Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van primaire menselijke proximale tubule-epitheelcellen en hun gebruik bij het maken van een microfysiologisch model van de proximale niertubuli

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67997

⸱

9 mei 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutics, School of Pharmacy, University of Washington, 2Department of Pharmacy, School of Pharmacy, University of Washington, 3Kidney Research Institute, Division of Nephrology, Department of Medicine, University of Washington, 4Barbara T. Murphy Division of Nephrology, Samuel Bronfman Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een geoptimaliseerd protocol voor het verwerken van hele menselijke nieren om primaire renale proximale tubulule-epitheelcellen te isoleren en te kweken en de toepassing van deze cellen in een driedimensionaal, microfluïdisch, microfysiologisch platform om de proximale niertubulus te recapituleren.

Samenvatting

Nierziekte treft wereldwijd meer dan 850 miljoen mensen, waaronder 37 miljoen Amerikanen. Risicofactoren voor chronische nierziekte zijn onder meer omgevingsinvloeden, genetische aanleg, naast elkaar bestaande medische aandoeningen en een voorgeschiedenis van acuut nierletsel. Deze factoren hebben vaak maanden of jaren nodig om zich te ontwikkelen, wat longitudinale studies van de etiologie en pathofysiologie van de ziekte bemoeilijkt. Geavanceerde niermodellen zijn nodig om ons begrip van ziektemechanismen te verbeteren en de voorspelling van nefrotoxiciteit bij de ontwikkeling van geneesmiddelen te verbeteren. Proximale tubulus-epitheelcellen (PTEC's) in de nier spelen een cruciale rol bij de opruiming van xenobiotica en toxines, evenals bij de reabsorptie van essentiële voedingsstoffen. We hebben eerder aangetoond dat driedimensionale (3D) microfysiologische systeem (MPS) platforms, bevolkt met geïsoleerde primaire PTEC's, kunnen worden gebruikt om renale geneesmiddelinteracties te onderzoeken, nefrotoxiciteit van verbindingen te beoordelen en de klaring van geneesmiddelen te voorspellen. Hier presenteren we protocollen voor het isoleren en kweken van primaire PTEC's uit hele menselijke nieren en voor het zaaien ervan in een 3D MPS-platform dat in vivo nierfysiologie nabootst. Dit protocol maakt langetermijnstudies mogelijk ter ondersteuning van de levensvatbaarheid van PTEC, fysiologische morfologie en functionele polarisatie van belangrijke transporteiwitten in MPS-apparaten gedurende maximaal 6 maanden.

Inleiding

De nier speelt een cruciale rol bij de klaring en eliminatie van een breed scala aan xenobiotica, toxines en endogene verbindingen uit het lichaam. Dit wordt bereikt door bloed te filteren om afvalproducten te verwijderen en door de elektrolytenbalans, het vochtgehalte en de pH te reguleren. Elke menselijke nier bevat ongeveer een miljoen nefronen, de structurele en functionele eenheden van de nier1. Binnen deze nefronen zijn gespecialiseerde epitheelcellen in de proximale tubuli, bekend als proximale tubule-epitheelcellen (PTEC's), verantwoordelijk voor het opnieuw absorberen van essentiële moleculen zoals glucose, aminozuren en ionen, evenals voor het afscheiden van geneesmiddelsubstraten en potentieel giftige stoffen in de urine 2,3,4. In sommige gevallen kunnen PTEC's ook verbindingen uit de urine opnieuw in de bloedbaan opnemen4. Vanwege hun cruciale rol in geneesmiddel- en toxine-interacties, bieden primaire PTEC's geïsoleerd uit menselijke nieren een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van renale geneesmiddelinteracties (DDI's) en het beoordelen van de nefrotoxiciteit van verbindingen.

Door geneesmiddelen geïnduceerde nefrotoxiciteit vormt een aanzienlijke klinische uitdaging, omdat het kan leiden tot acuut nierletsel en chronische nierziekte5. Daarom is een beter begrip van de fysiologie van de proximale tubulus nier essentieel voor het nauwkeurig voorspellen en karakteriseren van het nefrotoxische potentieel van geneesmiddelen en toxines. Traditionele in vitro-modellen, waaronder onsterfelijke niercellijnen (bijv. RPTEC-TERT1, HK-2), hebben beperkingen bij het nabootsen van de complexe structuur en functie van de menselijke proximale tubuli6, die werken onder dynamische, laminaire stroming (met een laag Reynoldsgetal) en een uniforme extracellulaire matrix (ECM) in vivo 7,8. Bovendien slagen traditionele tweedimensionale (2D) modellen er vaak niet in om belangrijke niertransporters functioneel tot expressie te brengen (bijv. organische aniontransporter 1 en 3 (OAT1 en OAT3), organische kationtransporter 2 (OCT2)) vanwege de snelle afbraak en internalisatie van deze eiwitten 6,9,10,11 . Diermodellen, hoewel informatief, repliceren mogelijk niet volledig de menselijke nierfysiologie en zijn vaak niet vertaalbaar vanwege soortverschillen in transporterexpressie en activiteit12. mOct1 wordt bijvoorbeeld basolateraal tot expressie gebracht in PTEC's van muizen, terwijl bij mensen de membraaneiwitexpressie van OCT1 in de nier niet detecteerbaar is13,14.

