucht houden.
      5. Sussief de gedroogde DNA-pellet opnieuw in 50 μL nucleasevrij water.
  8. Verwijder vrij nucleïnezuur om DNA op te schonen:
    1. Laad het opgeloste DNA op een DNA-spinkolom. Centrifugeer op 15.000 × g gedurende 15 seconden en verwijder de doorstroom.
    2. Was de kolom twee keer met 70% ethanol en centrifugeer elke keer 1 minuut op 15.000 × g. Gooi de doorstroming na elke wasbeurt weg.
    3. Breng de spinkolom over naar een schone 1,5 mL verzamelbuis. Voeg 30 μL nucleasevrij water toe aan de kolommatrix, incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur, en centrifugeer dan 1 minuut bij 15.000 × g om DNA te elueren.
    4. Leg het geëlueerde DNA op ijs. Verdeel het monster in twee buizen: één voor DNA-opslag bij 4 °C, de tweede aliquot voor latere DNA/RNA-hybride extractie.
  9. Extractie van RNA gehecht aan DNA (DNA/RNA-hybriden)
    1. DNase-behandeling
      1. Bereid een DNase-digestiemengsel door 5 μL (15 U) DNase I te combineren met 75 μL 10x DNase-digestiebuffer.
      2. Voeg 80 μL van het DNase-mengsel toe aan de gedroogde DNA-pellet. Incubeer het monster 15 minuten op kamertemperatuur.
    2. Fenol-chloroform-extractie
      1. Voeg 300 μL fenol toe aan het monster en incubeer 5 minuten op kamertemperatuur.
      2. Voeg 180 μL chloroform toe aan het mengsel en incubeer nog eens 5 minuten op kamertemperatuur.
      3. Centrifugeer op maximale snelheid (bijvoorbeeld 15.000 × g) gedurende 10 minuten bij 4 °C om de fasen te scheiden. Breng voorzichtig de bovenste waterige fase (met RNA:DNA-hybriden) over in een nieuwe buis.
  10. DNA/RNA-hybride isolatie
    1. Voltooi de isolatie van DNA/RNA-hybriden van stappen 3.3 tot 3.5.2.
    2. Voeg een gelijke hoeveelheid (1:1) isopropanol toe aan de waterige fase, draai kort om te mengen en broede 15 minuten op ijs.
    3. Centrifugeer op 12.000 × g, 4 °C gedurende 15 minuten. Zoek naar de RNA-pellet onderin de buis. Draai de buis voorzichtig om om het supernatant weg te gooien zonder de pellet te verstoren.
    4. Voeg 1,5 mL 70% ethanol toe aan de pellet. Tik voorzichtig 5 seconden op de tube om te wassen. Centrifugeer op 7.500 × g, 4 °C gedurende 5 minuten. Draai de buis om om het supernatant weg te gooien. Herhaal de ethanolwas twee keer (in totaal drie wasbeurten).
  11. RNA-zuivering:
    1. Na de laatste ethanolwasbeurt draai je de buis om en laat je eventueel restanten van ethanol aan de lucht drogen of verwijder je voorzichtig met een pipet.
    2. Voeg 30 μL RNase-vrij water toe aan de DNA/RNA-hybride pellet en pipetteer voorzichtig op en neer of tik de buis om het RNA volledig te laten ophangen.
    3. Bewaar DNA/RNA-hybride monsters bij −80 °C tot verder gebruik.

4. cDNA-synthese

OPMERKING: Zorg voor de integriteit van RNA, cDNA en DNA door gebruik te maken van RNase/DNase-vrije materialen en het bewaren van monsters gedurende de procedure.

  1. Voor elk monster wordt 6 μL gebruikt (20 ng RNA; zoals geïsoleerd in stap 3.6.5 voor vrij RNA of stap 3.13.3 voor DNA/RNA-hybride RNA). Breng het benodigde volume RNA over in gelabelde PCR-buizen.
  2. Bereid de cDNA-synthese-mastermix voor volgens de instructies van de fabrikant van de kit. Zorg ervoor dat de mastermix voor elke reactie reverse transcriptase, dNTP's, primers, buffer en RNase-remmers bevat. Voor elke reactie wordt 14 μL mastermix gecombineerd met 6 μL van het RNA-monster in een PCR-buis (totaalvolume: 20 μL per reactie). Neem ten minste één no-reverse transcriptase (-RT) controle op door een parallelle reactie voor te bereiden zonder reverse transcriptase-enzym toe te voegen, met dezelfde hoeveelheid RNA.
  3. Voer cDNA-synthese uit in een thermische cycler met behulp van het temperatuurprogramma dat in Tabel 1 is gespecificeerd.
  4. Verdun het resulterende cDNA 1:5 met nucleasevrij water en bewaar het bij −80 °C tot qPCR-analyse.

