Deze studie presenteert een methodologie voor de toediening van therapieën in het netvlies en de oogzenuwen van de volwassen rat. Daarnaast wordt een unieke methode voor weefselverzameling geïntroduceerd voor een top-down en bloc verzameling van de oogzenuw en het netvlies bij een volwassen rat.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Oculaire therapeutische toediening en geavanceerde weefselafname bij volwassen ratten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Therapeutische toediening aan het achterste deel van het oog, inclusief het netvlies en de oogzenuw, wordt bemoeilijkt door de aanwezigheid van bloed-hersen- en bloed-retinale barrières. Kleine diermodellen, zoals ratten, worden gebruikt voor het bestuderen van verschillende oculaire pathologieën. Hoewel therapeutische toediening aan het achterste oog een uitdaging is, is het bereiken ervan essentieel voor de behandeling van oogaandoeningen, waarvan er vele validatie in kleine diermodellen vereisen voor translationele relevantie. Daarom worden twee posterieure therapeutische toedieningstechnieken gepresenteerd: intravitreale injectie (IVI) en retrobulbaire injectie (RBI) voor gebruik bij volwassen ratten. Daarnaast wordt een methode geïntroduceerd voor de en bloc verwijdering van de ogen en oogzenuwen voor verschillende histologische en moleculaire analysetechnieken. Het dissectieprotocol maakt volledige observatie van het neurovisuele systeem mogelijk, terwijl postmortale schade aan netvlies- en oogzenuwweefsel tot een minimum wordt beperkt. Succesvolle toediening van de therapeutische ciclosporine aan het netvlies en de oogzenuw werd bereikt, waarbij detecteerbare concentraties vierentwintig uur na injectie werden waargenomen met behulp van zowel IVI als RBI. Bovendien werden en bloc netvlies- en zenuwmonsters met succes geëxtraheerd voor volledige histologische weefselanalyse van het oog, waardoor uitgebreide observatie van het netvlies en het bredere neurovisuele systeem mogelijk werd.
Inleiding
Het toedienen van therapieën aan het netvlies en de oogzenuw is ongelooflijk moeilijk vanwege de complexe anatomie van het oog 1,2, met name de aanwezigheid van de bloed-retinale barrière (BRB)3,4,5. De BRB dient om het netvlies te beschermen tegen invasie van de systemische circulatie, maar is een uitdagende tegenstander van therapeutische toediening, aangezien de systemische therapeutische circulatie vaak wordt geblokkeerd door de BRB 6,7. Kleine lipofiele moleculen kunnen gemakkelijk door de BRB diffunderen, maar grotere en hydrofiele moleculen hebben het moeilijker om toegang te krijgen tot het netvlies6. Intravitreale (IVI) en retrobulbaire (RBI) injecties maken de toediening van medicijnen aan de oogweefsels mogelijk, waardoor de beperkingen van de BRB worden overwonnen. De IVI dient als een veelbelovend compromis door therapieën toe te dienen in de interne omgeving van het oog 8,9. Deze methode vereist dat het medicijn het glasvocht passeert, waardoor de BRB wordt omzeild, en door het netvlies en het vaatvlies wordt verspreid om de oogzenuw7 te bereiken. De RBI wordt achter het oog afgeleverd in de retrobulbaire ruimte10. Therapieën kunnen worden toegediend door diffusie door de weefsels en klieren in de retrobulbaire ruimte, waardoor de oogzenuw en de omliggende structuren worden aangetast zonder rechtstreeks het netvlies binnen te dringen, dat de integriteit van de BRB behoudt. Door geneesmiddelen direct of indirect in het oog toe te dienen, kunnen zowel intravitreale als retrobulbaire injecties hogere lokale concentraties van het therapeutische geneesmiddel bereiken, wat de effectiviteit ervan verbetert in vergelijking met lokale of systemische toediening (oraal of intraveneus)2. Dit is vooral belangrijk voor behandelingen die een snelle werking of een hoge potentie vereisen, zoals bij veel oogaandoeningen. Gerichte toediening beperkt ook de blootstelling van de rest van het lichaam aan het medicijn, wat het risico op off-target effecten vermindert en helpt om mogelijke nadelige effecten te minimaliseren die kunnen optreden wanneer medicijnen topisch, oraal of intraveneus worden toegediend11.
