Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Eilandje-achtige cellen afgeleid van ductale celtransplantatie bij ratten

469 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68066

⸱

1 augustus 2025

 , 
1Department of Physiology, Ankara Medipol University Faculty of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Eilandachtige cellen afgeleid van ductale cellen tonen potentieel voor de behandeling van diabetes door de bloedglucosespiegels te verlagen en de insulineproductie bij diabetische ratten te verbeteren. Desalniettemin blijven er uitdagingen bestaan bij het waarborgen van voldoende celfunctie, immunologische afweer en veiligheid. Aanvullend onderzoek is nodig om de therapeutische capaciteit van deze stoffen te vergroten.

Samenvatting

Het gebruik van eilandachtige cellen afgeleid van ductale cellen is naar voren gekomen als een mogelijke benadering voor de behandeling van diabetes type 1. Diabetespatiënten hebben onvoldoende insulinesynthese in hun lichaam als gevolg van de auto-immuunvernietiging van bètacellen van de alvleesklier die verantwoordelijk zijn voor het maken van insuline. Binnen dit kader is het doel van eilandceltransplantatie om het vermogen van patiënten om insuline te produceren te herstellen. Obstakels zoals de onvoldoende verwerving van eilandcellen uit donoralvleesklieren en immuunreacties belemmeren echter de brede toepassing van deze therapiemethode. Onder specifieke omstandigheden bezitten ductale cellen van de alvleesklier het vermogen om te transformeren in cellen die insuline produceren. Deze cellen kunnen in een gecontroleerde omgeving worden gekweekt en worden omgezet in eilandachtige cellen die het vermogen hebben om insuline af te geven, waardoor ze geschikt zijn voor transplantatie. Deze innovatieve strategie biedt het potentieel om de progressie van diabetes type 1 een halt toe te roepen en de afhankelijkheid van insuline-injecties te verminderen. In deze studie werden eilandachtige cellen afgeleid van ductale cellen in de lever getransplanteerd via de poortader van de lever bij door streptozotocine geïnduceerde diabetische ratten. Na transplantatie merkten we substantiële verlagingen van de bloedglucosespiegels van de ratten op vanaf dag 5, die 15 dagen aanhield. Bovendien toonde een intraperitoneale glucosetolerantietest (IPGTT) aan dat diabetische ratten die de eilandachtige celtransplantaties kregen, significant meer insuline produceerden dan de controlegroep. Deze resultaten suggereren dat eilandachtige cellen afkomstig van ductale cellen een veelbelovende therapeutische benadering voor diabetes kunnen zijn. De belangrijkste obstakels in dit vakgebied zijn onder meer het bereiken van voldoende functioneel vermogen voor de cellen, het afschermen van het immuunsysteem en het waarborgen van hun veiligheid voor therapeutische toepassing. Toekomstige studies hebben het potentieel om cruciale inzichten op te leveren voor het optimaliseren van het gebruik van deze cellen in therapeutische omgevingen, met een focus op het verbeteren van zowel de werkzaamheid als de veiligheid.

Inleiding

Diabetes type 1 is een aanhoudende auto-immuunziekte die wordt gekenmerkt door de vernietiging van bètacellen in de alvleesklier die insuline produceren. De huidige behandelingen omvatten meestal langdurige insulinetherapie, die, hoewel succesvol in het beheersen van de bloedglucosespiegels, geen remedie biedt voor de aandoening of de ontwikkeling ervan stopt. Het onderzoek naar alternatieve therapieën voor diabetes type 1 wordt gemotiveerd door de noodzaak van effectievere alternatieven dan de bestaande nadruk op insulinebehandeling. Lopend onderzoek is hierdoor ingegeven, met de nadruk op alternatieve behandelingen zoals eilandceltransplantatie, die tot doel heeft het inherente vermogen van het lichaam om insuline te maken te herstellen. Toch heeft het feit dat donoreilandcellen moeilijk te verkrijgen zijn en er een kans is op immunologische afstoting, het moeilijk gemaakt om deze behandeling op grote schaal te gebruiken. Als gevolg hiervan is de wetenschappelijke gemeenschap steeds meer geïnteresseerd geraakt in het vinden van alternatieve bronnen van cellen die insulineproduceren 1,2,3.

Deze methode probeert het regeneratiepotentieel van deze cellen te benutten om een duurzame aanvoer van insuline-afscheidende cellen tot stand te brengen4. In vitro onderzoek heeft het vermogen van deze ductale cellen aangetoond om te worden omgezet in functionele bèta-achtige cellen die in staat zijn tot insulinesecretie als reactie op glucosestimulatie5. Deze onderzoekslijn is vooral van vitaal belang, gezien de ongunstige resultaten die verband houden met conventionele eilandjestransplantatie vanwege de ingewikkelde immuunresponsen die erbij betrokken zijn. Talrijke studies geven aan dat ductale cellen niet alleen het intrinsieke vermogen hebben om insuline te genereren, maar ook kenmerken kunnen vertonen die immuuntolerantie kunnen bevorderen, waardoor sommige uitdagingen die gepaard gaan met traditionele transplantatietechnieken worden verminderd 5,6,7,8. Deze cellen kunnen buiten het lichaam worden gekweekt, worden omgezet in cellen die lijken op eilandjes die insuline kunnen afgeven, en vervolgens worden geïmplanteerd bij personen met diabetes. Preklinische onderzoeken, die experimenten omvatten met door streptozotocine geïnduceerde diabetische ratten, hebben aangetoond dat de transplantatie van deze cellen de bloedglucosespiegels effectief kan verlagen en de insulinesecretie kan verbeteren9.

Onze aanpak was gericht op het versnellen van het differentiatieproces en het verbeteren van de functionaliteit van insulineproducerende cellen door het standaard celkweekmedium uit te breiden met insuline-transferrine-selenium (ITS)10,11,12, isoxazol 9 (ISX-9)13,14 en GLP-115. Deze factoren zijn naar verluidt essentieel bij het vergemakkelijken van pancreasdifferentiatie en het verbeteren van de insulinesecretie. De integratie van deze componenten was gericht op het efficiënter bereiken van functionele eilandachtige cellen, waardoor ze in staat zijn insuline te produceren en af te geven als reactie op glucosestimulatie 9,10,11,12,13,14.

Bij eilandjestransplantatie vormt immuunafstoting een belangrijk obstakel voor het bereiken van succesvolle resultaten. Allogene getransplanteerde eilandjes zijn kwetsbaar voor immuunaanvallen, waardoor immunosuppressieve therapieën nodig zijn om afstoting te voorkomen 16,17. De betrokkenheid van ductale cellen van de pancreas bij immuunafstoting tijdens eilandjestransplantatie vertegenwoordigt een zich ontwikkelend vakgebied. Er wordt gedacht dat ductale cellen eigenschappen kunnen hebben die de afstoting van het immuunsysteem kunnen verminderen, waardoor getransplanteerde eilandjes meer kans hebben om te overleven en goed te werken. Ilieva et al. toonden aan dat eilandjes die samen met ductale cellen waren gekweekt, verminderde centrale necrose en apoptose vertoonden, wat wijst op een beschermend effect tegen immuungemedieerde schade. Dit effect kan worden gemedieerd door factoren zoals insuline-achtige groeifactor 2 (IGF-2) die wordt uitgescheiden door ductale cellen, zoals opgemerkt door Marín-Cañas et al. (2019)18. Het beschermende effect is essentieel, aangezien afstoting van het immuunsysteem een aanzienlijke uitdaging vormt voor het succes van eilandjestransplantatie, vooral bij diabetes type 1. Ductale cellen in eilandjestransplantaten zijn in verband gebracht met een verbeterde transplantaatfunctie en overleving, waarschijnlijk toe te schrijven aan hun vermogen om immunomodulerende factoren af te scheiden die de immuunrespons verminderen19.