Vooruitgang in microfysiologische systemen (MPS) en organ-on-a-chip-technologieën hebben onderzoekers in staat gesteld in-vitromodellen te ontwikkelen die de driedimensionale (3D) architectuur en dynamische vloeistofstroomcondities van menselijke organen nauwkeurig nabootsen15. Onze groep heeft eerder twee MPS-modellen gekarakteriseerd met PTEC's16,17, en heeft deze modellen gebruikt om toxiciteitsstudies uit te voeren 18,19,20 en de dispositie van geneesmiddelen nauwkeurig te voorspellen 21. Het gebruik van primaire PTEC's in deze modellen biedt aanzienlijke voordelen vanwege hun vermogen om functionele kenmerken te behouden die in vivo worden waargenomen.

Hier presenteren we de protocollen voor de isolatie van menselijke PTEC's uit een intacte menselijke nier verkregen van een overleden donor via een door het United Network for Organ Sharing (UNOS) goedgekeurde organisatie voor het verkrijgen van organen en het toepassen van deze gekweekte menselijke PTEC's binnen een MPS-platform.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Al het werk werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Universiteit van Washington voor het omgaan met menselijk weefsel. Geschikte donoren voldoen aan de volgende vereisten: minder dan 36 uur koude ischemische tijd (CIT), geen bekende voorgeschiedenis van nieraandoeningen, dialyse of andere medische aandoeningen (bijv. diabetes mellitus type 1 of 2, hepatitis B, hepatitis C, humaan immunodeficiëntievirussen (HIV), virale/bacteriële meningitis, methicilline-resistente Staphylococcus aureus-infectie , syfilis, sepsis of Covid-19). De hele menselijke nieren die in deze studie zijn gebruikt, zijn afkomstig van een door UNOS goedgekeurde OPO.

1. Voorbereiding van de bioveiligheidskast

  1. Spuit de kap in met 70% ethanol. Ontsmet alle oppervlakken en voorwerpen in de kast om een steriele omgeving te creëren.
  2. Leg blauwe absorberende pads neer. Voer al het weefselwerk uit op deze pads.
  3. Zorg ervoor dat de benodigde apparatuur beschikbaar is in de bioveiligheidskast en op de juiste manier is gesteriliseerd (scheermesjes, serologische pipetpunten, serologisch pipetpistool, 100 μm celzeven, p1000 tips, 1000 μL micropipet, 15 cm ronde kweekschaaltjes en conische buisjes).

2. Voorbereiding van de voorbewerking van de nieren

  1. Bereid de oplossing voor de nierspijsvertering door 0,75 mg/ml collagenase IV + 0,75 mg/ml dispase II toe te voegen aan Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) met calcium en magnesium. Filtreer de oplossing door een steriel membraanfilter van 0,2 μm.
    OPMERKING: Voor een hele menselijke volwassen nier zijn ongeveer 14 conische buizen van 50 ml nodig, elk met ~35 ml digestieoplossing (in totaal 500 ml).
  2. Bereid PTEC-media voor door 4,425 g Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12-poeder zonder glucose, 0,5 g D-glucosepoeder, 0,6 g natriumbicarbonaatpoeder, 5 ml 100x insuline-transferrine-seleniumsupplement (met 1000 mg/l insuline, 550 mg/l transferrine en 0,67 mg/l natriumseleniet), 0,5 ml 50 μM hydrocortison en 5 ml 100x antibiotica-antimycotische oplossing (met 10000 eenheden/ml penicilline G-natrium, 10000 μg/ml streptomycinesulfaat en 25 μg/ml amfotericine B in 0,85% zoutoplossing) in 500 ml steriel geautoclaveerd ultrapuur (type 1) water. Filtreer de media door een steriel membraanfilter van 0,2 μm. Ontdooi foetaal runderserum (FBS) en maak 10 ml aliquots in 14 conische buisjes van 50 ml.
  3. Verzamel en label een extra set conische buizen van 50 ml. Zorg er bij deze stap voor dat er 3 sets van 14 tubes van 50 ml zijn.
  4. Verwarm de orbitale schudder voor op 37 °C.