Andere perioculaire injecties, zoals subconjunctivaal, posterieure subtenon en subretinaal, hebben hun eigen voordelen en beperkingen 2,5. Er is waargenomen dat posterieure subtenon-injecties hoge geneesmiddelconcentraties afgeven aan oogweefsels; De subtenoninjectie bevindt zich echter dichter bij de sclerale injectie dan de orbitale vassculartuur 5,12. Daarentegen plaatst de RBI het therapeutische dichter bij de oogzenuw dan het achterste subtenon of subconjunctivale13. Dit kan betekenen dat oogzenuwpathologieën de voorkeur geven aan RBI-geleverde therapieën boven andere soorten perioculaire injecties. Posterieure subtenon-injecties hebben bijbehorende risico's, waaronder scheelzien, hyphema en verhoogde intraoculaire druk5. Verhoogde intraoculaire druk is ook een gerapporteerde risicofactor bij IVI-, subconjunctivale en subretinale injecties2. Deze soorten injecties vereisen vaak herhaalde dosering om het gewenste therapeutische effect te bereiken2. Andere risicofactoren die verband houden met subretinale injecties, subconjunctivale injecties en IVI zijn staarvorming, netvliesbloeding, netvliesloslating en ontsteking2. Deze IVI-injecties, subretinale injecties en subconjunctivale injecties zijn invasiever dan de RBI-injecties, aangezien deze injecties intraoculair2 zijn. De RBI kan als minder invasief worden beschouwd omdat het het therapeutische middel in de retrobulbaire ruimte plaatst, zonder de naald rechtstreeks in de oogbol te brengen. Andere, minder invasieve therapeutische toedieningsstrategieën, zoals lokale toediening, voldoen niet aan voldoende medicijnafgifte, waarbij minder dan 5% van het geneesmiddel op het oogoppervlak wordt vastgehouden 2,5.
IVI is een prominente techniek in preklinische modellen die wordt gebruikt vanwege het vermogen om therapeutische middelen rechtstreeks in het achterste segment van het oog af te leveren. IVI levert het medicijn rechtstreeks aan het glasvocht, waardoor het een voorkeurstoedieningstechniek is voor gelokaliseerde behandeling14. De IVI-techniek stelt het therapeutisch middel in staat om de bloed-retinale barrière te omzeilen, wat een veel voorkomende belemmering is voor het binnendringen van geneesmiddelen in het netvlies14. IVI introduceert de mogelijkheid van ontsteking en schade aan oogstructuren, dus nauwgezette naleving van de procedure moet worden toegepast14. Om netvliesloslating en staarvorming tot een minimum te beperken, beschrijven Chiu et al. een IVI-benadering die de nadruk legt op het inbrengen en injecteren van een schuine afschuining van 45 graden ter hoogte van de par plana, waarbij de lens, het netvlies, de oogspier en de bloedvatenworden vermeden 15. Bij deze techniek wordt een naald van 30 G in de neussclera ingebracht voor therapeutische toediening15. IVI wordt nog steeds in verband gebracht met risico's vanwege het invasieve karakter. Mogelijke risico's zijn onder meer netvliesloslating, staarvorming, endoftalmitis of bloeding16. Het invasieve karakter van IVI-technieken verhoogt ook de intraoculaire druk, zoals blijkt uit een experiment met varkensogen uitgevoerd door Ikjong Park et al.16. De studie toont veranderingen in de intraoculaire druk tijdens verschillende stadia van het inbrengen van de naald en vloeistofinjectie. Ze rapporteren een substantiële variatie in intraoculaire druk tijdens de procedure16.
RBI's zijn in eerdere onderzoeken met succes gebruikt als middel voor therapeutische toediening aan knaagdieren. Een van die studies vergeleek de effecten van verschillende prostaglandine-analogen die via RBI17 werden toegediend. Albinoratten kregen een RBI met een naald van 26 G van 0,1 ml injectaat dat door het laterale gebied van de inferieure fornix werd ingebracht in een hoek van 45 graden17. Het protocol dat in deze studie werd gebruikt, is aangepast van een eerder beschreven methode waarbij de ratten werden verdoofd via intraperitoneale (IP) injectie van chloralhydraat18. Een andere studie uitgevoerd op ratten vergeleek topische druppels met retrobulbaire injecties19. De ratten werden verdoofd via een IP-injectie van ketamine/xylazine en de RBI werd toegediend via een naald van 30 G19. In tegenstelling tot de eerder besproken sedatiemethoden, gebruikte een studie die de effecten van RBI op orbitaal vet observeerde, inhalatie-isofluraan om de ratten te verdoven voorafgaand aan RBI20. Hoewel deze onderzoeken inzicht geven in welke anesthetica en naaldspecificaties succesvol zouden kunnen zijn, wordt de positionering en behandeling van de dieren tijdens de procedure niet besproken.
