Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Genereren van apicaal-out darmorganoïden en beoordeling van de proliferatiesnelheid van organoïden met behulp van EdU-labeling

2.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68039

⸱

28 maart 2025

 ,  ,  ,  , 
1Small Animal Internal Medicine, Department for Small Animals and Horses, University of Veterinary Medicine, 2Cluster of Excellence Physics of Life, TU Dresden, 3Unit for Microbiology, Center for Pathobiology, Department for Biological Sciences and Pathobiology, University of Veterinary Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van apicaal-out darmorganoïden uit standaard matrix-ingebedde organoïde culturen. Het schetst ook de daaropvolgende opname van EdU in actief prolifererende cellen en de semiautomatische kwantificering van EdU-positieve cellen.

Samenvatting

Hier beschrijven we het genereren van drijvende culturen van apicale darmorganoïden uit in hydrogel ingebedde darmorganoïde culturen. Tegelijkertijd worden drijvende basale organoïdeculturen vastgesteld voor directe vergelijking tussen apical-out en basale out-organoïden. Apicale en basale organoïden worden vervolgens onderworpen aan het thymidine-analoog 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), dat tijdens de S-fase van de celdeling in het nieuw gesynthetiseerde DNA wordt geïntegreerd. Deze opname in DNA kan worden gevisualiseerd in morfologisch intacte organoïden met behulp van confocale laserscanningmicroscopie. Cellen gelabeld met Hoechst33342 en EdU worden vervolgens op een halfautomatische manier gekwantificeerd met behulp van beeldanalysesoftware. Berekening van het percentage EdU-positieve cellen van het totale aantal cellen maakt de analyse van celproliferatie in driedimensionale (3D) organoïden mogelijk. Hoewel het protocol hier wordt gebruikt voor de analyse van proliferatie in darmorganoïden, is het ook van toepassing op de analyse van kernspecifieke kleuringen van verschillende soorten in andere organoïden of tweedimensionale celculturen.

Inleiding

Darmorganoïden zijn driedimensionale in vitro modellen die het darmepitheel recapituleren dat bestaat uit verschillende celtypen. Deze organoïden kunnen gemakkelijk worden vastgesteld uit volwassen stamcellen die zijn geïsoleerd uit darmcrypten1. Omdat organoïden veel dichter bij het in vivo epitheel staan, worden ze steeds belangrijker in biomedisch onderzoek. Organoïden van de darm worden niet alleen gebruikt voor de analyse van fysiologische mechanismen (bijv. darmniche signalering 2,3 en celdifferentiatie 4,5) maar ook voor onderzoek naar infectieziekten 6,7. Het kweken van gepolariseerde cellen in 3D die een centraal lumen omsluiten, is echter een uitdaging, omdat het apicale celoppervlak ontoegankelijk wordt binnen het organoïde lumen. Het onderzoeken van de verschillen tussen apicale en basolaterale celoppervlakken kan belangrijk zijn in metabole studies, zoals geïllustreerd door verschillen in vetzuuropname8 en onderzoek naar infectieziekten 9,10,11,12.

Het genereren van zogenaamde apical-out organoïden is een gemakkelijke optie om dit probleem op te lossen. Door de extracellulaire matrix uit standaard organoïdeculturen (d.w.z. basale, in de matrix ingebedde organoïden) te verwijderen en deze organoïden in een matrixvrij medium te zaaien, kan een polariteitswisseling worden geïnduceerd9.

