Methodenartikel

Voorbereiding en onderhoud van Bioexclusion IsoPositive Cage Experiment voor menselijke fecale transplantatie in kiemvrije muizen

DOI:

10.3791/68029

⸱

28 februari 2025

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Florida College of Medicine, 2Department of Infectious Diseases and Immunology, University of Florida College of Medicine, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de beste praktijken voor kiemvrije overdracht van muizen naar en huisvesting in experimentele isolatoren met één kooi (isocages) met behoud van steriele omstandigheden. Methoden voor fecale transplantatie in kiemvrije muizen en het verzamelen van levensvatbare bacteriën van deze darm "gehumaniseerde" muizen voor verdere toepassingen worden besproken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kiemvrije muizen zijn een belangrijk onderzoeksinstrument voor het begrijpen van de bijdrage van micro-organismen aan de gezondheid en ziekte van de gastheer, waardoor de specifieke rol van individuen, gedefinieerde of complexe groepen micro-organismen in de respons van de gastheer kan worden beoordeeld. Traditioneel gefokt en gekweekt in flexibele film of halfstijve isolatoren, kiemvrije muizenhouderij en experimentele manipulatie zijn kostbaar en vereisen veel opgeleid personeel en een grote ruimte in dierenverblijven. Het IsoPositive-kooisysteem maakt experimentele manipulatie mogelijk van kiemvrije muizen in individuele, hermetisch afgesloten isolatorkooien (isocages) met positieve druk, waardoor de kosten worden verlaagd en meer flexibiliteit bij experimentele manipulaties mogelijk is.

Hier wordt een protocol beschreven voor het overbrengen van kiemvrije muizen van kweekisolatoren naar isocages en de daaropvolgende fecale overdracht van menselijke donorontlasting naar muizen om stabiele, langdurige darm "gehumaniseerde" muizen te creëren voor toekomstige studies. De materialen en voorbereiding die nodig zijn voor het gebruik van het isocage-systeem worden beschreven, inclusief het gebruik van chloordioxide-sterilisatiemiddel chemisch sterilisatiemiddel om kooien, voorraden, apparatuur en persoonlijke beschermingsmiddelen schoon te maken. De methoden voor het bevestigen van de kiemvrije status van overgebrachte muizen en het bepalen van contaminatie in het kooisysteem worden besproken. De procedure voor de houderij, inclusief strooisel, voedsel en watervoorziening, wordt verder besproken. Het protocol voor de bereiding van menselijke fecale slurry en het insteken van kiemvrije muizen om darm "gehumaniseerde" muizen te creëren, samen met het verzamelen van ontlasting om de samenstelling van de microbiële gemeenschap van deze muizen te volgen, wordt beschreven. Een experiment illustreert dat twee weken na menselijke fecale transplantatie een stabiele kolonisatie van de donormicrobiota in de muizengastheren mogelijk maakt, waardoor later experimenteel gebruik mogelijk is. Verder wordt de verzameling van gehumaniseerde muizenuitwerpselen in media voor het behoud van de levensvatbaarheid beschreven, die gebruik in verdere functionele experimenten mogelijk maken. Over het algemeen maken deze methoden het mogelijk om veilig en effectief gehumaniseerde muizengemeenschappen op te zetten in experimentele gnotobiotische kooien voor verdere manipulatie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kiemvrije muizen zijn een essentieel hulpmiddel in het repertoire van microbioomonderzoekers, waardoor men de bijdrage van de microbiota aan de gezondheid en ziektetoestanden van de gastheer kan ontleden. Kiemvrije muizen worden volledig steriel geboren en blijven hun hele leven axenisch1. Kolonisatie van kiemvrije muizen met specifieke bacteriestammen maakt causale studies mogelijk tussen die taxa en metabole, immuun- of andere gastheerfuncties 2,3,4,5. Bijzonder voordelig is het vermogen om kiemvrije muizen op het niveau van de microbiota te "vermenselijken" door uitwerpselen verkregen van menselijke donoren te transplanteren en, wanneer ze in barrièreomstandigheden worden gehuisvest, besmetting door van muizen afgeleide micro-organismen te voorkomen1. Deze benadering heeft veel belangrijke ontdekkingen mogelijk gemaakt op het gebied van microbioom, bijvoorbeeld het effect van het menselijke darmmicrobioom op de respons van immunotherapie bij kanker 6,7,8.

Hoewel gehumaniseerde kiemvrije muizen van onschatbare waarde zijn voor onderzoeksinspanningen op het gebied van microbioom, zijn er veel beperkingen die de bredere aanpassing van deze aanpak hebben geremd. Kiemvrije muizen worden gekweekt en onderhouden in halfstijve of flexibele film grote isolatoren, maar functionele experimenten vereisen dat er aparte mini-isolatoren worden opgesteld, met één mini-isolator die meerdere kooien huisvest, maar alleen onder één experimentele voorwaarde. Deze mini-isolatorbenadering verhoogt de ruimtevoetafdruk en de kosten, terwijl het aantal experimentele omstandigheden dat in een experiment kan worden onderzocht en het aantal experimenten dat parallel kan worden uitgevoerd, aanzienlijk wordt beperkt. Een veelbelovende oplossing is het gebruik van een individueel, modulair kooisysteem genaamd het ISOcage P Bioexclusion System (hier aangeduid als isocage-systeem)9,10. Het isocage-systeem maakt experimentele manipulatie van kiemvrije muizen mogelijk in individuele, hermetisch afgesloten isolatorkooien met positieve druk, waardoor afzonderlijke experimentele omstandigheden tussen elke kooi mogelijk zijn in plaats van tussen elke mini-isolator. Met de juiste aseptische techniek kunnen dieren tot 12 weken onder kiemvrije omstandigheden in isocages worden gehuisvest of worden gehumaniseerd door menselijke fecale transplantatie voor gebruik in elke compatibele experimentele benadering (d.w.z. kan worden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden). Meerdere onafhankelijke experimenten kunnen parallel worden uitgevoerd met behulp van het isocage-systeem, en de ruimtevoetafdruk en kosten zijn dramatisch minder dan het uitvoeren van meerdere experimenten met mini-isolators.

Het doel van het kweken van kiemvrije muizen in flexibele filmkweekisolatoren is om de axenische status11 zorgvuldig te behouden. Technieken die worden gebruikt om de kiemvrije status te controleren, zijn onder meer routinematige uitstrijkjes van lichaamsoppervlakken en mondholten van muizen, evenals het aseptisch verzamelen van fecale monsters, die zowel worden gekweekt als getest door op PCR gebaseerde commerciële tests. Bacteriële, serologische en schimmeltesten van deze monsters zijn allemaal nodig om de kiemvrije status11 te bepalen. Wanneer kiemvrije muizen worden overgebracht van kweekisolatoren naar isocages voor experimenteel gebruik, worden de muizen afgenomen en getest om hun kiemvrije status bij overdracht te valideren. Isocage-steriliteitscontroles worden uitgevoerd door middel van aseptische verzameling van fecale monsters, die vervolgens worden gekweekt voor detectie van bacteriële, virale en schimmelverontreinigingen. Het zorgvuldig verzamelen en registreren van de resultaten van deze steriliteitscontroles vanaf de geboorte tot het einde van een experimenteel protocol is noodzakelijk om de kiemvrije status van deze muizen te valideren.

