Een eenvoudige methode met dubbele centrifugatiebuis om bloedplaatjesrijk plasma uit paardenbloed te verkrijgen

Samenvatting

Bloedplaatjesrijk plasma (PRP) wordt gebruikt bij de behandeling van musculoskeletale aandoeningen bij paarden. Verschillende technieken leveren PRP op met variërende concentraties bloedplaatjes en leukocyten. In dit artikel wordt een methode beschreven voor het verkrijgen van PRP uit paardenbloed.

Samenvatting

Bloedplaatjesrijk plasma (PRP) wordt veel gebruikt als routinebehandeling voor chronische musculoskeletale aandoeningen bij paarden, zoals artrose, tendinopathieën en desmopathieën. Deze effectiviteit komt voort uit de hoge concentratie van groeifactoren en ontstekingsremmende cytokines die vrijkomen bij activering van dit orthobiologische middel, ongeacht of het endogeen of exogeen wordt geactiveerd. Ondanks de groeiende populariteit is er een opmerkelijke afwezigheid van instructievideo's die de technieken voor het verkrijgen van PRP bij paarden demonstreren.

Deze studie onderzoekt een dubbele centrifugatiebuismethode voor het verkrijgen van PRP bij paarden. Volbloed van zes paarden werd verzameld in natriumcitraatbuisjes en tweemaal gecentrifugeerd bij 120 × g gedurende 5 minuten en 240 × g gedurende 5 minuten. De gemiddelde bloedplaatjesconcentratie voor PRP was 360,95 ± 56,31 bloedplaatjes (PLT) × 10³/μL, terwijl de gemiddelde leukocytenconcentratie 3,05 ± 1,53 cellen × 10³/μL was. Het aantal bloedplaatjes in PRP was 2,41x hoger dan in volbloed, terwijl de leukocytenconcentratie in PRP 0,44x lager was. De verzamelingsefficiëntie voor PLT in PRP was 17%, terwijl de verzamelingsefficiëntie voor leukocyten in PRP 3,1% was. De gemiddelde concentraties van transformerende groeifactor bèta 1 en van bloedplaatjes afgeleide groeifactor BB in PRP waren respectievelijk 2601,82 (95% betrouwbaarheidsinterval (BI): 2358,88-2844,76) pg/ml en 1208,05 (95% BI: 1051,09-1365,02) pg/ml. Deze resultaten geven aan dat PRP efficiënt en reproduceerbaar kan worden verkregen door middel van een eenvoudige, kosteneffectieve methode die geschikt is voor gebruik door paardenbeoefenaars.

Inleiding

Bloedplaatjesrijk plasma (PRP) is een orthobiologisch product dat vaak wordt gebruikt voor de behandeling van chronische musculoskeletale aandoeningen bij paarden, zoals tendinopathieën, desmopathieën, artrose en hoefbevangenheid ^1,2,3. Het is ook effectief bij de behandeling van ledemaatwonden en oogoppervlakaandoeningen ^4,5. De grondgedachte voor het gebruik ervan is gebaseerd op de hoge concentraties groeifactoren (GF's) die voornamelijk door bloedplaatjes worden afgegeven⁶. Leukocyten dragen ook bij door regulerende en ontstekingsremmende cytokines vrij te geven⁷. GF's zoals transformerende groeifactor bèta 1 (TGF-β₁) en van bloedplaatjes afgeleide groeifactor BB (PDGF-BB) oefenen krachtige anabole, proliferatieve, angiogene en ontstekingsremmende effecten uit⁸. Bij exogene of endogene activering polymeriseert PRP tot een bloedplaatjesrijke gel, waardoor celtransport, verankering en differentiatie worden vergemakkelijkt ^6,9. Op deze manier dient de PRP als een complexe levende steiger en niet alleen als een container voor GF's en cytokines¹⁰.

Verschillende systemen classificeren PRP-producten die zowel bij mensen als bij paarden worden gebruikt ^6,11,12. Een van de eenvoudigste en meest voorkomende systemen categoriseert deze hemocomponenten op basis van de leukocytenconcentratie^11,12. Volgens deze classificatie worden PRP-producten met lage tot verwaarloosbare leukocytenconcentraties en lage tot matige bloedplaatjesconcentraties - in verhouding tot de niveaus in het volbloed van het paard - aangeduid als pure PRP (P-PRP)^6,11,12. PRP-producten met detecteerbare tot hoge leukocytenconcentraties en matige tot hoge bloedplaatjesconcentraties worden daarentegen leukocyten- en bloedplaatjesrijk plasma (L-PRP) genoemd6,11,12.