3. Isolatie van PTEC's uit de hele nier

  1. Plaats met behulp van een steriele techniek de verzendcontainer met het weefselmonster in de bioveiligheidskap. Haal de zak uit de doos en spuit de buitenkant in met 70% ethanol voordat je hem in de kap doet.
  2. Leg de nier op een ronde kweekschaal van 15 cm. Zuig de resterende media op/gooi ze weg.
  3. Verwijder het omringende vet en het nierkapsel met behulp van steriele scheermesjes. Snijd voorzichtig in in het nierkapsel om een spleet in het midden te maken.
  4. Trek met een pincet de capsule eraf en gebruik scheermesjes om al het vet dat aan de nier vastzit af te snijden. Gooi zowel de capsule als het vet weg in een ander kweekschaaltje van 15 cm.
  5. Scheid de cortex (~1 cm dik) van de medulla. Gooi de medulla weg.
    OPMERKING: De cortex heeft een lichtere bruingele kleur in vergelijking met de medulla.
  6. Hak met een scheermesje de tissue in3 stukken van <1 cm tot een slurry-achtig uiterlijk.
  7. Voeg een kleine hoeveelheid nierverteringsbuffer toe aan de schaal en breng de suspensie over in de eerste set buisjes van 50 ml met 35 ml nierdigestieoplossing. Verdeel gelijkmatig en overschrijd een totaal volume van 45 ml voor elke buis niet.
  8. Breng alle buizen over op de orbitale schudder van 37 °C en incubeer gedurende 30 minuten met de hoogste snelheid die er niet voor zorgt dat de buizen eruit vallen. Breng de buisjes terug in de bioveiligheidskast nadat je ze hebt besproeid met 70% ethanol.
  9. Keer de buisjes om om te mengen en laat de grotere stukken weefsel naar de bodem zakken. Breng zoveel mogelijk van de oplossing over in de conische buisjes van 50 ml die 10 ml foetaal runderserum (FBS) bevatten zonder intact weefsel over te brengen. Verdeel gelijkmatig en overschrijd een totaal volume van 45 ml voor elke buis niet.
  10. Centrifugeer de buisjes bij 200 g gedurende 7 minuten. Verplaats de buisjes terug in de bioveiligheidskast nadat je ze hebt besproeid met 70% ethanol.
  11. Zuig voorzichtig het bovenliggende op. Voeg 10 ml PTEC-media toe aan elke buis en suspendeer de pellets opnieuw.
  12. Zeef de resulterende celsuspensies door celzeven van 100 μm in nieuwe conische buizen van 50 ml.
  13. Centrifugeer de resulterende celfiltraten bij 400 g gedurende 5 minuten. Verplaats de buisjes terug in de bioveiligheidskast nadat je ze hebt besproeid met 70% ethanol.
  14. Was de pellets met 5 ml DPBS. Resuspendeer de pellets met een p1000-tip.
  15. Centrifugeer de buisjes bij 400 g gedurende 5 minuten. Verplaats de buisjes terug in de bioveiligheidskast nadat u ze met 70% ethanol hebt besproeid en zuig vervolgens de supernatanten op.
  16. Herhaal stap 3.15 nog twee keer voor een totaal van drie wasbeurten. Resuspendeer vervolgens de celpellets met 15 ml PTEC-media en plaats de cellen op steriele celkweekkolven T-75.
  17. Etiketteer de kolven op de juiste manier en laat de cellen groeien in een steriele incubator bij 37 °C en 5% CO2 . Laat PTEC's 48 uur ongestoord in de broedmachine groeien voordat u de eerste mediawissel uitvoert.

4. Wijzigingen in de media

  1. Zuig media uit de kolven.
  2. Was de cellen met 5 ml voorverwarmde DPBS.
  3. Voeg 5 ml voorverwarmde PTEC-media toe aan de T-25-kolven.
  4. Plaats de kolf terug in de broedmachine.
  5. Vervang de media elke 48 uur totdat de kolf ten minste 70% samenvloeiing heeft bereikt voor passeren of gebruik in experimenten.

