Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Levende cel Förster resonantie energieoverdracht beeldvorming van metabolisch gereguleerde akt-activeringsdynamiek in HepG2-cellen

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68075

⸱

23 mei 2025

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biocomplexity and Engineering Biology, School of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 2Futian Biomedical Innovation R&D Center, The Chinese University of Hong Kong, 3Ciechanover Institute of Precision and Regenerative Medicine, School of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Immunology and Microbiology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology, 6Department of Computer Science and IT, University of Southern Punjab

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om de spatiotemporele dynamiek van Akt-activering en fosforylering in levende HepG2-cellen te kwantificeren. Förster resonantie energieoverdracht (FRET) beeldvorming is een krachtig hulpmiddel dat waardevolle inzichten biedt in insulinesignaleringsroutes en metabole regulatie in kankercellen.

Samenvatting

Metabolisch gereguleerde Akt-activering is een cruciaal knooppunt in de insulinesignaleringscascade en biedt waardevolle inzichten in de relatie tussen diabetes en kanker. Om de Akt-activiteit in HepG2-cellen nauwkeurig te kwantificeren, hebben we een robuust, reproduceerbaar protocol ontwikkeld dat gebruikmaakt van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) met genetisch gecodeerde Akt-specifieke biosensoren. Dit protocol schetst gedetailleerde stappen voor celkweek, bereiding van beeldvormingsschotels en transfectie van HepG2-cellen om FRET-gebaseerde biosensoren tot expressie te brengen, naast specifieke richtlijnen voor de hardware- en softwareconfiguratie van confocale microscoop met laserscanning. De resultaten toonden unieke patronen van insulinesignalering in HepG2-cellen, die een onomkeerbare schakelaar vertonen die wordt gekenmerkt door constitutieve Akt-activering met een gedefinieerde inschakeldrempel maar geen uitschakeldrempel. Myotubes daarentegen hebben een omkeerbare schakelaar. De aanhoudende Akt-activering in HepG2-cellen suggereert mechanismen die ten grondslag liggen aan insulineresistentie en metabole ontregeling in levercellen, met bredere implicaties voor het begrijpen van de progressie van metabole stoornissen en kanker. Dit protocol biedt een waardevol kader voor het verkennen van Akt-gerelateerde signaalroutes en cellulair gedrag in verschillende ziektecontexten.

Inleiding

Diabetes mellitus vormt een grote wereldwijde gezondheidsuitdaging, gekenmerkt door insulineresistentie en verminderde glucosehomeostase1. Een uitgebreid begrip van insulinesignaleringsroutes is cruciaal voor het ophelderen van de pathofysiologie van deze ziekte, aangezien insuline een cruciale rol speelt in het glucosemetabolisme, de celgroei en de overleving2. Talrijke onderzoeken hebben aangetoond dat insulinesignalering een aanzienlijke invloed heeft op verschillende vormen van kanker, waarbij insulineresistentie wordt gekoppeld aan tumorprogressie en slechte patiëntresultaten 3,4,5,6. HepG2-cellen, een veelgebruikte hepatocellulaire carcinoomcellijn, dienen als een waardevol model voor het bestuderen van insulineresistentie en de wisselwerking tussen metabole ontregeling en de ontwikkeling van kanker7. Traditioneel hebben onderzoekers insulineresponsen als gradatief beschouwd; Recente studies hebben echter aangetoond dat individuele cellen bistabiele reacties kunnen vertonen, waarbij opvallende overgangen tussen niet-responsiviteit en volledige respons optreden bij specifieke insulineconcentratiedrempels 8,9.

Förster resonantie energieoverdracht (FRET) beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de spatio-temporele verdeling van biomoleculen in levende cellen10. Door informatie uit de moleculaire dynamica te halen, biedt FRET in realtime inzicht in processen zoals Akt-activering, waardoor het een techniek van onschatbare waarde is voor het bestuderen van levende cellen11,12. Deze beeldvormingsmethode is essentieel gebleken bij het bestuderen van cellulaire dynamiek, met name bij stofwisselingsziekten en kanker, waar nauwkeurige moleculaire interacties cruciaal zijn13. FRET maakt ook real-time monitoring van moleculaire interacties mogelijk, wat licht werpt op mechanismen zoals insulineresistentie en tumorprogressie14,15. FRET-biosensoren zijn cruciaal in kankeronderzoek voor het bestuderen van tumormicro-omgevingen, resistentie tegen geneesmiddelen en stofwisselingsstoornissen16. FRET-detectiemethoden, zoals gesensibiliseerde emissie (SE), acceptorbleking (AB), fluorescentielevensduurbeeldvormingsmicroscopie (FLIM) en spectroscopie, bieden elk duidelijke voordelen voor het kwantificeren van moleculaire interacties17. SE meet de energieoverdracht tussen donor- en acceptorfluoroforen, wat resulteert in een meetbare verschuiving in emissiespectra die correleert met de nabijheid van interagerende biomoleculen18. AB maakt gebruik van selectieve fotobleking van de acceptorfluorofoor en volgt veranderingen in donorfluorescentie, waardoor onderzoekers de kinetiek en afstanden van de interactie kunnen beoordelen19. FLIM evalueert de fluorescentievervalsnelheden van de donorfluorofoor, rechtstreeks beïnvloed door FRET-efficiëntie, om nauwkeurige metingen op nanoschaal van moleculaire interacties te bieden20.

