Chemogenetische regulatie in geherprogrammeerde stamcel-afgeleide voorlopercellen bij de behandeling van neurodegeneratieve ziekten

Summary

Hier beschrijven we een protocol voor het manipuleren van chemisch geherprogrammeerde stamcellen om nauwkeurige neuronale modulatie te bereiken door deze cellen te differentiëren in dopaminerge voorlopercellen, ze te transplanteren in muismodellen van de ziekte van Parkinson en gedrags- en elektrofysiologische resultaten te evalueren om de succesvolle integratie en functionele effectiviteit van de getransplanteerde cellen te bevestigen.

Abstract

De integratie van designerreceptoren die uitsluitend worden geactiveerd door designerdrugs (DREADD) met op stamcellen gebaseerde therapieën biedt een geavanceerde strategie voor nauwkeurige neuronale modulatie. Hier gebruikten we CRISPR-gemanipuleerde menselijke geherprogrammeerde stamcellen die exciterende (hM3Dq) of remmende (hM4Di) DREADD-receptoren tot expressie brengen om de functionele integratie en modulatie van getransplanteerde dopaminerge voorlopers in een muizenmodel van de ziekte van Parkinson (PD) te evalueren. De belangrijkste stappen waren onder meer het genereren van niet-fusie DREADD-expressie stamcellijnen, het differentiëren ervan in dopaminerge voorlopers van de middenhersenen en het transplanteren van deze cellen in het striatum van 6-hydroxydopamine (6-OHDA) -laesie muizen. We voerden gedragsbeoordelingen en elektrofysiologische opnames uit om de effecten van de getransplanteerde cellen te analyseren. Gedragstests, zoals de cilindertest, toonden een significante modulatie van de motorische functie aan na toediening van clozapine-N-oxide (CNO). In het bijzonder verminderde activering van hM4Di de contralaterale beweging van de voorpoot, terwijl activering van hM3Dq geassocieerd was met verbeterd motorisch gedrag. Elektrofysiologische opnames onthulden verschillende synaptische reacties. hM4Di-activering verhoogde de intervallen tussen gebeurtenissen en verminderde piekamplitudes van spontane excitatoire postsynaptische stromen (sEPSC's), terwijl hM3Dq-activering de intervallen tussen gebeurtenissen verminderde en de piekamplitudes verhoogde, wat een weerspiegeling is van verbeterde excitatoire signalering. Samenvattend valideert de integratie van gedrags- en elektrofysiologische beoordelingen de precieze functionele integratie van gemanipuleerde chemisch geherprogrammeerde stamcellen in neurale circuits van de gastheer.

Introduction

Designerreceptoren die uitsluitend worden geactiveerd door designerdrugs (DREADD) zijn gemanipuleerde G-proteïne-gekoppelde receptoren die selectief kunnen worden geactiveerd door anders inerte synthetische liganden¹. De chemogenetische benadering is een essentieel hulpmiddel geworden in de neurowetenschappen door onderzoekers in staat te stellen de connectiviteit van neurale circuits met hoge precisie te onderzoeken en ons begrip van cellulaire functies zowel in vivo als in vitro te vergroten door de selectieve activering of remming van specifieke hersengebieden of celtypen ^2,3.

Stamceltherapie biedt een veelbelovende strategie voor de behandeling van neurodegeneratieve ziekten. De werkzaamheid van transplantaatcellen is afhankelijk van een goede integratie, overleving en functionele bijdrage aan gastheerweefsels. Ongecontroleerde cellulaire activiteit kan leiden tot negatieve gevolgen, waaronder tumorigenese⁴; Dit vereist een nauwkeurige controle van deze cellen na transplantatie. Door gebruik te maken van DREADD-technologie in menselijke geherprogrammeerde stamcellen en afgeleide neuronen kan de neuronale activiteit nauwkeurig worden gecontroleerd via de toediening van het designermedicijn CNO ^2,5. In de context van de ziekte van Parkinson (PD), die wordt gekenmerkt door het verlies van dopaminerge neuronen, is het manipuleren van de activiteit van van stamcellen afgeleide dopaminerge neuronen cruciaal voor het onderzoeken van hun synaptische inputs en projectiepatronen in knaagdiermodellen 6,7,8,9,10. Door exciterende hM3Dq en remmende hM4Di-receptoren in deze modellen op te nemen, wordt een nauwkeurige modulatie van de neuronale activiteit mogelijk^11,12.