5. Passeren van PTEC's

  1. Zuig media uit de kolf op. Voeg 5 ml voorverwarmde 0,05% trypsine-EDTA toe aan elke T-25-kolf en incubeer gedurende 1 tot 2 minuten bij 37 °C om de vertering van trypsine mogelijk te maken.
  2. Zodra de cellen zijn losgemaakt, neutraliseert u trypsine met 5 ml voorverwarmde gedefinieerde trypsineremmeroplossing.
  3. Resuspendeer 5 maal om de cellen die nog aan de kolf vastzitten los te maken. Breng vervolgens de celsuspensie over in conische buizen van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 g .
  4. Zuig het bovennatuurlijke op.
    OPMERKING: Stop hier om PTEC's te cryopreserveren en naar dat protocol te gaan.
  5. Resuspendeer celpellets met 14 ml PTEC-media per buis. Breng de celsuspensies over naar T-75-kolven (1 buisje per kolf).
  6. Voer een T-shake uit om de cellen gelijkmatig over de kolf te verdelen. Bewaak de cellen en vervang de media elke 48 uur.

6. Cryopreservatie van PTEC's

  1. Resuspendeer na stap 5.6 de celpellets in 2 ml 10% DMSO en 90% PTEC-media met een laag glucosegehalte voor elke conische buis van 15 ml en breng 1 ml over in één cryovivaat.
  2. Breng de cryovials over naar een celvriescontainer die temperatuurgecontroleerd invriezen mogelijk maakt en plaats de container gedurende 24 uur in een vriezer van -80 °C. Breng cryovials na 24 uur bij -80 °C over naar een tank met vloeibare stikstof voor langdurige opslag.

7. Ontdooiende PTEC's

  1. Ontdooi de injectieflacon vanaf -80 °C in het waterbad van 37 °C. Niet ontdooien bij kamertemperatuur (RT). Zodra de injectieflacon gedeeltelijk is ontdooid (er moet een klein stukje ijs zichtbaar zijn), voegt u 1 ml celsuspensie toe aan een conische buis van 15 ml met 10 ml voorverwarmde PTEC-media.
  2. Draai de celsuspensie gedurende 5 minuten op 400 g af. Zuig het bovenstaande op en resusinfecteer de cellen in 5 ml voorverwarmde PTEC-media met een laag glucosegehalte.
  3. Breng de celsuspensie van 5 ml over in een T-25-kolf en voer een T-shake uit om de cellen gelijkmatig over de kolf te verdelen. Volg vanaf hier sectie 4 voor mediawijzigingen.

8. Coating van het MPS-apparaat met Type I collageenmatrix

  1. Zuig de PBS op van het MPS-apparaat en verwijder het apparaat uit de verpakking. Veeg het apparaat droog met medische doekjes en label het naar wens.
  2. Plaats het MPS-apparaat in een ronde kweekschaal van 15 cm en plaats deze tot gebruik in 4 °C. Bewaar medische doekjes op de bodem van de schaal om te voorkomen dat er vocht op het MPS-apparaat komt.
  3. Bewaar spuiten van 1 ml met 22 G Luer-Lok naald blunts bevestigd bij -20 °C tot gebruik voor collageen I-injectie.
  4. Voor elke vier MPS-apparaten die moeten worden gevuld, moet u één conische buis van 15 ml op ijs houden. Gebruik voor elke conische slang van 15 ml een spuit van 1 ml met de stompe naald eraan.
  5. Met behulp van een steriele techniek in een bioveiligheidskast opent u alle poorten op het MPS-apparaat. Zorg ervoor dat de sleuven aan de bovenkant van elke schroefklep verticaal zijn uitgelijnd met de poort.
  6. Gebruik een stompe spuit/naald van 1 ml om de ECM-kamer met 1 ml ethanol in de poorten #1, #3 en #6 te spoelen. Zuig de ethanol op en laat het volledig verdampen (ten minste 30 s) zodat het het MPS-apparaat niet binnendringt via poorten #2, #4 en #5.
  7. Plaats het MPS-apparaat terug op 4 °C en bewaar PTEC-media, M199 en 1 N NaOH in de ijskast.
  8. Bereken de matrixsamenstelling voor 1 ml van het Type I collageenmengsel voor ongeveer vier MPS-apparaten volgens tabel 1 (schaal indien nodig). Meng in de bioveiligheidskast PTEC-media, M199 en 1 N NaOH in deze volgorde, volgens de bovenstaande berekeningen, en houd alle buizen op ijs.
  9. Voeg voorzichtig de Type I collageenbouillon met een spuit van 1 ml toe aan de kant-en-klare mix. Meng het collageenmengsel door op en neer te pipetteren tot het mengsel een stabiele zalmoranje-roze kleur heeft.
  10. Centrifugeer de buis kort om de oplossing op de bodem op te vangen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de oplossing zitten.
  11. Plaats de voorgekoelde spuiten van 1 ml met 22 G Luer-Lok naaldstompen en het MPS-apparaat in de bioveiligheidskast en op ijs. Vul de voorgekoelde spuit van 1 ml met het collageenmengsel en vermijd bubbels volledig.
  12. Injecteer de collageenoplossing heel langzaam en voorzichtig in poorten #1, #3 en #6 van de gekoelde apparaatkamers. Houd het apparaat verticaal met de poorten naar beneden gericht om luchtbellen omhoog en uit poorten #2, #4 en #5 te laten stromen.
    OPMERKING: Er moet een druppel van het collageenmengsel zijn op poorten #2, #4 en #5, wat aangeeft dat de kamers volledig bedekt zijn.
  13. Verwijder de spuit en plaats deze terug in de tube van 15 ml op ijs. Draai aan de schroefklep voor poorten #2, #4 en #5 om de gevulde chip af te dichten en plaats de chip gedurende 4 minuten op 30 minuten op de kweekschaal bij 4 °C.
  14. Breng na 30 minuten de chip met de schaal op een steriele manier over in de bioveiligheidskast en verdeel de chips gelijkmatig en afzonderlijk zodat ze gelijkmatig opwarmen.
  15. Doe een bevochtigd medisch doekje in elk schaaltje (om te voorkomen dat de collageen I-matrix uitdroogt en loslaat van de wanden van het MPS-apparaat) en sluit de schaaltjes af met een semi-transparante flexibele afdichtingsfilm. Laat het collageen een nacht polymeriseren bij RT.