Zoals we eerder hebben gepubliceerd, keren de meeste organoïden hun polariteit binnen 12 uur om. Het duurt echter 48-72 uur om een cultuur te verkrijgen met meer dan 90% apicale organoïden. Ondanks hun voordeel dat ze toegang tot het apicale celoppervlak mogelijk maken, vertonen apicale organoïden een significant verminderde proliferatie na omkering van de polariteit, terwijl de celdoodsnelheid toeneemt13. De factor van proliferatieve activiteit kan een verstorende variabele zijn in verschillende analyses en moet in gedachten worden gehouden bij het ontwerpen van een experiment.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het opzetten van intestinale apical-out organoïdeculturen en drijvende basale controleorganoïden voor stroomafwaartse analyses. Verder beschrijven we labeling met 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), opgenomen in nieuw gesynthetiseerd DNA en zo actief prolifererende cellen markeren. Verder beschrijven we de halfautomatische beeldanalyse van de proliferatiesnelheid van de organoïden met behulp van de software arivis Pro (Zeiss) door kwantificering van EdU+ cellen. Een schema van het proces wordt geschetst in figuur 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Volwassen stamcellen afgeleide darmorganoïden van honden, vastgesteld volgens Kramer et al., 202014 werden gebruikt. Op basis van de richtlijnen van de ethische commissie van de instelling is het gebruik van weefselmateriaal dat is verzameld tijdens therapeutische excisie of post-mortem opgenomen in de 'owner's consent for treatment' van de universiteit, die door alle patiënteigenaren is ondertekend.

1. Organoïde cultuur

  1. Kweek volwassen stamcel-afgeleide darmorganoïden ingebed in de basaalmembraanextract (BME)-matrix naar keuze in platen met 24 putjes en splits ze mechanisch met behulp van glazen pipetten, zoals in detail beschreven in Pleguezuelos et al., 202015.
    OPMERKING: Voor het hier beschreven protocol werd Geltrex gebruikt als de BME.
  2. Verwijder voorzichtig het geraffineerde medium (Tabel 1) van de in BME ingebedde organoïden.
  3. Voeg 500 μl 0,05 % trypsine-EDTA per putje toe en maak alle matrixkoepels los van het putje door herhaaldelijk op en neer te pipetteren. Breng de organoïden over in een tube van 15 ml en suspendeer goed om de hydrogelmatrix volledig te dissociëren.
  4. Incubeer organoïden met 0,05 % trypsine-EDTA bij 37 °C in een waterbad totdat alle organoïden zijn gedissocieerd in afzonderlijke cellen of kleine clusters van cellen.
  5. Verdun de trypsine/celsuspensie met basaal medium (tabel 1). Gebruik minstens twee keer zoveel basaal medium als trypsine.
  6. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 8 °C bij 420 × g . Verwijder zoveel mogelijk bovenmiddel.
  7. Zaadcellen ingebed in BME in evenveel putjes als werden gebruikt voor trypsinisatie in stap 1.3. en voorzie hen van geraffineerd medium (Tabel 1).
  8. Incubeer de cellen gedurende 3 dagen in een celkweekincubator en ga verder met stap 2.1.

