Bioreactorassemblage voor continue cultuur van complexe fecale gemeenschappen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de assemblage van mini-bioreactorarrays die moeten worden gebruikt voor continue stroomcultuur van complexe fecale gemeenschappen onder anaërobe omstandigheden. We bespreken ook de methoden voor assemblage, inoculatie en bemonstering van de reactoren voor verdere analyse.

Samenvatting

De microbiota, vooral bacteriën, reageren op verschillende blootstellingen aan het milieu, zoals micro- en macronutriënten, farmacologische verbindingen en ontstekingsmediatoren, die de samenstelling van de gemeenschap en de microbiële metabolische output dynamisch veranderen. Inzicht in de invloed van fysiologische kweekomstandigheden op microbiële gemeenschappen en diversiteit en hun metabolische capaciteit zal belangrijke kennis opleveren over hun impact op gezondheid en ziekten. Hier presenteren we een protocol dat is aangepast aan het sjabloon dat is gepubliceerd door Auchtung et al. om mini-bioreactorarrays te creëren die complexe fecale gemeenschappen kunnen cultiveren, bacteriële consortia of afzonderlijke stammen kunnen definiëren onder precieze omstandigheden, waaronder beschikbaarheid van voedingsstoffen, temperatuur, stroomsnelheid, pH en zuurstofgehalte. We beschrijven het proces voor het bouwen van het mini-bioreactorsysteem, inclusief aanpassingen om de beperkingen in het gepubliceerde protocol te verbeteren. We bespreken ook de opstelling van het mini-bioreactorsysteem onder anaërobe omstandigheden met behulp van MEGA-media (aangepast van Han et al.), een rijk medium dat de groei van diverse bacteriën ondersteunt. We beschrijven de inoculatie van darmgehumaniseerde fecale monsters van muizen in het mini-bioreactorsysteem, gevolgd door de oprichting van complexe gemeenschapsculturen binnen het mini-bioreactorsysteem, die onder continue stroom kunnen worden gekweekt met aseptische bemonstering om de samenstelling van de gemeenschap te controleren. Dit systeem kan worden aangepast aan veranderingen in het dieet en andere culturele veranderingen. De hier beschreven technieken maken het mogelijk om diverse, kieskeurige fecale gemeenschappen te karakteriseren onder dynamische omstandigheden of als reactie op verstoring los van van de gastheer afgeleide factoren.

Inleiding

De darmmicrobiota is een enorm netwerk van micro-organismen, waaronder bacteriën, schimmels, archaea en virussen, die een enorm genetisch en metabolisch repertoire bevatten dat veel groter is dan dat van een menselijke gastheer¹. De rijke metabolische capaciteit van het microbioom omvat metabolieten die worden geproduceerd door bacteriële verwerking van voedingsstoffen in de voeding, gastheermetabolieten die chemisch zijn gemodificeerd door bacteriën en metabolieten die uniek zijn gesynthetiseerd door de microbiota². Microbiota is betrokken bij bijna alle bioprocessen van de gastheer, maar ook bij ziektetoestanden zoals inflammatoire darmaandoeningen, kanker, stofwisselingsstoornissen en zelfs neurologische aandoeningen ^2,3. Het ontleden van de bijdrage van de microbiota van die van de gastheer is essentieel om de rol van specifieke micro-organismen of complexe gemeenschappen in gezondheid en ziekte te begrijpen. Een benadering die deze ontleding mogelijk maakt, is het gebruik van microbiële bioreactoren, die onder dynamische omstandigheden diverse microbiële gemeenschappen cultiveren. Er zijn veel in de handel verkrijgbare bioreactoren die de groei van fecale bacteriegemeenschappen voor bijna elk doel mogelijk maken, inclusief grootschalige teelt van bioproducten of nauwkeurige controle van specifieke voedingsfactoren voor de studie van metabolische processen. Deze systemen zijn echter enorm kostbaar en vereisen een uitgebreide voorbereiding, en maken het niet mogelijk om verschillende experimentele omstandigheden parallel te onderzoeken. Voor een vereenvoudigde aanpak die minder duur en aanpasbaar is en veel parallelle voorwaarden mogelijk maakt, presenteren we hier het protocol voor het opzetten en gebruiken van een mini-bioreactorarray onder continue stroom, aangepast van Auchtung et ^al.4.

De volledige opzet van het mini-bioreactorsysteem wordt gedemonstreerd in figuur 1A. Dit mini-bioreactorsysteem maakt gebruik van arrays van 6 reactorputten, die volledig onafhankelijk van elkaar zijn en in een anaërobe kamer onder peristaltische stroom zijn opgesteld om continue toevoer en verwijdering van media mogelijk te maken (Figuur 1A). Elke reactorarray bevindt zich op een magnetische roerplaat met 60 posities, met twee peristaltische pompen met 48 cassettes die 2-stopslangen bevatten voor de bronmedia en de afvalstroom (Figuur 1A). De anaërobe kamer is uitgerust met een CAM-12 anaërobe monitor voor het zuurstofgehalte, een katalysatordoos om zuurstof met verwarmingscapaciteit te verwijderen en een waterstofsulfideverwijderingskolom om overtollig gas van het bacteriële metabolisme te absorberen. Elke reactorput is uitgerust met een inlaat van de bronmedia, een afvaluitlaat en een monsterpoort, waardoor inoculatie of bemonstering van elke afzonderlijke reactorput mogelijk is (Figuur 1B).