Met behulp van FRET-technieken hebben we onlangs bistabiele insulineresponsen aangetoond in C2C12-afgeleide myotubes 8,9,21,22,23,24. De duidelijke in- en uitschakeldrempels voor Akt-activering, zoals we ontdekten, suggereren dat de graduele insulinedosisrespons van het hele lichaam de complexiteit van de subcellulaire signaalcascade logenstraft, beginnend bij insulinestimulus, die culmineert in een alles-of-niets-respons op het niveau van één cel 21,22,23,24. Om de aanwezigheid van bistabiliteit in andere celtypen te testen, stimuleerden we HepG2-cellen met insuline en registreerden we hun respons met behulp van eencellige FRET-beeldvorming. We stimuleerden HepG2-cellen met variërende insulineconcentraties en volgden de Akt-activiteit op eencellig niveau met behulp van een Akt-biosensor. De Akt-biosensor bestaat uit verbeterd cyaan fluorescerend eiwit (ECFP)25 als donorfluorofoor en de helderste variant van geel fluorescerend eiwit (YPet)26 als acceptorfluorofoor, verbonden door een Eevee-linker die de peptidesequentie SGRPRTTTFADSCKP bevat. Dit peptide fungeert als een substraat voor gefosforyleerd Akt (pAkt), geoptimaliseerd uit humaan glycogeensynthasekinase 3β (GSK3β). In niet-gefosforyleerde toestand overschrijdt de ruimtelijke scheiding tussen de donor- en acceptorfluoroforen de Förster-straal, die de energieoverdracht remt. Bij insulinestimulatie treedt Akt-fosforylering op en leidt tot de fosforylering van SGRPRTTTFADSCKP. Dit proces induceert een conformatieverandering die de donor en acceptor binnen de Förster-straal brengt, waardoor FRET27 mogelijk wordt. Als gevolg hiervan correleert de FRET-signaalintensiteit met de hoeveelheid gefosforyleerde Akt-moleculen en maakt het real-time kwantificering van insuline-gemedieerde cellulaire responsen mogelijk.

Dit protocol, oorspronkelijk ontwikkeld om insulinesignalering in C2C12-afgeleide myotubes te bestuderen, is met succes toegepast op HepG2-cellen en gebruikt op verschillende hardware- en softwareplatforms, waardoor de toepasbaarheid, het aanpassingsvermogen en de veelzijdigheid ervan worden aangetoond. HepG2-cellen vertonen constitutieve Akt-activiteit, waardoor ze een ideaal in vitro model zijn om leverspecifieke insulinesignalering en metabolische processen te bestuderen. De belangrijkste kenmerken van het protocol worden stap voor stap beschreven in het protocolgedeelte.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Een overzicht van de experimentele stappen die betrokken zijn bij FRET live-cell imaging om Akt-fosforylering in afzonderlijke HepG2-cellen te monitoren, wordt weergegeven in figuur 1.

1. Verwerving, vermeerdering en zuivering van plasmide

OPMERKING: Dit gedeelte schetst de essentiële stappen voor het verkrijgen, versterken en zuiveren van het plasmide dat nodig is voor eencellige FRET-analyse.

  1. Gebruik het pEevee-iAkt-NES-YPet-plasmide (Figuur 2A).
    OPMERKING: Het plasmide werd genereus ter beschikking gesteld door Prof. Kazuhiro Aoki van het National Institute for Basic Biology (NIBB), Japan.Plasmidekaarten voor de FRET-biosensoren die worden gebruikt voor Akt-monitoring en hun respectievelijke controles zijn weergegeven in figuur 2. De pEevee-iAkt-NES-ECFP (donor; Figuur 2B) en pEevee-iAkt-NES-Ypet (acceptor; Figuur 2C) plasmiden worden gebruikt als kalibratiecontroles tijdens FRET-experimenten9.
    OPMERKING: Figuur 3 toont de samenstelling en het mechanisme van de intramoleculaire FRET-biosensor.
  2. Om het plasmide te vermeerderen, voert u bacteriële transformatie uit met behulp van chemisch competente E. coli-cellen (zie Materiaaltabel). Plaats de getransformeerde cellen op Luria-Bertani (LB)-agar met 100 μg/ml ampicilline en incubeer een nacht bij 37 °C. Selecteer de volgende dag een ampicilline-resistente kolonie en kweek deze in LB-bouillon aangevuld met 100 μg/ml ampicilline voor plasmideamplificatie.
  3. Om het plasmide-DNA te zuiveren, gebruikt u een in de handel verkrijgbare plasmide-DNA-zuiveringskit (zie materiaaltabel) om een hoge zuiverheid en opbrengst te verkrijgen. Beoordeel de DNA-kwaliteit door de absorptieverhoudingen (A260/A280 en A260/A230) te meten met behulp van een spectrofotometer (zie materiaaltabel). Verhoudingen tussen 1,8-2,0 en 2,0-2,2 worden als optimaal beschouwd. Controleer de integriteit van het plasmide door middel van agarosegelelektroforese om ervoor te zorgen dat het geschikt is voor transfectie.

2. Procedure voor celkweek

OPMERKING: Voer alle celkweekprocedures uit in een laminaire stromingskap om een steriele omgeving te behouden en besmetting te voorkomen. De HepG2-celcultuurworkflow wordt weergegeven in figuur 4. Complete media voor HepG2-cellen bestaan uit minimaal essentieel medium (MEM), 10% foetaal runderserum (FBS), 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA), 1 mM natriumpyruvaat, 2 mM L-glutaminesupplement, 100 E/ml penicilline-streptomycine en 2,5 μg/ml antibiotische-antimycotische oplossing (zie materiaaltabel, tabel 1).