Het isocage-systeem bestaat uit individuele kooien (Figuur 1), transferschijven voor transport uit kweekisolatoren (Figuur 1) en het isocage-rek, waarin de kooien zijn ondergebracht (Figuur 2). Elke isocage bevat een HEPA-filter (High Efficiency Particulate Air) op kooiniveau dat op de toevoerluchtinlaat is geïnstalleerd en een siliconenpakking die een luchtdichte afsluiting vormt wanneer deze gesloten is, zodat er geen verontreinigingen via de lucht in de kooi kunnen komen (Figuur 1A). Dit kooideksel kan worden gebruikt als steriel werkoppervlak wanneer het ondersteboven in een gesteriliseerde bioveiligheidskast wordt geplaatst (Figuur 1A). Een rooster in de kooi bevat de voedsel- en waterfles (Figuur 1B). Een tang die in de kooi is geautoclaveerd, wordt gebruikt voor alle manipulaties die contact met de oppervlakken van de binnenkooi vereisen. De kooi zelf heeft inkepingen voor een verwijderbare kooikaarthouder om dieren aan de buitenkant te identificeren en luchtinlaat- en exportmondstukken die in het isocage-rek worden geplaatst (Figuur 1C-E). Veilige sluitingsklemmen en een lipvergrendeling op het deksel sluiten de kooi af wanneer deze klaar is om weer op het reksysteem te worden geplaatst (Afbeelding 1F). De voorgestelde bedding is Alpha-dri, en een autoclaveerbare verrijkingshut wordt ook aanbevolen (Figuur 1F). Transferschijven worden gebruikt om kiemvrije muizen van kweekisolatoren naar de isocages te verplaatsen en bevatten een draaibaar compartimentdeksel met een driehoekige opening om manipulatie van dieren mogelijk te maken (Figuur 1G-H). Schijven zijn er in de maten small (21,6 cm diameter) en large (28 cm diameter), die beide een capaciteit hebben van acht muizen. Geautoclaveerde tape wordt gebruikt om luchtdichte afdichtingen te maken op de omtrek en luchtgaten van de schijf, wat wordt uitgevoerd voorafgaand aan het weken met sterilisatiemiddel en transport in een met sterilisatiemiddel doordrenkte zak (Figuur 1I). Het racksysteem zelf heeft een scherm om de luchtblazers, de status van het HEPA-filter op rackniveau en de noodbatterijvoeding voor het rack te bewaken, die allemaal zijn opgenomen in de functies van het systeem (Afbeelding 2A). Een gesloten Magnehelic-meter geeft de positieve druk weer die door het kooisysteem wordt gehandhaafd, en een automatische visuele docking-indicator geeft de dockingstatus van de kooien weer (geel lipje betekent dat er geen kooi is gedockt of dat het dock niet succesvol was) (Figuur 2B-D). Ook noodzakelijk voor de manipulatie van isocages is een standaard gecertificeerde bioveiligheidskast.

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de juiste methoden voor de succesvolle overdracht van kiemvrije muizen van kweekisolatoren onder aseptische omstandigheden naar de isocages met behoud van de kiemvrije status, de humanisering van kiemvrije muizen met menselijke donorfecale slurry, en het verzamelen van uitwerpselen van muizen die in de isocage zijn gehuisvest voor bevestiging van de kiemvrije status of behoud van levensvatbaarheid voor verdere functionele studies. In dit voorbeeld worden kiemvrije muizen gehumaniseerd met gepoolde fecale monsters van menselijke proefpersonen die zijn behandeld met immunotherapie voor longkanker en gedichotomiseerd als responders of non-responders op therapie. In dit geval werd het responsfenotype op immunotherapierespons door de humanisering van de darmmicrobiota overgedragen aan de ontvangende muizen, die vervolgens verder konden worden geïnoculeerd met tumorcellen en behandeld met immunotherapie. Het protocol voor menselijke fecale slurry kan gemakkelijk worden aangepast aan alle uitwerpselen van menselijke donoren of elk preklinisch ziektemodel dat de onderzoeker wenst. Met behulp van dit protocol is het mogelijk om elke menselijke fecale donormicrobiota over te brengen naar de kiemvrije gastheer, waardoor verder onderzoek naar de rol van microbiota in gezondheid en ziekte mogelijk is.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schematisch diagram van isocage- en transferschijven. (A) Bovenaanzicht van de onderkant van het kooideksel, met labels die de locatie van het interne HEPA-filter op kooiniveau en de siliconen pakkingafdichting aangeven. (B) Bovenaanzicht van de binnenkant van de kooi, met labels die het deksel van de draadstang, de interne waterfles en de tuit aangeven, en de locatie in het rooster om autoclaveerbare voer vast te houden. (C) Vooraanzicht van de kooi met inkepingen voor de houder van de kooikaart. (D) Bovenaanzicht van een volledige kooi met het deksel erop, waarop te zien is hoe het HEPA-filter op het luchtinlaatmondstuk is geïnstalleerd. (E). Achteraanzicht van de kooi met luchtinlaat- en exportsproeiers die aan het isocage-reksysteem zijn gekoppeld. (F) Zijaanzicht van een volledige kooi met het deksel erop, met labels die de veilige sluitingsklemmen in de open stand aangeven, met witte lipjes op elke klem die ze op hun plaats vergrendelen. Het interieur van de kooi toont Alpha-dri bedding gelaagd aan de onderkant en suggereerde verrijkingshut geplaatst in bedding. (G) Bovenaanzicht van overdrachtsschijven met deksel erop. (H) Bovenaanzicht van de binnenkant van de transferschijf, met het draaibare deksel van het compartiment met een driehoekige opening om manipulatie van dieren mogelijk te maken. (I) Zijaanzicht van de volledig gemonteerde transferschijf met de plaatsing van de geautoclaveerde tape, die een luchtdichte afsluiting creëert tijdens de overdracht van de kweekisolator naar de isocage. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-introduction-2
Figuur 2: Schematisch diagram van het isocage-reksysteem. (A) Compleet isocage-rek met gedockte kooien en een label dat het bewakingsscherm aangeeft voor de status van de luchtblazer, de status van het HEPA-filter en de noodbatterij. Linksonder in het rack bevindt zich de sleuf voor het HEPA-filter op rackniveau. (B) Gesloten Magnehelische meter die de positieve druk weergeeft die door het rek wordt gehandhaafd. (C) Een aangemeerde isocage zonder zichtbare gele aanlegindicator, die een succesvolle verbinding tussen het rek en de luchtsproeiers aantoont. (D) Een lege sleuf in het rek, met een zichtbare automatische visuele docking-indicator die aangeeft dat er geen rek is geplaatst en dat er geen verbinding is van de luchtsproeiers met een isocage. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Florida (UF) en uitgevoerd in UF Animal Care Facilities (IACUC Protocol #IACUC202300000005). Kolonies van kiemvrij wildtype (GF WT; C57BL/6) muizen werden gefokt en gehouden in isolatoren door UF Animal Care Services Germ-free Division. GF WT-muizen van gemengd geslacht werden overgebracht van fokisolatoren en in het ISOcage P Bioexclusion-systeem geplaatst om microbiële manipulatie mogelijk te maken.