Zoals beschreven, maakt het bioreactorsysteem dynamische controle mogelijk over temperatuur, mediaconsumptie en beschikbaarheid van voedingsstoffen om de teelt en het onderhoud van fecale gemeenschappen te ondersteunen. De temperatuur wordt gemoduleerd door een katalysatorbox met verwarmingscapaciteit, waardoor temperatuurveranderingen in de hele anaërobe kamer snel kunnen worden doorgevoerd. Het mediaverbruik wordt geregeld door peristaltische pompdebieten, die kunnen worden aangepast om de mediaturnover in de reactoren te veranderen. De mediaomzet kan worden aangepast aan de gemeenschapstypen die in reactoren worden gekweekt, bijvoorbeeld aan de aanpassing voor langzaam groeiende of zeer snel groeiende doelstammen. Ten slotte kan de beschikbaarheid van voedingsstoffen dynamisch worden gewijzigd door componenten toe te voegen via de afzonderlijke monsterpoorten voor elke reactorput. Statische omstandigheden die aan het begin van een experiment kunnen worden gewijzigd, maar die geen dynamische controle in het systeem hebben, zijn het mediatype, het zuurstofgehalte en het aantal gelijktijdige reactoren. Onderzoekers kunnen ervoor kiezen om elke bronmedia te implementeren die ze willen, en hoewel één medium hier wordt beschreven, zijn er eindeloos veel andere bronmediatypen met succes geïmplementeerd. Men kan de reactoren laten werken onder aërobe of micro-aërofiele omstandigheden (afhankelijk van de beschikbaarheid van een micro-aërofiele kamer). Ten slotte kunnen zo veel of zo weinig reactoren worden opgezet als nodig is, afhankelijk van de experimentele behoeften van de onderzoeker. Terwijl reactoren zich in sets van zes binnen een array bevinden, werkt elke reactor onafhankelijk van de andere en kan elke reactor desgewenst aan een andere bron worden gekoppeld.

Dit modulaire bioreactorsysteem kan volledig worden opgezet voor ongeveer $ 25.000 (exclusief de anaërobe kamer of kamerspecifieke componenten), waarbij het enige niet-herbruikbare onderdeel de slang is die kan worden vervangen voor minder dan $ 100 per run van het systeem. Het systeem is grotendeels geautomatiseerd, maar vereist wel dagelijkse controle op medianiveaus, aangezien mediabronflessen moeten worden vervangen wanneer ze leeg zijn. Bovendien moet elke bemonstering handmatig worden voltooid en moeten alle dynamische voorwaardelijke wijzigingen aan het systeem handmatig worden geïnitieerd (bijvoorbeeld het wijzigen van de temperatuur). Van het oorspronkelijke systeemprotocol dat door Auchtung et al. werd gepubliceerd, werden enkele wijzigingen doorgevoerd om de algehele prestaties en bruikbaarheid⁴ te verbeteren. Ten eerste wordt het materiaal voor het 3D-printen van de bioreactor-array aangepast tot ABS-achtig doorschijnend helder plastic om de structurele integriteit van het systeem te verbeteren door middel van herhaalde autoclaveren. Bovendien wordt in plaats van de 1/8 inch (3,2 mm) OD PTFE-slang, E-LFL, 2,06 mm ID, 100 ft slang gebruikt vanwege het stevigere materiaal, dat beter bestand is tegen instorten, wat blokkades in de stroom in het systeem zou veroorzaken. Ten slotte wordt een extra fitting met 1/4 -28 mm schroefdraad naar mannelijke adapters met weerhaken gebruikt om veranderingen in het wegglijden van de buis van mediabronflessen te verminderen. Van Han et al. biedt het aangepaste MEGA media-recept een ongedefinieerd, complex, zeer rijk medium dat de teelt van kieskeurige anaërobe micro-organismen mogelijk maakt⁵. De media worden aangepast om een alternatieve bereiding van de histidine-hematinecomponent te gebruiken, aangezien het origineel niet langer in de handel verkrijgbaar is. Natriumhydroxide wordt ook gebruikt om de media te pH-en tot 7,0 of een gewenste pH. Over het algemeen is dit systeem budget- en gebruiksvriendelijk, geoptimaliseerd en een uitstekend startpunt voor continue flowcultuursystemen.

In dit protocol beschrijven we in detail de opzet van dit mini-bioreactor-arraysysteem, inclusief materialen, sterilisatie van het systeem en het daaropvolgende gebruik voor de teelt van darmgehumaniseerde ontlastingsmonsters van muizen. Het algemene doel van deze methode is het bouwen van een aanpasbaar en kosteneffectief bioreactorsysteem dat kan worden gebruikt voor het kweken van microbiële gemeenschappen onder gecontroleerde omstandigheden. Een gedetailleerd schema van de workflow voor de assemblage van het mini-bioreactorsysteem wordt gegeven in figuur 2 en er wordt naar verwezen bij de juiste stappen binnen het protocol. In ons voorbeeld inoculeren we twee reactoren met hetzelfde fecale monster van gehumaniseerde darmmuizen en beschrijven we de microbiële gemeenschapsstructuur onder een continue stroom van MEGA-media.