P-PRP-producten worden meestal verkregen door buis-tot-buis centrifugatie waarbij volbloed van paarden wordt verzameld in buisjes die anticoagulantia bevatten, zoals natriumcitraat en citraat, fosfaat en dextrose¹³. Het bloed wordt twee keer gecentrifugeerd om bloedplaatjes te scheiden van andere componenten¹⁴. Daarentegen worden L-PRP-producten voornamelijk bereid met behulp van semi-geautomatiseerde kits die zijn ontworpen voor menselijk bloed, waarvan sommige zijn gevalideerd voor gebruik bij paarden ^6,15. Deze semi-geautomatiseerde kits vereisen over het algemeen gespecialiseerde centrifuges en brengen hogere kosten met zich mee¹⁶, evenals mogelijke zorgen over aseptische behandeling, wat het praktische gebruik ervan in klinische omgevingen kan bemoeilijken¹⁷. Bovendien kunnen deze kits leiden tot een ongewenste concentratie van overmatige leukocyten of rode bloedcellen, wat in bepaalde klinische situaties schadelijk kan zijn¹⁸. Een verhoogd aantal leukocyten kan bijvoorbeeld overmatige ontsteking veroorzaken, en een overvloed aan rode bloedcellen kan het genezingsproces verstoren of leiden tot complicaties zoals weefselirritatie of afstoting¹⁵; een veelgebruikte methode voor het produceren van L-PRP bij paarden is echter een zwaartekrachtproces waarvoor geen gespecialiseerde apparatuur nodig is¹⁹.

In het licht van deze beperkingen zijn eenvoudigere en kosteneffectievere alternatieven voor PRP-bereiding zeer wenselijk. Verschillende in vitro studies, experimentele modellen van musculoskeletale aandoeningen en observaties bij paarden hebben aangetoond dat zowel P-PRP- als L-PRP-producten gunstige effecten hebben op behandelde cellen en weefsels ^1,2,20. Deze producten bevorderen de genezing, verminderen ontstekingen en verbeteren de weefselregeneratie⁶. De beslissing om P-PRP of L-PRP te gebruiken voor de behandeling van een paard kan echter worden beïnvloed door technische en economische factoren.

Volgens de auteurs zijn er geen gepubliceerde studies die een algemeen gevalideerde stapsgewijze procedure beschrijven en volledig aantonen voor het verkrijgen van een PRP-product uit paardenbloed. Dit artikel schetst de procedures die nodig zijn om veilig volbloed van paarden af te nemen en een PRP-product te produceren dat geschikt is voor zowel experimenteel als klinisch gebruik. Het omvat ook validatie van dit orthobiologische middel door kwantificering van bloedplaatjes en leukocyten en bepaling van de concentratie van TGF-β₁ en PDGF-BB, die een integraal onderdeel zijn van de therapeutische effecten. Door het proces te standaardiseren en de werkzaamheid van het product aan te tonen, probeert deze studie een betrouwbare en toegankelijke methode te bieden voor paardenbeoefenaars om PRP met vertrouwen en precisie te bereiden.

Hoewel de dubbele centrifugatiemethode voor het produceren van PRP bij paarden voor het eerst werd beschreven door Argüelles et ^al.14 in 2006, is dit de eerste keer dat het protocol volledig in een video wordt gepresenteerd. Deze video is bedoeld als praktisch hulpmiddel voor paardenbeoefenaars die te maken hebben met technische beperkingen en budgettaire beperkingen die hen ervan weerhouden om meer geavanceerde en duurdere PRP-kits te gebruiken voor paarden met musculoskeletale aandoeningen.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de interne protocollen voor de bereiding en het gebruik van PRP bij paarden in het Veterinary Teaching Hospital van de Universidad de Caldas, Manizales, Colombia. Voor deze studie was geen goedkeuring van de Internal Animal Care Committee vereist, aangezien de gegevens zijn verkregen van kreupele paarden die klinisch in onze instelling zijn behandeld. Om dit protocol te ontwikkelen, werden gegevens gebruikt van zes Colombiaanse Creoolse paarden, drie merries en drie ruinen, met een gemiddelde leeftijd van 7,4 (± 2,6) jaar. De eigenaren van de paarden werden geïnformeerd over de aard van het onderzoek en ondertekenden een formulier voor geïnformeerde toestemming. Alle paarden die in het onderzoek waren opgenomen, waren klinisch gezond, behalve het musculoskeletale probleem dat werd behandeld. Alleen dieren met een basale trombocytentelling van meer dan 100 × 10³/ml volbloed werden opgenomen. Het is belangrijk op te merken dat paarden met lagere bloedplaatjesconcentraties als trombocytopenisch¹⁴ kunnen worden beschouwd. Bovendien vertoonden deze dieren normale bloedtellingen, klinische biochemische parameters van lever en nieren en urineanalysewaarden binnen het normale bereik voor de paardensoorten.