Menselijke fecale monsters werden verkregen uit een prospectieve observationele studie waarbij longitudinale ontlastingsmonsters werden verzameld van patiënten die een behandeling met immuuncheckpointremmer (ICI) kregen12. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van patiënten na goedkeuring van de studie door Advarra IRB (MCC#18611, Pro00017235). Proefpersonen ontvingen en voltooiden een kit voor het verzamelen van ontlasting met vloeibaar tandheelkundig transportmedium (LDTM), bedoeld om de bacteriële levensvatbaarheid voor functionele onderzoeken te behouden. Responsbeoordeling karakteriseerde n=4 steekproeven als responders (R) en n=6 als non-responders (NR). De gehomogeniseerde, LDTM-geconserveerde patiëntenmonsters werden individueel ontdooid, elk gedurende niet meer dan 90 s in een anaërobe kamer geplaatst en gepoold op responsfenotype (R: n = 4, NR: n = 6). De gepoolde monsters werden vervolgens verdeeld en ingevroren bij -80 °C voor gebruik in dit protocol. Om het aantal anaërobe kolonievormende eenheden (CFU) van de donorontlasting te bepalen, werd de ontlasting van elke proefpersoon serieel verdund tot 1 × 10-5, en 10 μL van elke verdunning werd in tweevoud geplateerd op anaërobe hersenhartinfusie (BHI) en Luria Bertani (LB) agarplaten en CFU-tellingen per gram ontlasting geschat. Gelijke CFU van elke proefpersoon werd samengevoegd in fecale inoculummonsters voor maagsonde bij muizen.

1. Voorbereiding van kooien en autoclaaf

  1. Isocage bereiding
    1. Vul de kooien voor met ~ 500 ml 2018SX-dieet of een gewenst versterkt autoclaveerbaar dieet en leg de bodem op de bodem met ALPHA-dri-beddengoed. Plaats een autoclaveerbare verrijkingshut in het kooibed. Plaats een lege, niet-afgesloten waterfles en mondstuk en een lange tang met brede punt op het rooster.
    2. Plaats een biologische indicator van twee soorten in het voer binnen één kooi per autoclaafcyclus. Plaats een chemische integratorstrip op de buitenkant van elke kooi.
    3. Autoclaveer de kooien op een vacuümcyclus gedurende 45 minuten bij 121 °C en minimaal 15 PSI, gevolgd door een droogtijd van 30 minuten. Steriliseer de kooien met behulp van een decontaminatierek van de internationale organisatie voor standaardisatie (ISO) waardoor de kooien afgesloten blijven en stoom door het interne HEPA-filter kan gaan, dat de steriele omgeving handhaaft totdat de kooi wordt geopend.
    4. Vul flessen van 1 liter met drinkwater, sluit af met rubberen doppen en plaats een chemicaliënintegratorstrip op het oppervlak van de fles. Autoclaaf bij 121 °C en minimaal 15 PSI gedurende 45 minuten, met behulp van het langzame uitlaatprogramma voor vloeistoffen.
    5. Controleer visueel de chemische integratoren die aan elke kooi zijn bevestigd voor onmiddellijke verificatie van de juiste autoclaafparameters.
      OPMERKING: De biologische indicator moet worden verwijderd bij de eerste opening van de isocage onder steriele omstandigheden. Incubeer de biologische indicator gedurende 24 uur bij 37 °C en observeer eventuele kleurveranderingen. Een levendige kleurverandering van de oorspronkelijke blauw/paarse heldere oplossing naar een gele of troebele vloeistof geeft aan dat er microbiële groei aanwezig is. Als de indicator helder en blauw/paars van kleur blijft, dan is dit een bevestiging van de volledige steriliteit van het inwendige van de kooien in die autoclaafcyclus.

2. Bereiding van het sterilisatiemiddel met chloordioxide

LET OP: Chloordioxide-sterilisatiemiddel is extreem corrosief zodra het is geactiveerd. Het actieve chloordioxide-sterilisatiemiddel vervalt 24 uur na het mengen van de activator met de basis. Chloordioxide-sterilisatiemiddel produceert dampen, die irriterend kunnen zijn voor slijmvliesoppervlakken en irritatie kunnen veroorzaken bij contact met de huid. Zorg ervoor dat de ruimte voor de bereiding van sterilisatiemiddelen toegang heeft tot een gootsteen en goede ventilatie. Draag een veiligheidsbril, gasmasker en chemicaliënbestendige handschoenen wanneer u werkt met chloordioxide-sterilisatiemiddel, naast de vereiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) voor de dierenverblijven.

  1. Mengbasis en activator
    1. Om een standaard volume chloordioxide-sterilisatiemiddel van 6 l te maken, meet u eerst 1 l chloordioxide-sterilisatiebasis in een gegradueerde cilinder van 1 l en giet u dit in een dompeltank van 20 l.
    2. Meet met dezelfde maatcilinder af en giet 4 L kraanwater in de dompeltank.
    3. Zet de maatcilinder die voor de basis en het water wordt gebruikt opzij. Gebruik een nieuwe maatcilinder om 1 L chloordioxide-sterilisatiemiddel te meten en giet deze in de dompeltank.
    4. Zodra de activator aan de tank is toegevoegd, gebruikt u de maatcilinder om de inhoud van de tank te mengen.
  2. Activering
    1. Plaats het deksel op de dunktank en label het als chloordioxide-sterilisatiemiddel met de datum en tijd waarop de activator is toegevoegd en de naam van het personeel dat het heeft bereid. Indien gewenst kan de maatcilinder die wordt gebruikt om het sterilisatiemiddel te mengen, worden gebruikt om 1 L over te brengen naar een spuitfles.
    2. Verplaats de dunktank en spuitflessen naar de dierenruimte, waar het Isocage-rek en de kooien staan. Het actieve chloordioxide-sterilisatiemiddel moet vóór gebruik ten minste 20 minuten blijven zitten om volledige activering te garanderen.
      OPMERKING: Voor het manipuleren van grote hoeveelheden kooien (>9) kan tot 12 L tegelijk in de dunktank worden bereid. Voor het manipuleren van 1 kooi of in geval van nood kan 1,2 L chloordioxide-sterilisatiemiddel in een kleinere container worden bereid en vervolgens worden overgebracht in 2 spuitflessen van 1 L. Het wordt aanbevolen om het sterilisatiemiddel ten minste 1 uur voor de verwachte overdracht van kiemvrije muizen te bereiden.