Figuur 1: Schematisch diagram van de opstelling van de mini-bioreactor-array in de anaërobe kamer. (A) Volledig beeld van de voltooide opstelling van de mini-bioreactor-array in de anaërobe kamer. De bioreactorarray met 6 putten bevindt zich op de magnetische roerplaat met 60 posities. Het source luer tee-netwerk is bevestigd aan de bronmedia aan de linkerkant via de dop van de fles met twee gaten. Twee slangenpompen houden de 2-stop slang van de bron en het afvalnetwerk aan de linker- en rechterkant vast. Het afvoernetwerk van de afvoer mondt uit in de afvalfles aan de rechterkant. Essentiële apparatuur voor de werking van de anaërobe kamer, waaronder de CAM-12-monitor, de katalysatorkast met verwarmingscapaciteit en de verwijderingskolom voor waterstofsulfide, zijn in de kamer rond het array-systeem geplaatst. (B) Bovenaanzicht van de bron-, monster- en afvalpoorten die zijn bevestigd aan een reactorput met media op de juiste hoogte in de reactor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Schematisch diagram van de workflow voor de assemblage van mini-bioreactorarrays. (A) Bovenaanzicht van de mini-bioreactorarray, met de oriëntatie van de bron, het afval en de monsterpoorten. (B) Zijaanzicht van de mini-bioreactorarray met weergave ter illustratie van de stappen 2.3-2.4 van het protocol. De 1/8 inch PTFE-slang en fitting (1) worden bevestigd en in de afval- en monsterpoorten geplaatst. Fitting (1) zonder PTFE wordt in de bronpoort gestoken. (C) Zijaanzicht van de mini-bioreactorarray ter illustratie van de stappen 2.5-2.6 van het protocol. Fitting (2) is bevestigd aan de bron- en afvoerpoorten. Fitting (3) wordt bevestigd aan de samplepoort en daarop wordt fitting (4) bovenop geplaatst. (D) Zijaanzicht van de mini-bioreactor-array ter illustratie van de stappen 2.9-2.11. De E-LFL slang van 2.06 mm wordt aangesloten op de bron- en afvalpoorten en het andere uiteinde wordt aangesloten op fittingen (5) en vervolgens (6). Vervolgens wordt een 2-stops slang met de juiste diameter op de fitting (6) aangesloten. De omgekeerde aansluiting wordt vervolgens herhaald aan het einde van de 2-stops slang, waarbij fitting (6) wordt aangesloten op de 2-stop slang en fitting (5) daarop wordt aangesloten. Ten slotte wordt de E-LFL 2.06 mm-slang aangesloten op fitting (5) voor aansluiting op het luer tee-netwerk. (E) Bovenaanzicht van de mini-bioreactorarray met weergave van de opstelling van het bron- en afvalnetwerk zoals beschreven in de stappen 2.12-2.15. De slang van 2,06 mm E-LFL die eindigt in fitting (5) wordt gebruikt om elke reactor aan te sluiten op verschillende fittingen (7), waarvan de laatste opening is aangesloten op de dop op de bron- of afvalfles. (F) Zijaanzicht van de kroonkurk met twee gaten zoals beschreven in de stappen 2.16-2.17. Een opening in de dop is verbonden met een PTFE-slang die in de fles is geplaatst. Naar die opening wordt fitting (1) geplaatst, gevolgd door fitting (2), en E-LFL 2.06 mm slang aangesloten op fitting (5). Deze fitting wordt aangesloten op het bron- of afvalleidingsnetwerk. Op de opening die niet is aangesloten op PTFE-slang, wordt fitting (1) geplaatst, gevolgd door fitting (2), en E-LFL 2.06 mm slang wordt aangesloten op een andere fitting (5). Dit uiteinde wordt tijdens de sterilisatie van de autoclaaf afgedekt met folie voor toekomstige bevestiging aan een steriel spuitfilter van 0,22 μM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Fecale monsters die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn verkregen uit experimenten die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Florida (UF) en uitgevoerd in UF Animal Care Facilities (IACUC Protocol #IACUC202300000005). In het kort, gemengd geslacht kiemvrij wildtype (GF WT; C57BL/6) muizen (gefokt en gehouden in isolatoren door UF Animal Care Services Germ-free Division) werden overgebracht van fokisolatoren en in het ISOcage P Bioexclusion-systeem geplaatst om microbiële manipulatie mogelijk te maken. Gelijke kolonievormende eenheden (CFU) uit menselijke donoruitwerpselen werden samengevoegd voor maagsonde in muizen. Twee weken na de inoculatie werden aseptisch fecale monsters van deze muizen verzameld voor opslag en daaropvolgend gebruik in dit protocol.

OPMERKING: Het verzamelen en voorbereiden van fecale monsters die hier worden beschreven, zijn alleen bedoeld als een voorbeeld van een juiste procedure, aangezien deze procedure, afhankelijk van het type monsters dat wordt verzameld (mens, muis, ander dier) en de opslag van deze monsters, sterk kan variëren. Individuen moeten de juiste literatuur raadplegen om een protocol te ontwerpen voor het verzamelen en bewaren van fecale monsters op basis van de behoeften van de individuele onderzoeker.