1. Beperking en desinfectie van de huid van het paard

1. Voor de veiligheid van zowel het paard als de dierenarts moet het paard (Eqqus caballus) stevig in een klinische onderzoekskoker of met een hoofdstel (Figuur 1A) worden vastgezet, afhankelijk van het gedrag van het dier. Knip vervolgens een haargebied van 5 cm x 5 cm met een elektrisch scheerapparaat in het middelste derde deel van een kant van de nek, over de halsader.
   LET OP: Sommige eigenaren geven er de voorkeur aan dat het paard niet geschoren wordt. Een studie geeft aan dat het knippen van haar op de plaats van de venapunctie niet nodig is om bacteriële besmetting van P-PRP²¹ te voorkomen. Daarom is deze procedure ter beoordeling van de dierenarts.
2. Voer een voorbereidende, niet-steriele huidvoorbereiding uit over het afgeknipte deel van de halsader gedurende ten minste 10 cm met behulp van niet-steriel gaas en handschoenen gedurende ongeveer 3 minuten. Breng verschillende stukken gaas gedrenkt in antiseptisch schuim aan in een cirkelvormig patroon (Figuur 1B).
3. Bereid de venapunctieplaats aseptisch voor met zowel steriele handschoenen als gaas gedrenkt in ontsmettingsmiddel. Schrob de huid in de nek in een cirkelvormige beweging gedurende ongeveer 5 minuten. Reinig het gebied met een steriel gaasje gedrenkt in 95% ethylalcohol.

2. Aseptische bloedafname

1. Plaats 16 natriumcitraatbuisjes van 4,5 ml, vooraf gereinigd met gaas gedrenkt in 95% ethylalcohol, in een schoon plastic rek. Impregneer de rubberen doppen van de vacuümbuizen met 95% ethylalcohol, vooral in de uitsparing voor de naaldkoppeling.
   OPMERKING: Over het algemeen zijn acht natriumcitraatbuisjes van 4.5 ml nodig om 2.5 ml PRP te verkrijgen. Het aantal buisjes dat in een bepaald geval wordt gebruikt, hangt af van de zachte weefsels of het specifieke gewricht dat wordt behandeld.
2. Steek steriel een vlindernaald in de gedesinfecteerde halsplaats (Figuur 2A) en bevestig 4.5 ml natriumcitraatbuisjes aan de houder (Figuur 2B). Schud de buizen voorzichtig en plaats ze in een plastic rek.
   OPMERKING: Een natriumcitraatbuis van 4,5 ml wordt gebruikt voor geautomatiseerde hemogrammen en om plasma te bereiden na centrifugatie met harde centrifugatie. Dit plasma wordt vervolgens gebruikt als negatieve controle voor vergelijkingen van groeifactor en cytokineverrijking met PRP.