2. Inductie van polariteitsomkering en EdU-labeling

  1. Verwijder voorzichtig het medium van de in BME ingebedde organoïden.
  2. Voeg 500 μL organoïde oogstoplossing toe aan elk putje en maak alle matrixkoepels los van het putje door herhaaldelijk op en neer te pipetteren. Breng de organoïden over in een tube van 15 ml en suspendeer goed om de hydrogelmatrix volledig te dissociëren.
  3. Incubeer de tube van 15 ml gedurende 1,5 uur op ijs. Schud de tube elke 10 minuten goed om klonteren van de organoïden te voorkomen en zorg voor een gelijkmatige dissociatie van de resterende hydrogelcomponenten.
  4. Smeer tijdens de incubatie een plaat met 96 putjes in met anti-kleefoplossing. Voor elk putje van een plaat met 24 putjes die in stap 1.3 is getrypsineerd, bedek je 8 putjes van een plaat met 96 putjes. Incubeer gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur (RT).
  5. Voeg ten minste tweemaal zoveel PBS toe aan de buis van 15 ml als de organische oogstoplossing is gebruikt en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 8 °C bij 150 × g .
  6. Verwijder het bovenstaande en suspendeer de organoïden opnieuw in 1 ml PBS.
  7. Breng 500 μL van de organoïde/PBS-suspensie over in een afzonderlijke buis van 15 ml en centrifugeer beide buizen opnieuw bij 8 °C bij 150 × g gedurende 5 min.
  8. Verwijder alle anti-kleefvloeistof van de plaat met 96 putjes.
  9. Verwijder na het centrifugeren zoveel mogelijk overvloeimiddel.
  10. Gebruik een van de buisjes voor het genereren van drijvende basale uit (BO) organoïden en de andere buis voor apical-out (AO) organoïden.
  11. Voeg voor BO-organoïden 100 μL geraffineerd medium met 7,5% BME per putje van de 96-wells plaat toe aan één buisje. Meng goed en verdeel de organoïden gelijkmatig over het gewenste aantal putjes van de voorgecoate 96-wells plaat.
  12. Voeg voor AO-organoïden 100 μL gewoon geraffineerd medium (zonder toevoeging van BME) per putje van de 96-wells plaat toe aan de andere buis. Meng goed en verdeel de organoïden gelijkmatig over het gewenste aantal putjes van de voorgecoate 96-wells plaat.
  13. Incubeer de organoïden gedurende 3 dagen bij 37 °C en 5% CO2.
    OPMERKING: Morfologische verschillen zullen na dag 1 zichtbaar worden. Eerder gepubliceerde resultaten laten echter zien dat het ongeveer 3 dagen duurt voordat de overgrote meerderheid van de organoïden apicale uitpolariteit13 vertoont.
  14. Voeg op gedefinieerde tijdstippen, bijv. 24 uur/48 uur/72 uur na inductie van de polariteitsomkering, 50 μL 3 μM EdU verdund in geraffineerd medium toe aan alle putjes met organoïden die moeten worden geëtiketteerd, om een uiteindelijke concentratie van 1 μM EdU in elk putje te krijgen.
  15. Incubeer gedurende 1,5 uur bij 37 °C en 5% CO2 .
  16. Verzamel EdU-gelabelde organoïden met behulp van tips met brede boring en breng ze over in een tube van 15 ml.
  17. Voeg een gelijke hoeveelheid van 4% PFA toe aan elke buis (BO- en AO-organoïden; uiteindelijke concentratie PFA = 2%) en meng voorzichtig.
  18. Incubeer 15 minuten bij RT.
  19. Voeg ten minste tweemaal de hoeveelheid PBS toe als er volume in de buis van 15 ml zit en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 8 °C bij 80 × g .
  20. Verwijder het bovenstaande en suspendeer de organoïden opnieuw in 1 ml PBS.
  21. Centrifugeer opnieuw bij 8 °C bij 80 × g gedurende 5 min.
  22. Verwijder de supernatant, suspendeer de organoïden opnieuw in 1 ml PBS en breng ze over in een tube van 1,5 ml. Bewaar de organoïden bij 4 °C totdat de EdU-kleuringsreactie wordt uitgevoerd (zie rubriek 3).
  23. Herhaal stap 2.14-2.22 voor elk te analyseren tijdstip.

3. Click-it EdU-kleuringsreactie en Hoechst 33342-kleuring

  1. Centrifugeer de vaste organoïden (vanaf stap 2.22.) in een tube van 1,5 ml bij 4 °C bij 50 × g gedurende 5 min.
  2. Verwijder het bovenstaande en resusinfecteer de organoïden in 1 ml 3% runderserumalbumine (BSA) verdund in PBS met behulp van tips met brede boring.
  3. Herhaal stap 3.1. en 3.2 (stappen wassen).
  4. Verwijder het bovenstaande en suspendeer de organoïden opnieuw in 1 ml 0,5% Triton X-100 verdund in PBS.
  5. Incubeer 20 minuten bij RT.
  6. Centrifugeer organoïden bij RT bij 50 × g gedurende 5 min.
  7. Bereid in een verse tube 1x Buffer Additief door 45 μL H2O te mengen met 5 μL 10x Buffer Additief.
  8. Bereid in een andere buis de reactiecocktail door de volgende componenten te mengen: 385,8 μl H2O, 43 μl 10x reactiebuffer, 20 μl CuSO 4,1,2 μl Alexa Fluor 647 azide en 50 μl o 1x bufferadditief (vanaf stap 3.7.).
    OPMERKING: Dit mengsel is voldoende voor vijf reacties en kan worden opgeschaald en verkleind afhankelijk van het vereiste aantal kleuringsreacties.
  9. Herhaal stap 3.1. en 3.2. twee keer (wasstappen).
  10. Verwijder het bovenstaande en voeg 100 μL Reaction Cocktail (stap 3.8.) toe aan elk buisje met organoïden.
  11. Incubeer 30 minuten bij RT in het donker.
  12. Herhaal stap 3.1. en 3.2 (stappen wassen).
  13. Centrifugeer organoïden bij 50 × g gedurende 5 minuten bij RT.
  14. Resuspendeer organoïden in 1 ml 10 μg/ml Hoechst33342 verdund in PBS.
  15. Incubeer 45 minuten bij RT in het donker.
  16. Herhaal stap 3.1. en 3.2 (stappen wassen).
  17. Centrifugeer de organoïden 5 minuten bij 50 × g bij 4 °C.
  18. Zaad organoïden in de BME-matrix van uw keuze in een dia die compatibel is met confocale microscopie (bijv. μ-Slide 18 well)
  19. Beeld organoïden af onder een confocale microscoop.