1. Typische voorbereiding van fecale monsters voor opslag bij -80 °C

1. Selecteer een anaeroob conserveringsmedium voor levensvatbaarheid (hier hebben we Cary Blair gebruikt). Verdeel 1 ml conserveringsmedia in steriel, schroef de dop van 2 ml buizen in een bioveiligheidskast en breng deze vervolgens over naar de anaërobe kamer.
2. Voordat u fecale monsters ontvangt, moet u ervoor zorgen dat alle benodigdheden (geautoclaveerde spatels, steriele zoutoplossing en cryogene injectieflacons met schroefdop die conserveringsmedia bevatten) gedurende 24 uur in de anaërobe kamer zijn voorgemalen.
3. Verzamel aseptisch fecale monsters van muizen met behulp van steriele snap-cap-buisjes in een bioveiligheidskast met behulp van geautoclaveerde ontlastingsverzamelbekers en tangen. Vries de buisjes direct na het verzamelen in vloeibare stikstof in.
4. Breng de monsters onmiddellijk over naar een anaërobe kamer, samen met een draagbare weegschaal om te wegen. Weeg elke buis voor. Voor fecale monsters van muizen kunnen afzonderlijke fecale pellets per buis worden verdeeld. Als u menselijke monsters gebruikt, gebruik dan de steriele spatels om elk monster te roeren en verdeel het gelijkmatig in cryogene flesjes. Nadat u elke buis opnieuw hebt gewogen, voegt u media toe in een geschatte verhouding van 1:10 fecesmedia (massa: massa) aan elke buis voor een optimale bewaring.
   OPMERKING: Onmiddellijke anaërobe conservering van fecale monsters wordt aanbevolen na verzameling. Monsters die niet onmiddellijk geconserveerd zijn, kunnen een verminderde levensvatbaarheid, veranderingen in de samenstelling, enz. hebben in vergelijking met vers geconserveerde monsters ^6,7,8. Cary Blair conserveringsmedia behouden de levensvatbaarheid van bacteriële gemeenschappen terwijl ze verdere groei remmen en kunnen worden bewaard bij -80 °C. Voor de geschatte verhouding tussen conserveringsmedia en ontlasting, hoewel het natte gewicht van het fecale monster zeer variabel is, is dit de beste beschikbare schatting.
5. Etiketteer, verzegel, verwijder de injectieflacons uit de anaërobe kamer, vries de flits in met vloeibare stikstof en bewaar ze maximaal een jaar of langer bij -80 °C.

2. Bouwen van een reactorarray met 6 putten

1. Gebruik het CAD-bestand (aanvullend bestand 1) voor het 3D-printen van de reactor met 6 putten. Dit bestand kan voor productie worden ingediend bij elk 3D-printbedrijf. Gebruik ABS-achtig doorschijnend helder plastic als printmateriaal om visualisatie door de reactoren mogelijk te maken en tegelijkertijd bestand te zijn tegen herhaalde autoclaafcycli.
   OPMERKING: We hebben opdracht gegeven om de reactorarrays met 6 putjes te maken van ABs-achtig doorschijnend helder plastic door middel van stereolithografie. We raden aan om de array tijdens de productie te kantelen (d.w.z. het onderdeel 3D-geprint in een hoek van 30%-45%), waardoor dimensionale onnauwkeurigheden worden verminderd. Deze correctie zal resulteren in zichtbare laaglijnen die diagonaal over de array lopen, maar dit heeft geen invloed op de prestaties van de reactoren.
2. Breng met behulp van een tapgereedschap van 25-28 mm schroefdraad aan in elke opening van de reactorarray.
3. Knip 12, 25 mm stroken van de 1/8 inch PTFE-slang en steek het ene uiteinde van elk slangsegment in de schroefdraadopening van een mannelijke luer naar 25-28 schroefdraadfitting. Schroef de fittingen stevig in de daarvoor bestemde afval- en monsteropeningen van de array (Afbeelding 2B).
   OPMERKING: Een scheermesje kan worden gebruikt om de uiteinden van de slang lichtjes te scheren tot een kegelachtige configuratie om de slang beter geschikt te maken voor het inbrengen.
4. Steek een microroerstaaf in elke reactorput van de reactor en schroef vervolgens een mannelijke 1/4-28 schroefdraadfitting in de brongaten van elke reactorput (Figuur 2B).
5. Schroef vrouwelijke luer x 1/8 inch slangpilaaradapterfittingen in de 1/4-28 schroefdraadfittingen voor het afval en de bron voor elke reactorput (Figuur 2C).
6. Schroef vrouwelijke luer x 3/32 inch slang weerhaakadapter fittingen in de 1/4-28 schroefdraadfittingen voor de monsterpoort. Plaats een rubberen septum over de 3/32 inch slangpilaaradapters en vouw de bovenkant om (Figuur 2C).
7. Snijd twee sets E-LFL, 2,06 mm slang in de volgende lengtes voor de afvoer- en bronleidingen: 14 cm, 15,25 cm, 16,5 cm, 17,75 cm, 19 cm en 20,25 cm.
   OPMERKING: Gekleurd labeltape dat om het middengedeelte is gewikkeld, kan worden gebruikt om elke lengte van de slang te identificeren.
8. Bevestig de E-LFL 2.06 mm slang aan de female luer 1/8 inch slang barb adapter fittingen voor de bron- en afvoeraansluitingen (Figuur 2D). Gebruik heet water om de slang kneedbaarder te maken. Hierdoor past de slang gemakkelijk op de adapters.
9. Bevestig een mannelijke luer met een borgring x 1/8 inch slangpilaaradapter aan het andere uiteinde van de slang. Schroef daar een female luer x 1/16 inch slang barb adapter in (Figuur 2D).
10. Sluit de juiste maat 2-stop slang aan op de bijbehorende afvoer- en bronaansluitingen. De afvoerleidingen gebruiken 1,14 mm ID 2-stop slang, terwijl de bronleidingen 1,02 mm ID 2-stop slang gebruiken. Bevestig aan het andere uiteinde van de 2-stops slang nog een vrouwelijke luer x 1/16 inch slangpilaaradapterfitting (Figuur 2D).
11. Snijd 20, 5 cm stukken E-LFL, 2.06 mm buis, en plaats de mannelijke luer met borgring x 1/8 inch slang weerhaakadapter fittingen aan beide uiteinden van elke buis. Bevestig het ene uiteinde van de 5 cm slang met de mannelijke luer met borgring x 1/8 inch slang weerhaak adapter fitting aan de onbezette vrouwelijke luer x 1/16 inch slang weerhaak adapter fitting aan het einde van elk 2-stop buisgedeelte. Herhaal dit proces voor de resterende 19 stukken slang (Figuur 2D).
12. Sluit de E-LFL, 2.06 mm slang aan voor de bronleidingen van reactorputten 1 en 2 met behulp van tegenoverliggende uiteinden van een vrouwelijk luer-T-stuk. Bevestig een van de 5 cm lange stukken slang met mannelijke luer met borgring x 1/8 inch adapterfittingen aan elk uiteinde aan de middelste uitlaat van de tee, die leidt naar een tweede T-aansluiting (Figuur 2E).
13. Sluit de E-LFL, bronslang van 2,06 mm voor de derde reactor, aan op de andere kant van het tweede T-stuk. Aan het ene uiteinde moet nog een buis van 5 cm worden bevestigd met een mannelijke luer met een borgring x 1/8 inch adapter, terwijl aan het andere uiteinde een vrouwelijke luer moet worden bevestigd met een borgring x 1/8 inch adapter. Volg hetzelfde patroon voor reactoren 4, 5 en 6 (Figuur 2E).
14. Snijd een stuk E-LFL, 2.06 mm slang van 25 cm en bevestig een mannelijke luer met borgring x 1/8 inch slangpilaar aan het ene uiteinde van de buis, die wordt bevestigd aan de laatst overgebleven vrouwelijke luer T-verbinding, en bevestig aan het andere uiteinde een vrouwelijke luer x 1/8 inch slangpilaaradapterfitting. Dek dit uiteinde af met aluminiumfolie (Figuur 2E).
    OPMERKING: Tijdens de operatie is het essentieel om open uiteinden steriel te houden, dus we raden aan om ze tijdens het autoclaveren met folie af te dekken en met tape op hun plaats te bevestigen.
15. Bereid de afvalleidingen voor door dezelfde procedure te herhalen als de bronleidingen beschreven in de stappen 2.12-2.14 (Figuur 2E).
16. Om een afvalinzamelingsfles in elkaar te zetten, bevestigt u losjes een dop van een fles met twee gaten op een fles van 2 liter. Steek de mannelijke 1/4-28 schroefdraadfittingen in beide gaten van de dop. Bevestig een vrouwelijke luer met 1/8 inch slangpilaaradapters aan de buitendraadfitting die niet aansluit op de vooraf bevestigde PTFE-slang in de dop (Figuur 2F).
17. Knip vervolgens een stuk E-LFL 2,06 mm slang van 5 cm af en sluit deze aan op de slangpilaaradapter op de fles. Bevestig een male luer met borgring x 1/8 inch slang barb adapter aan het andere uiteinde van de 5 cm slang en dek deze af met folie (deze slang dient als ontluchter; na het autoclaveren wordt er een 0,22 μm spuitfilter toegevoegd om vervuiling te voorkomen; Figuur 2F).
18. Dek de hele dop af met aluminiumfolie. Autoclaveer de reactoren en de afvalfles bij 121 °C en minimaal 15 psi gedurende 45 minuten met behulp van het langzame uitlaatprogramma dat doorgaans is ingesteld voor vloeistoffen. Zodra de reactoren zijn afgekoeld, draait u de fittingen en de aluminiumfolieafdichtingen vast en plaatst u ze voor gebruik 48 uur in de anaërobe kamer.

