Orthotope transplantatie van de voorpoten van ratten

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om de microchirurgische haalbaarheid van transplantatie van de voorpoten van ratten aan te tonen. Dit model kan dienen als een belangrijk translationeel platform voor VCA-onderzoek.

Samenvatting

Gevasculariseerde samengestelde allotransplantatie (VCA) omvat de transplantatie van meerdere weefseltypen - waaronder huid, spieren, botten en zenuwen - en biedt een veelbelovende reconstructieve optie voor patiënten met ernstige traumatische verwondingen of misvormingen. Ondanks het transformatieve potentieel heeft VCA te maken gehad met aanzienlijke uitdagingen, zoals afstoting van transplantaten, chronische immunosuppressiecomplicaties en de fijne kneepjes van het neuromusculaire herstel.

We gebruiken een model van de voorpoten van ratten als een kosteneffectief en anatomisch relevant platform om deze uitdagingen aan te gaan. De voorpoot van de rat weerspiegelt nauw de anatomie van de menselijke ledematen, waardoor de translationele impact van onze bevindingen wordt versterkt. Eerdere studies hebben dit model gevalideerd voor het betrouwbaar en reproduceerbaar meten van functioneel herstel, waardoor het een belangrijk hulpmiddel is voor het beoordelen van het afstotingstraject van transplantaten van de voorpoot.

Bovendien biedt het model een waardevolle kans om innovatieve therapeutische benaderingen te verkennen en te dienen als een goed translationeel platform voor nieuwe conserveringstechnieken. Door verder onderzoek van dit model willen we ons begrip van de mechanismen achter transplantaatafstoting en neuromusculair herstel verdiepen. Uiteindelijk streeft dit werk ernaar de weg vrij te maken voor het verbeteren van de klinische resultaten van VCA, waarbij zowel de huidige beperkingen als de toekomstige uitdagingen in de transplantatiegeneeskunde worden aangepakt.

Inleiding

Gevasculariseerde samengestelde allotransplantatie (VCA) is een levensveranderende procedure om ernstige weefseldefecten te reconstrueren. VCA verwijst naar de transplantatie van een samengesteld weefsel dat bestaat uit huid, spieren, botten, bindweefsel, bloedvaten en zenuwen. Verdere verfijning en exploratie van VCA-technieken zou patiënten met traumatische verwondingen of misvormingen ten goede komen¹. De bredere toepassing ervan wordt echter uitgedaagd door aanhoudende hindernissen zoals afstoting van het transplantaat, complicaties door langdurige immunosuppressie, neuromusculair herstel en peri-transplantatielogistiek.

Het model van de voorpoten van de rat is naar voren gekomen als een voorkeurskeuze voor VCA-studies vanwege de kosteneffectiviteit en de sterke gelijkenis met menselijke anatomische en neuromusculaire kenmerken ^2,3. Ons eerdere werk heeft aangetoond dat dit model een betrouwbaar en reproduceerbaar middel biedt om functioneel herstel van gedrag te beoordelen⁴. In deze studie presenteren we een gedetailleerde, stapsgewijze handleiding voor de essentiële microchirurgische technieken die nodig zijn voor dit model.

Naarmate het VCA-onderzoek zich verder ontwikkelt, zal het model van de voorpoten van de rat mechanistisch onderzoek mogelijk maken naar het afstotingsproces, de zenuwregeneratie en het neuromusculaire functionele herstel. Onderzoekers zouden nieuwe conserveringstechnieken kunnen verkennen, de effectiviteit van machineperfusiemethoden kunnen evalueren en opkomende immunomodulerende therapieën kunnen testen, die kunnen helpen de huidige afhankelijkheid van immunosuppressie op de lange termijn te verminderen.

Protocol

Chirurgische ingrepen werden uitgevoerd volgens de protocollen die zijn goedgekeurd door het Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee (RA18M74) volgens de richtlijnen die zijn opgesteld door de National Institutes of Health en de American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care.