4. Halfautomatische beeldanalyse

OPMERKING: Voor deze analyse is arivis Pro versie 4.2.2 (beeldanalysesoftware) gebruikt.

  1. Importeer de confocale microscoopbeelden in de beeldanalysesoftware en definieer een map waarin het analysebestand wordt opgeslagen. Gebruik de optie Afbeeldingen als tijdstippen om meerdere afbeeldingen te importeren (foto's repliceren, verschillende tijdstippen, verschillende behandelingen, enz.). Elke afbeelding wordt dan behandeld als een enkel tijdstip, waardoor gemakkelijk tussen de afzonderlijke afbeeldingen kan worden geschakeld.
  2. Open het analysepaneel en importeer de analysepijplijn die is geleverd als aanvullend bestand 1 (arivis_EdU_pipeline).
  3. Gebruik de tool Nieuwe objecten plaatsen en de bol met de tag Organoïde om alle goed gescheiden organoïden eenvoudig te omcirkelen.
  4. Schakel over naar de volgende afbeelding, d.w.z. het volgende tijdstip, en ga verder met het markeren van organoïden voor alle afbeeldingen.
  5. Voor organoïden die heel dicht bij elkaar staan en dus niet gescheiden kunnen worden met de Sphere-modus , open je de objectenlijst en activeer je de tag Organoid.
  6. Blijf het gereedschap Objecten tekenen in de modus Veelhoek gebruiken om organoïde contouren met de hand te markeren.
    OPMERKING: In de objectenlijst zijn alle organoïden nu gemarkeerd en toegewezen aan een specifiek tijdstip. Dit tijdstip komt overeen met de volgorde van de afbeeldingen die in stap 4.1 zijn geïmporteerd. Deze tijdstippen kunnen nu desgewenst worden hernoemd zodat ze overeenkomen met de oorspronkelijke afbeeldingsnaam.
  7. Markeer in de objectenlijst alle objecten (=organoïden) en klik met de rechtermuisknop en klik vervolgens op Tags verwijderen om de handmatige tag van alle objecten te verwijderen.
  8. Deactiveer de Organoid-tag in de objectenlijst en markeer alle gebieden binnen eerder gedefinieerde objecten die moeten worden uitgesloten van de analyse met behulp van de tool Objecten tekenen in de Polygoonmodus . Deze gebieden kunnen dode cellen in het organoïde lumen of wazige gebieden bevatten, die de analyse kunnen vertekenen.
  9. Zorg er bij het openen van de objectenlijst voor dat alle organoïden worden vermeld met de Organoid-tag en dat alle gebieden die moeten worden uitgesloten de tag Handleiding hebben.
  10. Start de analysepijplijn door op de pijl in het deelvenster linksboven te klikken.
    OPMERKING: De software segmenteert nu alle kernen in de Hoechst33342- en EdU-kanalen. Deze analysepijplijn houdt alleen rekening met gesegmenteerde Hoechst33342+ en EdU+- kernen groter dan 15μm2 (d.w.z. oppervlakte in het kernsegment) om ervoor te zorgen dat kleine kernen, hoogstwaarschijnlijk afkomstig van dode cellen, worden uitgesloten van de analyse.
  11. U kunt de resultaten van de analyse in de objectenlijst vinden door op de tag Functiekolommen te klikken.
  12. Schakel over naar de hoofddetailweergave en selecteer de Organoids-tag in het bovenste paneel en de functie Eerste keerpunt.
  13. Selecteer in het onderste paneel de kenmerken die u per organoïde wilt weergeven. Gebruik projectiegebied (x/y/z) (voxel), gemiddelde intensiteit # 1 (EdU-kanaal) en SD-intensiteit #1.
  14. Exporteer de resultaten (Master Detail Report) met behulp van de Excel Export-functie .
  15. Sla het analysebestand op en sluit de software.