3. MEGA media voorbereiding

1. Bereid alle voorraadoplossingen volgens Aanvullende Tabel 1, Aanvullende Tabel 2, Aanvullende Tabel 3, Aanvullende Tabel 4, Aanvullende Tabel 5, Aanvullende Tabel 6, Aanvullende Tabel 7, Aanvullende Tabel 8.
2. Voeg in een glazen fles van 2 liter alle droge ingrediënten van aanvullende tabel 9 toe, gevolgd door 1640 ml ultrapuur water en vervolgens de rest van de aanvullende tabel 10 vloeibare ingrediënten. Voeg een roerstaaf toe en los volledig op middelhoog vuur (90 °C) op een roerplaat op. De media zullen lichtblauw tot violetkleurig zijn en zullen niet volledig helder zijn, maar zullen geen duidelijke onopgeloste klontjes hebben.
   OPMERKING: Het autoclaveren van glucose en andere suikers in aanwezigheid van peptiden kan leiden tot modificatie en kan de beschikbare suiker in media verlagen. Indien gewenst kunnen alle suikeroplossingen steriel worden gefilterd en toegevoegd met de componenten van Aanvullende Tabel 10, zoals beschreven in stap 3.7.
3. Eenmaal volledig gemengd, stelt u de pH van de media in op 7,0 door 10 N natriumhydroxide (NaOH) toe te voegen, waarbij precies wordt gemeten hoeveel volume er wordt toegevoegd. Voeg na de pH-meting 14,4 ml water toe minus het volume natriumhydroxide dat is toegevoegd om het volume op precies 2 l te brengen.
4. Bereid een flessendop met twee gaten voor door een mannelijke luer 1/4-28 mm schroefdraad in beide openingen te steken.
5. Knip in het gat van de dop dat niet vooraf is bevestigd aan PTFE-slang een stuk C-flex-slang van 5 cm af en sluit dit aan op de 1/8 inch slangpilaar van de vrouwelijke luer-fitting. Plaats aan het andere uiteinde van de slang van 5 cm nog een mannelijke luer met een borgring en een 1/8 inch slangpilaaradapter en dek af met folie (deze wordt ook aangesloten op een spuitfilter van 0.22 μM).
6. Bedek de hele dop met aluminiumfolie en schroef deze op de MEGA mediafles van 2 L. Autoclaaf bij 121 °C en minimaal 15 psi gedurende 45 minuten, met behulp van het langzame uitlaatprogramma voor vloeistoffen.
7. Haal de media uit de autoclaaf en laat al roerend afkoelen tot ze lauw zijn. Voeg de componenten in aanvullende tabel 10 toe aan de mediafles van 2 l in een bioveiligheidskast, sluit het deksel af en verplaats deze vervolgens naar een roerplaat om te homogeniseren. Zodra de media zijn afgekoeld, draait u de fittingen en de aluminiumfolieafdichtingen vast en plaatst u ze voor gebruik 48 uur in de anaërobe kamer.
   OPMERKING: We raden aan om de bronpomp te laten draaien op 16 μL/min (0.94 ml/h) voor een retentietijd van 16 uur. Voor dit debiet gebruikt een reactor met 6 putten ongeveer 0,135 L media per dag. We raden ook aan om de afvalpomp op 40 μL/min te laten draaien om blokkadevorming in de afvoerslang te voorkomen. Bewaak de slangen en de stroom en houd er rekening mee dat de afvalstroom naar behoefte kan worden verhoogd als er verstoppingen optreden. Zowel de bron- als de afvalstromen kunnen worden gewijzigd, maar onderzoekers moeten de samenstelling en groeisnelheden van de gemeenschap zorgvuldig in de gaten houden, aangezien deze ook kunnen veranderen bij een snellere of langzamere stroom. Om een reactor met 6 putten een week lang te laten draaien, raden we aan om minimaal 2 liter media te maken (dit verbruikt iets meer dan 1 liter).