3. Verkrijging van bloedplaatjesrijk plasma

1. Plaats de natriumcitraatbuisjes van 4,5 ml met volbloed in een uitzwenkbare rotor met vier plaatsen onder een hoek van 90° in een bankcentrifuge. Centrifugeer de buisjes bij 120 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Plaats na het centrifugeren de buisjes van 4,5 ml met gecitreerd bloed en twee extra gewone buisjes van 10 ml in een rek en plaats het rek aan de niet-dominante handzijde van de bediener in een klasse II laminaire stromingskap over een steriele, ondoordringbare afdekkap.
   OPMERKING: Eén studie suggereert dat een laminaire stromingskap van klasse II niet essentieel is om bacteriële besmetting tijdens PRP-inkoop^{te voorkomen 21}. In plaats daarvan kan PRP worden bereid in een cleanroom die vrij is van luchtstromen en stof. In dit scenario kan het bloedbuisrek op een tafel worden geplaatst die is bedekt met een steriel, ondoordringbaar laken.
2. Eerste centrifugatie: Draag een gezichtsmasker en steriele handschoenen en plaats een steriele luerspuit van 10 ml in combinatie met een steriele naald (21 G 5/8") aan de dominante handzijde aan de binnenkant van de laminaire stromingskap.
   OPMERKING: Vanaf dit moment blijft de dominante gehandschoende hand altijd steriel, terwijl de rubberen doppen van de natriumcitraatbuisjes moeten worden verwijderd met de gehandschoende niet-dominante hand.
3. Steek de steriele naald in elke gecentrifugeerde gecitreerde bloedbuis 3 mm over de buffy coat (Figuur 3A) en zuig voorzichtig 50% van de plasmafractie op, vermijd vloeistofturbulentie en bloedaspiratie. Zodra 10 ml plasma uit vier buisjes van 4,5 ml is aangezogen, verdeel het dan in 5-10 ml steriele gewone buisjes (Figuur 3B).
   NOTITIE: Verwijder de rubberen doppen van deze buizen met de niet-dominante hand en plaats ze op een steriele plaats van het laken of houd ze vast om bacteriële besmetting te voorkomen.
4. Tweede centrifugeren: sluit de buizen weer af met de rubberen stoppen en plaats ze in evenwichtstoestand in een uitzwenkbare rotor met vier standen onder een hoek van 90° in de tafelcentrifuge en draai deze buizen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 240 × g .
   OPMERKING: De keuze van de relatieve centrifugatiekracht (RCF of g) is gebaseerd op een baanbrekende studie¹⁴ die voor het eerst deze methode beschreef voor het verkrijgen van PRP uit paardenbloed. Bovendien is deze methode door andere auteurs beoordeeld op reproduceerbaarheid²².
5. Plaats de buizen in een rek en plaats ze aan de niet-dominante kant in de klasse II laminaire stromingskap, bovenop het eerder gelegde, steriele, ondoorlaatbare laken.
6. Gebruik de niet-dominante hand om de rubberen doppen te verwijderen en de steriele dominante hand om de eerste 75% van het plasma langzaam op te zuigen met behulp van een 18 G, 90 mm ruggengraatnaald die is bevestigd aan een steriele luer-spuit van 10 ml (Figuur 3C). Gooi deze spuit weg of bewaar deze voor ander experimenteel of klinisch gebruik, aangezien deze bloedplaatjesarm plasma (PPP) bevat. Bevestig vervolgens de eerder gebruikte steriele spinale naald aan een steriele luerspuit van 5 of 10 ml om het resterende plasma (25%) uit de steriele gewone buis van 5-10 ml op te zuigen. Deze breuk staat bekend als P-PRP (Figuur 3D).
   OPMERKING: Onder bepaalde klinische en experimentele omstandigheden wordt een aliquoot van 0,5-1 ml PRP gebruikt voor geautomatiseerde hemogrammen, gevolgd door groeifactor (TGF-β₁ en PDGF-BB) analyse door enzymgekoppelde immunosorbenttest. Meting van deze mediatoren kan worden uitgevoerd 3 uur na activering van P-PRP met calciumzouten of trombine²³ of na het induceren van celbeschadiging door temperatuurverandering of de toevoeging van niet-ionische detergenten²⁴.
7. Wikkel de steriele luer-spuit met PRP in een klein, ondoorlaatbaar steriel laken met een bevestigde steriele naald of dop om bacteriële besmetting van het orthobiologische product te voorkomen (Figuur 4A).
   OPMERKING: De anatomische structuur van het te behandelen paard moet worden voorbereid op aseptische injectie zoals beschreven in rubriek 1 van dit protocol. Het paard moet voldoende worden vastgehouden en verdoofd om ongemak tot een minimum te beperken en de veiligheid van zowel het paard als de dierenarts te waarborgen. Het PRP-product moet worden gehanteerd met steriele handschoenen en naalden en kan al dan niet worden geactiveerd op basis van de voorkeur van de arts (Figuur 4B).