Verschillende onderzoeken bij muizen voeren ook RBI's uit voor therapeutische toedieningsmethoden. In één studie werd RBI vergeleken met injectie van de laterale staartader voor het succesvol induceren van nefrotisch syndroom21. In een tweede studie werden ook dezelfde twee injectietechnieken vergeleken bij de toediening van contrastmiddelen voor cardiale beeldvorming22. De muizen werden verdoofd met inhalatie-isofluraan en geïnjecteerd in de mediale zijde van het oog22. Beide studies pasten hun RBI-methode aan van een eerder geschreven protocol. Het is belangrijk op te merken dat dit protocol hun injectie als retro-orbitaal noemde, maar de injectieplaats beschreef als de retrobulbaire ruimte achter het oog. De auteurs van dit protocol gebruikten inhalatie-isofluraan als een geprefereerde sedatiemethode, waarbij ze de snelle activerings- en hersteltijd van de muizen opmerkten23. Bij een RBI stak het oog gedeeltelijk uit de oogkas door druk uit te oefenen op de huid rond het oog23. Vervolgens werd de naald in een hoek van 30 graden aan de mediale canthus schuine kant naar beneden ingebracht en ingebracht totdat deze de basis van het oog bereikte23. Voorzichtigheid is geboden bij het uitoefenen van druk op het dier, aangezien onbedoelde blokkering van de bloedstroom of tracheale collaps kan optreden23. De injector is bij het inbrengen ook blind voor de naaldpunt, waardoor beschadiging van het oog een bijbehorend risico is. 23 Beschadiging van het oog bij therapeutische toediening is een kritiek risico in dit experiment, aangezien het veroorzaken van extra letsel de resultaten van het onderzoek rechtstreeks ondermijnt. Er moet ook worden opgemerkt dat de eerder beschreven positionerings- en hanteertechniek werd uitgevoerd op muizen en geen opmerkingen bevatte over de toepasbaarheid op ratten.
Er zijn veel manieren waarop is geprobeerd de oogzenuw en het netvlies te verwijderen. Een van die methoden onderzocht de verwijdering van oogzenuwen en ogen en bloc, waardoor een intact optisch chiasma behouden bleef24. Deze methode is het meest vergelijkbaar met de huidige studie, aangezien de individuele ogen en oogzenuwen ook worden bewaard voor verwijdering en bloc; Het optische chiasma is echter gescheiden. Voorzichtigheid betrachten bij deze procedure zou van het grootste belang zijn vanwege de complexiteit van de procedure. Bij de huidige methode beginnen we de dissectie via de staartschedel en werken we rostraal om toegang te bieden op een manier die schade aan de oogzenuwen beperkt en de hele zenuw intact laat. Bovendien is het van cruciaal belang om de zenuw intact te houden en aan het oog vast te houden voor het inbeddingsproces, aangezien schade aan elk deel van de zenuw kan overeenkomen met een andere pathologische observatie24. De oriëntatie van de oogzenuw is belangrijk om te overwegen, omdat de manier waarop deze is ingebed verschillende dwarsdoorsneden mogelijk maakt, wat belangrijk kan zijn voor histologische analyse.
Een op maat gemaakt apparaat dat bekend staat als de oogheelkundige operatietafel voor kleine dieren (SALOOT, een platform voor oogheelkundige chirurgie) bestaat uit een reeks 3D-geprinte materialen om anesthesie te bieden en het dier in een stabiele positie te houden voor oculaire therapeutische injecties. Het SALOOT-ontwerp zorgt voor stabiliteit van het hoofd en de oculaire structuren voor oogheelkundige ingrepen, wat de snelheid en reproduceerbaarheid van operaties verbetert, terwijl gasanesthesietoediening en het opruimen van uitademingsdeeltjes mogelijk is. De SALOOT is een driedimensionaal geprint blok met een concave reductie om het lichaam van de rat vast te houden met een smaller gebied aan de voorkant om de kop van het dier in een neuskegel met een isofluraaninlaat te houden. Onder de neuskegel bevindt zich een klein reservoir en uitlaat. De volgende methoden zijn ontwikkeld voor therapeutische oculaire toediening en nauwkeurige verwijdering van oogweefsel; Ze zijn ontworpen voor het bestuderen van weefsels na oculair trauma, dus het is van cruciaal belang om de effecten van het trauma, de injectie, de behandeling en de dissectie af te bakenen om verwarde interpretatie van bevindingen te voorkomen.
In dit artikel worden twee oculaire therapeutische injectiemethoden gepresenteerd, de intravitreale en retrobulbaire injecties, voor gebruik bij volwassen ratten. Daarnaast wordt een methode voor weefselafname gepresenteerd voor de en bloc verwijdering van de intacte oogzenuw en het netvlies van een volwassen rat. Deze technieken maken het mogelijk om de oculaire en peri-oculaire effecten van geïnduceerde pathologie en behandeling te onderzoeken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visueel onderzoek en goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierenverzorging en -gebruik van de Ohio State University. Mannelijke Sprague Dawley-ratten met een gewicht van ~ 200 g en een leeftijd van ongeveer 2 maanden werden gebruikt voor deze studie25. Nadere gegevens over de gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Intravitreale injectie (IVI)
- Sluit de isofluraan en de afvoerdraden aan op de SALOOT-bevestigingspoorten. Verdoving het dier met behulp van standaard isofluraanprocedures volgens de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visueel onderzoek en het goedgekeurde IACUC-protocol.