4. Array-opstelling in anaërobe kamer

NOTITIE: Het is essentieel om de binnenkant van de capuchon en de kaphandschoenen te reinigen met 3% waterstofperoxide, gevolgd door drievoudig gedeïoniseerd water spoelen om ervoor te zorgen dat het oppervlak niet wordt vervuild voordat de montage plaatsvindt. Als de verbindingen snel worden gemaakt na het verwijderen van de folie en er geen direct contact wordt gemaakt met de binnenkant van de fittingen en de anaërobe kamerhandschoenen, is de kans op besmetting minimaal

1. Lijn de array uit over een magnetische roerplaat in de anaërobe kamer. Zorg ervoor dat de array correct is uitgelijnd door de roerplaatcontroller op het maximale toerental (1600 tpm) in te stellen en het draaien van de roerstaven te observeren.
2. Monteer de 2-stop slang voor de bron en het afval in de klemmen op de bijbehorende slangenpompen. Als u dit minder dan 24 uur voor het beoogde gebruik doet, vergrendelt u de klemmen op hun plaats. Laat het anders los tot het klaar is voor gebruik om de slijtage van de slang te verminderen.
3. Verwijder de foliedop op de vrouwelijke luer x 1/8 inch slang weerhaakadapterfittingen op de bron- en afvoerleidingen en schroef deze in de mannelijke luer tot 1/4 -28 bedreigingsfittingen die in de doppen zijn geschroefd (zorg ervoor dat deze opening is aangesloten op de interne PTFE-slang).
4. Verwijder de foliedoppen en bevestig een spuitfilter van 0,22 μm op de ontluchtingsleiding van 5 cm van de bronfles en op de ontluchtingsleiding van de afvalfles.
5. Begin het debiet met een gematigde snelheid (1 ml/min op de bronpomp en 2 ml/min op de afvalpomp) om te beginnen met het vullen van de reactoren. Zorg ervoor dat de afvoerleiding in elke reactorput lager is dan die van de bronbuis, om overvulling of het legen van elke put te voorkomen.
6. Als de reactoren zich beginnen te vullen, zorg er dan voor dat ze allemaal hetzelfde volume bereiken en dat de media in de afvalleiding stromen. Met de hier beschreven metingen is het werkvolume van elke reactor 15 ml.
   NOTITIE: Als individuele reactoren niet vullen, draai dan alle losse fittingen vast en inspecteer de bronleidingen op problemen en vervang ze indien nodig door voorbereide extra's. Als het probleem zich blijft voordoen, vervangt u de bronfles indien beschikbaar. Als het gemiddelde niveau boven de interne afvalleiding in de reactoren uitkomt, controleer dan of de PTFE-slangen aan de binnenkant van de reactorafvalpoort nog op hun plaats zitten.
7. Nadat elke reactor is gevuld, stelt u de pompinstellingen in op het debiet van 16 μL/min en schakelt u vervolgens de pompen uit.
8. Laat het medium een nacht in de reactoren en de afvalfles(sen) blijven voordat u het inoculeert. Dit maakt verdere anaërobe conditionering van de media mogelijk (voor een totaal van ~72 uur) en stelt de gebruiker in staat om de steriliteit van het systeem te bevestigen.
9. Om de steriliteit van het systeem te bevestigen voorafgaand aan de inoculatie van het fecale monster, bemonstert u elke reactor en de bronmedia direct na de eerste vulling (stap 4.7) en opnieuw na stap 4.8. Volg de procedure voor aseptische bemonstering van de reactoren zoals beschreven in stap 6.
   1. Zorg ervoor dat de optische dichtheidsmeting van alle monsters hetzelfde is als die van de bronmedia; Als een verhoogde optische dichtheid wordt waargenomen, wordt besmetting vermoed en moeten alle media en het systeem worden gedeconstrueerd, gereinigd en weer in elkaar worden gezet.