Ondanks de veelbelovende vooruitgang moeten enkele hindernissen worden opgelost om de operationele werkzaamheid en veiligheid van deze celgebaseerde therapieën voor klinisch gebruik te garanderen. Het is essentieel om te verifiëren dat de geïnduceerde cellen functionele eigenschappen vertonen die vergelijkbaar zijn met inheemse bètacellen en om effectieve technieken vast te stellen om deze cellen te beschermen tegen aanvallen van het immuunsysteem om hun verlengde overleving en functionaliteit te garanderen20,21. Naarmate dit onderzoeksdomein vordert, zal uitgebreide kennis en het oplossen van deze obstakels essentieel zijn om de belofte van van ductale cellen afgeleide insulineproducerende cellen bij de behandeling van diabetes type 1 te benutten 22,23,24.

Deze studie heeft tot doel de in vivo efficiëntie te beoordelen van ductale cellen afkomstig van eilandjes, ontwikkeld onder optimale omstandigheden, voor het herstel van de glykemische controle in een streptozotocine-geïnduceerd diabetisch rattenmodel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie voldeed aan de ARRIVE-aanbevelingen en zorgde ervoor dat het ontwerp, de uitvoering en de rapportage van het onderzoek voldeden aan hoge normen voor dierenwelzijn en experimentele integriteit (https://arriveguidelines.org). Ankara Medipol University kreeg goedkeuring van de ethische commissie (AMUHADYEK-12- 09.05.2025) en institutionele toestemming. Alle methoden zijn uitgevoerd in overeenstemming met de geldende richtlijnen en voorschriften. Alle maatregelen werden genomen om dierenleed tot een minimum te beperken en het minimum aantal dieren in dienst te nemen dat nodig is om wetenschappelijke doelstellingen te bereiken.

1. Bereiding van oplossingen

  1. Enzymoplossing: Bereid een collagenaseoplossing met 50 mg Clostridium histolyticum collagenase type V in poedervorm. Bereid een oplossing van 50 ml door collagenase te combineren met HBSS (dat Ca-Mg bevat) om een concentratie van 1 mg/ml te bereiken. Gebruik 7 ml van de oplossing per monster en zet de rest in de vriezer bij -20 °C.
    OPMERKING: De aanbevolen concentratie collagenase is 1 mg/1 ml. Voordat het in de spuiten wordt opgezogen, moet het collagenase worden gemengd met de vooraf bereide HBSS-oplossing tot een concentratie van 1 mg/ml.
  2. Wasoplossing 1: Trek 62,5 ml aan 500 ml fenolroodvrije HBSS. Voeg heel voorzichtig 50 ml FBS toe aan de resterende HBSS. Voeg 5 ml penicilline/streptomycine (P/S), 5 ml L-glutamine (L-Gln) en 2,5 ml 1 M HEPES toe. Breng het volume op 500 ml.
    OPMERKING: Met de toevoeging van fenolrood bestaat het uiteindelijke volume uit 88% HBSS, 10% FBS, 1% P/S en 1% l-Gln. Om schuimvorming te voorkomen en de nauwkeurigheid te garanderen, moet u het foetale runderserum voorzichtig stap voor stap opnemen.
  3. Kweekmedium voor cellen en wasoplossing 2: Zuig 62,5 ml op uit 500 ml Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI w/L-Gln). Wees voorzichtig om te voorkomen dat de FBS schuimt tijdens de geleidelijke toevoeging van 50 ml aan de resterende RPMI. Voeg 2.5 ml 1 M HEPES, 5 ml P/S en 5 ml L-Gln toe. Zorg ervoor dat het totale volume 500 ml is. Bewaren bij 4 °C.
  4. Oplossingen voor dichtheidsgradiënt: Bereid de uiteindelijke dichtheidsoplossingen voor door de dichtheidsoplossing van 1100 mg/ml te verdunnen met HBSS-oplossing om een tussenliggend dichtheidsbereik van 1062-1096 mg/ml te verkrijgen. Om de nauwkeurigheid te garanderen, controleert u met een densitometer de dichtheid van elke bereide oplossing. Gebruik de 1077 concentratieoplossing als referentie. Zodra de gewenste concentraties (1062-1096 mg/ml) zijn verkregen, worden de oplossingen overgebracht naar luchtdichte recipiënten en op een donkere plaats bij 4 °C bewaard om hun stabiliteit te behouden.
  5. Bereid een 0,4% trypan blauwe oplossing. De celontwikkeling wordt bevorderd door een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), die een pH van 7,4 heeft.
  6. Celkweekgroeimedium: Combineer 43,4 ml Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) en Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM-lage glucose). Voeg 10% foetaal kalfsserum (FCS), 1% insuline-transferrine-selenium (ITS), 1% L-glutamine (L-Gln), 1% penicilline-streptomycine (P/S) en 0,2 ml 1 M HEPES toe. Vul het uiteindelijke volume aan tot 100 ml. Bewaren bij 4 °C.
  7. Celcultuurdifferentiatiemedium: Voeg 43,4 ml RPMI toe met 43,4 ml DMEM-lage glucose. Voeg 10% FCS, 1% insuline-transferrine-selenium (ITS), 1% L-Gln, 1% P/S en 0,2 ml 1 M HEPES toe aan het mengsel. Voeg bovendien 1 μL Isoxazol 9 (ISX-9) verdund in 4 ml ethanol toe aan de differentiatiemedia. Voeg ten slotte 24 μl van een glucagon-achtig peptide 1 (GLP-1) oplossing met een concentratie van 50 nM toe aan het celkweekmedium.
    LET OP: ISX-9 en GLP-1 worden alleen vers toegevoegd tijdens cultuurveranderingen; Ze zijn vooraf voorbereid. Voor al het culturele materiaal is een nieuwe voorbereiding vereist.
  8. Dithizon (DTZ) oplossing: Los 100 mg dithizon op in 20 ml dimethylsulfoxide (DMSO) en meng goed. Voeg 30 ml HBSS toe aan de resulterende oplossing en roer tot een homogeen mengsel is verkregen. Filtreer de filters van de oplossing 0,2 of 0,4 μm. Voeg 50 ml HBSS toe aan de gefilterde oplossing. Label de oplossing met de datum van bereiding. Zodra de vaste stoffen volledig zijn afgebroken, laat u de oplossing door een filterapparaat van 0,4 μm lopen. Doe de gefilterde oplossing in buisjes van 2 ml en gebruik ze meteen, nadat ze zijn ontdooid. Bewaar de gemaakte oplossing bij -20 °C.
  9. Krebs-oplossing: Voeg in een container van 250 ml 1,68 g natriumchloride (voor 115 mM), 0,50 g natriumbicarbonaat (voor 24 mM), 0,09 g kaliumchloride (om er 5 mM van te maken), 0,05 g magnesiumchloride (voor 1 mM), 0,09 g calciumchloride (voor 2,5 mM) en 0,25 g runderserumalbumine (voor 0,1%) toe. Voeg 6,25 ml 1 M HEPES toe. Stel het volume in op 250 ml door gedeïoniseerd water toe te voegen en roer tot alles gemengd is. Stel de pH in op een bereik van 7,3 tot 7,5 met behulp van 1 M NaOH of 1 M HCl. Filtreer door een filter van 0,22 μm. Bewaar de oplossingen bij kamertemperatuur. Voeg in een waterbad van 37 °C de oplossingen toe wanneer ze klaar zijn voor gebruik.
  10. Oplossing met hoge glucoseconcentratie: Meet en voeg 149,1 mg D-(+)-glucose toe aan een buisje. Voeg 50 ml Krebs-oplossing toe aan de tube en meng grondig door te schudden. Filter door een filter van 0,22 μm.
  11. Oplossing met lage glucoseconcentratie: Combineer 1 ml oplossing met hoge glucoseconcentratie van 16,7 ml met 9 ml Krebs-oplossing.