OPMERKING: Als het dier al onder narcose was van een andere oogheelkundige testsessie (d.w.z. ketamine/xylazine-mix; 90 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine), breng het dier dan over naar het oogheelkundig chirurgieplatform en titreer de anesthesie met isofluraan (3 zuurstof: 3 isofluraan verhouding) om ervoor te zorgen dat de anesthesie voldoende diep blijft. - Plaats het platform voor oogheelkundige chirurgie met het verdoofde dier onder een live opererende microscoop. Beoordeel de anesthesiediepte via de pedaalterugtrekkingsreflex.
- Breng één tot twee druppels 0,5% tetracaïnehydrochloride oogheelkundige oplossing aan in het oog of de ogen die worden geopereerd. Breng smerende topische oogzalf zoals hypromellose 0,3% aan op het contralaterale oog als er geen manipulatie hoeft te worden uitgevoerd.
- Gebruik vervolgens een tot twee druppels 5% povidon-jodium op het oogoppervlak en breng met een wattenstaafje povidon-jodium aan op de huid rond het oog.
- Gebruik een spuit van 10 μl met een naald van 33 g met een stijl 4-punt met een lengte van 10 mm en een hoek van 15 graden en zuig 0,9% bacteriostatisch natriumchloride op. Spoel de spuit en naald met de zoutoplossing voordat u de naald in een hete kralensterilisator dompelt.
- Laat het afkoelen voordat je verder gaat. Nadat de naald is afgekoeld, trekt u het betreffende geneesmiddel op tot de gewenste hoeveelheid (4 μL).
OPMERKING: Voor proof of concept-studies werden niet-verdunde tatoeage-inkt en Evan's Blue-kleurstof in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gebruikt. Evan's Blue-poeder werd gemengd met PBS tot het ondoorzichtig was. Voor therapeutische proof-of-concept-studies werden de volgende concentraties gebruikt: ibudilast 1 mg/ml, tauroursodeoxycholzuur (TUDCA) 5 mg/ml, ciclosporine-injectie 250 mg/ml en anakinra 100 mg/0,67 ml. Therapeutische poeders werden verdund in 0,9% bacteriostatische zoutoplossing.
- Laat het afkoelen voordat je verder gaat. Nadat de naald is afgekoeld, trekt u het betreffende geneesmiddel op tot de gewenste hoeveelheid (4 μL).
- Gebruik een fijne oogheelkundige tang met tanden om het sclerale weefsel bij de limbus voorzichtig vast te pakken om te stabiliseren. Er zal een vage rode ring rond de iris zijn. Gebruik deze ring als oriëntatiepunt, steek de naald met de schuine kant naar beneden in en injecteer deze in het achterste oog.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de naald in de richting van het netvlies loopt en steek de naald slechts 2/3 van de weg in (Figuur 1). Zorg ervoor dat de naald geen krassen op de lens maakt, omdat dit kan leiden tot staarvorming. - Nadat het geneesmiddel is geïnjecteerd, verwijdert u de naald langzaam. Sluit het oog en houd de druk minstens 10-15 s vast voordat u het spoelt met een zoutoplossing.
- Stop met het gebruik van isofluraan en verwijder het van het platform voor oogheelkundige chirurgie. Doe een druppel hypromellose 0,3% in elk oog en laat het dier vervolgens herstellen op een verwarmingskussen.
2. Retrobulbaire injectie (RBI)
- Sluit de isofluraan en de afvoerdraden aan op de SALOOT-bevestigingspoorten. Verdoof het dier met behulp van standaard isofluraanprocedures.
OPMERKING: Als het dier al onder narcose was van een andere oogheelkundige testsessie (d.w.z. ketamine/xylazine-mix; 90 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine), breng het dier dan over naar het oogheelkundig chirurgieplatform en titreer de anesthesie met isofluraan (3 zuurstof: 3 isofluraan verhouding) om ervoor te zorgen dat de anesthesie voldoende diep blijft. - Plaats het platform voor oogheelkundige chirurgie met het verdoofde dier onder een live opererende microscoop. Beoordeel de anesthesiediepte via de pedaalterugtrekkingsreflex.
- Breng één tot twee druppels 0,5% tetracaïnehydrochloride oogheelkundige oplossing aan in het oog of de ogen die worden geopereerd. Breng smerende topische oogzalf (hypromellose 0,3%) aan op het contralaterale oog als er geen manipulatie hoeft te worden uitgevoerd.
- Gebruik vervolgens een tot twee druppels 5% povidon-jodium op het oogoppervlak en breng met een oogspeer povidon-jodium aan op de huid rond het oog.
- Zorg voor een insulinespuit van 0,5 ml met een naald van 28 G. Stel het therapeutisch middel van belang op tot de gewenste hoeveelheid (100 μL).