3. Sterilisatie

  1. Trek PBM's aan
    1. Als primaire kooimanipulator draag je een veiligheidsbril, een gasmasker, chemicaliënbestendige handschoenen, een steriele operatiejas, een bouffant, mouwovertrekken en schoenovertrekken. Draag scrubs onder de PBM, aangezien elk contact van de stof met chloordioxide-sterilisatiemiddel zal leiden tot uitgebreide vlekken.
    2. Een assistent van de primaire kooimanipulator wordt aanbevolen. Laat de assistent dezelfde persoonlijke beschermingsmiddelen dragen als de primaire kooimanipulator, hoewel ze een niet-steriele operatiejas kunnen dragen.
  2. Voorbereiding van de bioveiligheidskast
    1. Plaats 10 doekjes in de chloordioxide-sterilisatietank en zorg ervoor dat ze volledig doorweekt zijn.
    2. Verplaats de geweekte doekjes in de bioveiligheidskast en week alle oppervlakken van de kast in de volgende volgorde van achter naar voren: plat werkoppervlak, linkerkant, achterkant van de kap, rechterkant en glas aan de voorkant. Voer contactloos weken uit van de niet-beschermde oppervlakken van de bioveiligheidskast door de doekjes over deze oppervlakken te knijpen zonder ze aan te raken.
    3. Plaats de doekjes na één reinigingsronde terug in de chloordioxide-sterilisatietank om te weken.
  3. Bereiding van de isocages
    1. Maak een grote plastic zak klaar door deze te vullen met ten minste 100 ml chloordioxide-sterilisatiemiddel met behulp van een maatcilinder en schud de zak om ervoor te zorgen dat alle binnenoppervlakken doorweekt zijn. Plaats de zak op een vlakke ondergrond.
    2. Verwijder een enkele isocage uit het rek en plaats deze in de chloordioxide-sterilisatietank zodat elk oppervlak van de kooi in contact komt met de vloeistof. Gebruik de geweekte doekjes in de tank om de oppervlakken van de kooi verder te schrobben om volledig contact met de vloeistof te garanderen.
    3. Laat de assistent na het weken van de kooi de geweekte plastic zak openen. Plaats de kooi in de zak en laat de assistent de opening onmiddellijk sluiten. Spuit de zakopening in met chloordioxide-sterilisatiemiddel met behulp van de spuitfles. Volg deze procedure voor elke kooi die moet worden gebruikt; Er passen maximaal vier kooien in een enkele zak van 36" 32" 48".
    4. Dompel zoveel gesteriliseerde waterflessen van 1 liter onder als nodig is (1 liter water voor 2 kooien) in de dompeltank met chloordioxide-sterilisatie en doe ze vervolgens in een andere geweekte plastic zak. Wanneer alle benodigdheden in de zak zijn geplaatst, sluit u de zak en spuit u de zakopening in met chloordioxide-sterilisatiemiddel met behulp van de spuitfles.
    5. Zodra alle kooien en voorraden zijn ingepakt, dompelt u de chemicaliënbestendige handschoenen onder in chloordioxide-sterilisatiemiddel (zo ver mogelijk in de handschoenen zonder de opening te bereiken).
  4. Sterilisatieperiode van 20 minuten
    1. Volledige sterilisatie vereist een minimum van 20 minuten contacttijd met vloeistof. Zodra het laatste artikel is gesteriliseerd en de plastic weekzak is gesloten, laat je de assistent een timer van 20 minuten instellen. Zorg ervoor dat de chemicaliënbestendige handschoenen na het starten van de timer geen oppervlak raken dat niet doordrenkt is met chloordioxide-sterililant.
    2. Voer het sterilisatieproces van de bioveiligheidskast (stap 3.2) herhaaldelijk uit totdat de timer aangeeft dat er 20 minuten zijn verstreken.
    3. Laat de assistent regelmatig de buitenkant van de geweekte plastic zak schudden om ervoor te zorgen dat de vloeistof constant in contact komt met de kooi en de flesoppervlakken erin.
    4. Laat de assistent na de periode van 20 minuten de geweekte plastic zak openen om de gesteriliseerde kooien en waterflessen te onthullen en zorg ervoor dat u alleen de buitenkant van de zak aanraakt.
    5. Gebruik de gesteriliseerde, chemisch bestendige handschoenen om elke kooi en fles naar de gesteriliseerde bioveiligheidskast te verplaatsen. Als er te veel kooien zijn om in de bioveiligheidskast te passen, laat dan de resterende kooien in de plastic zakken, want deze blijven steriel zolang de opening van de plastic zak gesloten is en doordrenkt met chloordioxide-sterilisatiemiddel tussen elke opening.