  1. Ontdooi bevroren HepG2-cellen snel door de injectieflacon in een thermomixer of waterbad van 37 °C te plaatsen tot deze volledig is ontdooid.
  2. Breng de ontdooide cellen over in een conische buis van 15 ml met 10 ml volledig groeimedium (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Verwarm het volledige groeimedium voor gebruik voor op 37 °C om thermische schokken voor de cellen te minimaliseren.
  3. Centrifugeer de buis op 200 x g gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren.
  4. Zuig het bovenstaande voorzichtig op met behulp van een pipetpunt met brede boring om te voorkomen dat de celpellet wordt verstoord.
  5. Resuspendeer de korrel in 10 ml vers compleet groeimedium.
  6. Breng de celsuspensie over in een weefselkweekkolf van 75 cm².
  7. Incubeer de kolf bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2
    OPMERKING: Observeer de cellen gedurende de volgende 24-48 uur om de gehechtheid te bevestigen en het herstel te beoordelen. Verstoor de cellen niet gedurende ten minste 4 uur om een goede bevestiging te garanderen voordat u het medium vervangt. Vermijd het regelmatig openen van de broedmachine gedurende de eerste 4 uur, omdat dit de celhechting kan verstoren. Volg de bioveiligheidsprotocollen van de instelling en gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) om een veilige werkomgeving te behouden tijdens alle celkweekprocedures. Subcultuur HepG2-cellen wanneer ze 70%-80% samenvloeiing bereiken voor het behoud van optimale groeiomstandigheden en het voorkomen van overbevolking, wat de levensvatbaarheid en het groeipotentieel van cellen kan beïnvloeden.
  8. Voor subcultuur aspireert u het medium op en spoelt u de cellen eenmaal met 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  9. Voeg 1 ml 0,25% trypsine toe om de celmonolaag te bedekken (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de trypsine is voorverwarmd tot 37 °C voor een optimale activiteit. Trypsineer de cellen niet te veel, omdat dit de levensvatbaarheid kan verminderen. Bewaak de cellen onder een microscoop om de loslating te bevestigen.
  10. Incubeer bij 37 °C gedurende ongeveer 5 minuten.
  11. Wanneer de cellen loskomen, voeg dan 2 ml volledig medium toe om de trypsine te neutraliseren en verzamel de cellen door te pipetteren.
  12. Piket voorzichtig de celsuspensie om klonten te breken en een eencellige suspensie te verkrijgen.
  13. Voeg 3 ml volledig medium toe aan elke nieuwe kolf en breng de cellen vervolgens in een splitsingsverhouding van 1:2 over naar elke kolf.
    OPMERKING: Voor vroege passages splitst u de cellen in een verdunning van 1:2. Na de passages 4-5 kunnen verdunningen van 1:4 of 1:5 worden uitgevoerd, indien van toepassing.
  14. Incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 .
    OPMERKING: Controleer de cellen na 24 uur om de bevestiging te bevestigen en het herstel te beoordelen.
  15. Vervang voor routinematige teelt het kweekmedium elke 2-3 dagen of eerder als de pH-indicator verandert van roze naar geel, wat verzuring aangeeft.
    OPMERKING: Laat het medium niet te zuur worden, dit kan de cellen beschadigen.
  16. Controleer de celmorfologie regelmatig onder een microscoop om de gezondheid van de cellen te garanderen.
    OPMERKING: Voor kortstondige opslag HepG2-cellen invriezen bij -80 °C; Bewaar voor langdurige opslag in vloeibare stikstof. De samenstelling van het vriesmedium dat in dit experiment is gebruikt, wordt beschreven in (Tabel 2).

3. Beeldvormingsschalen coaten met poly-l-lysine

  1. Gebruik 1 ml van een 0,1 mg/ml Poly-L-Lysine-oplossing per beeldschaaltje om het hele oppervlak te bedekken (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Pas de Poly-L-Lysine-concentratie aan op basis van specifieke celtypevereisten.
  2. Schud de schaal voorzichtig om een uniforme coating van het kweekoppervlak te krijgen.
    OPMERKING: Zorg tijdens het hele proces voor steriele omstandigheden om besmetting te voorkomen.
  3. Incubeer de gerechten een nacht bij kamertemperatuur (RT).
  4. Zuig overtollige Poly-L-Lysine-oplossing uit de vaat door uit te pipetteren.
  5. Spoel het oppervlak drie keer af met PBS en laat telkens 5 minuten rusten (zie materiaaltabel). Verwijder de ongebonden Poly-L-Lysine volledig uit de beeldvormingsschaal om remming van de celgroei te voorkomen. Spoel de platen voorzichtig af om te voorkomen dat ze de glazen bodem schrapen of beschadigen.
  6. Laat de gecoate beeldvormingsschaaltjes gedurende ten minste 3 uur aan de lucht drogen bij 37 °C.
  7. Gebruik de gecoate beeldvormende schaaltjes onmiddellijk of bewaar ze maximaal 2 weken bij 4 °C.

4. Transfectie van HepG2-cellen

OPMERKING: De HepG2-transfectiemethode wordt geïllustreerd in figuur 5.