1. Donorprocedure (figuur 1)

1. Voer de inductie van anesthesie uit via inhalatie van isofluraan in een concentratie van 5% en houd deze gedurende de hele procedure op 1%. Start de procedure nadat u het juiste anesthesieniveau hebt gecontroleerd via teenknijpen.
2. Maak een circumferentiële incisie ongeveer 1 cm boven de elleboog. Verdeel de huid en leg het onderliggende oppervlakkige onderhuidse weefsel bloot zonder het te beschadigen (Figuur 1A).
3. Ontleed het onderhuidse weefsel/fascia, schroei alle oppervlakkige bloedvaten dicht en transecteer. Vervolgens worden de deltaspier, een deel van de pectoralis major, en de triceps brachii blootgelegd.
4. Ontleed botweg onder de grote musculus pectoralis, waarbij de armvaten worden onthuld, evenals de nervus medianus en ulnaris (Figuur 1B).
5. Snijd de oppervlakkige ader op de deltaspier dicht en transecteer proximaal, transecteer vervolgens de deltaspier loodrecht op de oriëntatie van de spiervezel. Ontleed en doorsnijd daarna de grote en kleine borstspieren, waarbij de okselslagader, ader en zenuw zichtbaar worden. (Figuur 1C).
6. Transecteer de mediane, ulnaire en radiale zenuw aan het proximale uiteinde (direct na de splitsing), waarbij zoveel mogelijk lengte behouden blijft.
7. Ontleed en bevrijd de armslagader en -ader.
8. Transecteer de biceps brachii, triceps brachii en de latissimus dorsi-spier. Zorg ervoor dat het opperarmbeen goed wordt blootgesteld na voltooiing van de dissectie.
9. Gebruik een rongeurtang om het bot distaal van de deltaspiertuberositas van het opperarmbeen te transecteren.
10. Controleer voorzichtig het lumen van de armslagader en -ader (Figuur 1C). Spoel het transplantaat met 6 ml gehepariniseerde zoutoplossing.
11. Monteer de polyimide manchet op respectievelijk zowel de armslagader als de ader (Figuur 1D).
12. Wikkel het transplantaat in met nat katoenen gaas en bewaar het bij 4 °C.
13. Euthanaseer de donorrat via een overdosis inhalatie-anestheticum (isofluraan). Zodra u volledig niet meer reageert op een teenknelpunt, voert u een thoracotomie uit en snijdt u het hart weg.

2. Procedure voor de begunstiging (figuur 2)

1. Voer de inductie van anesthesie uit via inhalatie van isofluraan in een concentratie van 5% en houd deze gedurende de hele procedure op 1%. Bevestig de status van de anesthesie door in de teen te knijpen.
2. Maak een circumferentiële incisie ongeveer 1-2 cm boven de elleboog.
3. Ontleed de onderhuidse bloedvaten en schroei grotere bloedvaten dicht om de deltaspier, een deel van de pectoralis major, en de triceps brachii-spier bloot te leggen.
4. Voer een stompe dissectie uit onder de grote spier van de borstspier om de armvaten te onthullen, evenals de mediane en nervus ulnaris.
5. Transecteer de deltaspier en een deel van de grote en kleine borstspier aan het distale uiteinde, waardoor de armvaten, mediane zenuwen en ulnaire zenuwen bloot komen te liggen (Figuur 2A).
6. Ontleed en doorsnijd de nervus medianus en ulnaris aan het distale uiteinde. Ligate alle vasculaire takken (Figuur 2B).
7. Transecteer de biceps brachii, triceps brachii en latissimus dorsi spier om het opperarmbeen bloot te leggen. Schroei eventuele bloedingen van de doorgesneden spieren zorgvuldig dicht.
8. Transecteer het opperarmbeen bij de tuberositas deltoïde wervelbeen. Gebruik botwas om de mergholte af te dichten.
9. Gebruik een intramedullaire staaf om de beenmergholte van de donor en ontvanger opnieuw te verbinden en gebruik vervolgens botwas om de verbinding af te dichten. Hecht de triceps brachii-spier met een 6-0 resorbeerbare hechting en creëer zo een platform voor vatanastomose.
10. Voer epiperineuriële neurorrhaphy uit met onderbroken 10-0 hechting van de radiale zenuw.
11. Voer de vasculaire anastomose uit met behulp van een niet-hechtmanchettechniek (Figuur 2C).
12. Voer epiperineuriële neurorragie uit met onderbroken 10-0 hechtingen om de mediane en ulnaire zenuwen opnieuw te verbinden (Figuur 2D).
13. Verbind de deltaspier en de grote borstspier opnieuw met behulp van onderbroken hechtingen.
14. Sluit de wond met 4-0 niet-resorbeerbare hechtdraad.
15. Dien aan het einde van de operatie subcutaan warme, steriele zoutoplossing toe in een dosis van 2% van het lichaamsgewicht.
16. Observeer het dier gedurende ten minste 4 uur onder een verwarmende lamp om te herstellen. Breng het terug naar de dierenopvang zodra het alert is, zichzelf kan rechtop zetten, gecoördineerde bewegingen kan vertonen en zelfstandig water en voedsel kan halen.