2. Isolatie van de alvleesklier van ratten

  1. Begin met een cohort van drie Wistar Albino-laboratoriumratten (3 maanden oud/mannetje) met een gewicht tussen 220 g en 280 g. Verdoof de dieren met een combinatie van ketamine (35-50 mg/kg) en xylazine (5-10 mg/kg). Controleer de diepte van de anesthesie door het ontbreken van de terugtrekkingsreactie van het pedaal. Breng veterinaire zalf aan op de ogen om te voorkomen dat ze uitdrogen.
  2. Begin het chirurgische proces met een buikincisie van 3-4 cm in de middellijn langs de linea alba met een schaar. (Figuur 1A). Voer delicate manipulatie van de lever uit door zachte fysieke druk met de vingers uit te oefenen op de ribbenkast om het middenrif omhoog te brengen. Exteïriseer de lever en plaats deze op een steriel gaasje voor stabiliteit.
  3. Bereid een gestandaardiseerde collagenaseoplossing in een dosering van 28 mg/g lichaamsgewicht en zuig 7 ml (ongeveer 7 g) op in de spuit voor ratten met een gewicht tussen 250 en 300 g. Wijzig het volume van de oplossing op basis van het lichaamsgewicht van elk dier.
  4. Snijd de ductus pancreaticus in. Knip met een fijne vaatschaar het kanaal bij de lever af. Gebruik anatomische posities ten opzichte van de alvleesklier en het omliggende vaatstelsel om het kanaal te identificeren. Gebruik locatie-aanwijzingen zoals bloedvaten in de buurt en weefselkenmerken om nauwkeurigheid te garanderen. Maak een perfecte snede op deze plek voor occlusie.
    OPMERKING: De incisie was minimaal - te klein om precies te worden gemeten - maar voldoende breed om het inbrengen van de katheter mogelijk te maken. De incisie zorgt voor een soepele en efficiënte plaatsing van de katheter, waardoor trauma aan het omliggende weefsel tot een minimum wordt beperkt.
  5. Breng een katheter met een geïntegreerd infuus in de gegenereerde ductale opening (Afbeelding 1B). Als de katheter correct is geplaatst, maakt u de katheter vast met een chirurgische klem (bijv. microtang) om losraken te voorkomen.
  6. Dien de collagenase-enzymatische oplossing toe door middel van gecontroleerde infusie door geleidelijke, opzettelijke plunjerdepressie.
  7. Gebruik na het opblazen fijne chirurgische instrumenten om het pancreasweefsel voorzichtig te scheiden van de omliggende structuren. Voer de excisie snel en met nauwkeurige en zachte manoeuvres uit om weefselbeschadiging te minimaliseren. Plaats de alvleesklier onmiddellijk na verwijdering in een buis van 50 ml op ijs om eventuele enzymactiviteit te stoppen.
  8. Het hele proces duurt ongeveer 60 s voor één alvleesklier25. Bewaar bovendien het collagenase en de verwijderde alvleesklieren op ijs totdat alle alvleesklieren volgezogen zijn.

figure-protocol-1
Figuur 1: Verwerking van de pancreas. (A) Klemming van de opening van de ductus pancreaticus in de twaalfvingerige darm en (B) Collagenase type 5 inflatie resulteert in een beeld van de pancreas. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3 Isolatie van ductale cellen uit pancreasweefsel

  1. Incubeer na chirurgische extractie de alvleesklier gedurende 12 minuten in een waterbad van 37 °C.
  2. Voeg 25 ml wasoplossing 1 toe aan de tube om de collagenase-activiteit te neutraliseren. Schud de buis handmatig om de afbraak van pancreasweefsel te bevorderen. Voer alle volgende procedures uit onder een steriel veld met laminaire stroming.
  3. Houd alle media in de ijskast. Centrifugeer de monsters bij 4 °C, bij 100 x g gedurende 1 minuut en zet de rem op de maximale stand. Gooi het bovenstaande weg. Voeg aan de celpellet 25 ml wasoplossing 1 toe en suspendeer het mengsel opnieuw.
  4. Voer de centrifugatie opnieuw uit en gooi het supernatant weg. Voeg aan de pellet 25 ml wasoplossing 1 toe en suspendeer opnieuw. Zeef het bewerkte pancreasweefsel door een stalen gaas van 425 μm om eventuele resterende vasculaire of onverteerde weefselfragmenten te verwijderen.
  5. Breng na filtratie het volume op 25 ml met wasoplossing 1. Voer de centrifugatie 1x uit bij 100 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C. Verwijder de supernatant.
  6. Breng de pellet over in een nieuwe buis met behulp van een steriele plastic pipet na toevoeging van 50 ml RPMI-medium. Centrifugeer het monster opnieuw bij 100 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C. Gooi het bovenstaande weg en bewaar de pellet voor verdere analyse.
    OPMERKING: Alle resterende stappen werden uitgevoerd in laminaire stromingskasten onder steriele omstandigheden die geschikt zijn voor celkweekexperimenten.
  7. Voeg 10 ml dichtheidsoplossing 1.077 toe aan de pellet die na de laatste is verkregen, gevolgd door een zachte verstoring en homogenisatie van de pellet door met een vinger op de rand van de buis te tikken.
    OPMERKING: Het dichtheidsbereik voor het isoleren van eilandcellen uit het omringende pancreasweefsel is ongeveer 1.077, in tegenstelling tot de dichtheid van het medium, die ongeveer 1.00126 is. Daarom hebben we voor dit doel de dichtheidsoplossing 1.077 gebruikt.
  8. Voeg 10 ml RPMI toe en centrifugeer bij 600 x g gedurende 12 minuten bij 4 °C met uitgeschakelde remmen. Deze procedure zorgde voor een op dichtheid gebaseerde deling in de buizen, wat resulteerde in de accumulatie van eilandcellen in een laag direct onder de RPMI-laag, direct onder de RPMI-laag.
  9. Verwijder zowel de eilandcellen als RPMI werden geëlimineerd. Het doel van deze stap was om eilandcellen te zuiveren om hun verwijdering uit pancreasweefsels te verbeteren, wat resulteerde in een zuiverder ductaal celisolatieproces.
  10. Verwijder eventueel overtollig pancreasweefsel in een nieuwe tube van 50 ml met behulp van een pipet. Voeg 10 ml oplossing met een dichtheid van 1,096 toe aan de weefselpellet.
  11. Voeg vervolgens langzaam 10 ml oplossingsgradiënt met een dichtheid van 1.062 toe met een spuit. Let op het behoud van een homogene verdeling van de componenten. Maak een gradiënt door oplossingen te stapelen in volgorde van dicht naar minst dicht.
  12. Voeg er 10 ml RPMI aan toe. Centrifugebuisjes bij 600 x g gedurende 12 minuten bij 4 °C zonder remmen. Na het spinnen worden verschillende dichtheidslagen gezien. De ductale cellen bevinden zich in de middelste laag, onder de RPMI-laag.
  13. Verwijder de ductale cellen voorzichtig met behulp van een wegwerppasteurpipet en doe ze in een aparte buis van 50 ml. Voeg 25 ml wasoplossing 2 toe en meng de suspensie voorzichtig door met een vinger op de tube te tikken.
  14. Draai de buis 1 minuut op 100 x g en gooi de supernatant weg. Voer nog twee centrifugatierondes uit met de pellet. Voeg na de laatste wasbeurt 2 ml wasoplossing 2 toe aan de pellet27.