4. Kiemvrije muisoverdracht

  1. Bereiding van de isocages
    1. Om de hermetisch afgesloten isocage te openen, tilt u de witte lipjes op de twee klemmen aan de zijkanten van het deksel op en trekt u vervolgens elke klem zijwaarts naar buiten. Het deksel moet vrij zijn van het onderste gedeelte van de kooi om het deksel van de kooi te kunnen tillen. Plaats het deksel ondersteboven links van de kooi en gebruik dit als steriele werkplek.
      OPMERKING: Een alternatief voor het gebruik van kooideksels of de binnenkant van geautoclaveerde instrumententassen als steriel werkoppervlak is het gebruik van geautoclaveerde gordijnen, die een groter oppervlak bieden en onbedoelde besmetting van het kooideksel voorkomen als er een fout wordt gemaakt.
    2. Gebruik de steriele pincet die zich in de kooi bovenop het rooster bevindt, verwijder de lege waterfles en plaats deze aan de binnenkant van het deksel. Open de waterfles van 1 liter door de rubberen afdichting te verwijderen en giet het water in de waterfles om deze te vullen. Plaats het mondstuk met de tang op de waterfles en druk stevig aan om af te dichten.
    3. Gebruik een steriele tang om het rooster op te tillen en plaats het enkele centimeters terug om een opening naar de bodem van de kooi mogelijk te maken. Laat de steriele tang op het rooster rusten en zorg ervoor dat de handgrepen niet in contact komen met de oppervlakken van de kooi.
  2. Gebruik van de overdrachtsschijf
    OPMERKING: Getraind kiemvrij personeel is verantwoordelijk voor de verzorging en het onderhoud van de kweekisolatoren. Gezien de risico's die gepaard gaan met het openen van kweekisolatoren, voeren deze medewerkers de sterilisatie, voorbereiding en overdracht van kiemvrije muizen van isolatoren naar isocages uit. Om het proces kort te beschrijven: transferschijven worden voorbereid in een autoclaveerbare cilinder om sterilisatie mogelijk te maken. Biologische indicatoren worden gebruikt om hun steriliteit te verifiëren. Tape om de transferschijven af te dichten wordt ook in de cilinder geautoclaveerd. De gesteriliseerde cilinder die deze materialen omsluit, wordt via een overdrachtshuls aan de isolator bevestigd en de muizen worden van de kooien naar de schijf verplaatst. Het deksel wordt vervolgens op de schijf geplaatst en met geautoclaveerde tape wordt de omtrek van de schijf en de luchtgaten luchtdicht afgesloten. De verzegelde schijf wordt onmiddellijk in de uitgangspoort van de isolator geplaatst. De poortdop van de thuisisolator wordt vervolgens gesloten en de buitenkant van de schijf wordt grondig afgeveegd met sterilisatiemiddel en in een met sterilisatiemiddel doordrenkte zak geplaatst, die gedurende 20 minuten wordt gecontroleerd om volledige ontsmetting te garanderen. Kiemvrij fokpersoneel levert deze schijven vervolgens af bij het onderzoekspersoneel. Muizen kunnen niet langer dan 30 minuten op de verzegelde schijf worden bewaard vanaf het moment dat de overdrachtsschijf is verzegeld, dus het is van essentieel belang dat alle voorgaande stappen in dit protocol ruim voor de aankomst van de overdrachtsschijf zijn voltooid.
    1. Laat de assistent na ontvangst van de overdrachtsschijf het plastic deksel vasthouden en gedeeltelijk uitpakken, zodat het doorweekte oppervlak van de overdrachtsschijf zichtbaar is maar niet wordt aangeraakt door de assistent.
    2. Laat de assistent na ontvangst van de overdrachtsschijf het plastic deksel vasthouden en gedeeltelijk uitpakken, zodat het doorweekte oppervlak van de overdrachtsschijf zichtbaar is maar niet wordt aangeraakt door de assistent.
    3. Draag de chemisch bestendige handschoenen gedrenkt in chloordioxide-sterilisator, verwijder de transferschijf uit de plastic verpakking en zorg ervoor dat u geen oppervlak aanraakt dat niet doordrenkt is met sterilisatiemiddel . Plaats vervolgens de transferschijf op het vlakke oppervlak van de gesteriliseerde bioveiligheidskast.
    4. Om de overdrachtsschijf te openen, verwijdert u de tape, verzegelt u de schijfomtrek en gooit u deze buiten de bioveiligheidskast weg. Verwijder het deksel van de overdrachtsschijf en gooi deze buiten de bioveiligheidskast weg.
    5. In de overdrachtsschijf bevindt zich een draaibaar compartimentdeksel met een enkele opening. Gebruik de steriele pincet die eerder op het rooster van de kooi rustte om het deksel van dit compartiment te manipuleren om de opening naar de muis te verplaatsen die nodig is voor de overdracht.
  3. Overdracht van muizen van schijf naar isocage
    1. Pak met de tang de basis van de staart van de muis vast door de opening in het plastic schijfdeksel en til de muis op en breng deze over in de isocage door de eerder geopende ruimte tussen het rooster en de kooi. Herhaal dit voor alle muizen die bestemd zijn voor die kooi.
    2. Zodra alle muizen naar die isokooi zijn overgebracht, plaatst u het rooster terug met behulp van de tang. Til vervolgens het deksel van de kooi op en plaats deze met de tang terug op de kooi.
    3. Til elke klem van het deksel van de kooi op en laat deze voorzichtig over de zijkanten van de kooi zakken, gevolgd door het naar beneden duwen van de witte lipjes om het deksel van de kooi af te sluiten.
    4. Zodra de kooi is verzegeld, laat u de assistent elk mondstuk van de dockingplaats op het kooirek besproeien met chloordioxide-sterilmiddel. Verwijder vervolgens de kooi van de kap en geef deze door aan de assistent, die de kooi vervolgens op de drager kan plaatsen.
    5. Herhaal deze stappen voor elke muis op de overdrachtsschijf.
  4. Opruimen van de bioveiligheidskast
    1. Na voltooiing van alle muizentransfers in isocage, maakt u de kap leeg van vuil en veegt u deze volledig af met met chloordioxide sterilisatiemiddel doordrenkte doekjes.
    2. Veeg de kap af met isopropylalcohol om achtergebleven chloordioxide-sterilisatiemiddel te verwijderen. De ruimte onder het werkoppervlak van de afzuigkap verzamelt een grote hoeveelheid sterilisatiemiddel van het sterilisatieproces. Verwijder dit via absorptie met droge doekjes en veeg af met isopropylalcohol.
    3. Gooi vloeibaar chloordioxide-sterilisatiemiddel 24 uur na activering weg via de gootsteenafvoer. Gooi vaste materialen die verontreinigd zijn met sterilisatiemiddel weg als gewoon afval.
      OPMERKING: Kiemvrije muizen die naar isocage-omstandigheden zijn overgebracht, worden 1 week gelaten om te acclimatiseren aan hun nieuwe omgeving voordat er wordt ingegrepen. Dit vermindert de stress die de dieren ervaren, wat de studieresultaten zou kunnen verstoren. Verzamel aan het einde van deze acclimatiseringsperiode van 1 week ontlasting zoals beschreven in stap 6 om de kiemvrije status te bevestigen voorafgaand aan elke interventie.