4. Statistische analyse

1. Verzamel gegevens over het aantal bloedplaatjes en leukocyten in volbloed en PRP. Evalueer gegevens op normaliteit met behulp van de Kolmogorov-Smirnov-test. Als de gegevens normaal verdeeld zijn (P > 0,05), vergelijk en analyseer dan de celgegevens met behulp van de t-toets. Als de gegevens over de concentratie van bloedplaatjes en leukocyten niet normaal verdeeld zijn (P < 0,05), vergelijk en analyseer dan de gegevens met behulp van een Wilcoxon-test.
2. Bepaal de efficiëntieconcentratie van bloedplaatjes en leukocyten in P-PRP volgens de volgende formules²⁵:
   Efficiëntie van het verzamelen van bloedplaatjes = × 100
   Efficiëntie van de verzameling van leukocyten = × 100
3. Verzamel gegevens van TGF-β₁ - en PDGF-BB-concentraties in plasma (negatieve controle), PRP-supernatanten (na 3 uur activering met calciumgluconaat) en PRP-lysaten verkregen door toevoeging van een niet-ionische detergentoplossing.
4. Gebruik een gegeneraliseerd lineair gemengd model om groeifactorconcentraties tussen plasma, PRP-supernatanten en PRP-lysaat te vergelijken. In het geval van significante statistische verschillen, pas dan een Tukey's post-hoctest toe.
5. Beschouw p < 0,05 waarden statistisch significant voor alle tests.

Resultaten

Het gemiddelde aantal bloedplaatjes (bloedplaatjes × 10³/μl) was significant hoger in PRP dan in volbloed (p < 0,001). Daarentegen was de gemiddelde leukocytenconcentratie (leukocyten × 10³/μL) in PRP significant lager dan die in volbloed (p < 0,001) (Tabel 1). In het bijzonder was het aantal bloedplaatjes in PRP 2.41x hoger dan in volbloed, terwijl de leukocytenconcentratie in PRP 0.44x lager was. De verzamelingsefficiëntie voor PLT in PRP was 17%,...

Discussie

Het gebruik van PRP in de humane en diergeneeskunde voor de behandeling van chronische aandoeningen van het bewegingsapparaat neemt toe^met 1,8,26,27. Een belangrijk punt van kritiek op PRP-toepassingen in experimentele en klinische omgevingen is echter het gebrek aan basisgegevens over de technieken en protocollen die worden gebruikt om deze hemocomponenten te ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10 mL gewone veneuze bloedopnamebuisjes	BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, USA	Ref 366430	Dit is slechts een voorbeeld, buisjes van andere merken kunnen worden gebruikt.
4.5 mL natriumcitraatbuisjes (105 M/3. 2%)	BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, USA	107451	Dit is slechts een voorbeeld, buisjes van andere merken kunnen worden gebruikt.
Tischcentrifuge	Rotofix 32A, Hettich GmbH, Tuttlingen, Duitsland		Andere tafelcentrifuges kunnen worden gebruikt.
Butterflynaald (21 G × 0.75 inch) met 12 inch slang en vooraf bevestigde houder	Safety-Lok Blood Collection Set, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, USA	Ref 367296	Dit is slechts een voorbeeld, butterflynaalden van andere merken kunnen worden gebruikt.
Chlorhexidine schuimoplossing bij 2,3-4%			De merk- of handelsnamen van deze producten kunnen van land tot land verschillen.
Klasse II laminare stromingskast	Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA		Andere klasse II laminaire stromingskassen kunnen worden gebruikt
ELISA-lezer	Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA
Ethylalcohol bij 95%			De merk- of handelsnamen van deze producten kunnen van land tot land verschillen.
Human PDGF-BB DuoSet ELISA	R&D Systems, Inc, McKinley Place, MN, USA	DY220
Human TGF-beta 1 DouSet ELISA	R&D Systems, Inc, McKinley Place, MN, USA	DY240
Povidonjodium schuimoplossing bij 4-10%			De merk- of handelsnamen van deze producten kunnen van land tot land verschillen.
SPSS 25.0 software	IBM Corp, SPSS, NY, USA
Steriele luer-spuitjes van verschillende volumes	Discardit Syringe, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, USA		Dit is slechts een voorbeeld, spuitjes van andere merken kunnen worden gebruikt.
Steriele spinale naald (18 G × 90 mm)	BD Quincke Spinel Needle, Franklin Lakes, NJ, USA		Dit is slechts een voorbeeld, spinale naalden van andere merken kunnen worden gebruikt.