  1. Zaad HepG2-cellen in voorgecoate beeldvormingsschotels 24-48 uur voorafgaand aan transfectie om ervoor te zorgen dat ze 70%-90% samenvloeiing bereiken.
  2. Ontdooi het transfectiereagens en het plasmide dat codeert voor de FRET-biosensor op ijs. Draai grondig en voer een korte spin uit (bijv. 5.000 x g gedurende 5 s) voor gebruik (zie Materiaaltabel).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het transfectiereagens en het plasmide vóór gebruik volledig zijn ontdooid.
    VOORZICHTIGHEID: Vermijd herhaalde vries-dooicycli, aangezien dit de efficiency van het transfectiereagens kan verminderen.
  3. Voeg 8 μg plasmide dat codeert voor de FRET-biosensor met de reactiebuffer toe tot een eindvolume van 100 μL. Meng goed door 5 s te vortexen op hoge snelheid (ongeveer 3.000-5.000 x g).
    OPMERKING: Voeg altijd plasmide toe aan de buffer voordat u het op polymeren gebaseerde transfectiereagens toevoegt. Ten minste 50 μl van de oplossing moet bestaan uit de reactiebuffer (zie materiaaltabel).
  4. Voeg 2,4 μL van het transfectiepolymeer toe aan de buis die het verdunde plasmide-DNA bevat. Meng goed door 15 s op hoge snelheid te vortexen (ongeveer 3.000-5.000 × g).
    OPMERKING: Gebruik altijd 0,3 μL van het transfectiepolymeer per 1 μg DNA.
    VOORZICHTIGHEID: Zorg ervoor dat het transfectiepolymeer grondig wordt gemengd met het plasmide-DNA om uniforme nanodeeltjescomplexen te vormen.
  5. Incubeer het mengsel van biosensor en polymeer gedurende 15 minuten bij 37 °C om nanodeeltjescomplexen te vormen.
    OPMERKING: Vermijd het houden van het transfectiepolymeer in oplossing voor meer dan 30 min, aangezien dit de transfectieefficiency kan verminderen.
    VOORZICHTIGHEID: Bewaak de incubatietijd zorgvuldig om overincubatie te voorkomen, die tot verminderde transfectieefficiency kan leiden.
  6. Draai de buis gedurende 5 s op 5.000 x g om de inhoud op de bodem op te vangen en voeg vervolgens de volledige 100 μL nanodeeltjescomplexoplossing druppelsgewijs toe aan het celkweekmedium. Schud de plaat voorzichtig heen en weer om te mengen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de complexe oplossing van nanodeeltjes druppelsgewijs wordt toegevoegd om deze gelijkmatig over het celkweekmedium te verdelen.
    LET OP: Vermijd krachtig schommelen, omdat dit cellen kan losmaken of een ongelijkmatige verdeling van de complexen kan veroorzaken.
  7. Incubeer de plaat gedurende 4 uur tot een nacht bij 37 °C.
    OPMERKING: De incubatietijd kan worden aangepast op basis van experimentele behoeften, maar 4 uur is doorgaans voldoende voor efficiënte transfectie.
    LET OP: Vermijd langdurige incubatie (>16 uur), omdat dit de levensvatbaarheid van de cellen kan verminderen.
  8. Verwijder de nanodeeltjescomplexen door aspiratie uit de cellen, vervang ze door 2 ml vers volledig groeimedium en plaats de plaat terug in de incubator van 37 °C tot het moment van analyse. De piekexpressie bereikt doorgaans 48 uur na transfectie.
  9. Analyseer de cellen onder fluorescentiemicroscopie.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat de microscoop correct is gekalibreerd voor fluorescentiebeeldvorming om nauwkeurige resultaten te verkrijgen.
    LET OP: Minimaliseer de blootstelling van cellen aan intens licht tijdens beeldvorming om fototoxiciteit te voorkomen.

5. Uithongering van HepG2-cellen

OPMERKING: Na het voltooien van de transfectiestap, serum-verhonger de cellen vóór insulinestimulatie en FRET-weergave. Dit minimaliseert de activering van de Akt-route als gevolg van insuline in FBS en zorgt voor consistente basislijnniveaus van Akt-activiteit. De samenstelling van het hongermedium dat in dit experiment is gebruikt, wordt beschreven in (Tabel 3). BSA wordt geleverd in poedervorm. Om een oplossing van 0,1% (m/v) te bereiden, reconstitueert u 0,1 g BSA in 3 ml DMEM en mengt u grondig. Steriliseer de oplossing met behulp van een filter van 0,45 μm en stel het uiteindelijke volume in op 100 ml door DMEM toe te voegen.

  1. Verwijder het kweekmedium en spoel de beeldvormschalen twee keer gedurende 5 minuten af met 1x PBS.
    OPMERKING: De twee PBS-wasbeurten helpen om het resterende serum en eventuele insuline- of groeifactoren die het experiment kunnen verstoren, volledig te verwijderen.
  2. Voeg 2 ml hongermedium toe aan de beeldvormingsschalen (zie materiaaltabel). Voeg het medium voorzichtig toe aan de rand van de schaal om te voorkomen dat de cellen van de glazen bodem losraken. Incubeer gedurende 4 uur bij 37 °C.
    OPMERKING: De incubatie van 4 uur is optimaal voor het synchroniseren van het cellulaire metabolisme; De duur kan echter worden verlengd, afhankelijk van de experimentele behoeften.

6. FRET live-cell beeldvorming voor HepG2-cellen

OPMERKING: Dit gedeelte bevat instructies voor beeldvorming van FRET-live-cellen om de spatiotemporele dynamiek van Akt-fosforylering in afzonderlijke HepG2-cellen te volgen. Het is essentieel om de microscoopopstelling, hanteringsprocedures en beeldvormingsomstandigheden voor levende HepG2-cellen te optimaliseren, zoals hieronder beschreven. De microscoopopstelling is cruciaal voor het optimaliseren van de beeldvormingsomstandigheden voor FRET-beeldvorming. Volg de instelling van de PC/confocale laserscanmicroscopie (CLSM) stapsgewijs volgens de instructies van de fabrikant om een stabiele werking te garanderen. De aangepaste CLSM-configuratie voor FRET-beeldvorming wordt weergegeven in (Afbeelding 6).