4. Isolatie en kweek van ductale cellen

  1. Inoculeer de geoogste cellen in een T25-kolf en voeg 5 ml voorverwarmde celkweekvloeistoffen toe. Houd de broedmachine op 5% CO2en 37 °C.
    OPMERKING: Het stabiel houden van fysiologische temperaturen is belangrijk voor de werking van celcultuur, dus alle oplossingen werden verwarmd tot ongeveer 37 °C voordat ze werden gebruikt.
  2. Zuig het medium na 24 uur voorzichtig op. Spoel de cellen twee keer met wasoplossing 2. Voeg vers celkweekmedium toe en doe de kolf terug in de broedmachine. De cellen die zich aan het oppervlak van de kolf hechtten, werden ductale cellen genoemd.
  3. Vervang het groeimedium elke 3 dagen. Als de kleur van het medium erg snel verandert, betekent dit dat het voedingsstoffen verliest en zuurder wordt, wat aangeeft dat het medium vaker moet worden vervangen.
  4. Passagecellen zodra de cellen in de kolven 80% samenvloeiing bereiken. Was 2x met 1-2 ml PBS en verwijder eventuele extra media.
  5. Voeg 2 ml enzymatische dissociatieoplossing (zonder fenolrood) toe om het enzymatische afbraakproces op gang te brengen en de cellen van het oppervlak van de kolf te scheiden.
  6. Incubeer gedurende 2-3 minuten en beoordeel de celloslating onder een 10x microscoop. Als de cellen gedeeltelijk aangehecht blijven, incuber dan opnieuw bij 37 °C gedurende nog eens 2 minuten.
  7. Nadat de cellen volledig waren losgemaakt van het oppervlak van de kolf, stopt u de enzymvertering door ongeveer 8 ml celgroeimedium toe te voegen, wat 4x het volume is van de enzymatische dissociatieoplossing. Tik zachtjes op de wanden van de kolf.
    OPMERKING: Tikken, dat de cellen kan helpen scheiden, verkort de totale incubatietijd en voorkomt dat de enzymen het celmembraan beschadigen, zodat dit gebeurt na langdurig contact met de enzymatische dissociatieoplossing.
  8. Na het toevoegen van celkweekmedia wordt de celsuspensie overgebracht in buisjes van 15 ml en centrifugeert u deze gedurende 10 minuten bij 150 x g bij 25 °C bij 25 °C met een milde vertragingsinstelling (snelheid 9 pauze) om de cellen te pelleteren.
  9. Gooi het bovenstaande weg. Resuspendeer de celpellet in 6-8 ml wasoplossing 2. Herhaal de centrifugatie zoals hierboven. Gooi het bovenstaande weg. De procedure werd herhaald om de grondige eliminatie van de enzymatische dissociatieoplossing te garanderen.
  10. Door voorzichtig te pipetteren wordt de pellet geresuspendeerd in een vers celkweekmedium van 5 ml om een uniforme celsuspensie te maken. Voer in dit stadium een celtelling uit.
  11. Meng 10 μl van de celsuspensie met 10 μl trypan blue en tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
  12. Zaai 1 × 106 cellen per T25-kolf met behulp van de getelde suspensie.
    OPMERKING: Tegen die tijd waren de meeste cellen geïdentificeerd als ductale cellen. Een groot aantal cellen werd in elk gerecht gezaaid op basis van het aantal cellen dat werd gedaan. Op basis van wat we in de experimenten zagen, werden cellen verspreid over twee verschillende T25-kolven zodra ze het beste niveau van samenvloeiing in één kolf hadden bereikt. Dit werd gedaan om de proliferatie-efficiëntie hoog te houden. Met deze methode waren we in staat om ductale cellen met succes te scheiden van het weefsel van de alvleesklier van de rat. Nadat ze met succes waren gescheiden, werden de cellen volgens het studieplan klaargemaakt voor verdere experimenten.
  13. Ga door met kweken tot passage 4. Passage cellen wanneer dat nodig is om optimale groeiomstandigheden te behouden.
    OPMERKING: Vanaf passage 4 was er een merkbare stijging van het aantal cellen tussen dag 3 en 9. Omdat cellen de neiging hebben om zich na meer cycli minder te delen, zorgde deze methode ervoor dat er voldoende levensvatbare cellen waren. Toen de ductale cellen eenmaal voldoende waren gegroeid, begonnen ze te veranderen in eilandjesachtige cellen. Op basis van wat we hebben gevonden, hebben cellen tussen fase 3 en 6 de snelste proliferatie. Passage 4 laat een bijzonder opvallende toename van het aantal ductale cellen zien. Na passage 6 was er echter een afname van het proliferatieve vermogen. Het protocol is op basis van deze resultaten aangepast om het juiste aantal cellen te krijgen met behoud van hun levensvatbaarheid en bruikbaarheid28.

5. Differentiatie van ductale cellen in eilandvormige clusters

  1. Oogst passage 4 ductale cellen met behulp van de standaard passageprocedure. Was tweemaal met 1-2 ml PBS om resten en losse cellen te verwijderen.
  2. Voeg 2 ml enzymatische dissociatieoplossing (zonder fenolrood) toe aan de kolf. Incubeer 2-3 minuten bij 37 °C en monitor onder een 10x microscoop.
  3. Als de cellen gehecht blijven, incuber dan nog 2 minuten. Stop de enzymatische reactie door 8 ml celgroeimedium toe te voegen.
  4. Breng de suspensie over in een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 150 × g bij 25 °C, stand 9 voor versnellen en vertragen.
  5. Gooi het bovenstaande weg. Resuspendeer de pellet in 6-8 ml wasoplossing 2. Centrifugeer en gooi het bovenstaande weg.
  6. Resuspendeer de uiteindelijke pellet in 5 ml vers medium. Tel de cellen zoals eerder beschreven.
  7. Zaad 1 × 105 cellen per putje in een plaat met zes putjes en voeg 3 ml medium per putje toe. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2.
  8. Vervang het medium de eerste 7 dagen elke 3 dagen. Pas de frequentie aan als de gemiddelde kleur snel verandert.
  9. Schakel na 7 dagen geleidelijk over op differentiatiemedium. Ga in totaal 15 dagen door met kweken (7 dagen groei + 8 dagen differentiatie). Vervang het medium elke 2 dagen tijdens de differentiatie.
  10. Op dag 8 begint u met de differentiatiefase. Was de cellen na 4 dagen twee keer met PBS en voeg een enzymatische dissociatieoplossing van 500 μL toe.
  11. Incubeer 2-3 minuten en stop de reactie door 2 ml groeimedium toe te voegen. Centrifugeer bij 150 x g gedurende 10 minuten bij 25 °C. Resuspendeer en zaai opnieuw 1 x 105 cellen per putje in platen met zes putjes.
  12. Voer op de 15e dag een volledige microscopische analyse uit om de vorming van eilandachtige cellulaire aggregaten duidelijk te karakteriseren en te bevestigen24.

6. Kwantificering van de zinkconcentratie in gedifferentieerde ductale cellen door dithizon

  1. Ontdooi en breng de DTZ-oplossing in evenwicht vanaf -20 °C opslag. Voeg 3-4 druppels DTZ-oplossing toe aan elk putje van de 15-daagse gedifferentieerde cellen. Observeer onder een microscoop. Identificeer insulineproducerende cellen door rode kleuring28 (Figuur 2).

figure-protocol-2
Figuur 2: Microscoopbeelden van eilandachtige ductale cellen. Beelden bij (A) dag 11 cultuur (20x), (B) dag 13 cultuur (20x), (C, D) dag 15 cultuur (20x). Cellen werden gevisualiseerd na kleuring met Dithizon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. Test op glucosestimulatie

  1. Zaai 1 x 104 eilandachtige trossen per putje in een plaat met 24 putjes met 1 ml differentiatiemedium per putje.
  2. Stimuleer op dag 15 cellen met glucose. Verwijder het bestaande medium en voeg 1 ml oplossing met een laag glucosegehalte (1,67 mM) toe. Incubeer 1 uur bij 37 °C.
  3. Verzamel het medium en breng het over in tubes van 2 ml. Voeg 1 ml oplossing met een hoog glucosegehalte (16,7 mM) toe. Incubeer 1 uur. Verzamel medium voor analyse. Verzamel het celkweekmedium met elk interval van 1 uur tussen de toevoeging van verschillende glucoseoplossingen.
  4. Voer insuline-ELISA uit volgens de instructies van de fabrikant. Nadat u de microplaat uit het foliezakje hebt gehaald, laat u de microplaat op kamertemperatuur komen voordat u met de ELISA-procedure begint.
  5. Voeg 10 μL reagens toe aan de monster-, controle- en standaardputjes. Voeg 75 μL werkende geconjugeerde oplossing toe. Sela de plaat en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met schudden (700-900 tpm).
  6. Spoel de putten 6x met 350 μL wasbuffer. Voeg 100 μL 3,3′,5,5,5,5-tetramethylbenzidine (TMB) substraat toe per putje. Sluit de platen af en broed 15 minuten in het donker met schudden (700-900 tpm) bij kamertemperatuur.
  7. Voeg 100 μL stopoplossing per putje toe en meng door de plaat voorzichtig te roeren om het proces te stoppen. Verwijder luchtbellen en lees de absorptie af bij 450 nm. Meet gedurende 30 minuten na toevoeging van de stopoplossing27.