9. Het creëren van een buisvormig lumen met Type IV Collageen als de ECM in een MPS-apparaat

  1. Steriliseer C-flex-slangen door de buizen te spoelen met ultrapuur (type 1) water en zuivere ethanol en autoclaveer vervolgens de hele slanglijn.
  2. Open in de bioveiligheidskast alle poorten van het Type I met collageen gevulde MPS-apparaat (de schroefklep staat verticaal ten opzichte van de poorten) en verwijder de draad die uit de poorten #1, #3 en #6 steekt om de buisvormige lumen te vormen.
  3. Steek de metalen koppelingen in poorten #1, #3 en #6.
  4. Bereid een oplossing van 10 ml van 5 μg/ml collageen type IV in PTEC-media.
  5. Plaats 24 inch steriele C-flex-slang op de metalen blunts die uit poorten #1, #3 en #6 steken.
  6. Vul spuiten van 1 ml voorzien van een 22-G Luer-Lok naald blunt met 0,5 ml collageenoplossing type IV
  7. Plaats de gevulde spuit op een infuuspomp van een spuit en sluit de slang van poort #1 aan op de spuit. Herhaal deze stap voor poorten #3 en #6.
  8. Breng met behulp van de spuitpomp de Type IV collageenoplossing gedurende 30 minuten in de MPS-poorten met een snelheid van 10 μl/min. Nadat de ports zijn toegediend, laat u het collageen een nacht stollen in een incubator van 37 °C voordat u het de volgende dag gebruikt.
    OPMERKING: Type IV collageengecoate MPS-apparaten kunnen tot 1 week bij 4 °C worden bewaard.