5. Inenting van fecale monsters

1. Plaats steriele pipetpunten met brede boring, steriele zoutoplossing, conische buisjes van 50 ml, steriele serologische pipetten van 25 ml, spuiten van 5 ml en naalden van 16 gauge in de anaërobe kamer om gedurende ten minste 24 uur in de anaërobe omgeving te conditioneren.
2. Bereken de hoeveelheid fecaal materiaal die nodig is om het gewenste aantal reactoren te inoculeren. Elke reactorput vereist 3,8 ml supernatans in een fecale suspensie van 25% m/v. Voor zes reactorputten moet in totaal 22,8 ml 25% m/v fecale suspensie voldoende supernatans leveren voor inoculatie, waarvoor 5,7 g vaste ontlasting nodig is.
3. Breng de geconserveerde fecale monsters in cryogene flesjes over naar de anaërobe kamer en laat ze 15 minuten ontdooien.
4. Gebruik een pipetpunt met brede boring om fecaal materiaal van de cryogene flesjes over te brengen naar een conische buis van 50 ml, sluit deze goed af en centrifugeer gedurende 5 minuten op 200 x g om deeltjes te laten bezinken.
5. Breng terug naar een anaërobe kamer en verwijder supernatant. Breng met behulp van een geautoclaveerde laboratoriumspatel de fecale vaste stoffen over in een nieuwe conische buis van 50 ml, waardoor een totale massa van 5,7 g wordt bereikt. Voeg 17,1 ml anaërobe steriele zoutoplossing toe aan de buis en sluit deze goed af.
6. Verwijder de conische buizen uit de kamer, homogeniseer ze gedurende 5 minuten door middel van vortex en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten op 200 x g om de deeltjes te laten bezinken.
7. Steriliseer de septa bovenop elke reactor met een laboratoriumdoekje van 10% bleekmiddel gedurende ten minste 2 minuten terwijl de monsters in de centrifuge worden geplaatst.
8. Breng de monsters terug naar de anaërobe kamer en breng de bovenstaande middelen met behulp van steriele serologische pipetten over in nieuwe conische buisjes van 50 ml.
9. Laad 3,8 ml fecale slurry-supernatans in zes afzonderlijke spuiten van 5 ml met naalden van 16 G 1,5 inch.
10. Verwijder het doekje, steek de naald door het septum en injecteer langzaam de fecale slurry in de reactor.
11. Laat de fecale gemeenschappen zich in elke reactor ongeveer 16-18 uur vestigen voordat u de stroom naar de reactor start. Stel de magnetische roerplaat in op de maximale snelheid vanaf het moment dat de fecale slurry wordt geïnjecteerd (1600 tpm).

6. Aseptische verzameling van monsters uit reactorputten

1. Prik de verpakking door op zes steriele spuiten van 1 ml en zes steriele naalden van 22 G 3 inch en plaats ze in de anaërobe kamer om 24 uur te ontgassen.
2. Steriliseer de septa bovenop elke reactor onmiddellijk voor de bemonstering met een laboratoriumdoekje van 10% bleekmiddel gedurende ten minste 2 minuten.
3. Verwijder het bleekmiddel laboratoriumdoekje en bevestig onmiddellijk een naald aan een spuit en steek de naald in het midden van de septa van de eerste reactorput.
4. Trek 1 ml van het monster omhoog, verwijder de naald uit de septa en breng het monster over van de spuit naar een gelabelde buis van 1.7 ml voor stroomafwaarts gebruik. De rubberen septa zal zich opnieuw afdichten bij het verwijderen van de naald. Gebruik een nieuwe naald en spuit voor elke reactorput om kruisbesmetting te voorkomen.
5. Als het bovenstaande gewenst is, verwijder dan de buisjes uit de anaërobe kamer en centrifugeer op 20.000 x g gedurende 1 minuut om bacteriële cellen te pelleteren.
6. Breng het bovenstaande over in een apart geëtiketteerde tube van 1,7 ml en bewaar bij -80 °C.

7. Deconstructie en reiniging van het mini-bioreactorsysteem

1. Koppel de bronfles los van de bron-T-stuk en verhoog het debiet (1 ml/min op de bronpomp en 2 ml/min op de afvalpomp) om te beginnen met het legen van de slang. Laat de slang volledig leeglopen. Zet de roerplaat uit.
2. Zodra de slang leeg is, koppelt u de afvalfles los van het afvoerkanaal. Plaats vervolgens de reactoreenheid in de luchtsluis van de anaërobe kamer en verwijder deze uit de kamer.
3. Koppel alle E-LFL 2.06 mm slang- en PTFE-slangsegmenten los en gooi ze weg. Koppel alle fittingen los en plaats ze in een oplossing van 10% bleekmiddel.
4. Verwijder de mini-roerrepen uit elk putje en plaats ze in de bleekoplossing. Keer de reactorarray om om de media te legen in een aparte bleekoplossing van 10% voor desinfectie. Dompel de lege array vervolgens onder in een verse bleekoplossing.
5. Laat alle fittingen en de reactorarray 30 minuten weken in de 10% bleekoplossing (langdurig weken veroorzaakt verkleuring).
6. Spoel de fittingen en de reactorarray af met gedeïoniseerd water en dompel ze vervolgens een nacht onder in een enzymatische wasmiddeloplossing volgens de instructies van de fabrikant.
7. Spoel de fittingen en de reactorarray driemaal af met gedeïoniseerd water en laat ze vervolgens ten minste 3 dagen volledig aan de lucht drogen. Eenmaal droog kunnen de reactorarray en fittingen opnieuw worden gebruikt voor montage.

Resultaten

Fecale monsters werden 2 weken na inoculatie verzameld van muizen die waren gekoloniseerd met menselijke fecale slurry en bewaard bij -80 °C. Het bioreactorsysteem werd opgezet met een continue MEGA-mediastroom voor twee gerepliceerde reactorputten (Figuur 3A). De fecale slurry werd bereid uit de fecale pellets van muizen volgens het protocol beschreven in stap 6, en beide reactoren werden geïnoculeerd door middel van een mo...