OPMERKING: Voor proof of concept-studies werden niet-verdunde tatoeage-inkt en Evan's Blue-kleurstof in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gebruikt. Evan's Blue-poeder werd gemengd met PBS tot het ondoorzichtig was. Voor therapeutische proof-of-concept-studies werden de volgende concentraties gebruikt: ibudilast bij 10 mg/ml, TUDCA bij 50 mg/ml, ciclosporine-injectie 250 mg/ml en anakinra bij 100 mg/0,67 ml. Therapeutische poeders werden verdund in 0,9% bacteriostatische zoutoplossing. - Gebruik een fijne oogheelkundige tang met tanden en pak voorzichtig het onderste ooglid vast om te stabiliseren. Steek de naald met de schuine kant naar beneden in een hoek halverwege tussen 6 en 7 uur langs de onderste orbitale rand totdat de achterkant van de oogkom voelbaar is. Trek de naald iets terug en injecteer dan langzaam het geneesmiddel (figuur 2).
- Verwijder de naald voorzichtig en langzaam. Sluit vervolgens het oog en houd de druk minstens 10-15 s vast voordat u spoelt met zoutoplossing.
- Stop met het gebruik van isofluraan en verwijder het van het platform voor oogheelkundige chirurgie. Doe een druppel hypromellose 0,3% in elk oog en laat het dier vervolgens herstellen op een verwarmingskussen.
3. Dissectie van oogweefselisolatie
- Nadat het dier is geëuthanaseerd via CO2 -verstikking of zoals anders vermeld in het goedgekeurde IACUC-protocol, plaatst u het dier in sternale lighouding. Gebruik een transversale huidincisie over de dorsale hals, die zich uitstrekt tot het niveau van de oorschelp.
- Ontleed de dorsale musculatuur om het atlanto-occipitale gewricht bloot te leggen. Gebruik een mayo-schaar om door het atlanto-occipitale gewricht te snijden en het hoofd van het lichaam te scheiden (Figuur 3). Verwijder met behulp van stompe dissectie voorzichtig de huid van de dorsale schedel vanaf het niveau van de neus tot aan de dorsale nek, waarbij de huid rond beide ogen intact blijft.
- Steek een paar middelrechte hemostaten of naalddrivers in het foramen magnum aan de basis van de schedel. Gebruik de hemostaten om voorzichtig door de laterale schedel te breken die zich uitstrekt van het foramen magnum tot het temporale gebied aan beide zijden (Figuur 3).
- Houd bij het verwijderen van de bovenkant van de schedel de hemostaten evenwijdig aan de dorsale zijde van de hersenen. Dit zorgt ervoor dat de hersenen intact blijven en niet worden ingedeukt tijdens het botverwijderingsproces.
- Gebruik een platte spatel om de hersenen voorzichtig rostraal te reflecteren om de oogzenuwen bloot te leggen. Er moet voor worden gezorgd dat er geen spanning door het gewicht van de hersenen op de oogzenuwen wordt uitgeoefend.
- Met de zenuwen bloot, neem je een middelgrote microschaar en maak je een kleine incisie over het optische chiasma, waarbij beide zenuwen van de hersenen worden doorgesneden. Op dit punt kunnen de hersenen worden weggegooid of gedurende 24 uur bij 4 °C in paraformaldehyde in PBS (4% PFA) worden geplaatst voor histologische beoordeling.
- Gebruik een kleine irisschaar en een getande oftalmische microtang om voorzichtig het overtollige weefsel (d.w.z. oogleden, bindweefsel, enz.) rond het oog te verwijderen. Eenmaal voltooid, moet het oog zich in de oogkom bevinden, maar met alleen de extraoculaire spier en klieren nog aanwezig.
- Gebruik de hemostaten in combinatie met de kleine irisschaar om door de oogbaan te knippen en zorg ervoor dat u niet in de oogzenuw snijdt wanneer deze door het oogkanaal gaat. Breek voorzichtig het bot aan de achterkant van de oogkom weg met de hemostaten en gebruik voor een nauwkeurigere controle de kleine dissectieschaar.
- Nadat het bot is verwijderd, snijdt u voorzichtig rond de oogbaan met een microschaar en een fijne tang om de vetkussentjes, klieren en extraoculaire spieren te verwijderen. Zorg ervoor dat u tijdens dit proces op de oogzenuwen let.
- Het oog moet zachtjes caudaal naar het binnenste van de schedel kunnen worden gereflecteerd. Gebruik nu een kleine microschaar en een fijne tang om het bindweefsel rond de zenuw op de onderste schedelkam te verwijderen.
- Zodra dit weefsel is verwijderd, moeten het oog en de volledige oogzenuw en bloc van de schedel kunnen worden getild. Herhaal deze stappen voor het contralaterale oog en de zenuw.
- Reinig verder de oogzenuw en het oog van overtollig weefsel, zoals de durale schede. Als weefsels niet hoeven te worden bewaard voor histologische analyse, vries ze dan snel in met droogijs of vloeibare stikstof voordat ze bij -80 °C worden bewaard.