10. Zaaien van primaire PTEC's in een MPS-apparaat

  1. Inspecteer het MPS-apparaat onder de microscoop om er zeker van te zijn dat het lumen zich correct heeft gevormd.
  2. Plaats een voorgesteriliseerde spuit van 5 ml met een naald van 22 g in een buis van 15 ml met 5 ml ethanol.
  3. Verkrijg een PTEC-celpellet in een conische buis van 15 ml uit een T-25-kolf door stap 5.1 te volgen. tot 5.3. Voeg 80 μL PTEC-media toe aan de celpellet en suspendeer voorzichtig.
  4. Breng de celsuspensie over in een microbuisje van 1,5 ml.
  5. Haal het schaaltje met het MPS-apparaat uit de broedmachine en plaats het in de bioveiligheidskast. Sluit de poorten #2, #4 en #5 en draai de schroefklep horizontaal naar de poorten.
  6. Veeg voorzichtig tegen de PTEC-bevattende buis om de cellen opnieuw te suspenderen. Vul de spuit met cellen en steek de naald in de injectiepoort die het verst van de poorten van de schroefkleppen verwijderd is.
  7. Duw de zuiger van de spuit voorzichtig naar beneden om de cellen te injecteren. Visualiseer de cellen na injectie onder een microscoop.
    OPMERKING: Cellen moeten door het lumen bewegen. Als er geen cellen in het lumen worden waargenomen, controleer dan of de naald goed in de injectiepoort is gestoken en breng de naald indien nodig opnieuw in. Een volle spuit met cellen kan alle drie de lumen op het apparaat vullen.
  8. Ga door met celinjecties met de andere twee poorten. Sluit na de injecties de poorten #2, #4 en #5 en plaats het MPS-apparaat terug in de 37 °C-incubator. Houd de plaat waterpas zodat de cellen niet door de zwaartekracht uit het lumen bewegen.
  9. Voor extra MPS-apparaten moet de spuit na het legen met ethanol worden gewassen en moet u de spuit met DPBS wassen voordat u de cellen opzuigt.
  10. Laat de MPS-apparaten een nacht ongestoord staan.
  11. Sluit de volgende dag de MPS-apparaten aan op de spuitpompen.
  12. Vul in de bioveiligheidskast spuiten van 5 ml met PTEC-media. Plaats vervolgens 22 G Luer-Lok-tipblunts met het 24-inch gedeelte van de C-flex-slang dat aan de spuiten is bevestigd.
  13. Plaats de PTEC-spuiten met medialading in de spuitpomp. Bereid de lijnen voor om eventuele luchtbellen te verwijderen.
  14. Bevestig de geprimede slangleidingen aan poorten #1, #3 en #6 en draai de schroefkleppen naar een verticale positie om de mediastroom te introduceren.
  15. Stel het debiet van de spuitpomp in op 0.5 μL/min. Plaats de schaal met het MPS-apparaat terug in de 37 °C-incubator en laat de cellen buisjes vormen (binnen 5 tot 7 dagen) onder continue mediaperfusie voordat u een experiment start.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Morfologie en samenvloeiing van geïsoleerde primaire PTEC's in de loop van de tijd in 2D-cultuur
Na isolatie van de nierschors konden PTEC's ten minste 48 uur ongestoord groeien vóór de eerste mediaverandering. Ongeveer een week na het kweken van de cellen moeten kleine batches PTEC's door de hele kweekkolf verschijnen met een uniforme epitheliale, geplaveide morfologie (Figuur 1A,B). Afhankelijk van de groeisnelheden van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

MPS, of organ-on-a-chip-technologieën, bieden een zeer relevant in vitro platform om belangrijke aspecten van de menselijke fysiologie samen te vatten, waardoor de afhankelijkheid van diermodellen bij de ontwikkeling van geneesmiddelen en toxicologische beoordelingen wordt verminderd. Onlangs heeft de FDA Modernization Act 2.0 (2022) de opname van MPS, naast andere alternatieven, in Investigational New Drug-toepassingen29 toegestaan. Dit protocol beschrij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten of financiële openbaarmakingen hebben die relevant zijn voor deze studie.