De combinatie van gedragsbeoordelingen bij dieren en elektrofysiologische opnames maakt een uitgebreide evaluatie mogelijk van de effecten van chemogenetische modulatie op getransplanteerde cellen in vivo¹³. Gedragsbeoordelingen, waaronder door apomorfine geïnduceerde rotatie, de cilindertest en de rotarod-test, evalueren de motorische coördinatie en geven inzicht in veranderingen in de motorische functie die verband houden met experimentele modellen van PD¹⁴. Elektrofysiologische technieken, zoals patch-clamp-opnames, maken real-time monitoring van synaptische responsen en actiepotentialen mogelijk, waardoor een uitgebreid beeld wordt verkregen van hoe getransplanteerde cellen integreren in bestaande neurale netwerken¹⁵. Door gedragsbeoordelingen te combineren met elektrofysiologische evaluaties, kunnen we onderzoeken hoe chemogenetische modulatie de integratie en functionaliteit van deze cellen in neurale circuits van de gastheer beïnvloedt¹⁶. Voorlopige bevindingen suggereren dat CNO-toediening de neuronale activiteit in getransplanteerde cellen effectief moduleert, wat resulteert in verbeterde functionele resultaten in diermodellen.

In dit protocol werden menselijke geherprogrammeerde stamcellen gemanipuleerd om hM3Dq- of hM4Di-receptoren tot expressie te brengen met behulp van geclusterde, regelmatig tussenliggende korte palindromische herhalingen (CRISPR) -technologie. Na het differentiëren van gemodificeerde geherprogrammeerde stamcellen in dopaminerge voorlopercellen in de middenhersenen, werden deze cellen getransplanteerd in muismodellen van PD om hun integratie en functionele regulatie binnen de neurale circuits van de gastheer te beoordelen met behulp van gedragsbeoordelingen en elektrofysiologische opnames.

Protocol

Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Beijing Association for Laboratory Animal Science en de National Institutes of Health for the Care and Use of Laboratory Animals. Menselijke perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) werden verkregen van een gezonde donor met schriftelijke geïnformeerde toestemming zoals beschreven in een eerdere studie¹⁷.