5. Orale sonde van menselijke fecale suspensie tot kiemvrije muizen

  1. Voorbereiden van geautoclaveerde sondebenodigdheden
    1. Plaats de maagsondenaalden in zelfsluitende sterilisatiezakjes (1 per muis) en steriele spuiten van 1 ml in zelfsluitende sterilisatiezakjes (1 per muis) 1 dag voorafgaand aan de orale maagsondeprocedure. Plaats deze en 600 ml polypropyleen bekers (1 per muis) en een lange tang in een autoclaafveilige zak en steriliseer via een autoclaaf.
    2. Sluit de zak direct na het verwijderen van de zak uit de autoclaaf af met verpakkingstape en bewaar deze tot de volgende dag.
  2. Bereiding van menselijke fecale slurry
    1. Breng op de dag van de maagsonde menselijke uitwerpselen die zijn gehomogeniseerd en opgeslagen in anaërobe conserveringsmedia (in dit geval vloeibare tandheelkundige transportmedia) over van de vriezer van -80 °C naar de anaërobe kamer. Verdun gehomogeniseerd fecaal materiaal ongeveer 1:10 in steriele, anaërobe zoutoplossing in een conische buis van 10 ml.
    2. Sluit de buis met de menselijke fecale suspensie af met parafilm, homogeniseer door vortex en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 200 g om de deeltjes te laten bezinken.
    3. Plaats de buis terug in de anaërobe kamer en breng het bovenstaande over in een andere conische buis van 10 ml. Sluit de buis met het menselijke fecale supernatans af met parafilm, verwijder deze uit de anaërobe kamer en plaats deze in een secundaire lekvrije container. Vervoer de container samen met de geautoclaveerde zak met sondebenodigdheden naar de locatie van de dierenverblijven.
      OPMERKING: Het is essentieel om voor rapportagedoeleinden een schatting te maken van de totale CFU/ml van de menselijke uitwerpselen die bedoeld zijn voor maagsonde. Het is onduidelijk wat de minimale CFU-belasting is om adequate kolonisatie te garanderen, maar hogere CFU's leiden tot een betere implantatie van donorontlasting13. Als de CFU-belasting van menselijk fecaal materiaal resulteert in lage implantatiepercentages, herinner dan menselijke fecale monsters. Het gebruik van een levensvatbaarheidsconserveringsmedium zal het CFU-herstel van verzamelde fecale monsters verbeteren. Om het anaërobe/aërobe CFU-gehalte van de donorontlasting te bepalen, verdunt u het monster serieel tot 1 x 10-5 en plakt u 10 μL van elke verdunning in tweevoud op aërobe en anaërobe BHI- en LB-agarplaten. Tel na 24 uur (aëroob) en 48 uur (anaëroob) de CFU per gram ontlasting.
  3. Bereiding van de isocages
    1. Herhaal stap 2 en 3, met als enige verschil nu dat er muizen in deze kooien zijn gehuisvest, en er moet voor worden gezorgd dat binnen 30 minuten na het verwijderen van het rek elke isocage in de gesteriliseerde kap wordt geplaatst en het deksel wordt geventileerd om luchtstroom naar de muizen mogelijk te maken.
    2. Steriliseer de geautoclaveerde zak met sondemateriaal en de buis voor menselijke fecale suspensie uit de stappen 5.1 en 5.2 via chloordioxide-sterilisatieverzadiging op dezelfde manier als de waterflessen (dwz dompel ze onder in sterilisatiemiddel en plaats ze vervolgens in een met sterilantier doordrenkte zak).
    3. Breng de isocages en de benodigdheden voor orale sonden over naar de bioveiligheidskast na voltooiing van de sterilisatieperiode van 20 minuten. Doorboor de geautoclaveerde voorraadzak door de zak tegen de lange tang te duwen die erin zit, verwijder vervolgens de benodigdheden en gooi de zak buiten de kap weg.
  4. Gavage
    1. Trek een nieuwe steriele operatiejas en steriele chirurgische handschoenen aan in plaats van de chemisch bestendige handschoenen om te voorkomen dat achtergebleven chloordioxide-sterilisatiemiddel in contact komt met muizen. Laat de assistent indien nodig helpen bij dit proces.
    2. Bereid de sondenaalden voor door elk sterilisatiezakje uit te pakken en gebruik de binnenkant van het zakje als droog, steriel rustoppervlak. Sluit de sondenaald aan op elke spuit, open de slang van de fecale slurry en trek 200 μL fecale slurry in elke spuit.
    3. Pak met een tang de basis van de staart van een enkele muis in de kooi vast en plaats deze op het rooster. Houd de muis voorzichtig in bedwang door te schuren, en terwijl u de muis rechtop in verticale positie houdt, steekt u de naald in en injecteert u voorzichtig de fecale suspensie, gevolgd door onmiddellijke verwijdering van de naald.
    4. Plaats de muis direct in een van de gesteriliseerde bekers ter observatie. Herhaal het proces voor elke muis in de kooi. Nadat alle muizen de sonde hebben ontvangen, gebruikt u de tang om elke muis terug in het kooibed te verplaatsen en sluit u de kooi af zoals beschreven in de stappen 4.3.2-4.3.4.
      OPMERKING: In gevallen waarin twee of meer afzonderlijke fecale slurries worden gebruikt, is volledige hersterilisatie van de bioveiligheidskast en de vereiste kooien en materialen vereist. In gevallen waarin een groep muizen kiemvrij blijft, wordt aanbevolen dat deze muizen hun controlesonde krijgen voordat een andere groep wordt behandeld.
    5. Volg de procedure in stap 4.4 om chloordioxide-sterilisatiemiddel en met sterilantier doordrenkte materialen weg te gooien. Behandel alle materialen die verontreinigd zijn met menselijke fecale slurry als biomedisch afval en gooi ze weg in overeenstemming met de milieu-, gezondheids- en veiligheidsprocedures.