Dankbetuigingen

Delen van dit werk werden ondersteund door het NASA-contract 80ARC023CA001, het National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS) (U2CTR004867, UH3TR000504, UG3TR002158), gezamenlijk door de NCATS en het Center for the Advancement of Science in Space (CASIS) (UG3TR002178), het National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (P30ES00703), het National Institute of General Medical Sciences (T32GM007750), een onbeperkte gift van Northwest Kidney Centers aan het nieronderzoek Instituut, en de School of Pharmacy aan de Universiteit van Washington (Ji-Ping Wang Award en Bradley Fellowship).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL Luer-Lok Tip SyringesBecton, Dickinson309628
1.5 mL microcentrifuge tubesCELLTREAT Scientific Products229442
15 mL steriele conische polypropyleenbuisFisher Scientific14-959-53A
3D microfysiologisch apparaatNortisTCC-001
5 mL Luer-Lok Tip SyringesBecton, Dickinson309646
50 mL steriele conische polypropyleenbuisFisher Scientific12-565-271
Antibiotic-Antimycotic (100x)ThermoFisher Scientific15240062
Collageenase, Type IV, poederThermoFisher Scientific17104019
D-(+)-GlucoseMilliporeSigmaG8270
Gedefinieerd trypsine-remmerThermoFisher ScientificR007100
Dimethyl sulfaat, Bioreagens, Thermo Scientific ChemicalsThermoFisher ScientificJ66650-AK
Dispase II, poederThermoFisher Scientific17105041
Dulbecco’s MEM (DMEM)/F-12 zonder glucoseUS Biological Life SciencesD9807-02
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), calcium, magnesiumThermoFisher Scientific14040117
Foetaal runderserum (FBS), PremiumThermoFisher ScientificA5670701
Finnpipette F2 Good Laboratory Pipetting (GLP) KitsThermoFisher Scientific05-719-511Micropipetten
Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, niet-gefilterdFisher Scientific02707407, 02707410, 02707438
Verse volledige menselijke nierNovabiosishttps://www.novabiosis.com/research-organ-allocation-services/Menselijke nieren werden verkregen via Novabiosis, een UNOS-goedgekeurde OPO
Bevochtigde incubator (37 °C en 5% CO2)Fisher Scientific51033556
HydrocortisonMilliporeSigmaH0888
Incuberende orbitale shakerAvantor12620-946
Insulin-Transferrin-Selenium (100X) (ITS -G)ThermoFisher Scientific41400045
Cryogene flesjes met binnendraadCorning430487
Kimtech Science KimwipesKimberly-Clark Professional34120
Luer Stubs (stompe naald), 22 G x 0,5 inchInstech Laboratories, Inc.LS22
Medium 199, Earle's zouten (10x)ThermoFisher Scientific21180021
Megafuge 8 kleine tafelcentrifugeThermoFisher Scientific75007210
Metaalkoppeling (stompe)Instech Laboratories, Inc.SC 20/15
Mr. Frosty vriescontainerThermoFisher Scientific5100-0036
Nikon Eclipse Ti-S MicroscoopNikon Instrumentshttps://www.thelabworldgroup.com/product/nikon-eclipse-ti-fluorescent-microscope/Origineel model uit productie
Nunc niet-behandelde kolven, T-25ThermoFisher Scientific169900
Nunc niet-behandelde kolven, T-75ThermoFisher Scientific156800
Pipet, 10 mL, gradueel, 1/10 mL, sterieelGreiner Bio-One607180
Siliconcouling, C-flex-slang, (ID: 0,020", OD: 0,083")Cole-Parmer06422-00
Mes met één snede (sterieel)BiosealKI-205/50
NatriumbicarbonaatMilliporeSigmaS6297
NatriumhydroxideMilliporeSigmaS8045
Steriele wegwerpfiltereenheden met PES-membranenThermoFisher Scientific567-0020
Weefselkweek behandelde schotels, 150 mm  x 20 mm geventileerdGenesee Scientific25-203
Trypsine-EDTA (0,05%), fenolroodThermoFisher Scientific25300054
Type I collageen, rattenstaartCorning354236
Type IV Collageen, MuisCorning354233

