Methodenartikel

Een elektroporatiecytometrieprotocol voor live-cell, fluorescentiemicroscopie met behulp van U2 OS-celcultuur

DOI:

10.3791/68005

⸱

13 juni 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Toronto Metropolitan University, 2Institute for Biomedical Engineering, Science and Technology (iBEST), a partnership between St. Michael's Hospital, a site of Unity Health Toronto, and Toronto Metropolitan University, 3Keenan Research Centre for Biomedical Science at St. Michael's Hospital

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroporatie is het gebruik van gepulseerde elektrische velden (PEF's) om voorbijgaande poriën in celculturen te creëren om moleculaire lading te introduceren. Deze techniek wordt de laatste tijd veel gebruikt in onderzoeks- en klinische omgevingen. Hier beschrijven we elektroporatietechnieken met behulp van het recent ontwikkelde "Electroporation Cytometry System" voor het uitvoeren van fluorescentiemicroscopie in levende cellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gepulseerde elektrische velden (PEF's) hebben een breed scala aan toepassingen in medisch onderzoek en klinische toepassingen. Een belangrijk onderzoeksgebied richt zich op elektroporatie (omkeerbaar of onomkeerbaar). Omkeerbare elektroporatie wordt al tientallen jaren gebruikt voor het overbrengen van moleculen door celmembranen zoals plasmide-DNA, meestal aangeduid als genelektrooverdracht (GET). Omgekeerd is onomkeerbare elektroporatie een populaire techniek geworden bij de behandeling van kanker, die een niet-toxisch alternatief biedt door cellen permanent te scheuren met behulp van PEF's. Dit kan worden gecombineerd met verschillende soorten medicijnen of reagentia om het effect te versterken dat bekend is geworden als elektrochemotherapie (ECT). Ondanks het brede succes in praktische toepassingen, is echter verdere ondersteuning van technologie en onderzoek nodig om de huidige technieken te verbeteren. Om dit aan te pakken, werd een elektroporatiecytometriesysteem ontwikkeld ter ondersteuning van PEF-experimenten met levende cellen met de mogelijkheid om fluorescentiemicroscopie op lange termijn uit te voeren. Dit was in combinatie met een stabiel tot expressie brengende FUCCI(CA)5 U2-OS-cellijn voor het beoordelen van veranderingen in de celcyclus als reactie op blootstelling aan PEF. Daarbij werd tot 30 uur timelapse-microscopie bereikt, die real-time veranderingen in celactiviteit opleverde op basis van de FUCCI(CA)5-reporter. Als gevolg hiervan waren fasespecifieke veranderingen kwantificeerbaar voor downstream-analyse.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gepulseerde elektrische velden (PEF's) zijn uitgegroeid tot een veelgebruikt hulpmiddel voor een verscheidenheid aan toepassingen in de biologie en klinische toepassingen1. Deze kunnen grofweg worden gecategoriseerd naar elektroporatie (EP) en elektrostimulatie (ES). Elektroporatie heeft twee deelgebieden die bekend staan als omkeerbare en onomkeerbare elektroporatie. Omkeerbare elektroporatie (RE) wordt al tientallen jaren gebruikt als een effectief hulpmiddel voor het overbrengen van moleculaire lading zoals plasmide-DNA naar cellen van verschillende typen, zoals zoogdieren, bacteriën engisten 2. Meer recentelijk is irreversibele elektroporatie (IRE) steeds belangrijker geworden als een niet-toxisch alternatief voor de huidige kankerbehandelingen3. Een opkomend subveld wordt Pulsed Field Ablation (PFA) genoemd, dat zich richt op niet-thermische weefselverwijdering, met name voor de behandeling van bepaalde hartstoornissen4. In combinatie met medicijnen en andere reagentia heeft dit geleid tot de ontwikkeling van elektrochemotherapie (ECT). Het huidige begrip van PEF-behandelingen wordt echter overtroffen door klinische toepassingen5. Hier presenteren we een elektroporatiecytometriesysteem voor het onderzoeken van elektrochemotherapieën. De celcyclus is een belangrijke indicator van de levensvatbaarheid van cellen, en veranderingen kunnen fasespecifieke effecten identificeren. Door deze instrumenten te ontwikkelen, kunnen protocollen sneller worden aangepast, waardoor effectievere behandelingen worden geboden voor een breder scala aan kankers.