5. Bepaling van de proliferatiesnelheid van organoïden

  1. Open het bestand met het hoofddetailrapport dat in stap 4.14 is geëxporteerd.
  2. Er is één apart tabblad voor elke geanalyseerde afbeelding. Bereken de oppervlakte/voxel-som voor kernen en EdU-kleuring voor elke afbeelding. Kopieer vervolgens alle resulterende gegevens naar een nieuw collectief tabblad en groepeer alle gegevens die naar hetzelfde tijdstip verwijzen.
  3. Bereken vervolgens de totale oppervlakte van celkernen (d.w.z. de som van het Hoechst33342+ -gebied en het EdU+ -gebied) voor elk beeld.
  4. Deel vervolgens de totale oppervlakte zelf (= 100%) en de gemiddelde EdU+ oppervlakte door de totale oppervlakte (=percentage EdU+ DNA).
  5. Zet het percentage proliferatief DNA van BO- en AO-organoïden uit op de y-as en de verschillende tijdstippen op de x-as.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Organoïden die gedurende 3 dagen na trypsinisatie worden gekweekt, moeten idealiter tussen 50-250 μm zijn, zoals weergegeven in figuur 2A. Organoïden die aanzienlijk groter zijn dan dit, kunnen hun polariteit niet efficiënt omkeren. Grotere organoïden kunnen ook gaan uitlopen, en we hebben gemerkt dat deze organoïden ook problemen kunnen hebben met het efficiënt omkeren van de polariteit. Basale en apicale organoïden vertonen al duidelij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft in detail hoe polariteitsomkering kan worden geïnduceerd in standaard van volwassen stamcellen afgeleide darmorganoïde culturen. Apicale organoïden dienen om toegang te krijgen tot het apicale celoppervlak, dat meestal gericht is op het organoïde lumen. Het kunnen onderzoeken van het apicale oppervlak kan voor bepaalde toepassingen van groot belang zijn, aangezien dit het deel van het celmembraan is dat onder fysiologische omstandigheden in vivo wordt blo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund met behulp van middelen van de VetImaging Core Facility (VetCore, Vetmeduni, Oostenrijk). We willen Ursula Reichart bedanken voor haar steun bij semi-kwantitatieve beeldanalyse. GC is een ontvanger van een DOC-fellowship (beursnummer 26349) van de Oostenrijkse Academie van Wetenschappen (ÖAW) bij de afdeling Inwendige Geneeskunde voor Kleine Huisdieren van Vetmeduni.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24 well platesBiologix07-6024
[Leu15]-Gastrin I human, ≥95% (HPLC)Sigma-AldrichG-9145
µ-Slide 18 Well Glass Bottomibidi81817
100X Penicillin-Streptomycin supplement for MediaGibco/Thermo15140122
A 83-01 Tocris Bioscience2939/10 
Anti-Adherence Rinsing SolutionStemCell Technologies7010
arivis Pro ZeissVersion 4.2.2
B27 SerumFree Supplement (50X), liquidGibco/Thermo17504044
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)Abcamab145597
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7906-100G
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dyeThermo ScientificC10340
DMEM-F12Gibco/Thermo11320033
GeltrexGibco/ThermoA1413202
GlutaMAX Supplement Gibco/Thermo35050061
HEPES Buffer Solution 1 M, liquidGibco/Thermo15630056
Human FGF-basicPeproTech100-18B-100µG
Human HGF PeproTech100-39-100µG 
Human IGF-I PeproTech100-11-100µG
Human NOGGIN (Mammalian) PeproTech120-10C-200µG 
N-Acetyl-L-cysteine,cell culture tested, BioReagent Sigma-AldrichA9165-5G 
Organoid Harvesting SolutionThermoC10340
Triton(TM) X-100,for molecular biologySigma-AldrichT8787-250ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco/Thermo25300054