5. Bepaling van TERRA-expressieniveaus via Q-PCR

  1. Bereid het qPCR-reactiemengsel voor met een SYBR Green-gebaseerde qPCR-kit, volgens de instructies van de fabrikant. Voor elke reactie combineert u 1 μL SYBR Green Master Mix, 0. μL vooraanstaande primer voor TERRA (zie Tabel 2), 0. μL omgekeerde primer voor TERRA (zie b), en μL nucleasevrij water.
  2. Doseer 16 μL van het reactiemengsel in elke put van een 96-put qPCR-plaat.
  3. Voeg 4 μL verdund cDNA (van stap 4.6) toe aan elke put, voor een eindreactievolume van 20 μL.
    OPMERKING: Voor elk monster moet je minstens twee technische replicaten en twee biologische replicaten toevoegen. Neem no-template controles (NTC's) toe om te controleren op besmetting en no-reverse transcriptase-controles om specificiteit van RNA-afgeleide signalen te waarborgen.
  4. Voer qPCR uit met het temperatuurprogramma dat in Tabel 3 is gespecificeerd.
  5. Normaliseer de TERRA-expressie naar β-Actine (huishoudgen) met behulp van de 2-ΔΔCt-methode .

6. Bepaling van telomeerlengte

  1. Bereid het qPCR-mengsel voor telomeerlengtemeting 21. Voor elke reactie combineert u 1 μL SYBR Green Master Mix, 0. μL telomeervoorwaartse primer (zie Tabel 2]), 0. μL telomeer-omgekeerde primer (zie Tabel 2) en μL nucleasevrij water.
  2. Doseer 16 μL van het telomeerreactiemengsel in elke put van een 96-put qPCR-plaat.
  3. Voeg 4 μL genomisch DNA (uit stap 3.10.5) toe aan elke put, voor een eindreactievolume van 20 μL.
  4. Voer qPCR uit volgens de juiste programmaparameters die door de fabrikant zijn gespecificeerd (zie Tabel 3).
  5. Parallel wordt reacties opgezet voor een referentiegen met één kopie (36B4) met dezelfde concentraties en uiteindelijke volume.
  6. Standaardcurves werden gegenereerd met seriële verdunningen van een synthetisch telomeer-oligonucleotide (Tabel 2) om de relatieve abundantie en de amplificatie-efficiëntie te schatten. Absolute kwantificatie werd niet uitgevoerd. De relatieve telomeerlengte wordt berekend als de T/S-verhouding (telomeerherhaalingskopie tot enkel kopie gennummer) met behulp van de ΔCt-methode21.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie hebben we de niveaus van vrije TERRA, DNA/RNA-hybride TERRA en telomeerlengte over meerdere muisweefsels (bloed, sperma, huid, hypothalamus, hypofyse, bijnier) evenals in menselijke bloed- en huidmonsters gekwantificeerd en vergeleken, om weefselspecifieke dynamiek en de relatie met telomeerbiologie te onderzoeken. Vrije TERRA werd geïsoleerd uit de waterige fase na fenol-chloroform-extractie (protocolstappen 3.6.1-3.6.5), ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een centrale kracht van het hier gepresenteerde protocol ligt in de stapsgewijze extractie en discriminatie van vrije TERRA en DNA/RNA-hybride TERRA uit complexe weefselmonsters. Kritieke stappen zijn onder meer de zorgvuldige scheiding van de waterige en interfasefracties tijdens fenol-chloroformextractie, omdat kruisbesmetting het onderscheid tussen vrije en hybride TERRA kan verwarren. De daaropvolgende DNase I-behandeling van de interfasefractie is ook cruciaal: onvoldoende vertering...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij zijn Erciyes University Scientific Research Unit dankbaar voor de ondersteuning van dit werk met subsidienummers TYL-2019-9224 en TSA-2022-11929.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 mL PCR tubes Greiner671201
15 mL Falcon TubesIsolab078.02.001
2 mL SyringeHayatN/A
96- Multiwell plateGreiner50-720-3203
Absolute EthanolMerck1070172511
Amonnium AcetateSigma238074-500G
cDNA Synhesis KitRoche07 912 439 001
ChloroformMerck1024451000
DNAse I Kit ZymoE1010
EDTASigmaE9884-1KG
Glass bottleIsolabLB.IS.061.01.901
Graduated cylinderIsolab 015.01.901
Guanidine isothiocyanate SigmaG9277-100G
IsoproponalMerck1096342511
Light Cycler 480 IIRoche5015278001
Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)Greiner616201
Micropipettes (10 µL)GilsonFD10001
Micropipettes (100 µL)GilsonFD10004
Micropipettes (1000 µL)GilsonFD10003
Micropipettes (2 µL)GilsonGFAM00064
NanodropShimadzuC101-E112
PBS TabletSigmaP4417-50TAB
PCR DeviceSensoquestT3-0140
PGL3 Basic VectorPromega #212936
Pipette tips (10 µL, 200 µL, 1000 µL)Greiner772352
Plastic Petri dishesGreiner627102
Proteinase KSigmaP6556-10MG
SDSSigma8170342500
Serological PipetteGreiner760107
SpinGilsonPMC880
Sybr Green MasterRoche4707516001
ThermomixerEppendorf#5355
Trizma baseSigma1503-1KG     
TrizolBiorad7326890
Unimax 1010 DT ShakerHeidolph543-12310-00-6
VortexHeidolph541-10000-00-1
Zymo-Spin I ColumnsZymoC1003-50