6. Ontlasting verzamelen van gehumaniseerde muizen voor behoud van levensvatbaarheid

  1. Bereid geautoclaveerde benodigdheden voor
    1. Plaats een korte tang met brede punt in zelfsluitende sterilisatiezakjes (1 per muis), 600 ml polypropyleen bekers (1 per muis) en een lange tang in een autoclaafveilige zak en steriliseer via een autoclaaf 1 dag voorafgaand aan de ontlastingsverzamelingsprocedure.
    2. Sluit de zak direct na het verwijderen van de zak uit de autoclaaf af met verpakkingstape en bewaar deze tot de volgende dag.
  2. Voorbereiding van de conserveringsmediabuis
    1. Selecteer een anaeroob conserveringsmedium voor levensvatbaarheid (hier werd Cary Blair gebruikt). Doseer 1 ml conserveringsmedia in steriele buisjes van 2 ml met schroefdop in een bioveiligheidskast. Een verhouding van 1:10 feces:media wordt aanbevolen voor een optimale conservering.
    2. Etiketteer elke tube vooraf met een permanente marker, maar houd er rekening mee dat blootstelling aan chloordioxide-sterilisatiemiddel permanente markerlabels van plastic oppervlakken kan verwijderen. Een andere methode is om de buisjes ongeëtiketteerd te laten en de assistent-buisjes direct na het verzamelen te labelen voordat ze worden ingevroren.
    3. Plaats deze buizen in een standaard polypropyleen buisrek zodat de buizen rechtop kunnen worden bewaard terwijl sterilisatie door contact met chloordioxide-sterilisatiemiddel nog steeds mogelijk is.
  3. Sterilisatiekooien en bioveiligheidskast
    1. Herhaal stap 2 en 3 om isocages en de bioveiligheidskast te steriliseren. Nogmaals, zorg ervoor dat binnen 30 minuten na het verwijderen van het rek elke isocage in de gesteriliseerde kap wordt geplaatst en dat het deksel wordt geventileerd om luchtstroom naar de muizen mogelijk te maken.
    2. Steriliseer bovendien de geautoclaveerde voorraadzak en het rek met voorbereide buizen via chloordioxide-sterilisatieverzadiging en plaats ze in de geweekte plastic zak met de kooien. Het doel is volledig vloeistofcontact met alle oppervlakken van elke buis en het rek zelf.
  4. Afname en opslag van fecale monsters
    1. Breng de isocages, geautoclaveerde benodigdheden en het buizenrek over naar de bioveiligheidskast na voltooiing van de sterilisatieperiode van 20 minuten. Doorboor de geautoclaveerde voorraadzak door de zak tegen de lange tang te duwen die erin zit, verwijder de benodigdheden en gooi de zak buiten de kap weg.
    2. Trek een nieuwe steriele operatiejas en steriele chirurgische handschoenen aan in plaats van de chemisch bestendige handschoenen om te voorkomen dat achtergebleven chloordioxide-sterilisatiemiddel in contact komt met muizen. Laat de assistent desgewenst assisteren bij dit proces.
    3. Bereid de stompe pincet voor door de zakjes uit te pakken en het oppervlak van het binnenzakje als een steriel gebied te gebruiken. Plaats het buisrek op het oppervlak van de bioveiligheidskap.
    4. Pak met een lange tang de basis van de staart van een enkele muis in de kooi vast en plaats ze direct in een van de gesteriliseerde bekers voor observatie. Herhaal dit proces voor elke muis in de kooi.
    5. Observeer de muizen totdat er ten minste twee vers gepasseerde fecale pellets zijn geproduceerd.
      1. Gebruik de stompe pincet om de fecale korrels op te pakken en plaats ze direct in de buis. Sluit het deksel van de schroefdop onmiddellijk af en geef deze aan de assistent.
      2. Laat de assistent de buis labelen en de kruk onmiddellijk homogeniseren via vortexing. Zodra de buis homogeen is, vriest u de buis in vloeibare stikstof in en bewaart u deze op lange termijn bij -80 °C.
    6. Herhaal het verzamelen van ontlasting voor elke muis in de kooi. Plaats elke muis terug in de thuiskooi na het verzamelen van de ontlasting en plaats de kooien weer op hun rek. Herhaal stap 4.4 om de afzuigkap schoon te maken en afval weg te gooien.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke fecale monsters, gepoold op ICI-responder en non-responder fenotype (eerder beschreven in het protocol), werden gezweld in GF-WT-muizen van gemengd geslacht, gehuisvest in 3 isocages per groep (n = 1-2 muizen/kooi, n = 6 voor responder en n = 5 voor non-responder). Muizen mochten na de overdracht 1 week acclimatiseren. Van deze muizen werden vervolgens fecale monsters verzameld (kiemvrije omstandigheden). Muizen werden vervolgens doorboord met 1 × 107 CFU van respon...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier beschreven protocol biedt een reproduceerbare, zeer gedetailleerde methode voor de humanisering van kiemvrije muizen die in experimentele isocages zijn gehuisvest. Het vermogen om uitsluitend fecale gemeenschappen van menselijke proefpersonen naar muizengastheren te transplanteren, is van onschatbare waarde voor microbioomonderzoek. Zonder besmetting door muisspecifieke commensale microbiota, kan men de impact van door mensen bewoonde bacteriën op een verscheidenheid aan gezondh...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zijn de Germ-Free Services Division van UF Animal Care Services dankbaar voor de hulp bij het gnotobiotisch houden, Dr. Brooke Bloomberg en Dr. Laura Eurell voor veterinaire en IACUC-hulp, en Josee Gauthier voor de hulp bij 16S rRNA-gensequencing. Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door de UF Health Cancer Center Funds (CJ) en het UF Department of Medicine Gatorade Fund (CJ). R.Z.G. werd ondersteund door fondsen van het UF Health Cancer Center. R.C.N. werd ondersteund door de National Institutes of Health TL1 Training Grant aan de Universiteit van Florida (TL1TR001428, UL1TR001427), de National Cancer Institute of the National Institutes of Health Team-Based Interdisciplinary Cancer Research Training Program award T32CA257923 en het UF Health Cancer Center. Het onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd ondersteund door het UF Health Cancer Center, gedeeltelijk ondersteund door staatskredieten in Fla. Stat. § 381.915 en het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder Award Number P30CA247796. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health of de staat Florida. De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL BD Slip Tip Syringe steriele, voor eenmalig gebruikFisher Scientific309659
2,0 mL schroefdopbuis, NonKnurl, Skirred, Natural, E-Beam steriele buis met gemonteerde dopFisher Scientific14-755-228
36 x 32 x 48" 3 Mil Gusseted Poly BagsUlineS-13455
5 gallon tank van Exspor chloordioxide sterilantactivator Ecolab6301680
5 gallon tank van Exspor chloordioxide sterilantbasis Ecolab6301194
600 mL polypropyleen bekersFisher ScientificS01914
ALPHA-dri beddingShepherd Specialty Papers
Anaërobe kamerCoy Lab ProductsType B
Bioveiligheidskabinet klasse 2Nuaire
Gecertificeerde IsoCage autoclaveerbare HEPA-filter XT Extreme TemperatuurTecniplast1245ISOFHXT
Clear Lens LPX IQuity Veiligheidsbril Fastenal922205455
DuPont Tyvek Hoes - 18"UlineS-13893E
DWK Life Sciences DURAN 45 mm Push-on Natural Rubber CapFisher Scientific01-258-107Rubber dop voor 1 L autoclaaf flessen
Dynalon Quick Mist HDPE SproeiflesFisher Scientific03-438-12B
Fisherbran Polypropyleen Afgemeten CilindersFisher Scientific03-007-44
Fisherbran Dissectie Dwerg PunttangFisher Scientific08-887
Fisherbrand Instant Sealing Sterilisatie ZakkenFisher Scientific01-812-51
Fisherbrand Rechte Brede Sterke Tip Algemene Toepassing Tang Fisher Scientific16-100-107
Fisherbrand loodvrije AutoclaaftapeFisher Scientific15-901-110
Gavetnaald, herbruikbaar roestvrij staal. Recht. 22 gauge naald, tip diameter 1,25 mm, lengte 38 mm of 1,5 inch(doz)Braintree ScientificN-PK 020
H-B Instrument Durac TimerFisher Scientific13-202-015
IsoPositive Kooien en Rack (d.w.z. isocoages)Tecniplast  ISO30P30 kooien (6 w x 5 h), enkelzijdig
Nitrile Chemisch Resistente Handschoenen Maat S (7), M (8) of L (9) 18” lang, 22 mil, AnsellGrainger4T426
Nitrile Onderzoekshandschoenen, Medium, Niet-Steriele, PoedervrijMedSupply PartnersKG-1101M
Olive / Magenta Bajonet Gas & Damp Cartridges / Partikelfilter 2Ct  3M/Fastenal50051138541878
Polycarbonaat RadDisk Mini voor Muizen 8-75 x 4Braintree ScientificIRD-P M
Polypropyleen Bouffant Caps - 24", BlauwUlineS-10480BLU
Puritan Cary-Blair Medium, 5 mLFisher Scientific22-029-646
S, M en L Blauwe Siliconen Dual-Mode Hoofdband Half Masker Ademhalingsbescherming  3M/Fastenal50051131370826
Sgpf Serie Steriele Poedervrije Latex Handschoenen, CT International, Dikte = 6,5 mm, Lengte = 30,5 cm (12), Handschoenmaat = 8,5, Handschoenkleur = WitFisher Scientific18-999-102F
Skid Resistant SchoenenovertrekUline S-25639
Chirurgische Kleding, Handdoek, Steriele, Groot, 32/csThomas ScientificKIM 95111
Teklad Global 18% proteïne geëxtrudeerd knaagdier dieet (sterieel te maken) Inotiv2018SX
Thermo Scientific Nalgene Heavy-Duty Rechthoekige LLDPE Tank met Deksel (20 L volume)Thermo Scientific14-831-330J
VERIFY Dual Species Zelfbeschermende Biologische IndicatorenSteris HealthcareS3061
WypAll L40 1⁄4 Fold WipersUlineS-8490