8. Eilandjes en eilandje-achtige ductale celtransplantatie

  1. Verdoof ratten met ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg). Ontsmet en drapeer de operatieplaats. Maak een incisie in de middellijn van 2-3 cm.
  2. Verplaats de darmen en leg de poortader bloot met behulp van retractors. Voer een venotomie uit en breng een katheter in die vooraf is gevuld met zoutoplossing (Figuur 3A).
  3. Breng 100-500 μL celsuspensie in de poortader. Verwijder de katheter en sluit de venotomie af met hechtingen of lijm. Sluit de buik en controleer het herstel, geef indien nodig analgesie (Figuur 3B).

figure-protocol-3
Figuur 3: Transplantatie van eilandjes en eilandjesachtige cellen. (A) Steriele intraveneuze intracath die wordt gebruikt voor het transplanteren van eilandjes en eilandjesachtige cellen. (B) Transplantatie van eilandjes en eilandachtige cellen in een steriele spuit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

9. Streptozotocine (STZ) geïnduceerde diabetische ratten

  1. Snelle ratten 12 uur. 45 mg/kg STZ intraperitoneaal toedienen, opgelost in koude citraatbuffer (pH 4,5).
    OPMERKING: 12 uur vasten voorafgaand aan STZ-injectie verbetert de GLUT2-expressie, wat het glucosetransport in bètacellen van de alvleesklier vergemakkelijkt. Dit proces verhoogt de opname van STZ in de cellen, wat resulteert in grotere bètacelschade. Dit mechanisme vergemakkelijkt de progressie van meer significante hyperglykemie en verbetert de effectiviteit van het diabetesmodel.
  2. Bevestig diabetes 48-72 uur na injectie met een bloedglucose >250 mg/dL. Classificeer ratten die gewoonlijk bloedglucosewaarden van meer dan 250 mg/dL bereikten als diabetici en neem ze op in het experiment29.

10. Voorbereiding van eilandjes en eilandjesachtige cellen voor transplantatie

  1. Oogst de cellen na behandeling met de enzymatische dissociatieoplossing gedurende 1 min. Schraap cellen die zich aan het oppervlak hechten. Vervang door vers medium en verzamel cellen.
  2. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 min. Resuspendeer de pellet in 100-150 μL zoutoplossing. Voer een celtelling uit en pas het aantal cellen aan naar 1000 IEQ of 800 eilandjes per rat of 1 x 105 eilandachtige cellen per rat.

11. Transplantatie van de poortader

  1. Verdoof dieren door intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg).
  2. Ontsmet de buikstreek van het dier met een steriele oplossing (betadine of 70% ethanol). Omhul het operatiegebied met een steriel laken.
  3. Maak een incisie in de middellijn, ongeveer 2-3 cm lang, om toegang te krijgen tot de buikholte.
  4. Verplaats de darmen om de lever te onthullen. Zet de linker- en rechterlobben van de lever vast met steriele retractors. Leg het ventrale oppervlak van de lever bloot om de poortader te lokaliseren.
  5. Spoel de polyethyleenkatheter (PE-10 of PE-50) voor met een zoutoplossing en vul deze volledig. Gebruik een microchirurgische tang om een tak van de poortader vast te houden, meestal de linker of rechter zijtak.
  6. Voer een kleine venotomie uit (ongeveer 1-2 mm). Breng de katheter voorzichtig in op de plaats van de venotomie. Om verplaatsing te voorkomen, gebruikt u hechtmateriaal of een tang om de katheter te verankeren, meestal met behulp van een 6-0 hechtdraad.
  7. Controleer de nauwkeurige positionering van de katheter door geleidelijk steriele zoutoplossingen toe te dienen. De katheter leverde geleidelijk de geprepareerde eilandjescel en eilandvormige celsuspensie af in de poortader. Het totale volume is 100-500 μL.
  8. Na voltooiing van de infusie verwijdert u de katheter en gebruikt u steriele weefsellijm of resorbeerbare hechtingen om de venotomieplaats af te dichten.
  9. Voer bloedingsbeheer uit. Verplaats alle weefsels rond de lever en hecht de buikspieren met resorbeerbare draad. Zet de huid vast met hechtingen of clips.
  10. Houd het dier onder toezicht in een warme omgeving. Zorg voor geschikte pijnstillers voor pijnbestrijding tijdens het ontwaken uit de anesthesie (bijv. buprenorfine 0,1 mg/kg). Observeer dieren gedurende 48 uur. Onderzoek op tekenen van infectie, oedeem op de operatieplaats of bloeding30.

12. Bloedglucose monitoring

  1. Beoordeel de initiële bloedglucosewaarden. Houd de rat voorzichtig vast en gebruik een lancet om een kleine snee in het puntje van de staart te maken. Verwijder voorzichtig de eerste druppel bloed met behulp van een steriel wattenstaafje.
  2. Breng de tweede druppel bloed aan op de glucoseteststrip en documenteer de basisglucosespiegel31.

13. Intraperitoneale glucosetolerantietest

OPMERKING: Ratten ondergaan de intraperitoneale glucosetolerantietest (IPGTT) om de efficiëntie van hun glucoseklaring in hun bloedbaan te evalueren. Deze test biedt inzicht in het glucosemetabolisme, de insulinegevoeligheid en mogelijke diabetische aandoeningen. De intraperitoneale glucosetolerantietest werd uitgevoerd op dag 15 op dag 15 na de transplantatie. De belangrijkste reden voor het implementeren van een bepaalde vastenduur vóór de IPGTT is het stabiliseren van de basale glucosespiegels en het zorgen voor een consistente metabolische toestand. De vastenperiode vergemakkelijkt de uitputting van de leverglycogeenvoorraden, waardoor een betrouwbaardere evaluatie van de glucosetolerantierespons mogelijk is. 6 uur vasten vermindert de postprandiale effecten, terwijl 's nachts vasten (ongeveer 12-16 uur) duidelijke implicaties kan hebben, die mogelijk de insulinegevoeligheid en het glucosemetabolisme kunnen beïnvloeden.

  1. Onderwerp ratten aan een vastenperiode van 6 uur, waarbij alleen 's nachts toegang tot water is toegestaan, zodat de vastenduur niet langer is dan 12 uur. Zorg voor een uniforme vastenperiode voor alle proefpersonen om de variabiliteit in glucosemetingen te verminderen.
  2. Voordat glucose wordt toegediend, weegt u de ratten. Om een steriele oplossing te bereiden, lost u 20 g glucose op in 100 ml steriele zoutoplossing.
    OPMERKING: De standaarddosering is over het algemeen 2 g glucose/kg lichaamsgewicht (2 g/kg). Het opgegeven totale volume wordt bepaald door het lichaamsgewicht van het dier.
  3. Beoordeel de basislijn van de bloedglucosespiegels. Houd de rat vast en gebruik een lancet om een kleine incisie te maken aan het puntje van de staart. Verwijder voorzichtig de eerste druppel bloed met een steriel wattenstaafje.
  4. Breng de tweede druppel bloed aan op de glucoseteststrip en noteer de basisglucosespiegel.
  5. Op basis van het lichaamsgewicht van de rat wordt de juiste hoeveelheid glucoseoplossing toegediend met een snelheid van 2 g/kg.
  6. Vóór intraperitoneale (IP) toediening van de glucoseoplossing moet u de rat voorzichtig hanteren. Injecteer glucose in de peritoneale holte, niet in onderhuids weefsel of enig orgaan, en zorg ervoor dat het correct wordt toegediend.
  7. Verzamel na de glucose-injectie met gespecificeerde tussenpozen bloedmonsters om de glucosespiegels te controleren. Typische tijdsintervallen zijn 15, 30, 60, 90 en 120 minuten na injectie.
  8. Verzamel op elk punt bloed door de staartader door te snijden. Zorg er voor elke bloedafname voor dat de staart wordt afgeveegd met een alcoholdoekje.
  9. Meet op elk aangewezen tijdstip de glucosespiegels en documenteer deze met behulp van een glucosemeter.
  10. Controleer de ratten tijdens de test op tekenen van ongemak of bijwerkingen. Om stress voor de dieren tussen de metingen tot een minimum te beperken, moet u een warme en rustige omgeving aanhouden.
  11. Maak na de laatste bloedglucosemeting de staartwonden schoon en troost de dieren29.