Ons op maat gemaakte elektrocytometriesysteem (Figuur 1) bestaat uit een kamer met aluminium parallelle plaatelektroden en een glazen bodem, evenals een eenvoudige exponentiële vervalpulsgenerator. De kamer is opgebouwd uit een 3D-geprinte kamer en een #1.5 glazen afdekbodem is bevestigd met drukgevoelige lijm van medische kwaliteit. Elektroden worden gevormd uit zelfklevende aluminiumfolie die over in de kamer ingebouwde steunen wordt geplaatst, waardoor twee parallelle elektroden op 0,4 cm van elkaar ontstaan. Dit is een gebruikelijke configuratie voor commerciële elektroden en biedt een robuust ontwerp dat de huidige protocollen snel kan aanpassen. De kamer past in milieubehuizingen die zijn ontworpen voor objectglaasjes van 25 mm x 55 mm, wat ook een veelgebruikt objectglaasformaat is dat wordt ondersteund door commerciële microscoopleveranciers. De pulsgenerator levert tot 330 V exponentiële vervalpulsen, waardoor een breed scala aan experimenten kan worden uitgevoerd, waaronder omkeerbare en onomkeerbare elektroporatie.

Om de effecten van PEF's op de celcyclus te bestuderen, gebruikten we een transgene menselijke osteosarcoomcellijn (U2 OS) die de Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator (CA)5 (FUCCI(CA)5) tot expressie brengt, een fluorescerende live celcyclusreporterconstructie. Het systeem introduceert twee fluorescerende, afgekapte vormen van Geminin en Cdt1, die tijdens de celcyclus in specifieke snelheden worden geproduceerd en gerecycled. Bovendien kan apoptose tijdens het experiment gericht worden gecontroleerd met behulp van een stabiel tot expressie brengende FUCCI(CA)5-lijn van U2-OS-cellen. Tijdens de celcyclus werkt de reporter voorspelbaar met elke fase, omdat deze worden geproduceerd en afgebroken met dezelfde snelheden als de functionele versies die van nature in de cel tot expressie worden gebracht. Wanneer apoptose optreedt, wordt deze cyclus verstoord en wordt de celcyclus snel afgesloten. Meestal zal dit zich visueel manifesteren als de fluorescentie die binnen de celcyclus veroudert, gevolgd door dramatische morfologische veranderingen in de kern, die duidelijk zichtbaar is door de lokalisatie van de reporters naar de kern6. Dit maakt visuele identificatie van elke fase in afzonderlijke cellen in de loop van de tijd mogelijk (Figuur 2). Omkeerbare elektroporatie veroorzaakt veranderingen in de intracellulaire omstandigheden en een exponentiële vervalpuls van 180 V werd geselecteerd voor onderzoek. Deze puls werd gekozen om celdood zoveel mogelijk te beperken en tegelijkertijd elektroporatie bij de meerderheid van de bevolking te garanderen. Dit werd bepaald op basis van eerder onderzoek naar optimale elektroporatiepulsparameters voor zes cellijnen van zoogdieren. De energiedichtheid van een puls van 180 V was iets lager dan de optimale transfectieparameters, wat een betere levensvatbaarheid van de cel met hoge poratie7 opleverde. Het effect van de puls werd bestudeerd in niet-gesynchroniseerde cellen en gesynchroniseerde cellen in de S-fase met behulp van een thymidine dubbel blok met en zonder PEF-toepassing (Figuur 3). De resultaten wezen op een afname van de gemiddelde lengte voor S en G2 in vergelijking met de controlegroep. Dit gaf aan dat de S-fase gevoelig was voor blootstelling aan PEF, wat resulteerde in een snellere celcyclus. Dit toonde aan dat het elektroporatiecytometriesysteem in staat was om de afgifte van PEF's te combineren met langdurige live celbeeldvorming voor het bestuderen van de celcyclus. Hoewel we dit platform hebben gebruikt om de celprogressie door de celcyclus te observeren als reactie op PEF's, is dit een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van een verscheidenheid aan toepassingen en voorwaarden voor PEF's en celcultuur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparaat van de celcultuur

  1. Bereid de stabiele lijn voor met behulp van omkeerbare elektroporatie met de volgende parameters: 100 μL geresuspendeerde U2 OS-cellen (6 × 106 cellen/ml) met 5 μg plasmide-DNA in een cuvet van 0,4 cm, en een blokgolfpuls van 180 V gedurende 10 ms.
  2. D-print het aangepaste kamerontwerp met behulp van een geschikte 3D-printer en biocompatibel plastic zoals polymelkzuur (PLA) (zie aanvullend bestand 1). Desinfecteer de voltooide kamer met ethanol (70%) en bewaar deze voor gebruik in een steriele container.
  3. Kweek U2-OS FUCCI(CA)5-cellen in een plaat van 10 cm met 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)-High Glucose met 10% foetaal runderserum en 1% PenStrep en incubeer bij 37 °C en 5% CO2.
  4. Wanneer de cultuur 80% samenvloeiing bereikt, zuigt u de media op, wast u de celcultuur met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en dissocieert u de cellen met 1 ml 0,25% trypsine gedurende 1,5 minuut.
  5. Neutraliseer de trypsine door de celcultuur opnieuw te suspenderen in 5 ml DMEM-High Glucose (met 10% FBS en 1% PenStrep).
  6. Haal uit de geresuspendeerde celcultuur een monster van 100 μl en plaats dit in de kamer van het elektroporatiecytometriesysteem op het onderste glazen dekglaasje. Zorg ervoor dat de kamer voor 30% samenvloeit na het inbrengen van het monster. Als het monster vóór de incubatie overvloeiend lijkt te zijn, zuigt u het monster op en verlaagt u het monstervolume.
  7. Voeg langzaam 4 ml DMEM-High Glucose (met 10% FBS en 1% PenStrep) toe aan het uiteinde van de kamer, om te voorkomen dat de vloeistof het monster wegspoelt.
  8. Plaats een standaard microscoopglaasje op de bovenkant van de kamer en incubeer de kamer gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 , waarbij u ervoor zorgt dat de cultuur volledig aan de bodem van de kamer is gehecht. Gebruik optioneel Hoechst 33342 (1 μg/ml) om celkernen te kleuren voor eenvoudigere stroomafwaartse celkwantificering en apoptose. Voer de kleuring 30 minuten voorafgaand aan de time-lapse-microscopie uit.