- Voor massaspectrometrie moet het netvlies worden geïsoleerd van het interne gebied van de wereld en moet de oogzenuw worden geïsoleerd. Scheid de oogzenuw van de wereldbol op het dichtstbijzijnde uitwendige punt. Plaats de zenuw in een cryobuis op ijs voordat deze wordt overgebracht naar -80 °C.
- Plaats de bol van het oog op een petrischaaltje onder een operatiemicroscoop. Gebruik een gebogen tang om het oog stil te houden voordat u met een kleine microschaar een incisie maakt bij de limbus.
- Verleng de snede om de hele omtrek van de wereld te omvatten. De bol moet worden doorgesneden en het voorste deel kan worden weggegooid.
- Plaats het achterste gedeelte met de binnenste kant naar boven en verwijder met een fijn oogheelkundig pincet het dunne crèmekleurige weefsel. Het kan lijken alsof het aan de optische schijf blijft plakken. Als dit gebeurt, gebruik dan de microschaar om het netvlies weg te knippen van de schijf.
OPMERKING: Het netvliesweefsel kan vervolgens in een cryobuis op ijs worden geplaatst voordat het wordt overgebracht naar -80 °C. Weefsels kunnen vervolgens worden overgebracht naar de massaspectrometriefaciliteit voor evaluatie.
- Voor immunohistologische kleuring met behulp van gedeeltelijke perfusie, plaatst u het intacte oog op een petrischaaltje. Gebruik een gebogen tang om het oog stil te houden voordat u een insulinespuit met een naald van 28 G neemt en deze bij de limbus inbrengt, met de naald in de richting van het netvlies. Herhaal deze stap op nog twee punten langs de limbus. Punctie van de bol helpt om voldoende perfusie te garanderen en helpt bij de juiste fixatie.
OPMERKING: De bol moet gedurende ten minste 40 minuten worden gefixeerd in 4% PFA voordat u overgaat op een shaker en nog eens 20 minuten op lage snelheid roeren om vloeiende bewegingen te vergemakkelijken. - Zodra de fixatiestap is voltooid, verwijdert u de PFA en vervangt u deze door PBS. Plaats de injectieflacons gedurende 15 minuten voorzichtig en herhaal deze stap vervolgens voor een tweede PBS-spoeling van 15 minuten.
- Zuig na de laatste PBS-spoelcyclus de PBS op en vervang deze door 30% sucroseoplossing in PBS en zet deze vervolgens 24 uur in de koelkast. Na de incubatiestap van sucrose wordt weefsel in OCT ingebed voor histologische evaluatie26.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Voorlopige proefexperimenten werden uitgevoerd op kadaverdieren met behulp van injectiekleurstof (Evans Blue-kleurstof) en tatoeage-inkt (Figuur 2B) om de plaatsing en grootte van de naald voor zowel RBI als IVI te optimaliseren. Tatoeage-inkt was niet-verdund en vervolgens werd Evans Blue-poeder gemengd in PBS totdat de vloeistof ondoorzichtig werd. We concludeerden dat de ideale RBI bestond uit een naald van 28 G die in een hoek halverwege tussen 6 en 7 uu...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De ingewikkelde uitdagingen die gepaard gaan met het toedienen van therapieën aan het netvlies en de oogzenuw, voornamelijk als gevolg van de ondoordringbare barrière die door de BRB wordt gevormd, onderstrepen het belang van deze studie 3,4. De verkenning van IVI- en RBI-technieken belicht niet alleen innovatieve benaderingen om deze obstakels te overwinnen, maar benadrukt ook de bredere implicaties voor oogzorg en therapeutisch...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door het Vision Research Program Awards W81XWH-15-1-0074 en W81XWH-22-1-0989 van het Amerikaanse ministerie van Defensie. De meningen of beweringen in dit document zijn de privé-opvattingen van de auteurs en mogen niet worden opgevat als officieel of als een weerspiegeling van de opvattingen van het ministerie van het leger of het ministerie van Defensie. Deze onderzoeksbeurs werd gedeeltelijk ondersteund door de Ohio Affiliate of Prevent Blindness Young Investigator Student Fellowship Award for Females Scholars in Vision Research. We zijn dankbaar voor de steun van de Ross Foundation. Diensten werden uitgevoerd in het OSU Vision Sciences Research Core Program onder P30EY032857. We willen het Ohio State University Laboratory and Animal Resources (ULAR) bedanken. Daarnaast willen we de Reilly-niet-gegradueerde lableden Michelle Mosko, Emma Lally, Sam Duckworth en Eve Howard bedanken. We willen ook Bongsu Kim bedanken voor hun bijdrage aan het SALOOT-ontwerp, evenals Elizabeth Urbanski en Ryan Webb. Figuur 1, Figuur 2A en Figuur 3 zijn gemaakt met BioRender.com.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anakinra 100 mg/0.67 mL | Sobi | NDC: 66658-0234-07 | |