Discussie

Het mini-bioreactorsysteem dat in dit protocol wordt beschreven, maakt het mogelijk om onafhankelijke fecale gemeenschappen te kweken voor parallelle experimenten. Dit vermogen om microbiële gemeenschappen te bestuderen zonder onderscheid te maken tussen gastheerfactoren is een essentiële benadering om inzicht te krijgen in het intrinsieke vermogen van micro-organismen om zich aan te passen aan hun omgeving. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast voor de teelt van gedefinieerde bact...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 mL BD Slip Tip Syringe sterile, single use	Fisher Scientific	309659
1/4-28 mm thread to barbed male adaptor (3.2 mm), 5/pack	Cole-Parmer	008NB32-KD5L	Om 1 6-well array te bouwen, heb je 2 packs nodig
10M NaOH (Natriumhydroxide)	Sigma	72068-100ML
2.0ml Screw Cap Tube, NonKnurl, Skirted,Natural, E-Beam Sterile tube w/ attached cap	Fisher Scientific	14-755-228
2mag MIXdrive 60 Stirring Drive	2mag	40060	60-positie magnetische roerplaat (optioneel toevoegen van verwarmingscapaciteit- cat# 40260)
6-well reactor array, ABS-achtig doorschijnend helder plastic	Protolabs	Custom	Zie aanvullende bestanden voor.stl-bestand voor 3D-printen
Absolute ethanol (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818
Azijnzuur, glazuur	Sigma	A6283
Adapter, nylon, mannelijke luer naar 1/4-28 draad, 25/pack	Cole-Parmer	EW-45505-82	Om 1 6-well array te bouwen, heb je 6 (1 pack) nodig
Aluminiumfolie	Fisher Scientific	01-213-100
Anaërobe kamer	Coy Lab Products	Type B
Bel-Art SP Scienceware Flea Micro Spinbar Magnetic Stirring Bars (1/pk)	Fisher Scientific	22-261679	Om 1 6-well array te bouwen, heb je 6  nodig
Bioveiligheidskast klasse 2	Nuaire
Boterzuur	Sigma	B103500
CaCl2 · 2H2O (Calciumchloridedihydraat)	Sigma	C7902
Clorox Healthcare Germicidal Wipes With Bleach, Unscented, 6" x 5", Pack Of 150 Wipes	Office Depot	129202
D-(-)-Fructrose	Sigma	F0127-100G
D-(+)-Cellobiose	Sigma	C7252-100G
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270-100G
D-(+)-Maltosemonohydraat	Sigma	M5885-100G
Drill America Plug Hand Tap DWTP1/4-28	Home Depot	305699489
Dulbecco's Fosfaat Buffered Saline, 1X zonder Ca en Mg, steriele	Genesee	25-508
Vrouwelijke luer × 1/16″ slangenbarb adapter, Nylon, 25/pack	Cole-Parmer	EW-45502-00	Om 1 6-well array te bouwen, heb je 24 (1 pack) nodig
Vrouwelijke luer × 1/8″ slangenbarb adapter, Nylon 25/pack	Cole-Parmer	EW-45502-04	Om 1 6-well array te bouwen, heb je 6 (1 pack) nodig
Vrouwelijke luer × 3/32″ slangenbarb adapter, Nylon, 25/ pack	Cole-Parmer	EW-45502-02	Om 1 6-well array te bouwen, heb je 6 (1 pack) nodig
Vrouwelijke luer tee, Nylon, 25/pack	Cole-Parmer	EW-45502-56	Om 1 6-well array te bouwen, heb je 10 (1 pack) nodig
FeSO4 · 7H2O (IJzer [II] sulfaatheptahydraat)	Sigma	F8633
Hematine	Sigma	H3281
Histidine	Sigma	H7750
Isovalerinezuur	Sigma	129542
K2HPO4 dibasisch (dikaliumbisfosfaat)	Sigma	P2222-1KG
KH2PO4 monobasisch (kaliumdiwaterstoffosfaat)	Sigma	P0662-500G
Grote orificiale pipet tips	Fisher Scientific	02-707-134
L-Cysteïnehydrochloride	Sigma	C1276-10G
Mannelijke luer met vergrendelingsring × 1/8″ slangenbarb adapter, Nylon, 25/pack	Cole-Parmer	EW-45505-04	Om 1 6-well array te bouwen, heb je 42 (2 packs) nodig
Vleesextract	Sigma	70164-500G
Med Vet International Exel Needle, 20G X 1", Hypodermic, 100/Box, 26417	Fisher Scientific	50-209-2532
Menadion (Vitamine K3)	Sigma	M5625
MgSO4 · 7H2O (Magnesiumsulfaatheptahydraat)	Sigma	M1880-500G
Milli-Q water
NaCl (Natriumchloride)	Sigma	S9888-500G
NaHCO3 (Natriumbicarbonaat)	Sigma	S5761-500G
Omnifi t Q-series twee-gats flesdop	Cole-Parmer	00945Q-2	Om 1 6-well array te bouwen, heb je 1 nodig
PMP IPC-N L 24CHNL 8RLR 115V	MasterFlex	ISM939C-115V	24-kanaals peristaltiekpomp, vereist 1 voor bron en 1 voor afval
Precision Seal® rubberen septa, wit, 7 mm O.D. glazen buis (100/pk)	Millipore Sigma	Z553905-100EA	Om 1 6-well array te bouwen, heb je 6 septa nodig
Propionzuur	Sigma	P5561
Pompsuurgaten, 2-stop, Tygon S3 E-Lab, 1,02 mm ID; 12/PK	VWR	MFLX96460-28	Om