2. Voorbereiding van de microscoop

  1. Schakel eerst een omgekeerde fluorescerende microscoop met omgevingscontroles en kamer in, zodat de omstandigheden kunnen stabiliseren voordat u elektroporatie uitvoert.
    OPMERKING: Elke omgekeerde fluorescentiemicroscoop met een omgevingssysteem dat geschikt is voor het kamerglaasje van 25 mm x 55 mm x 16 mm. Het ontwerp is oorspronkelijk ontworpen om te werken aan de omgekeerde microscoop waarnaar wordt verwezen (zie Materiaaltabel) en het bijbehorende milieusysteem.
    Verwarming van de tafel kan een afwijking in het beeld veroorzaken als gevolg van metaaluitzetting.
  2. Terwijl het milieusysteem de optimale temperatuur bereikt, sluit u een digitale multimeter aan op de condensator van de pulsgenerator en de hoogspanningsschakelaar met behulp van geschikte elektrische kabels. Om dit protocol te volgen, gebruikt u "krokodelijn" clipkabels om een snelle montage en demontage met de elektroporatiekamer mogelijk te maken.
  3. Selecteer vervolgens een vergroting van 20x en zorg er met behulp van de software van de microscoop voor dat de kanalen FITC (GFP) en A594 (TexRed/mCherry) (optioneel DAPI-kanaal voor Hoechst 33342) zijn geselecteerd die overeenkomen met de twee fluorescerende eiwitten in het FUCCI(CA)5-systeem. Gebruik lage belichtingsinstellingen (meestal <0,05 s) om fotoschade door langdurige time-lapses te voorkomen.
  4. Optimaliseer de beeldfocus en -kwaliteit door testfoto's te maken voordat u met de time-lapse begint.
    OPMERKING: Fluorescentie mag alleen zo helder zijn als nodig is voor kleurvisualisatie.
  5. Programmeer de time-lapse om 3 - 6 gezichtspunten vast te leggen elke 10 minuten gedurende 24 uur om een grote hoeveelheid celcyclusgegevens per time-lapse te verkrijgen en tegelijkertijd fotoschade te beperken.
    OPMERKING: De tijdsduur kan variëren, afhankelijk van de tijdschaal van de cellulaire activiteit.
  6. Zorg ervoor dat autofocus is ingeschakeld voor het A594-kanaal voor de beste resultaten door de celcultuur tijdens de time-lapse te volgen.
  7. Laat de software in de stand-bymodus staan totdat de elektroporatie is uitgevoerd. Zodra de puls is afgeleverd, activeert u onmiddellijk de time-lapse om de hoogst mogelijke gegevensnauwkeurigheid te garanderen.

3. Elektroporatie

  1. Plaats de elektroporatiecytometriekamer in de microscoop met een geschikte omgevingskamer. Laat voorafgaand aan de elektroporatie de kamer gesloten terwijl het omgevingssysteem draait om ervoor te zorgen dat de celcyclus niet wordt beïnvloed.
  2. Bevestig een digitale multimeter aan de pulsgenerator en sluit de pulsgenerator aan op de kamerelektroden met behulp van krokodillenklemkabels door de omgevingskamer te openen.
  3. Laad de condensator in de pulsgenerator op tot 180 V en ontlaad de puls snel in de kamer totdat de digitale multimeter 0 volt aangeeft.
  4. Verwijder de elektrische aansluitingen naar de kamer en plaats het deksel zo snel mogelijk terug om de juiste kweekomstandigheden te garanderen.
  5. Activeer de time-lapse onmiddellijk zodra het omgevingssysteem van de microscoop is geïnstalleerd.