1. Constructie van niet-fusie DREADD-stamgebaseerde cellijnen

1. Construeer het DREADD-donorplasmide.
   OPMERKING: De spijsverteringsplaatsen moeten worden ontworpen volgens de vectorvolgorde. Fragmenten moeten worden gesynthetiseerd en geamplificeerd met overlappingen van 20-30 bp die overeenkomen met de fragmentarmen om de efficiëntie van de assemblage te verbeteren.
   1. Ontwerp en synthetiseer het T2A-ZsGreen-fragment (Fragment I).
   2. Amplificeer het hM3Dq/hM4Di-T2A-fragment van het oorspronkelijke plasmide met behulp van PCR (Fragment II). Stel de PCR-reactie (50 μL totaal volume) in op 1x PCR-buffer, 200 μM van elke dNTP-mix, 0,5 μM voorwaartse en achterwaartse primers, 10-50 ng plasmide-DNA-sjabloon en 1,25 U high-fidelity DNA-polymerase. Voer thermocycling uit onder de volgende omstandigheden: eerste denaturatie bij 98 °C gedurende 2,75 minuten om de sjabloon volledig te denatureren; 32 versterkingscycli, bestaande uit 98 °C gedurende 15 s (denaturatie), 60 °C gedurende 30 s (primergloeien) en 72 °C gedurende 60 s (verlenging); laatste verlenging bij 72 °C gedurende 7 min.
   3. Verteer het vectorplasmide met het juiste enzym om de gelineariseerde vector te verkrijgen. Zuiver alle fragmenten door agarosegelelektroforese en kwantificeer ze met behulp van een spectrofotometer.
      OPMERKING: Hier werd het oorspronkelijke plasmide verteerd met MluI en SalI.
2. Meng voorzichtig 50-100 ng van de gelineariseerde vector, Fragment I en Fragment II in een molaire verhouding van 1:3:3, samen met 2x Kloonmix. Incubeer het mengsel gedurende 1 uur bij 55 °C om homologe recombinatie door Gibson Assembly te vergemakkelijken.
3. Plaats het gids-RNA gericht op de AAVS1-site in de BbsI-site van de pX458-vector.
   OPMERKING: Voer sequentieverificatie uit op alle geconstrueerde plasmiden met behulp van Sanger-sequencing.
4. Behoud de geherprogrammeerde stamcellen in de media, waarbij wordt gestreefd naar een celdichtheid van 2-5 × 10⁶ cellen/ml.
   OPMERKING: De geherprogrammeerde stamcellen die hier worden gebruikt, werden geïnduceerd door menselijke PBMC's zoals beschreven in een eerdere studie¹⁷. Het monitoren van de gezondheid van cellen is essentieel, aangezien de celstatus een aanzienlijke invloed heeft op de efficiëntie van elektroporatie. Zie Materiaaltabel voor een vergelijking van de media.
5. Meng 2-5 × 10⁶ cellen, 2 μg van elk donorplasmide (hM4Di-T2A-ZsGreen of hM3Dq-T2A-ZsGreen) en 2 μg gRNA-plasmide in 100 μL elektroporatiebuffer en breng over in een cuvet voor elektroporatie.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat het mengsel goed gemengd en vrij van bubbels is voordat u overgaat tot elektroporatie. Optimaliseer elektroporatieparameters op basis van celtype om de transfectie-efficiëntie te maximaliseren, aangezien verschillende apparaten specifieke aanpassingen kunnen vereisen.
6. Stel de Nucleofector in op het B16-programma en start elektroporatie om een efficiënte transfectie van de doel-iNSC's te vergemakkelijken.
7. Voeg 1 ml 50 μg/ml poly-D-lysine (PDL) toe aan elk putje van een plaat met 6 putjes en incubeer gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur. Verwijder alle PDL uit de putjes en voeg 1,5 ml laminine van 5 μg/ml toe aan elk putje en incubeer gedurende 2-4 uur bij 37 °C. Gebruik de gecoate plaat direct of bewaar 1 week bij 2-8 °C.
8. Breng de geëlektroporeerde cellen over in platen met zes putjes die zijn gecoat met PDL en laminine. Verdeel ongeveer 500.000 cellen per putje in een volume van 2 ml kweekmedium per putje.
9. Gebruik na 72 uur elektroporatie een flowcytometer om fluorescerende positieve cellen te sorteren.
   1. Resuspendeer gedissocieerde cellen in DPBS en filtreer door een celzeef van 70 μm.
   2. Configureer de sorteerder met FITC-kanaal voor ZsGreen-detectie. Neem onbehandelde iNSC's op als negatieve controles om de basisfluorescentie te definiëren.
   3. Kalibreer het instrument met behulp van nozzles van 100 μm bij een manteldruk van 20 psi. Implementeer een sorteermodus voor zuiverheid in vier richtingen met bevestiging van één cel.
10. Plaat enkele ZsGreen⁺ -cellen in platen met 96 putjes die zijn voorgecoat met PDL en laminine en voeg 200 μL kweekmedium per putje toe om de initiële groei te ondersteunen. Bewaar 7-14 dagen in een kweekmedium
    OPMERKING: Controleer de putjes dagelijks op tekenen van groei en fluorescentie die wijzen op een succesvolle integratie en label de positieve put.
11. Isoleer afzonderlijke klonen die fluorescentie vertonen met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een GFP-filterset. Scherm klonen met 10x vergroting. Markeer putjes met monoklonale kolonies met een aanhoudend, uniform ZsGreen-signaal. Leg helderveld- en fluorescentiebeelden vast om morfologie en fluorescentie-intensiteit te documenteren.
    OPMERKING: Vervang voorafgaand aan de beeldvorming vers medium om achtergrondfluorescentie te verminderen. Sluit kolonies met een onregelmatige morfologie of autofluorescentie uit.
12. Zet de positieve cellen uit op gecoate platen met 48 putjes. Vervolgens opgesplitst in twee delen, een voor cultuur en de andere voor genotypering.
13. Extraheer genomisch DNA uit kandidaat-klonen. Bereid PCR-reacties voor met twee primerparen: een paar om de insertie van het gen van interesse te bevestigen, de andere primer om homozygote en heterozygote klonen te onderscheiden. Voer thermocycling uit onder de volgende omstandigheden: eerste denaturatie bij 95 °C gedurende 5 min; 38 cycli van 95 °C gedurende 30 s, 60 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 45 s; laatste verlenging bij 72 °C gedurende 7 min. Los PCR-producten op op een 2% agarosegel.
    OPMERKING: Zie Materiaaltabel voor de primers. Bevestig de insertie van het gen van belang door een enkele 650 bp-band (primer 1). Identificeer heterozygote klonen door de aanwezigheid van een enkele 630 bp-band en homozygote klonen door de afwezigheid van deze band (primer 2).
14. Zet de positieve cellen uit op gecoate platen met zes putjes.
15. Verwerk de cellen en was ze in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door centrifugeren bij 250 × g gedurende 3 minuten. Vries de cellen in cryopreservatiemedium in met 10% DMSO met een dichtheid van 2,5 × 10⁶ cellen per injectieflacon.