  1. Zet de afstandsbediening aan om de microscoop, computer, scanner, laserlancering, piëzotrap en epifluorescentie-LED-lichtbron van stroom te voorzien. Zorg ervoor dat alle componenten correct zijn aangesloten voordat u ze inschakelt om mogelijke schade te voorkomen.
  2. Draai de sleutel naar de AAN-stand op de laserlancering en druk op de knoppen om beide lasers te activeren die nodig zijn voor FRET (laserlijnen van 457 nm en 514 nm).
    NOTITIE: Zorg ervoor dat de juiste filters en instellingen aanwezig zijn voor een optimale FRET-beeldvorming. De selectie van de laserlijn moet gebaseerd zijn op de excitatie- en emissieprofielen van de biosensor.
  3. Schakel de stekkerdoos in om de computer en monitor die op de microscoop zijn aangesloten van stroom te voorzien.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat alle verbindingen goed vastzitten voordat u ze inschakelt om schade aan de apparatuur te voorkomen.
  4. Log in op Windows en start de microscopiesoftware.
  5. Klik op A1 voor acquisitie om de beeldvormingsinstelling te starten. Selecteer de juiste optische configuraties op basis van de vereisten van het FRET-experiment.
  6. Pas het laservermogen en de gevoeligheid van de detector naar behoefte aan voor optimale beeldvormingsomstandigheden. Installeer de couveuse van de microscoop voorzichtig en zet deze vast met schroeven.
    OPMERKING: Draai de schroeven niet te vast om schade aan de couveuse of de microscooptafel te voorkomen.
  7. Vul het interne waterbad met steriel dubbel gedestilleerd water (ddH2O). Installeer de bovenste verwarmer stevig en schakel de voeding voor de podiumverwarmer, badverwarmer en lensverwarmer in (Afbeelding 7A).
    OPMERKING: Vul niet te vol om morsen in het systeem te voorkomen. Zorg ervoor dat alle kachels goed functioneren om consistente temperatuuromstandigheden te behouden voor beeldvorming van levende cellen.
  8. Gebruik de 40x olie-onderdompelingslens voor beeldvorming (zie materiaaltabel).
    NOTITIE: Raadpleeg de website van de fabrikant voor technische specificaties.
  9. Veeg de objectieflens af met lenspapier dat is bevochtigd met 95% ethanol. Plaats een klein druppeltje dompelolie op de objectieflens (Figuur 7B). Plaats het beeldschaaltje met de HepG2-cellen op de microscooptafel en zet het vast met de houder (Figuur 7C).
    NOTITIE: Zorg ervoor dat de beeldschotel goed is uitgelijnd en vastgezet om beweging tijdens de beeldvorming te voorkomen. Vermijd druk tegen de lens om schade aan zowel de lens als de glazen bodem van de schaal te voorkomen.
  10. Sluit de kamer en incubeer de cellen in de levende celkamer gedurende 1-2 uur om ze in evenwicht te laten komen (Figuur 7D).
  11. Pauzeer tijdens time-lapse-beeldvorming met specifieke tussenpozen en verwijder voorzichtig de media (Figuur 7E) en voeg vervolgens 1 ml vers bereide media toe met de gegeven insulineconcentratie (Figuur 7F, Materiaaltabel).
    OPMERKING: Bereid een insulinestockoplossing van 1 mg/ml door 1 mg insuline op te lossen in 1 ml 10 ml azijnzuur. Filtreer de oplossing door een steriel spuitfilter van 0,2 μm en bewaar de aliquots bij -20 °C.
  12. Start het ND Acquisition-venster vanuit het menu Bestand van de microscopiesoftware.
    OPMERKING: De ND-acquisitie-instelling wordt weergegeven in (Afbeelding 8).
  13. Selecteer het tabblad Tijd om het interval, de duur en de gewenste lussen voor time-lapse-beeldvorming in te stellen. Klik vervolgens op het tabblad XY en druk op de knop + toevoegen om individuele HepG2-cellen op te nemen voor beeldvorming.
  14. Als u meerdere cellen wilt toevoegen, zoekt u geschikte cellen, scant, stelt u scherp scherp en vergrendelt u de Point Spread Function (PSF). Herhaal deze stap voor elke nieuwe cel die wordt toegevoegd voor beeldvorming. Scan meerdere cellen op verschillende locaties binnen de beeldvormingsschalen om verschillende doelcellen te identificeren voor opname.
  15. Klik op het rode X-pictogram om de selectie van cellen op te heffen. Vink het vakje 'Z' aan om de Z-positie in te stellen. Nadat u alle parameters hebt geselecteerd, voert u de naam van het experiment in het vak 'Bestandsnaam' in.
  16. Klik op Bladeren om de doelmap te kiezen en schakel vervolgens het vakje Opslaan in bestand in. Druk op het tabblad Nu uitvoeren om de ND-acquisitie te starten. Het ND-acquisitievenster toont de real-time voortgang van de time-lapse-beeldvorming, inclusief verstreken en resterende tijd.
  17. Registreer basislijnmetingen gedurende maximaal 30 minuten zonder de cellen met insuline te stimuleren.
  18. Zoek geschikte cellen, zoom in/uit om een enkele cel scherp te stellen en selecteer cellen met een hoge fluorescentie-intensiteit. Voeg de cellen één voor één toe, tot een maximum van 6 cellen.
    OPMERKING: Beperk het aantal cellen om vertragingen bij het verkrijgen van afbeeldingen en bevriezing van vensters tijdens beeldvorming te voorkomen.
  19. Stel de tijd en beeldfrequentie in voor de time-lapse-beeldvorming. Start de time-lapse-beeldvorming.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat alle parameters, inclusief belichtingstijd en laservermogen, zijn geoptimaliseerd voordat u met de beeldvormingssessie begint.
  20. Pauzeer de beeldvorming met regelmatige tussenpozen, verwijder voorzichtig de media uit de schaal met glazen bodem en voeg 1 ml medium toe, aangevuld met de juiste insulineconcentratie.
  21. Hervat de beeldacquisitie. Herhaal stap 6.20 indien nodig.
  22. Klik aan het einde van het experiment op het tabblad Voltooien om te sluiten. Maak een back-up van verkregen afbeeldingen en sla ze veilig op voor analyse.

7. Gegevensanalyse

  1. Corrigeer de voorbewerkte time-lapse FRET-beeldvormingsgegevens van controlemonsters voor spectrale overspraak en CFP-autofluorescentie, wat resulteert in gecorrigeerde FRET-waarden en nauwkeurige FRET-efficiëntie. Gebruik beeldvormingssoftware voor het verkrijgen, verwerken en analyseren van FRET-beelden, volgens de protocollen die zijn uiteengezet in eerdere studies 27,28,29,30 (Figuur 9).

8. FRET efficiëntie berekeningen

  1. Om de FRET-efficiëntie te bepalen, verkrijg je zeven afbeeldingen: cel (IDA(D), IDD(D), IDA(A), IAA(A), IDD, IAA en IDA). Bereken de FRET-efficiëntie met behulp van de volgende formule:
    figure-protocol-1
    waarbij FRETCorrected wordt verkregen uit de vergelijking:
    figure-protocol-2
    met d en a gedefinieerd als:
    figure-protocol-3
    figure-protocol-4
    Hier vertegenwoordigen IDA, IDD en IAA beelden van cellen die met de biosensor zijn getransfecteerd. IDA(D)  en IDD(D)) zijn controlebeelden die alleen voor de donor zijn, en IDA(A) en IAA(A) zijn controlebeelden die alleen voor de acceptor gelden.