14. Analyse van insuline via ELISA na bloedafname

OPMERKING: De stappen in dit protocol zijn voor het afnemen van bloed uit de abdominale aorta van een rat en vervolgens het gebruik van de enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA)-methode om op insuline te testen.

  1. Verdoof de rat vóór de bloedafname zoals eerder beschreven. Plaats de verdoofde rat in rugligging op een steriel chirurgisch platform.
  2. Scheer de buikstreek en desinfecteer het gebied met 70% ethanol of jodiumoplossing om steriliteit te garanderen.
  3. Maak een incisie in de middellijn met een scalpel om de huid en spierlagen binnen te dringen en de buikholte bloot te leggen.
  4. Trek de darmen terug om toegang te krijgen tot de abdominale aorta die zich naast de wervelkolom bevindt. Gebruik een gehepariniseerde spuit om de naald onder een kleine hoek in de abdominale aorta in te brengen.
  5. Verzamel bloed (meestal 1-3 ml, afhankelijk van de grootte van de rat) in de spuit. Pas geleidelijke en consistente zuigkracht toe om vasculaire collaps of hemolyse van het bloed te voorkomen.
  6. Doe het verzamelde bloed in een centrifugebuis en bewaar het op ijs.
  7. Als het dier na de procedure moet worden geëuthanaseerd, voer dan euthanasie uit in overeenstemming met de ethische richtlijnen van de instelling.
  8. Centrifugeer het afgenomen bloed bij 300 x g gedurende 10-15 minuten bij 4 °C om scheiding van plasma of serum te garanderen. Breng het bovenstaande over in een nieuw buisje en bewaar het bij -80 °C voor daaropvolgende insulineanalyse.
    OPMERKING: Het is belangrijk om hemolyse tijdens bloedafname te vermijden, omdat dit de nauwkeurigheid van ELISA-resultaten kan beïnvloeden (Figuur 4)29.

figure-protocol-4
Figuur 4: Bloedmonsters werden verkregen uit de staartader van ratten in bloedbuisjes voor insulineanalyse aan het einde van het experiment op dag 15 na de transplantatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

15. Insulinemeting door ELISA

  1. Bereid de insuline-ELISA-kit voor volgens de instructies van de fabrikant. Laat alle reagentia, standaarden en monsters op kamertemperatuur komen voordat u met de test begint.
  2. Bepaal het vereiste aantal putjes op de ELISA-plaat voor standaarden, controles en serummonsters van ratten.
  3. Bereid de serummonsters van ratten voor op analyse door ze te verdunnen zoals aangegeven in het ELISA-kitprotocol, bijv. 1:10 verdunning in PBS.
  4. Bereid insulinestandaarden voor door middel van seriële verdunning om een standaardcurve te genereren, bijvoorbeeld van 0 tot 10 ng/ml.
  5. Doseer standaarden, controles en verdunde serummonsters van ratten (meestal 50-100 μl per putje) in de aangegeven putjes van de ELISA-plaat. Doseer de detectie-antilichaamoplossing die bij de kit is geleverd in elk putje om een gelijkmatige verdeling te garanderen.
  6. Incubeer de plaat gedurende de aangegeven tijd (meestal 1-2 uur) bij kamertemperatuur of volgens de meegeleverde instructies.
  7. Zorg er na de incubatie voor dat de putjes worden gewassen met de aangewezen wasbuffer, meestal PBS met 0,05% Tween-20, om ongebonden stoffen te verwijderen. Voer de wasstap 3x tot 5x uit volgens de instructies van de kit en zorg ervoor dat de resterende vloeistof na elke wasbeurt volledig is verwijderd.
  8. Plaats de substraatoplossing in elk putje. Het substraat zal interageren met het antilichaam dat aan het enzym is gebonden, waardoor een kleurverandering ontstaat; De intensiteit van de kleur is gerelateerd aan de hoeveelheid insuline die in het monster aanwezig is. Incubeer de plaat in het donker voor de duur die door de kit wordt aangegeven, meestal variërend van 15 tot 30 minuten.
  9. Voeg de stopoplossing toe aan elk putje om de colorimetrische reactie te beëindigen. De kleurverandering zal stabiliseren na de toevoeging van de stopoplossing, die meestal geel is.
  10. Meet onmiddellijk de optische dichtheid (OD) van elke put met behulp van een plaatlezer die is ingesteld op 450 nm (of zoals gespecificeerd door de kit).
  11. Genereer een standaardcurve door de bekende concentraties van insulinestandaarden uit te zetten tegen de overeenkomstige waarden voor optische dichtheid (OD).
  12. Bereken de insulineconcentratie in serummonsters van ratten met behulp van de standaardcurve en de bijbehorende OD-waarden. Insulinespiegels moeten worden gerapporteerd in ng/ml of andere geschikte eenheden29.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Analyse van lichtmicroscopie

Tijdens de 14edag onderzoeken van ductale cellen bleek uit lichtmicroscopie-analyse dat de cellen zich groepeerden en een eilandje-achtige structuur vormden. Deze structurele verandering geeft aan dat ductale cellen na een bepaalde periode hun morfologische kenmerken veranderen door een organisatorische orde binnen te gaan en een eilandachtig uiterlijk te krijgen. De neiging van de cellen om te clusteren...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De studie van de functionele capaciteit van eilandachtige cellen uit verschillende bronnen heeft veel belangstelling getrokken voor diabetesonderzoek. Eerste onderzoek toont aan dat deze cellen insuline kunnen afgeven wanneer de glucosespiegel wordt verhoogd, wat suggereert dat ze de functies van natuurlijke pancreaseilandjes kunnen nabootsen. Onderzoekers hebben dithizonkleuring gebruikt om de fenotypische gelijkenis van eilandachtige cellen met pancreaseilandjes te verifiëren, zoals bl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Er werd geen potentieel belangenconflict gemeld door de auteur(s).