2. Getransplanteerde DREADD-stamcel-afgeleide voorlopercellen in PD-modelmuizen

1. Dien 30 minuten voor de operatie een intraperitoneale injectie van desipramine toe in een concentratie van 5 mg/ml (10 mg/kg) aan immunodeficiënte muizen. Verdoof de muizen met 2% isofluraan.
2. Voer eenzijdige stereotactische injecties uit van 3 μL 6-hydroxydopamine (6-OHDA, 5 μg/μL). Richt je op het rechter corpus striatum met behulp van de volgende coördinaten: anteroposterieur = 0,5 mm, lateraal = 2,1 mm en verticaal = -3,2 mm.
   OPMERKING: 6-OHDA moet worden opgelost in een zoutoplossing die 0,2% ascorbinezuur bevat. Zorg voor nauwkeurige targeting om de variabiliteit in de ernst van de laesie te minimaliseren.
   LET OP: 6-OHDA is cytotoxisch en produceert reactieve zuurstofsoorten die cellulaire stress veroorzaken. Voorzichtig behandelen.
3. Dien een intraperitoneale injectie met apomorfine toe (1 mg/kg, 0,5 mg/ml opgelost in zoutoplossing) om de laesies 4 weken na de operatie te valideren. Selecteer geïnfecteerde muizen die meer dan 100 contralaterale rotaties vertonen binnen een observatieperiode van 30 minuten voor volgende experimenten.
   OPMERKING: Apomorfine is een dopaminereceptoragonist, die direct overgevoelige postsynaptische receptoren in het gedenerveerde striatum activeert, waardoor de activiteit van het bilaterale nigrostriatale circuit uit balans raakt. Apomorfine-geïnduceerde rotatie dient om de ernst van unilaterale dopaminerge laesies te evalueren door middel van 6-OHDA.
4. Zaad- en kweekcellen in gecoate platen met zes putjes (150.000 cellen per putje). Incubeer gedurende 10 dagen in fase 1 differentiatiemedium en ververs het medium elke 2 dagen. Schakel op dag 11 over op fase 2-differentiatiemedium en ga door met incuberen tot dag 13, waarbij u het medium elke dag verandert.
   OPMERKING: Zie Materiaaltabel voor een vergelijking van het differentiatiemedium.
5. Oogst de cellen op dag 10 en 13 van differentiatie en meng ze vervolgens in een verhouding van 1:7. Suspendeer het mengsel in transplantatiebuffer in een concentratie van 100.000 cellen/μl.
   OPMERKING: Zie Materiaaltabel voor een vergelijking van de transplantatiebuffer.
6. Dien een stereotactische injectie toe met een totaal volume van 4 μl van de bereide celsuspensie in een PD-muis.
7. Voer de cilindertest uit op verschillende tijdstippen na de celtransplantatie. Plaats een glazen beker (diameter: 20 cm, hoogte: 30 cm) op een vlakke, niet-reflecterende ondergrond. Plaats een camera met bovenaanzicht boven de cilinder om de volledige diameter vast te leggen.
   OPMERKING: Omsluit de cilinder met zwarte gordijnen om externe visuele prikkels te elimineren.
8. Plaats elke muis in het midden van de cilinder en start gelijktijdige video-opname (3 min/sessie). Na de sessie brengt u de muis terug naar zijn thuiskooi.
   NOTITIE: Acclimatiseer muizen 30 minuten in de testruimte onder lichtomstandigheden. Reinig de cilinder met 70% ethanol tussen de proeven door om olfactorische signalen te elimineren.
9. Beoordeel het bewegingsvermogen van de muizen in de bovenste ledematen gedurende 3 minuten. Bereken het aantal wandcontacten van de gehandicapte voorpoot ten opzichte van het totale aantal contacten van beide voorpoten.
10. Toediening van zoutoplossing of CNO in een dosering van 1,2 mg/kg via intraperitoneale injectie. Voer de cilindertest uit om gedragsmodulatie in het PD-muismodel te beoordelen na toediening van CNO
    OPMERKING: Houd rekening met een herstelperiode van ongeveer 40 minuten voordat u doorgaat met de beoordeling.