Referenties

  1. Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatr Nephrol. 26 (9), 1529-1533 (2011).
  2. Zhang, X., et al. Tubular secretion of creatinine and kidney function: an observational study. BMC Nephrol. 21, 108(2020).
  3. Wang, K., Kestenbaum, B. Proximal tubular secretory clearance. Clin J Am Soc Nephrol. 13 (8), 1291-1296 (2018).
  4. Yin, J., Wang, J. Renal drug transporters and their significance in drug-drug interactions. Acta Pharm Sin B. 6 (5), 363-373 (2016).
  5. Connor, S., Roberts, R. A., Tong, W. Drug-induced kidney injury: challenges and opportunities. Toxicol Res (Camb). 13 (4), tfae119(2024).
  6. Meijer, T., et al. Characterization of organic anion and cation transport in three human renal proximal tubular epithelial models. Cells. 13 (12), 1008(2024).
  7. Theocharis, A. D., Skandalis, S. S., Gialeli, C., Karamanos, N. K. Extracellular matrix structure. Adv Drug Deliv Rev. 97, 4-27 (2016).
  8. Miceli, C., et al. Fluid flow-induced shear stress controls the metabolism of proximal tubule kidney epithelial cells through primary cilium-dependent lipophagy and mitochondria biogenesis. Autophagy. 16 (12), 2287-2288 (2020).
  9. Tsang, Y. P., Hao, T., Mao, Q., Kelly, E. J., Unadkat, J. D. Dysregulation of the mRNA expression of human renal drug transporters by proinflammatory cytokines in primary human proximal tubular epithelial cells. Pharmaceutics. 16 (2), 285(2024).
  10. Bajaj, P., et al. Freshly isolated primary human proximal tubule cells as an in vitro model for the detection of renal tubular toxicity. Toxicology. 442, 152535(2020).
  11. Brown, C. D. A., et al. Characterisation of human tubular cell monolayers as a model of proximal tubular xenobiotic handling. Toxicol Appl Pharmacol. 233 (3), 428-438 (2008).
  12. Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrol Dial Transplant. 28 (10), 2432-2438 (2013).
  13. Morse, B. L., et al. Pharmacokinetics of organic cation transporter 1 (OCT1) substrates in Oct1/2 knockout mice and species difference in hepatic OCT1-mediated uptake. Drug Metab Dispos. 48 (2), 93-105 (2020).
  14. Samodelov, S. L., Kullak-Ublick, G. A., Gai, Z., Visentin, M. Organic cation transporters in human physiology, pharmacology, and toxicology. Int J Mol Sci. 21 (21), 7890(2020).
  15. Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Exp Biol Med. 239 (9), 1061-1072 (2014).
  16. Weber, E. J., et al. Development of a microphysiological model of human kidney proximal tubule function. Kidney Int. 90 (3), 627-637 (2016).
  17. Chapron, A., et al. An improved vascularized, dual-channel microphysiological system facilitates modeling of proximal tubular solute secretion. ACS Pharmacol Transl Sci. 3 (3), 496-508 (2020).
  18. Adler, M., et al. A quantitative approach to screen for nephrotoxic compounds in vitro. J Am Soc Nephrol. 27 (4), 1015-1028 (2016).
  19. Chang, S., et al. Human liver-kidney model elucidates the mechanisms of aristolochic acid nephrotoxicity. JCI Insight. 2 (22), e95978(2017).
  20. Weber, E. J., et al. Human kidney on a chip assessment of polymyxin antibiotic nephrotoxicity. JCI Insight. 3 (24), e123673(2018).
  21. Imaoka, T., et al. Bridging the gap between in silico and in vivo by modeling opioid disposition in a kidney proximal tubule microphysiological system. Sci Rep. 11 (1), 21356(2021).
  22. Van Ness, K. P., Chang, S., Weber, E. J., Zumpano, D., Eaton, D. L., Kelly, E. J. Microphysiological systems to assess nonclinical toxicity. Curr Protoc Toxicol. 73, 14.18.1-14.18.28 (2017).
  23. Lidberg, K. A., et al. Serum protein exposure activates a core regulatory program driving human proximal tubule injury. J Am Soc Nephrol. 33 (5), 949-965 (2022).
  24. Sakolish, C., et al. Technology transfer of the microphysiological systems: a case study of the human proximal tubule tissue chip. Sci Rep. 8 (1), 14882(2018).
  25. Hart, A., et al. Identification of prognostic biomarkers for antibiotic associated nephrotoxicity in cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 23 (2), 293-299 (2024).
  26. Lidberg, K. A., et al. Antisense oligonucleotide development for the selective modulation of CYP3A5 in renal disease. Sci Rep. 11 (1), 4722(2021).
  27. Imaoka, T., et al. Microphysiological system modeling of ochratoxin A-associated nephrotoxicity. Toxicology. 444, 152582(2020).
  28. Chapron, B. D., et al. Reevaluating the role of megalin in renal vitamin D homeostasis using a human cellderived microphysiological system. ALTEX. 35 (4), 504-515 (2018).
  29. Adashi, E. Y., O'Mahony, D. P., Cohen, I. G. The FDA modernization act 2.0: drug testing in animals is rendered optional. Am J Med. 136 (9), 853-854 (2023).
  30. Qi, W., Johnson, D. W., Vesey, D. A., Pollock, C. A., Chen, X. Isolation, propagation and characterization of primary tubule cell culture from human kidney (methods in renal research). Nephrology. 12 (2), 155-159 (2007).
  31. Mihevc, M., Petreski, T., Maver, U., Bevc, S. Renal proximal tubular epithelial cells: review of isolation, characterization, and culturing techniques. Mol Biol Rep. 47 (12), 9865-9882 (2020).
  32. Shaver, C. M., et al. Cellfree hemoglobin augments acute kidney injury during experimental sepsis. Am J Physiol Renal Physiol. 317 (4), F922-F929 (2019).
  33. Sbarbati, R. Separation of human endothelial cells from fibroblasts by centrifugation in Percoll gradients. Biosci Rep. 5 (6), 469-472 (1985).
  34. Horn, P., et al. Isolation of human mesenchymal stromal cells is more efficient by red blood cell lysis. Cytotherapy. 10 (7), 676-685 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Proximale tubuluscellenrenale microfysiologisch modelisolatie van niercellenprimaire epitheelcellen3D MPS platformvoorspelling van nefrotoxiciteitbeoordeling van drugstransportcelkweektechniekentrypsineverteringcryopreservering van cellen
Isolatie van primaire menselijke proximale tubule-epitheelcellen en hun gebruik bij het maken van een microfysiologisch model van de proximale niertubuli
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.