Dankbetuigingen

De auteurs willen het laboratoriumteam bedanken voor hun bijdragen aan de studie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.9% Sodium ChlorideSahar PharmaVoor verwijdering van pancreas en celtransplantatie
10 mL serologische pipette - sterieleCorning4488Voor isolatie
24 well plateCorning353047Voor GSIS 
25 mL serologische pipette - sterieleCorning4489Voor isolatie
70% ethanol ISOLAB64-17-5Voor desinfectie van ratten
betadine Baticonol 1186Voor desinfectie van ratten
Biocholl 1077SigmaL6715-BCVoor pancreas zuivering
Biocoll, Dichtheid 1.10 g/mLSigmaL6155-BCVoor pancreas zuivering
Bloed glucose meters en glucose test stripsOn Call PlusVoor meten bloed glucose
BSASigmaA9418Voor voorbereiding van krebs
CaCl2Sigma57647902Voor voorbereiding van krebs
Catheter samenstelling: Polyethyleen catheter (intraveneus intracath) Bicakcilar24G en 14GVoor pancreas en lever 
CentrifugeThermoST1R PlusVoor isolatie 
Collageenase Type V, ≥ 1 FALGPA units/mg solid,
>125 CDU/mg solid 		SigmaC9263- 1GVoor pancreas vertering
D-(+)-glucose Sigma50-99-7Voor GSIS en IPGTT
Dithizone (DTZ)SigmaD5130Voor eilandje bepaling
DMSOSigmaD8779Voor oplossen in DTZ
Dulbecco’s Gemodificeerd Eagles Medium (DMEM—lage glucose) Gibco11885084Voor celcultuur
Eppendorf tubeISOLABVoor cel wassen
Falcon tube (50 mL)ISOLABLB.IS.078.02.009Voor isolatie
fetaal bovien serum (FBS)SigmaN4637Voor pancreas isolatie en cultuur
Fijne naald en hechtmateriaal (maat 6-0 of 7-0)PROLENE Blue 18" P-1 Naald | 8697GVoor verwijdering van pancreas en celtransplantatie
glucagon-like peptide 1 (GLP-1) Aladdinrp174144Voor Cel Cultuur
Hank's balanced salt solution (HBSS met Ca-Mg) CapricornHBSS-1AVoor enzym voorbereiding
HBSS geen calcium, geen magnesium, geen fenolroodBIOCHROM L2015Voor pancreas isolatie
HEPESLonzaVoor celcultuur
Insulin ElisaAlpco80-INSRT-E01Voor insuline elisa
insuline-transferrine-selenium (ITS)GibcoITS -GVoor celcultuur
Isoxazole 9 (ISX-9) AladdinI304735-10mgVoor celcultuur
KClSigma329820207Voor voorbereiding van krebs
Ketamine HCl 200 mg/mLNexGenVoor ratten anesthesie
Laminaire stroomkastenLabor IldamBSC-1100IIA2-XVoor isolatie en Cultuur periode
LancettenAyset28 GVoor meten bloed glucose
L-glutamine Sigma59202cVoor pancreas isolatie en cultuur
MgCl2Sigma329759772Voor voorbereiding van krebs
microplate readerBioTek SynergyH1 Multimode ReaderVoor insuline elisa
microplate shakerVWR 444-0270Voor insuline elisa
Microchirurgisch microscoopEMZ-200TR 3.9X Voor verwijdering van pancreas en celtransplantatie
Microchirurgische scharen en pincettenAesculapVoor verwijdering van pancreas en celtransplantatie
Millicell Hanging Cell Culture Insert, polyethyleen tereftalaat 8.0µm MILLIPOREPIEP30R48 Voor GSIS 
NaClSigma7647-14-5Voor voorbereiding van krebs
NaHCO3Sigma144-55-8Voor voorbereiding van krebs
Pasteur Pipette 3 MlBIOSIGMAVoor isolatie
penicilline/streptomycine SigmaVoor pancreas isolatie en cultuur
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) BIOCHROM L1815Voor celpassage
Retractor (voor de stabilisatie van de lever en bindweefsels)AesculapVoor verwijdering van pancreas en celtransplantatie
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI met L-Gln)CapricornRPMI-AVoor pancreas isolatie en cultuur
Steriele katoenen tipDynarexVoor verwijdering van pancreas en celtransplantatie
Steriele spuit (10 mL)Ayset32MM 22GVoor Collegenase reactie
StopwatchKenkoKK613DVoor IPGTT
Streptozotocin (STZ) Sigma18883-66-4Voor het voorkomen van diabetische ratten
Spuitpomp Filter Unit (GP-0.22 µm-3 mm)MillexSLGP033RSVoor sterilisatie van celcultuur media
T25 flaskThermo130189Voor cultuur
TrypLE Express reagentiaGibcoVoor celpassage
Waterbad Labor IldamALB128Voor Collegenase reactie
Xylazine 2% w/v oplossing voor injectieRompunVoor ratten anesthesie