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, J. C., Im, S. -H. Of men in mice: the development and application of a humanized gnotobiotic mouse model for microbiome therapeutics. Exp Mol Med. 52 (9), 1383-1396 (2020).
  2. Li, F., et al. Microbiome remodelling leads to inhibition of intestinal farnesoid X receptor signalling and decreased obesity. Nat Commun. 4, 2384(2013).
  3. Schwabe, R. F., Jobin, C. The microbiome and cancer. Nat Rev Cancer. 13 (11), 800-812 (2013).
  4. Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
  5. Gray, S. M., et al. Mouse adaptation of human inflammatory bowel diseases microbiota enhances colonization efficiency and alters microbiome aggressiveness depending on recipient colonic inflammatory environment. Microbiome. 12 (1), 147(2024).
  6. Gopalakrishnan, V., et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 359 (6371), 97-103 (2018).
  7. Matson, V., et al. The commensal microbiome is associated with anti-PD-1 efficacy in metastatic melanoma patients. Science. 359 (6371), 104-108 (2018).
  8. Routy, B., et al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors. Science. 359 (6371), 91-97 (2018).
  9. Paik, J., et al. Potential for using a hermetically-sealed, positive-pressured isocage system for studies involving germ-free mice outside a flexible-film isolator. Gut Microbes. 6 (4), 255-265 (2015).
  10. Hecht, G., et al. A simple cage-autonomous method for the maintenance of the barrier status of germ-free mice during experimentation. Lab Anim. 48 (4), 292-297 (2014).
  11. Dremova, O., et al. Sterility testing of germ-free mouse colonies. Front Immunol. 14, 1275109(2023).
  12. Newsome, R. C., et al. Interaction of bacterial genera associated with therapeutic response to immune checkpoint PD-1 blockade in a United States cohort. Genome Med. 14 (1), 35(2022).
  13. Le Roy, T., et al. Comparative evaluation of microbiota engraftment following fecal microbiota transfer in mice models: age, kinetic and microbial status matter. Front Microbiol. 9, 3289(2018).
  14. Lebeuf, M., et al. Contaminants and where to find them: microbiological quality control in axenic animal facilities. Front Microbiol. 12, (2021).
  15. He, Z., et al. Campylobacter jejuni promotes colorectal tumorigenesis through the action of cytolethal distending toxin. Gut. 68 (2), 289-300 (2019).
  16. Wu, G. D., et al. Linking long-term dietary patterns with gut microbial enterotypes. Science. 334 (6052), 105-108 (2011).
  17. Ross, F. C., et al. The interplay between diet and the gut microbiome: implications for health and disease. Nat Rev Microbiol. 22 (11), 671-686 (2024).
  18. Maier, L., et al. Extensive impact of non-antibiotic drugs on human gut bacteria. Nature. 555 (7698), 623-628 (2018).
  19. Walter, J., Armet, A. M., Finlay, B. B., Shanahan, F. Establishing or exaggerating causality for the gut microbiome: Lessons from human microbiota-associated rodents. Cell. 180 (2), 221-232 (2020).
  20. Berland, M., et al. High engraftment capacity of frozen ready-to-use human fecal microbiota transplants assessed in germ-free mice. Sci Rep. 11 (1), 4365(2021).
  21. Choo, J. M., Rogers, G. B. Establishment of murine gut microbiota in gnotobiotic mice. iScience. 24 (2), 102049(2021).
  22. Bokoliya, S. C., Dorsett, Y., Panier, H., Zhou, Y. Procedures for fecal microbiota transplantation in murine microbiome studies. Front Cell Infect Microbiol. 11, 711055(2021).
  23. Li, Y., Cao, W., Gao, N. L., Zhao, X. -M., Chen, W. -H. Consistent alterations of human fecal microbes after transplantation into germ-free mice. Genomics Proteomics Bioinformatics. 20 (2), 382-393 (2022).
  24. Turnbaugh, P. J., Ridaura, V. K., Faith, J. J., Rey, F. E., Knight, R., Gordon, J. I. The effect of diet on the human gut microbiome: a metagenomic analysis in humanized gnotobiotic mice. Sci Transl Med. 1 (6), 6ra14(2009).
  25. Staley, C., et al. Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning. Microbiome. 5 (1), 87(2017).
  26. Lebeuf, M., Turgeon, N., Faubert, C., Robillard, J., Paradis, É, Duchaine, C. Managing the bacterial contamination risk in an axenic mice animal facility. Can J Microbiol. 67 (9), 657-666 (2021).
  27. Basic, M., et al. Monitoring and contamination incidence of gnotobiotic experiments performed in microisolator cages. Int J Med Microbiol. 311 (3), 151482(2021).
  28. Amorim, N., et al. Refining a protocol for faecal microbiota engraftment in animal models after successful antibiotic-induced gut decontamination. Front Med. 9, 770017(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Humane fecale transplantatiemicrobioomoverdrachtgehumaniseerde muizenchloordioxide sterilisatiemiddelbiologische veiligheidskabinetgavage van fecale slurrymicrobi le gemeenschapsstructuurkankermuismodel

Gerelateerde artikelen