9. Beeldacquisitie

  1. IDA : Verkrijg het beeld door donorexcitatie (434 nm) met acceptoremissie (530 nm).
  2. IDD : Verkrijg het beeld door donorexcitatie (434 nm) met donoremissie (477 nm).
  3. IAA : Verkrijg het beeld door acceptorexcitatie (517 nm) met acceptoremissie (530 nm).
  4. IDA(D) en IDA(A) : Verkrijg het beeld met dezelfde excitatie en emissie als IDA, maar van cellen die respectievelijk alleen de donor en de acceptor tot expressie brengen.
  5. IDD(D) : Verkrijg de afbeelding onder dezelfde voorwaarden als IDD voor de controle alleen door de donor.
  6. IAA(A) : Verkrijg het beeld onder dezelfde voorwaarden als IAA, maar is specifiek voor de besturing met alleen acceptor.

10. Achtergrond correctie

  1. Open de beeldanalysesoftware op de computer. Ga vanuit de bovenste menubalk naar het menu Bestand . Selecteer Openen of Bestand openen in de vervolgkeuzelijsten.
  2. Navigeer naar de map met de time-lapse-beeldgegevens. Zoek het time-lapse-beeld dat moet worden geanalyseerd (bijv. nd2-indeling).
  3. Kies het bestand en klik op Openen of OK om het in de software te laden voor weergave en analyse. Definieer een interessegebied (ROI) binnen de cel (of gebruik de hele cel als ROI) en noteer de grijswaarde van elke pixel binnen dit gebied.
  4. Kies een celvrij gebied als achtergrond en bereken de gemiddelde grijswaarde. Maak de gecorrigeerde afbeelding door dit achtergrondgemiddelde af te trekken van de grijswaarde van elke pixel binnen de ROI van de cel.

11. FRET doorbloeden (overspraak) eliminatie

OPMERKING: De spectrale overlap tussen de donoremissie en de acceptorexcitatie wordt weergegeven in figuur 3B, wat van cruciaal belang is voor de FRET-efficiëntie en het energieoverdrachtsproces. Doorbloeding in time-lapse FRET-beeldvorming is een belangrijke uitdaging die voortkomt uit de spectrale overlap van donor- en acceptorfluoroforen, wat leidt tot onnauwkeurige metingen. Overspraak is inherent omdat de spectra van zowel donor- als acceptorfluoroforen elkaar tot op zekere hoogte overlappen (Figuur 3C, D). Dit probleem wordt verergerd door factoren zoals hoge fluorofoorconcentraties en onjuiste filterconfiguraties. Het aanpakken van bleed-through is cruciaal om de betrouwbaarheid van FRET-metingen te waarborgen.

  1. Raadpleeg een eerdere studie voor een methode om doorbloedingseffecten te verminderen9.

12. Kwantificering en statistische analyse

  1. Voer statistische analyses uit met behulp van statistische analysesoftware.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om Akt-activering in HepG2-cellen te onderzoeken, werden de cellen gezaaid op voorgecoate beeldvormingsschalen en getransfecteerd met de op FRET gebaseerde biosensor pEevee-iAkt-NES (Figuur 2A), ontworpen om real-time monitoring van Akt-fosforylering mogelijk te maken. Na transfectie ondergingen de cellen serumhonger gedurende 4 uur in een serumvrij medium om hun metabolische toestand te synchroniseren en basale insulinesignalering te minimaliseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het protocol voor live-cell FRET-beeldvorming om Akt-fosforylering in HepG2-cellen te monitoren, omvat verschillende belangrijke stappen om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te garanderen. De eerste kritieke stap is celcultuur, die routinematig celonderhoud, coating van beeldvormingsgerechten en celzaaiing omvat. Een goede coating is essentieel voor celhechting tijdens time-lapse-beeldvormingsexperimenten, omdat het zorgt voor een stabiele celhechting, loslating voorkomt en drift...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Natural Science Foundation van Shenzhen (JCYJ20240813113606009), de Shenzhen-Hong Kong Cooperation Zone for Technology and Innovation (HZQB-KCZYB-2020056), National Natural Science Foundation of China (32070681), National Key R&D Program of China (2019YFA0906002) en Shenzhen Peacock Plan (KQTD2016053117035204).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% trypsin-EDTAGibcoCat#25200-056Gebruik ijskoud PBS voor celwassing
15 mm glas bodem celkweekschaalNESTCat#801001
2 mL Nalgene cryogenic vialsThermo ScientificCat#5012-0020
5 mL Stripette Serologische PipettenCorningCat#4487
95% EthanolKermelCat#C028005
A1 HD25/A1R HD25 confocale microscoopNikonhttps://www.nikon.com/Vergroting: 40×, Numerieke Apertuur (NA): 1.30, Pixel Dwell Time: 2.4 ms, Pixel Size: 1024
AmpicillineSigma-AldrichCat#A9393
Rundserum albumine (BSA)VWR Life ScienceCat#N208-10g
Corning 25 cm2 rechthoekige kweekkolvenCorningCat#430639
Countess 3 geautomatiseerde celtellerThermo Scientifichttp://www.thermofisher.com/#AMQAX2000
Countess celtellingskamer slidesThermo Scientifichttp://www.thermofisher.com/#C10228
Digitale vortex mixersThermo Scientifichttps://www.thermofisher.com/
Dimethyl sulfaatSigma-AldrichCat#D2650
Eppendorf Safe-Lock buizen 1.5 mLEppendorfCat#022363204
EZ-PCR mycoplasma detectiekitBiological IndustriesCat# 20-700-20
Fetaal runder serum, gekwalificeerd, AustraliëGibcoCat#10099141
GlutaMAX SupplementGibcoCat#35050061
GraphPad Prism 9GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com/
HepG2National Collection of Authenticated Cell Cultures#CSTR:19375.09.3101HUMSCSP510  http://www.cellbank.org.cn/
Immersiol Type 37Cargille LaboratoriesCat #16237
InsulineSigma-AldrichCat#I5500-50MGVerwarmen tot 37 °C voor gebruik
LB Broth (1x)InvitrogenCat#10855001
Minimum Essential Medium (MEM)GibcoCat#11095080Verwarmen tot 37 °C voor gebruik
mySPIN 12 mini centrifugeThermo Scientifichttps://www.thermofisher.com/
NanoDrop OneThermo Scientifichttps://www.thermofisher.com
Nikon Plan Fluor 40×/1.30 Olie LensNikonhttps://www.nikon.com/
NIS-Elements-ARNikonhttps://www.nikon.com/
Niet-Essentiële Aminozuren (NEAA) (100x)GibcoCat#11140050
One Shot LB Agar Plates InvitrogenCat#A55802
One Shot Stbl3 chemisch competent E. coliInvitrogenCat#C737303
ParafilmPARAFILMCat#B8R05606
PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing)GibcoCat#10010023
pEevee-iAkt-NES (7,033 bp)Miura et al31https://benchling.com/s/seq-q46zFYCfl0swLAun0t28/edit
Penicilline-streptomycineGibcoCat#15070063
Plasmocin profylacticumInvivoGenCat#ant-mpp
Poly-L-Lysine Hydrobromide Sigma-AldrichCat#P4832
Precision algemene doelbadenThermo Scientifichttps://www.thermofisher.com/
QIAprep spin miniprep kitQIAGENCat#27106
SnapGeneSnapGene by Dotmaticshttps://www.snapgene.com
Natrium Pyruvaat (100 mM)GibcoCat#11360070
Spuitfilter unit, 0.22 μmMilliporeCat#SLGP033RS
Tokai Hit stage top incubatorTOKAI HIThttps://www.tokaihit-livecell.com/stagetopincubator
UltraPure DNase/RNase-vrij gedistilleerd waterInvitrogenCat#10977015
Xfect Transfectie ReagensTakara BioCat#631317