3. In vivo elektrofysiologische profilering van chemogenetisch gemoduleerde cellen

1. Verdoof muizen door een intraperitoneale injectie van 250 mg/kg pentobarbital. Extraheer de hersenen en plaats deze onmiddellijk in ijskoude kunstmatige hersenvocht op basis van sucrose (s-ACSF) om de cellulaire integriteit te behouden. Snijd met behulp van een vibratoom de hersenen in secties van 300-400 μm dikte.
   OPMERKING: Werk snel om de hersenen op lage temperaturen te houden om de cellulaire functie te behouden. Zie Materiaaltabel voor de s-ACSF die wordt gebruikt bij de bereiding van verse hersensecties.
2. Breng de monsters over naar een kamer gevuld met ACSF die in evenwicht is met 95% O₂ en 5% CO₂ bij 34 °C, en zorg ervoor dat deze temperatuur gedurende het hele experiment wordt gehandhaafd.
   OPMERKING: Zie materiaaltabel voor ACSF.
3. Laad glazen pipetten met een intracellulaire ijsoplossing, met een elektrodeweerstand van 7 tot 10 MΩ.
   OPMERKING: Zie Materiaaltabel voor intracellulaire oplossing. Glazen pipetten worden gemaakt van glazen capillairen door een micropipettrekker¹⁸. Controleer voordat u met experimenten begint op lekken in de glazen pipetten en zorg ervoor dat de punten scherp genoeg zijn om het celmembraan binnen te dringen. Bereid pipetten snel voor om temperatuurschommelingen in de intracellulaire oplossing te minimaliseren.
4. Monteer de plakjes in een ondergedompelde opnamekamer die bij 34 °C is overgefuseerd (2 ml/min) met zuurstofrijk ACSF. Plaats pipetten met behulp van gemotoriseerde micromanipulatoren onder infrarood differentiële interferentiecontrastmicroscopie. Breng een configuratie van de hele cel tot stand door zachte zuigkracht (weerstand > 1 GΩ) toe te passen op gepatchte neuronen in transplantaatgebieden. Klem cellen vast op -70 mV met behulp van een patch-clamp versterker; verkrijg basislijn sEPSC's gedurende 8 minuten bij 10 kHz bemonsteringsfrequentie (gefilterd op 2 kHz) en bewaak continu de toegangsweerstand (doel: <20 MΩ; weggooien als >25 MΩ of fluctuerend >10%).
   NOTITIE: Gebruik de juiste druk bij het afzuigen om ongewenste celverplaatsing of breuk te voorkomen, en pas de positie van de pipet zorgvuldig aan om een goede afdichting te bereiken. Als de kwaliteit van de afdichting slecht is, gooi dan de pipet weg en probeer het opnieuw.
5. Voeg 50 μM CNO toe aan de registratiekamer onmiddellijk na het voltooien van de basislijnmeting en ga door met het registreren van gegevens gedurende nog eens 16 minuten terwijl u veranderingen in de sEPSC-frequentie of amplitude observeert.
6. Voer een wash-outprocedure uit door de CNO-oplossing te vervangen door verse ACSF om CNO effectief uit de opnamekamer te verwijderen. Ga door met het registreren van gegevens voor de rest van het experiment om eventueel herstel van de synaptische activiteit te evalueren.

Results

Figuur 1 toont de belangrijkste stappen van deze methodologische benadering voor gemanipuleerde menselijke geherprogrammeerde stamcellen die excitatoire (hM3Dq) of remmende (hM4Di) DREADD-receptoren tot expressie brengen om de functionele integratie en modulatie van afgeleide dopaminerge precursoren in een muismodel van de ziekte van Parkinson (PD) te evalueren. Figuur 2 schetst de CRISPR/Cas9-gemedieerde gen-knock-in-strategie ...

Discussion

Dit protocol maakte gebruik van CRISPR-technologie om door mensen geherprogrammeerde stamcellen te manipuleren om exciterende hM3Dq- en remmende hM4Di-receptoren tot expressie te brengen. De modulatie van neuronale activiteit door CNO werd beoordeeld door middel van celtransplantatie in muismodellen van de ziekte van Parkinson, vergezeld van gedragsbeoordelingen en elektrofysiologische opnames.