| Antipamezole hydrochloride (Antisedan) 5.0 mg/mL | Zoetis | NADA #141-033 | 107204-8 | |
| Bacteriostatic sodium chloride (0.9%) | Hospira Inc. | NDC: 0409-1966-02 | |
| Cryotube | VWR | 76417-258 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=76417-258 |
| Curved forceps | Fischer Scientific | 08-953F | |
| cyclosporine injection 250 mg/mL | Perrigo | NDC: 00574-0866-10 | |
| cyclosporine topical, 0.05% (Restasis) | AbbVie (Vizient) | NDC: 00023-9163-30 | |
| Cyotube Cap | Thermo Scientific | 3471BLK | https://www.fishersci.com/shop/products/screw-cap-microcentrifuge-tube-caps/14755237?searchHijack=true&searchTerm= screw-cap-microcentrifuge-tube-caps&searchType=Rapid& matchedCatNo=14755237 |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129-10G | |
| Eye Spears | Fischer Scientific | NC0972725 | https://www.fishersci.com/shop/products/ultracell-pva-eye-spears-100-p/NC0972725 |
| Fine forceps | Fischer Scientific | 08-953E | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-dissecting-jewelers-microforceps-2/08953E?gclid=Cj0KCQiAkJO8BhCGARIsAM kswyiER9Kanmi3ZMgoXTr82Zg3 g44m1Q6WLftkYfb36hC7pbkwR hVAy3MaAqkLEALw_wcB&ef_id =Cj0KCQiAkJO8BhCGARIsAMks wyiER9Kanmi3ZMgoXTr82Zg3g4 4m1Q6WLftkYfb36hC7pbkwRhV Ay3MaAqkLEALw_wcB:G:s&ppc _id=PLA_goog_2086145680_81 843405274_08953E__38624700 1354_6556597232892883360& ev_chn=shop&s_kwcid=AL!4428 !3!386247001354!!!g!827721591 040!&gad_source=1 |
| Fine ophthalmic forceps with teeth | Fisher Scientific | 50-253-8287 | https://www.fishersci.com/shop/products/bonn-suturing-forceps-7-5-cm/502538287 |
| Flat spatula | Fischer Scientific | 14-375-100 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-spoonula-lab-spoon/1437510#?keyword= |
| Hot bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Instrument-Care-Accessories/Sterilization/Hot-Bead-Sterilizers |
| Hypromellose 0.3% (GenTeal Tears Severe Dry Eye Gel) | Alcon Laboratories Inc. | https://www.amazon.com/GenTeal-Tears-Lubricant-Ointment-Night-Time/dp/B01IN5G1L0/ref=sr_1_4?dib=eyJ2IjoiMSJ9.DxYpqjIIBNO TVuPo7jln5xeGazA_YFg0cbt3 kCyC-0ouZARw5qIHYvCM7vB R_vO30OWUEXDZhQmQfLQ9 ySld4mujpzrWjxbsEXLBs5JPhjZ eUPgPY0sHoJA46f9EYULdxiTu BQy5fVA2OB20RV09mbdW8hX 6j8-bXIYTZljPGMo5_GMq9jnJo8 3iR35c1THxEiEH2FsvSx7VXup- QK9uCkWwAYrw2v3tyLUCq2JT APPF34nsYqGnSASMgOARU_ 2lVz-kIy-QUEYHGOoIimIWwBY htz33RkFrq7YjtnC2uDbImNiudG zWJv-uUhmJngYjbBGbeWE0VX 7CGPkEokUZrCQ8AI2HeXjSMph gPhMbK88RcHJ63AyH0TiBtS2k1 Xceh-CD26_prJSNxF6Mv5-jgGf9 iLmXvVtKkkSwc-5uYLk7gZHaFC Yj73F_imbmeHYr.4vfu7h4m4Jlfy- qiqmgeAnDHlJTGYV22HJ2w_xD ir0k&dib_tag=se&keywords=Gent eal+gel&qid=1736793609&sr=8-4 | |
| ibudilast | Millipore Sigma | I0157-10MG | |
| insulin syringe 0.5 mL with a 28 gauge Micro-Fine IV Needle | Becton, Dickinson and Company (BD) | 14-826-79 | |
| Isoflurane | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | |
| Ketamine | Covetrus | NDC: 11695-0703-1 | |
| Long Evans Rat | Charles River Laboratories International, Inc. | https://www.criver.com/products-services/find-model/long-evans-rat?region=3611 | |
| Mayo Scissors | Electron Microscopy Sciences | 72968-03 | |
| Medium microscissors | Amazon | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z168866#product-documentation | |
| Medium straight he |
Referenties
- Nguyen, D. D., Lai, J. -Y. Advancing the stimuli response of polymer-based drug delivery systems for ocular disease treatment. Polym Chem. 11 (44), 6988-7008 (2020).