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allison, D. F., Wang, G. G. R-loops: formation, function, and relevance to cell stress. Cell Stress. 3, 38-46 (2019).
  2. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdiscip Rev RNA. 5, 407-419 (2014).
  3. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat-containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318, 798-801 (2007).
  4. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318, 798-801 (2007).
  5. Oliva-Rico, D., Herrera, L. A. Regulated expression of the lncRNA TERRA and its impact on telomere biology. Mech Ageing Dev. 167, 16-23 (2017).
  6. Azzalin, C. M., Lingner, J. Telomeres: the silence is broken. Cell Cycle. 7, 1161-1165 (2008).
  7. Roake, C. M., Artandi, S. E. Approaching TERRA Firma: genomic functions of telomeric noncoding RNA. Cell. 170, 8-9 (2017).
  8. Xu, Y., et al. Finding a human telomere DNA-RNA hybrid G-quadruplex formed by human telomeric 6-mer RNA and 16-mer DNA using click chemistry: a protective structure for telomere end. Bioorg Med Chem. 22, 4419-4421 (2014).
  9. Montero, J. J., López De Silanes, I., Graña, O., Blasco, M. A. Telomeric RNAs are essential to maintain telomeres. Nat Commun. 7, 1-13 (2016).
  10. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdiscip Rev RNA. 5, 407-419 (2014).
  11. De Silanes, I. L., et al. Identification of TERRA locus unveils a telomere protection role through association to nearly all chromosomes. Nat Commun. 5, 4723(2014).
  12. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318, 798-801 (2007).
  13. Roake, C. M., Artandi, S. E. Approaching TERRA Firma: genomic functions of telomeric noncoding RNA. Cell. 170, 8-9 (2017).
  14. Pfeiffer, V., Lingner, J. TERRA promotes telomere shortening through exonuclease 1-mediated resection of chromosome ends. PLoS Genet. 8, e1002747(2012).
  15. Balk, B., Dees, M., Bender, K., Luke, B. The differential processing of telomeres in response to increased telomeric transcription and RNA-DNA hybrid accumulation. RNA Biol. 11, 95-100 (2014).
  16. Yu, T. Y., Kao, Y. W., Lin, J. J. Telomeric transcripts stimulate telomere recombination to suppress senescence in cells lacking telomerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 3377-3382 (2014).
  17. Mehmetbeyoglu, E., et al. Decrease in RNase HII and accumulation of lncRNAs/DNA hybrids: a causal implication in psoriasis. Biomolecules. 12 (3), 368(2022).
  18. Boguslawski, S. J., et al. Characterization of monoclonal antibody to DNA.RNA and its application to immunodetection of hybrids. J Immunol Methods. 89, 123-130 (1986).
  19. Phillips, D. D., et al. The sub-nanomolar binding of DNA-RNA hybrids by the single-chain Fv fragment of antibody S9.6. J Mol Recognit. 26, 376-381 (2013).
  20. Ginno, P. A., Lott, P. L., Christensen, H. C., Korf, I., Chédin, F. R-loop formation is a distinctive characteristic of unmethylated human CpG island promoters. Mol Cell. 45, 814-825 (2012).
  21. O'Callaghan, N. J., Fenech, M. A quantitative PCR method for measuring absolute telomere length. Biol Proced Online. 13, 1-10 (2011).
  22. Arora, R., Azzalin, C. M. Telomere elongation chooses TERRA ALTernatives. RNA Biol. 12, 938-941 (2015).
  23. Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nat Struct Mol Biol. 20, 1199-1206 (2013).
  24. Roake, C. M., Artandi, S. E. Approaching TERRA Firma: genomic functions of telomeric noncoding RNA. Cell. 170, 8-9 (2017).
  25. Luke, B., Lingner, J. TERRA: telomeric repeat-containing RNA. EMBO J. 28, 2503-2510 (2009).
  26. Cañas, J. C., Aguilera, A., Gómez-González, B. Detection of R-loops by in vivo and in vitro cytosine deamination in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 2528, 39-53 (2022).
  27. Cerritelli, S. M., Sakhuja, K., Crouch, R. J. RNase H1, the gold standard for R-loop detection. Methods Mol Biol. 2528, 91-114 (2022).
  28. Skourti-Stathaki, K. Detection of R-loop structures by immunofluorescence using the S9.6 monoclonal antibody. Methods Mol Biol. 2528, 21-29 (2022).
  29. Kianmehr, L., et al. Analysis of RNA/DNA hybrid profiles in blood from autistic patients reveals differences in mRNA and non-coding RNA regions. bioRxiv. , (2024).
  30. Yilmaz Sukranli, Z., et al. Experimentally altering microRNA levels in embryos alters adult phenotypes. Sci Rep. 14, 19014(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Telomeer RNADNA RNA hybridenTERRA schattingniet coderend RNAzuivering van hybridenfasescheidingproteinase KDNase behandelingfenol chloroformeextractieisolatie van nucle nezuren

Gerelateerde artikelen