Referenties

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  2. Li, Y., et al. BMP suppresses Wnt signaling via the Bcl11b-regulated NuRD complex to maintain intestinal stem cells. EMBO J. 43 (23), 6032-6051 (2024).
  3. Gaowa, A., Leangpanich, S., Park, E. J., Kawamoto, E., Shimaoka, M. Irisin promotes intestinal epithelial cell proliferation via Wnt/β-catenin and focal adhesion kinase signaling pathways. Sci Rep. 14, 25702(2024).
  4. Basak, O., et al. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190 (2017).
  5. Ludikhuize, M. C., et al. Mitochondria define intestinal stem cell differentiation downstream of a FOXO/Notch axis. Cell Metab. 32 (5), 889-900.e7 (2020).
  6. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science (1979). 353 (6306), 1387-1393 (2016).
  7. Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nat Med. 26 (7), 1077-1083 (2020).
  8. Joo, S. -S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals. 12 (3), 372(2022).
  9. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Rep. 26, 2509-2520.e4 (2019).
  10. Sasaki, N., et al. Development of a scalable coculture system for gut anaerobes and human colon epithelium. Gastroenterology. 159 (1), 388-390.e5 (2020).
  11. Mayorgas, A., et al. A novel strategy to study the invasive capability of adherent-invasive escherichia coli by using human primary organoid-derived epithelial monolayers. Front Immunol. 12, 646906(2021).
  12. Csukovich, G., et al. Neutralising effects of different antibodies on clostridioides difficile toxins TcdA and TcdB in a translational approach. Int J Mol Sci. 24 (4), 3867(2023).
  13. Csukovich, G., et al. Polarity reversal of canine intestinal organoids reduces proliferation and increases cell death. Cell Prolif. 57 (2), e13544(2023).
  14. Kramer, N., et al. Generation of differentiating and long-living intestinal organoids reflecting the cellular diversity of canine intestine. Cells. 9 (4), 822(2020).
  15. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).
  16. Dutta, D., Heo, I., O'Connor, R. Studying infection in 3D tissue-derived human organoid culture systems by microinjection. J Vis Exp. (151), e59610(2019).
  17. Kumar, A., et al. Decreased SLC26A3 expression and function in intestinal epithelial cells in response to Cryptosporidium parvum infection. Am J Physiol Cell Physiol. 317 (6), C1205-C1212 (2019).
  18. Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Curr Opin Immunol. 48, 15-22 (2017).
  19. Csukovich, G., Pratscher, B., Burgener, I. A. The world of organoids: Gastrointestinal disease modelling in the age of 3R and one health with specific relevance to dogs and cats. Animals. 12 (18), 2461(2022).
  20. Han, X., et al. Creating a more perfect union: Modeling intestinal bacteria-epithelial interactions using organoids. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 12 (2), 769-782 (2021).
  21. Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. J Virol. 94 (21), e01006-e01020 (2020).
  22. Smith, D., et al. The development of ovine gastric and intestinal organoids for studying ruminant host-pathogen interactions. Front Cell Infect Microbiol. 11, 733811(2021).
  23. Nash, T. J., Morris, K. M., Mabbott, N. A., Vervelde, L. Inside-out chicken enteroids with leukocyte component as a model to study host-pathogen interactions. Commun Biol. 4 (1), 377(2021).
  24. Hanson, K. I., Weiss, A. A. Intestinal tissue response to Shiga toxin exposure. mBio. 15 (9), e0123224(2024).
  25. Hovhannisyan, P., et al. Infection of human organoids supports an intestinal niche for Chlamydia trachomatis. PLoS Pathog. 20 (8), e1012144(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Apicaal-uit organoïdenbasaal-uit organoïdenconfocale microscopiedrijvende organoïdcultuuromkering van celpolariteitkernkleuringsoftware voor beeldanalyse
Genereren van apicaal-out darmorganoïden en beoordeling van de proliferatiesnelheid van organoïden met behulp van EdU-labeling
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.