- Tsai, C. -H., et al. Ocular drug delivery: Role of degradable polymeric nanocarriers for ophthalmic application. Int J Mol Sci. 19 (9), ijms19092830(2018).
- Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules (Basel, Switzerland). 24 (8), 24081583(2019).
- Ryan, A. K., Rich, W., Reilly, M. A. Oxidative stress in the brain and retina after traumatic injury. Front Neurosci. 17, 1021152(2023).
- De Matteis, V., Rizzello, L. Noble metals and soft bio-inspired nanoparticles in retinal diseases treatment: A perspective. Cells. 9 (3), 679(2020).
- O'Leary, F., Campbell, M. The blood-retina barrier in health and disease. FEBS J. 290 (4), 878-891 (2023).
- del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Prog Retin Eye Res. 57, 134-185 (2017).
- Nguyen, D. D., Luo, L. -J., Yang, C. -J., Lai, J. -Y. Highly retina-permeating and long-acting resveratrol/metformin nanotherapeutics for enhanced treatment of macular degeneration. ACS Nano. 17 (1), 168-183 (2023).
- Luo, L. -J., et al. Targeting nanocomposites with anti-oxidative/inflammatory/angiogenic activities for synergistically alleviating macular degeneration. App Mat Today. 24, 101156(2021).
- Naik, S., et al. Small interfering RNAs (siRNAs) based gene silencing strategies for the treatment of glaucoma: Recent advancements and future perspectives. Life Sci. 264, 118712(2021).
- Luo, L. -J., Nguyen, D. D., Lai, J. -Y. Dually functional hollow ceria nanoparticle platform for intraocular drug delivery: A push beyond the limits of static and dynamic ocular barriers toward glaucoma therapy. Biomat. 243, 119961(2020).
- Ghate, D., Brooks, W., McCarey, B. E., Edelhauser, H. F. Pharmacokinetics of intraocular drug delivery by periocular injections using ocular fluorophotometry. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (5), 2230-2237 (2007).
- Soni, V., Pandey, V., Tiwari, R., Asati, S., Tekade, R. K. Chapter 13 - Design and evaluation of ophthalmic delivery formulations. Basic Fund Drug Deliv. , 473-538 (2019).
- Varela-Fernández, R., et al. Drug delivery to the posterior segment of the eye: Biopharmaceutic and pharmacokinetic considerations. Pharmaceutics. 12 (3), 313(2020).
- Chiu, K., Chang, R. C. -C., So, K. -F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), e313(2007).
- Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes. PLOS One. 16 (8), e0256344(2021).
- Cosan, S., et al. Effect of retrobulbar prostaglandin analog injection on orbital fat in rats. Int Ophthal. 43 (12), 4985-4990 (2023).
- Levy, Y., Kremer, I., Shavit, S., Korczyn, A. D. The pupillary effects of retrobulbar injection of botulinum toxin A (oculinum) in albino rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (1), 122-125 (1991).
- Jbara, D., Eiger-Moscovich, M., Didkovsky, E., Keshet, Y., Avisar, I. In vivo effects of prostaglandin analogs application by topical drops or retrobulbar injections on the orbital fat of a rat model. Ocular Imm Inflamm. 31, 1-6 (2022).
- Eftekhari, K., et al. Histologic evidence of orbital inflammation from retrobulbar alcohol and chlorpromazine injection: A clinicopathologic study in human and rat orbits. Ophthal Plastic and Reconstr Surg. 32 (4), 302-304 (2016).
- Bohnert, B. N., et al. Retrobulbar sinus injection of doxorubicin is more efficient than lateral tail vein injection at inducing experimental nephrotic syndrome in mice: A pilot study. Lab Animals. 53 (6), 564-576 (2019).
- Socher, M., Kuntz, J., Sawall, S., Bartling, S., Kachelrieß, M. The retrobulbar sinus is superior to the lateral tail vein for the injection of contrast media in small animal cardiac imaging. Lab Animals. 48 (2), 105-113 (2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals. 40 (5), 155-160 (2011).
- Pozyuchenko, K., et al. Investigating animal models of optic neuropathy: An accurate method for optic nerve and chiasm dissection in mice. J Neurosci Methods. 331, 108527(2020).
- Sengupta, P. The laboratory rat: Relating its age with human's. Int J Prevent Med. 4 (6), 624-630 (2013).
- Ryan, A. K., et al. Torsion-Induced Traumatic Optic Neuropathy (TITON): A physiologically relevant animal model of traumatic optic neuropathy. PLOS One. 20 (1), e0312220(2025).
- Bora, K., et al. Assessment of Inner blood-retinal barrier: Animal models and methods. Cells. 12 (20), 2443(2023).
- Vinores, S. A. Breakdown of the blood-retinal barrier. Encyc Eye. , 216-222 (2010).
- Heisler-Taylor, T., et al. Multimodal imaging and functional analysis of the chick NMDA retinal damage model. PLOS One. 16 (9), e0257148(2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