3. Beheer na transplantatie op lange termijn

1. Controleer dieren elke dag op tekenen van pijn en angst, zoals hieronder gedefinieerd.
   1. Controleer op anorexia aangegeven door de afwezigheid van uitwerpselen in de kooi.
   2. Controleer of het dier geen water drinkt, wat leidt tot uitdroging, wat blijkt uit het tenten van de huid.
   3. Controleer of het dier voorovergebogen zit, niet wil bewegen, de voorkeur geeft aan een ledemaat of de incisieplaats bewaakt.
   4. Controleer of het dier zich niet kan verzorgen en reflecteer in een gegolfde of vuile vacht.
   5. Controleer of het dier overmatig likt/krabt. Controleer op roodheid en zwelling op de incisieplaats en zelfverminking.
   6. Controleer op agressief gedrag, vooral wanneer u probeert het dier op te pakken.
   7. Controleer of het dier hijgt, moeite heeft met ademhalen en roodbruine neus-/oogafscheiding heeft.
   8. Controleer op sepsis.
2. Verwijder de hechtingen 14 dagen na de operatie.
3. Dien een tweede dosis buprenorfineSR toe (dosis bij ratten: 1,0 mg/kg SC) op postoperatieve dag 2 (POD2; 48 uur na de initiële dosis).
4. Start een wekelijkse functionele evaluatie in week 4 na de transplantatie.
   1. Fixeer kort, onder algemene narcose, de voorpoot van het dier in 90° abductie. Plaats twee naaldelektroden op 1 mm afstand van elkaar in de oksel bij het inbrengen van de pectoralis major op het opperarmbeen.
   2. Stimuleer de proximale nervus medianus percutaan bij 10 V om een maximale tetanische contractie van de flexoren te induceren.
   3. Zodra volledige digitale flexie een greep vormt, plaatst u een metalen lus die is aangesloten op een krachtmeter op de handpalm en zet u deze vast in de gebogen cijfers. Trek vervolgens aan de krachtmeter totdat de greep verloren is gegaan en registreer de maximale kracht (in Newton).

Resultaten

De overleving van het transplantaat kan worden gecontroleerd en bepaald door middel van macroscopische observatie. Representatieve foto's van zowel de korte termijn (POD7) als de lange termijn follow-up (POD120) worden getoond in Figuur 3. Het transplantaat kon herstellen zonder duidelijke tekenen van necrose. De overlevingsgegevens zijn weergegeven in figuur 4. Zowel huid- als spiermonsters worden geoogst op het aangewezen eind...

Discussie

Orthotope transplantatie van de voorpoot bij ratten is een veelgebruikt model bij experimentele reconstructieve transplantatie, omdat het niet alleen gevasculariseerde composietweefsels bevat, maar ook de beoordeling van functioneel herstel mogelijk maakt. Een conventionele hechttechniek voor vasculaire anastomose is zeer complex en vereist geavanceerde microchirurgische vaardigheden die jarenlange microchirurgische training vereisen. Om de tijd en kosten sterk te verminderen, werd een v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10-0 Non-Sterile Micro Suture	AROSurgical	TK-107038
4-0 Sharpoint Nylon Black	esutures	A1667N
4-0 Sharpoint Polysyn Taper	esutures	G214N
5 mL-spuiten	MDC	2045
6-0 zijde	Fisher Scientific	NC9742105
ABB-22 V Dubbele Micro Vaat	S&T	00480
B-1 V Enkele Micro Vaatklem	S&T	00462
BD Quincke Spinale naald	esutures	405073
Castroviejo Micro Naaldhouders	F.S.T	12061-02
Chatilon DFE II krachtmeter	Ametek	DFE II-serie
Katoen met punt	JH Supply store	100252
Fijne schaar - Tungsten Carbide	F.S.T	14569-09
Pincetten	S&T	FRS-15 RM-8
Gaas Sponges	Fisher Scientific	22-362178
Halsted-Mosquito Hemostatische Klemmen	F.S.T	13009-12
Heparine	JHH Pharmacy	NDC 63323-540-05
I.V. Katheter Radiopaque 24 G	esutures	SMTH5053
Bipolare Coagulerende Pincetten voor Juweliers, Roestvrij Staal	ASSI	103000BPS03
Ronde Handgreep Vannas Veerschaar	F.S.T	15400-12
Special-Forceps	S&T	FRAS-15 RM-8
Vessel Dilators - Gebalanceerde Instrumenten	F.S.T	18602-15