Referenties

  1. GBD 2021 Diabetes Collaborators. Global, regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet. 402 (10397), 203-234 (2023).
  2. Li, M., et al. Trends in insulin resistance: insights into mechanisms and therapeutic strategy. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 216(2022).
  3. Poloz, Y., Stambolic, V. Obesity and cancer, a case for insulin signaling. Cell Death Dis. 6 (12), e2037(2015).
  4. Arcidiacono, B., et al. Insulin resistance and cancer risk: an overview of the pathogenetic mechanisms. Exp Diabetes Res. 2012, 789174(2012).
  5. Godsland, I. F. Insulin resistance and hyperinsulinaemia in the development and progression of cancer. Clin Sci (Lond). 118 (5), 315-332 (2009).
  6. Tsugane, S., Inoue, M. Insulin resistance and cancer: epidemiological evidence. Cancer Sci. 101 (5), 1073-1079 (2010).
  7. Yudhani, R. D., et al. In vitro insulin resistance model: A recent update. J Obes. 2023, 1964732(2023).
  8. Akhtar, J., et al. Bistable insulin response: The win-win solution for glycemic control. iScience. 25 (12), 105561(2022).
  9. Akhtar, J., Imran, M., Wang, G. Protocol for live-cell Forster resonance energy transfer imaging to reveal the bistable insulin response of single C2C12-derived myotubes. STAR Protoc. 5 (2), 103109(2024).
  10. Kamino, K., et al. Optimal inference of molecular interaction dynamics in FRET microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (15), e2211807120(2023).
  11. Kraft, A. E., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time visualization of second messengers in living cells. Methods Mol Biol. 1563, 85-90 (2017).
  12. Veeriah, S., et al. High-throughput time-resolved FRET reveals Akt/PKB activation as a poor prognostic marker in breast cancer. Cancer Res. 74 (18), 4983-4995 (2014).
  13. Conway, J. R. W., et al. Monitoring AKT activity and targeting in live tissue and disease contexts using a real-time Akt-FRET biosensor mouse. Sci Adv. 9 (17), eadf9063(2023).
  14. Chandris, P., Giannouli, C. C., Panayotou, G. Imaging approaches for the study of metabolism in real time using genetically encoded reporters. Front Cell Dev Biol. 9, 725114(2021).
  15. Yang, J., et al. Longitudinal FRET imaging of glucose and lactate dynamics and response to therapy in breast cancer cells. Mol Imaging Biol. 24 (1), 144-155 (2022).
  16. Mandrou, E., et al. A reliable system for quantitative G-protein activation imaging in cancer cells. Cells. 13 (13), 1114(2024).
  17. Fang, C., Huang, Y., Zhao, Y. Review of FRET biosensing and its application in biomolecular detection. Am J Transl Res. 15 (2), 694-709 (2023).
  18. Miller, J. N. Fluorescence energy transfer methods in bioanalysis. Analyst. 130 (3), 265-270 (2005).
  19. Verveer, P. J., Rocks, O., Harpur, A. G., Bastiaens, P. I. Imaging protein interactions by FRET microscopy: FRET measurements by acceptor photobleaching. CSH Protoc. 2006 (6), (2006).
  20. Vu, C. Q., Arai, S. Quantitative imaging of genetically encoded fluorescence lifetime biosensors. Biosensors (Basel). 13 (10), 939(2023).
  21. Wang, G. A more holistic view of the logarithmic dose-response curve offers greater insights into insulin response. J Biol Chem. 301 (1), 108037(2025).
  22. Wang, G. Body mass dynamics is determined by the metabolic Ohm's law and adipocyte-autonomous fat mass homeostasis. iScience. 23 (6), 101176(2020).
  23. Wang, G. Raison d'être of insulin resistance: the adjustable threshold hypothesis. J R Soc Interface. 11 (101), 20140892(2014).
  24. Wang, G. Optimal homeostasis necessitates bistable control. J R Soc Interface. 9, 2723(2012).
  25. Heim, R., Tsien, R. Y. Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. Curr Biol. 6 (2), 178-182 (1996).
  26. Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nat Biotechnol. 23 (3), 355-360 (2005).
  27. Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nat Protoc. 8 (2), 265-281 (2013).
  28. Gordon, G. W., Berry, G., Liang, X. H., Levine, B., Herman, B. Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy. Biophys J. 74 (5), 2702-2713 (1998).
  29. Tron, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis. Biophys J. 45 (5), 939-946 (1984).
  30. Calibration of fluorescence resonance energy transfer in microscopy. , US 6456734 United States Patent and Trademark Office (2002).
  31. Miura, H., Matsuda, M., Aoki, K. Development of a FRET biosensor with high specificity for Akt. Cell Struct Funct. 39 (1), 9-20 (2014).
  32. Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122(2014).