4. Time-lapse data-acquisitie

  1. Nadat de time-lapse is voltooid, gebruikt u de microscoopsoftware om de time-lapse op te slaan als een enkele video op basis van de beelden die tijdens de time-lapse zijn vastgelegd. Verbeter de visuele kwaliteit in dit stadium om te helpen bij handmatige kwantificering.
    OPMERKING: Elke framesnelheid kan worden geselecteerd; 6 frames/s zorgt echter voor een matige afspeelsnelheid met 1 videoseconde wat resulteert in 1 uur realtime.
  2. Zodra de time-lapse-video is voorbereid, volgt u de celfasen in de loop van de tijd door de veranderingen in FITC- en A594-signalen te observeren

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van het FUCCI-systeem (Figuur 2) werden visuele celcyclusgegevens verkregen door de tijdsduur te meten waarin elke kleur door de cel tot expressie werd gebracht als gevolg van eiwitexpressie en unbiquitinatie. Op basis van de resultaten van de niet-gesynchroniseerde en gesynchroniseerde experimenten (Figuur 3) was het duidelijk dat blootstelling aan S-fase PEF de celcyclus opreguleerde. Dit bleek uit de afname van de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als ze correct worden uitgevoerd, kunnen gegevens in de celcyclusfase worden gekwantificeerd voor grote hoeveelheden afzonderlijke cellen gedurende perioden tot 24 uur. Dit protocol leverde vergelijkbare celcyclusgegevens op als alternatieve methoden zoals FAC's. Dit is een veelgebruikte methode waarbij cellen fluorescerend worden gelabeld naarmate ze verder komen in de celcyclus. Na ten minste 24 uur te hebben geïncubeerd, worden ze gesorteerd op fluorescerende intensiteit, wat overeenk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen zowel het Gupta Lab als de leden van de Rackus Group bedanken voor hun voortdurende steun binnen en buiten het lab. Subsidie genereus verstrekt via samenwerking met Mitacs.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Chamber Slide (3D Printed/Assesmbled) N/AN/A
Culture Plate (10 cm)Sarstedt83.3902
Delta VisionOlympusN/AAlternatieve microscoopmodellen kunnen ook worden gebruikt. Zorg ervoor dat het platform en het omgevingssysteem de electroporatie-kamerslide kunnen bergen (55 mm x 
DMEM – High GlucoseGibco11965092
Fetal Bovine Serum ThermoFisherA5256701 
i3 MK3S 3D PrinterPrusaN/AAlternatieve printermodellen kunnen worden gebruikt die STL-bestanden kunnen gebruiken. 
Pen StrepThermoFisher15070063
Phosphate Buffered SalineGibco10010031
tFUCCI(CA)5Addgene153521
TrypsinSigma-Aldrich9002-07-07
U2-OS Cell LineATCCHTB-96

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), 3044(2018).
  2. Kandušer, M., Miklavčič, D. Electroporation in biological cell and tissue: An overview. Electrotechnologies for extraction from food plants and biomaterials. Food Engineering Series. , Springer. New York. (2009).
  3. Cemazar, M., Sersa, G. Recent advances in electrochemotherapy. Bioelectricity. 1 (4), 204-213 (2019).
  4. Iyengar, S. K., Iyengar, S., Srivathsan, K. The promise of pulsed field ablation and the challenges ahead. Front Cardiovasc Med. 10, 1235317(2023).
  5. Miklavčič, D., Mali, B., Kos, B., Heller, H., Serša, H. Electrochemotherapy: From the drawing board into medical practice. Biomed Eng Online. 13 (1), 29(2014).
  6. Ando, R., Sakaue-Sawano, A., Shoda, K., Miyawaki, A. Two coral fluorescent proteins of distinct colors for sharp visualization of cell-cycle progression. Cell Struct Funct. 48 (2), 132-144 (2023).
  7. Nesmith, T., Vieira, C., Rackus, D., Gupta, G. An electroporation cytometry system for long-term, live cell cycle analysis. Biomicrofluidics. 18 (4), 044105(2024).
  8. Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science. 166 (3906), 747-749 (1969).
  9. Chao, H. X., et al. Evidence that the human cell cycle is a series of uncoupled, memoryless phases. Mol Sys Bio. 15 (3), e8604(2019).
  10. Diehl, F. F., Sapp, K. M., Vander Heiden, M. G. The bidirectional relationship between metabolism and cell cycle control. Trends Cell Bio. 34 (2), 136-149 (2024).
  11. Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382(2013).
  12. Klein, S. G., et al. Toward best practices for controlling mammalian cell culture environments. Front Cell Dev Bio. 10, 788808(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Gepulseerde elektrische veldenlive cell imagingU2 OS cellencelcyclusanalysetime lapse microscopieFUCCI reporterS fase synchronisatiemicroflu dische celkweek

Gerelateerde artikelen