Referenties

  1. Nichols, G. A., Kimes, T. M., Harp, J. B., Kou, T. D., Brodovicz, K. G. Glycemic Response and Attainment of A1C Goals Following Newly Initiated Insulin Therapy for Type 2 Diabetes. Diabetes Care. 35 (3), 495-497 (2012).
  2. Shapiro, A. M. J., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New Engl J Med. 343 (4), 230-238 (2000).
  3. Barton, F. B., et al. Improvement in Outcomes of Clinical Islet Transplantation: 1999-2010. Diabetes Care. 35 (7), 1436-1445 (2012).
  4. Jacobson, A., et al. Biomedical Risk Factors for Decreased Cognitive Functioning in Type 1 Diabetes: An 18-year Follow-Up of the Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) Cohort. Diabetologia. 54 (2), 245-255 (2010).
  5. Rovner, A. J., et al. Development and Validation of the Type 1 Diabetes Nutrition Knowledge Survey. Diabetes Care. 35 (8), 1643-1647 (2012).
  6. Knopp, B., Perumareddi, P. An Atypical Presentation of Type 1 Diabetes. Arch Clin Cases. 8 (3), 46-49 (2021).
  7. Low, J. C., et al. Do Obese Children With Diabetic Ketoacidosis Have Type 1 or Type 2 Diabetes. Primary Care Diabetes. 6 (1), 61-65 (2012).
  8. Xu, X., et al. β cells can be generated from endogenous progenitors in injured adult mouse pancreas. Cell. 132 (2), 197-207 (2008).
  9. Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832(2011).
  10. Kim, B., et al. Differentiation of human labia minora dermis-derived fibroblasts into insulin-producing cells. Exp Mol Med. 44 (1), 26(2012).
  11. Campbell, S. C., et al. Selenium stimulates pancreatic beta-cell gene expression and enhances islet function. FEBS Lett. 582 (15), 2333-2337 (2008).
  12. Shaer, A., Azarpira, N., Vahdati, A., Karimi, M. H., Shariati, S. Differentiation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells Into Insulin-Producing Clusters. Exp Clin Transplantat. 13 (1), 68-75 (2015).
  13. Koh, S. H., et al. Differential Effects of Isoxazole-9 on Neural Stem/Progenitor Cells, Oligodendrocyte Precursor Cells, and Endothelial Progenitor Cells . PLoS One. 10 (9), e0138724(2015).
  14. Tsakmaki, A., Fonseca Pedro, P., Pavlidis, P., Hayee, B., Bewick, G. A. ISX-9 manipulates endocrine progenitor fate revealing conserved intestinal lineages in mouse and human organoids. Mol Metabol. 34, 157-173 (2020).
  15. Khan, S., Sur, S., Newcomb, C. J., Appelt, E. A., Stupp, S. I. Self-assembling glucagon-like peptide 1-mimetic peptide amphiphiles for enhanced activity and proliferation of insulin-secreting cells. Acta Biomaterialia. 8 (5), 1685-1692 (2012).
  16. White, A. M., et al. Engineering Strategies to Improve Islet Transplantation for Type 1 Diabetes Therapy. ACS Biomater Sci Eng. 6 (5), 2543-2562 (2020).
  17. Li, X., Meng, Q., Zhang, L. The Fate of Allogeneic Pancreatic Islets following Intraportal Transplantation: Challenges and Solutions. J Immunol Res. 2018, 1-13 (2018).
  18. Marín-Cañas, S., et al. Pancreatic ductal cells may have a negative effect on human islet transplantation. PLoS One. 14 (7), e0220064(2019).
  19. Webb, M. A., et al. The Impact of Potential Islet Precursor Cells on Islet Autotransplantation Outcomes. Cell Transplant. 22 (6), 1041-1051 (2013).
  20. Vendrame, F., et al. Recurrence of Type 1 Diabetes After Simultaneous Pancreas-Kidney Transplantation, Despite Immunosuppression, Is Associated With Autoantibodies and Pathogenic Autoreactive CD4 T-Cells. Diabetes. 59 (4), 947-957 (2010).
  21. Barron, E., et al. Associations of Type 1 and Type 2 Diabetes With COVID-19-related Mortality in England: A Whole-Population Study. Lancet Diabetes Endocrinol. 8 (10), 813-822 (2020).
  22. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  23. Blum, B., et al. Functional β-cells maturation is marked by an increase in the glucose threshold for insulin secretion and by expression of urocortin3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
  24. Karimi, N., Ozcan, G. B. Rat Ductal Cell-Derived Differentiation into Islet-Like Cells. Methods Mol Biol. , 1-15 (2024).
  25. Dagli Gul, A. S., Fadillioglu, E., Karabulut, I., Yesilyurt, A., Delibasi, T. The effects of oral carvacrol treatment against H2O2-induced injury on isolated pancreas islet cells of rats. Islets. 5 (4), 149-155 (2013).
  26. Noguchi, H., et al. Evaluation of Osmolality of Density Gradient for Human Islet Purification. Cell Transplant. 21 (2-3), 493-500 (2012).
  27. Boyuk, G., Yigit, A. A., Aydogan, I. Co-culture of rat luteal cells with islet cells enhances islet viability and revascularization. In Vitro Cell Dev Biol Animal. 54, 640-647 (2018).
  28. Karimi, N., Boyuk Ozcan, G. Isolation Procedure for Rat Pancreatic Ductal Cells. Methods Mol Biol. , (2024).
  29. Karakose, M., et al. Comparison of the Ovary and Kidney as Sites for Islet Transplantation in Diabetic Rats. Transplant Proc. 48, 2216-2220 (2016).
  30. Gou, W., Cui, W., Cui, Y., Wang, H. Minimizing post-infusion portal vein bleeding during intrahepatic islet transplantation in mice. J Vis Exp. (171), e62530(2021).
  31. Geiger, M. C., et al. Evaluation of Metabolic Control Using a Continuous Subcutaneous Glucose Monitoring System in Patients with Type 1 Diabetes Mellitus who Achieved Insulin Independence after Islet Cell Transplantation. Cell Transplant. 14 (2-3), 77-84 (2005).
  32. Farina, M., et al. 3D Printed Vascularized Device for Subcutaneous Transplantation of Human Islets. Biotechnol J. 12 (9), 1700169(2017).
  33. Biancone, L., et al. Platelet-Activating Factor Synthesis and Response on Pancreatic Islet Endothelial Cells: Relevance for Islet Transplantation. Transplantation. 81 (4), 511-518 (2006).
  34. Lee, Y. S., Lee, C., Choung, J. S., Jung, H. S. Glucagon-Like Peptide 1 Increases Β-Cell Regeneration by Promoting Α- To Β-Cell Transdifferentiation. Diabetes. 67 (12), 2601-2614 (2018).
  35. Akinci, E., Banga, A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Reprogramming of pancreatic exocrine cells towards a beta (β) cell character using Pdx1, Ngn3 and MafA. Biochem J. 442 (3), 539-550 (2012).
  36. Kalwat, M. A., et al. Isoxazole Alters Metabolites and Gene Expression, Decreasing Proliferation and Promoting a Neuroendocrine Phenotype in Β-Cells. Acs Chem Biol. 11 (4), 1128-1136 (2016).
  37. Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
  38. García-Ocaña, A., et al. Transgenic Overexpression of Hepatocyte Growth Factor in the β-Cell Markedly Improves Islet Function and Islet Transplant Outcomes in Mice. Diabetes. 50 (12), 2752-2762 (2001).
  39. Vegas, A. J., et al. Long-term glycemic control using polymer-encapsulated human stem cell-derived beta cells in immune-competent mice. Nat Med. 22 (3), 306-311 (2016).
  40. Zhang, W. J., et al. Evaluation of islets derived from human fetal pancreatic progenitor cells in diabetes treatment. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 141(2013).
  41. El-Kersh, A. O. F. O., El-Akabawy, G., Al-Serwi, R. H. Transplantation of human dental pulp stem cells in streptozotocin-induced diabetic rats. Anat Sci Int. 95 (4), 523-539 (2020).
  42. Lee, D. Y., Park, S. J., Nam, J. H., Byun, Y. Optimal aggregation of dissociated islet cells for functional islet-like cluster. J Biomater Sci Pol Ed. 19 (4), 441-452 (2008).
  43. Brissova, M., et al. Intraislet Endothelial Cells Contribute to Revascularization of Transplanted Pancreatic Islets. Diabetes. 53 (5), 1318-1325 (2004).
  44. Maxwell, K. G., Kim, M. H., Gale, S. E., Millman, J. R. Differential function and maturation of human stem cell-derived islets after transplantation. Stem Cells Transl Med. 11 (3), 322-331 (2022).
  45. Brissova, M., et al. Pancreatic Islet Production of Vascular Endothelial Growth Factor-A Is Essential for Islet Vascularization, Revascularization, and Function. Diabetes. 55 (11), 2974-2985 (2006).
  46. Chow, L. W., Wang, L., Kaufman, D. B., Stupp, S. I. Self-assembling Nanostructures to Deliver Angiogenic Factors to Pancreatic Islets. Biomaterials. 31 (24), 6154-6161 (2010).
  47. Assady, S., et al. Insulin Production by Human Embryonic Stem Cells. Diabetes. 50 (8), 1691-1697 (2001).
  48. Homma, J., Sekine, H., Shimizu, T. Tricultured Cell Sheets Develop into Functional Pancreatic Islet Tissue with a Vascular Network. Tissue Engineering Part A. 29 (7-8), 211-224 (2023).
  49. Loganathan, G., et al. Culture of Impure Human Islet Fractions in the Presence of Alpha-1 Antitrypsin Prevents Insulin Cleavage and Improves Islet Recovery. Transplaxt Proc. 42 (6), 2055-2057 (2010).
  50. Hilderink, J., et al. Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets. J Cell Mol Med. 19 (8), 1836-1846 (2015).
  51. Choi, H., Shinohara, M., Ibuki, M., Nishikawa, M., Sakai, Y. Differentiation of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Endocrine Progenitors to Islet-like Cells Using a Dialysis Suspension Culture System. Cells. 10 (8), 2017(2021).
  52. Ding, Y., Xia, S., Zhang, H., Chen, Q., Niu, B. Loureirin B Activates GLP-1R and Promotes Insulin Secretion in Ins-1 Cells. J Cell Mol Med. 25 (2), 855-866 (2020).
  53. O'Mara, B. A., Liehuaa, L., Ahrén, B. Stromal Derived Factor 1 Alpha (SDF-1a) in a Dual Therapy With the DPP-4 Inhibitor 1 Vildagliptin Does Not Enhance Beta Cell Function but Improves Glucose Clearance After Oral Glucose in Streptozotocin Diabetic Mice. J Chem Biol Ther. 1, 110(2016).
  54. Caporarello, N., Parrino, C., Trischitta, V., Frittitta, L. Insulin Receptor Signaling and Glucagon-Like Peptide 1 Effects on Pancreatic Beta Cells. Plos One. 12 (8), e0181190(2017).
  55. Schwenk, R. W., et al. GLP-1-oestrogen Attenuates Hyperphagia and Protects From Beta Cell Failure in Diabetes-Prone New Zealand Obese (NZO) Mice. Diabetologia. 58 (3), 604-614 (2014).
  56. He, Y., et al. Reversal of Early Diabetic Nephropathy by Islet Transplantation under the Kidney Capsule in a Rat Model. J Diabetes Res. 2016, 1-12 (2016).
  57. Yun, F., Zhaorigen, B., Han, X., Li, X., Yun, S. Islet-Like Cells Induced from Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells with Neonatal Bovine Pancreatic Mesenchymal Exosomes for Treatment of Diabetes Mellitus. Hormone Metabolic Res. 56 (06), 463-470 (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Diabetes type 1insulineproductiepancreatische bètacelleneilandceltransplantatieverlaging van de bloedglucosewaardeintraperitoneale glucosetolerantiestreptozotocine-diabetische rattenimmuunbescherming

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.