  33. Rani, K., Sengupta, S. Multi-stimuli programmable FRET based RGB absorbing antennae towards ratiometric temperature, pH and multiple metal ion sensing. Chem Sci. 12 (47), 15533-15542 (2021).
  34. Betolngar, D. B., et al. pH sensitivity of FRET reporters based on cyan and yellow fluorescent proteins. Anal Bioanal Chem. 407 (14), 4183-4193 (2015).
  35. Salonikidis, P. S., et al. An ion-insensitive cAMP biosensor for long term quantitative ratiometric fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurements under variable physiological conditions. J Biol Chem. 286 (26), 23419-23431 (2011).
  36. Youvan, D. C., et al. Calibration of fluorescence resonance energy transfer in microscopy using genetically engineered GFP derivatives on nickel chelating beads. Biotechnol Alia. 3, 1-18 (1997).
  37. Menaesse, A., et al. Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method. Cytometry A. 99 (4), 407-416 (2021).
  38. Batta, A., Hajdu, T., Nagy, P. Improved estimation of the ratio of detection efficiencies of excited acceptors and donors for FRET measurements. Cytometry A. 103 (7), 563-574 (2023).
  39. Coullomb, A., et al. QuanTI-FRET: a framework for quantitative FRET measurements in living cells. Sci Rep. 10 (1), 6504(2020).
  40. Hoppe, A., Christensen, K., Swanson, J. A. Fluorescence resonance energy transfer-based stoichiometry in living cells. Biophys J. 83 (6), 3652-3664 (2002).
  41. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophys J. 86 (6), 3923-3939 (2004).
  42. Hochreiter, B., Kunze, M., Moser, B., Schmid, J. A. Advanced FRET normalization allows quantitative analysis of protein interactions including stoichiometries and relative affinities in living cells. Sci Rep. 9 (1), 8233(2019).
  43. Liu, H., Zhang, F., Mishra, S. K., Zhou, S., Zheng, J. Knowledge-guided fuzzy logic modeling to infer cellular signaling networks from proteomic data. Sci Rep. 6, 35652(2016).
  44. Garrido-Rodriguez, M., Zirngibl, K., Ivanova, O., Lobentanzer, S., Saez-Rodriguez, J. Integrating knowledge and omics to decipher mechanisms via large-scale models of signaling networks. Mol Syst Biol. 18 (7), e11036(2022).
  45. Greenwald, E. C., Polanowska-Grabowska, R. K., Saucerman, J. J. Integrating fluorescent biosensor data using computational models. Methods Mol Biol. 1071, 227-248 (2014).
  46. Zhao, Z., Xia, J. Computational Approaches for Modeling Signal Transduction Networks. Encyclopedia of Bioinformatics and Computational Biology. , Elsevier. Cambridge, MA. (2019).
  47. Wang, G., Krueger, G. R. Computational analysis of mTOR signaling pathway: bifurcation, carcinogenesis, and drug discovery. Anticancer Res. 30 (7), 2683-2688 (2010).
  48. Wang, G. Singularity analysis of the AKT signaling pathway reveals connections between cancer and metabolic diseases. Phys Biol. 7 (4), 046015(2010).
  49. Chedere, A., Hari, K., Kumar, S., Rangarajan, A., Jolly, M. K. Multi-stability and consequent phenotypic plasticity in AMPK-Akt double negative feedback loop in cancer cells. J Clin Med. 10 (3), 472(2021).
  50. Mosca, E., et al. Computational modeling of the metabolic States regulated by the kinase akt. Front Physiol. 3, 418(2012).
  51. Liao, J., Madahar, V., Dang, R., Jiang, L. Quantitative FRET (qFRET) technology for the determination of protein-protein interaction affinity in solution. Molecules. 26 (21), 6339(2021).
  52. Verma, A. K., Noumani, A., Yadav, A. K., Solanki, P. R. FRET based biosensor: Principle applications recent advances and challenges. Diagnostics (Basel). 13 (8), 1375(2023).
  53. Mattheisen, J. M., et al. Application of bioluminescence resonance energy transfer to quantitate cell-surface expression of membrane proteins. Anal Biochem. 684, 115361(2024).
  54. Lionetti, M. C., La Porta, C. A. M. FLIM-FRET investigation of heterogeneous huntingtin aggregation in HeLa cells. Methods Mol Biol. 2551, 595-604 (2023).
  55. Petutschnig, E. K., Pierdzig, L., Mittendorf, J., Niebisch, J. M., Lipka, V. A novel fluorescent protein pair facilitates FLIM-FRET analysis of plant immune receptor interaction under native conditions. J Exp Bot. 75 (3), 746-759 (2024).
  56. Sprenger, J. U., Perera, R. K., Gotz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. J Vis Exp. 66, e4081(2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

FRET beeldvorminginsulinesignaleringmetabole regulatiegenetisch gecodeerde biosensorenconfocale microscopieceltransfectiemetabole stoornissencancersignalering
Levende cel Förster resonantie energieoverdracht beeldvorming van metabolisch gereguleerde akt-activeringsdynamiek in HepG2-cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.