De eerste kritische stap bij het genereren van stabiel tot express...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Rapid Taq Master Mix	Vazyme	P222-01	gebruikt voor genotyperinganalyse
2×Seamless Cloning Mix	Biomed Gene Tech.	CL117-01	gebruikt voor plasmideconstructie
6-OHDA	Sigma-Aldrich	H4381	gebruikt voor het opzetten van PD-muizenmodel
AAVS1-Pur-CAG-EGFP	Addgene	80945	gebruikt als controle
AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry	Addgene	80947	originele plasmide voor constructie van hM4Di-T2A-ZsGreen
AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry	Addgene	80948	originele plasmide voor constructie van hM3Dq-T2A-ZsGreen
AAVS1-CAG-hM4Di-T2A-ZsGreen	N/A	N/A	Geconstrueerd donorplasmide op basis van #80947
AAVS1-CAG-hM3Dq-T2A-ZsGreen	N/A	N/A	Geconstrueerd donorplasmide op basis van #80948
Accutase	Invitrogen	A11105-01	Gebruikt voor het verteren van cellen
AMAXA Nucleofector	Lonza	AAD-1001S
Apomorphine	Sigma-Aldrich	A4393
Kunstmatig hersenvocht (ACSF)	N/A	N/A	125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 25 mM glucose, en  26 mM NaHCO3
Ascorbinezuur	Sigma-Aldrich	1043003
B-27 Supplement	Gibco	17504044
BDNF	Peprotech	450-02
cAMP	Sigma-Aldrich	D0627
CHIR99021	Yeasen	53003ES10
Clozapine-N-oxide	Enzo	BML-NS105
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Desipramine	Sigma-Aldrich	D3900
D-glucose	Sigma-Aldrich	G5767
DMEM/F12	Gibco	11330-032
DMEM/F12	Gibco	11320-033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
FGF8	Peprotech	100-25
GDNF	Peprotech	450-10
GlutaMax	Gibco	35050-061
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175095
Human leukemia inhibitory factor (hrLIF)	Millipore	LIF1010
Iced intracellulair vocht	N/A	N/A	130 mM K-gluconaat, 16 mM KCl, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 4 mM Na2-ATP, 0,4 mM Na3-GTP, 0,3% neurobiotine
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028
Laminine	Roche	11243217001
Micropipet Puller	Sutter Instrument Company	P-1000
N-2 Supplement	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal-A Medium	Gibco	10888-022
Non-essentiële aminozuren (NEAA)	Gibco	11140-050
PBS	Gibco	10010023
pCLAMP 11 software suite	Molecular Devices	N/A	Patch-clamp elektrofysiologie gegevensverzameling en analysesoftware
Differentiatiemedium fase 1	N/A	N/A	96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% B-27 Supplement, 1% N-2 Supplement, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 1 µM SAG1, en 100 ng/mL FGF8
Differentiatiemedium fase 2	N/A	N/A	96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% B-27 Supplement, 1% N-2 Supplement, 1% NEAA, en 1% GlutaMax, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 ng/mL TGF-βIII, 10 µM DAPT, 0,2 mM ascorbinezuur, en 0,5 mM cAMP.
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich	P7886
Primers voor genotypering	N/A	N/A	Insertion Foward: TCTTCACTCGCTGGGTTCCCTT; Insertion Reverse: CCTGTGGGAGGAAGAGAAGAGGT; Homozygosity Foward:CGTCTCCCTGGCTTTAGCCA; Homozygosity Reverse: GATCCTCTCTGGCTCCATCG
pX458	Addgene	152199
SAG1	Enzo	ALX-270-426-M01
SB431542	Yeasen	53004ES50
Sucrosegereed kunstmatig hersenvocht (s-ACSF)			234 mM sucrose, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, 11 mM Dglucose, 0,5 mM CaCl2, en 10 mM MgSO4
Stamcellenkweekmedium	N/A	N/A	48% DMEM/F12 (Gibco, 11330-032) en 48% Neurobasal, met de toevoeging van 1% B27, 1% N2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 10 ng/mL hrLIF, 2 µM SB431542, en 3 µM CHIR99021
TGF-βIII	Peprotech	100-36E
Transplantatiebuffer