Method Article

Een gestroomlijnde aanpak voor proteomics op basis van massaspectrometrie met behulp van geselecteerde weefselregio's

DOI:

10.3791/68076

⸱

April 18th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Science, School of Medicine, CHA University, 2Department of Proteomic Research, CHA Future Medicine Research Institute, 3Department of Pathology, Seoul National University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen we een op massaspectrometrie gebaseerde proteomische methode op met behulp van geïsoleerde interessegebieden in formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties. Dit protocol wordt gebruikt om proteoom te analyseren van specifieke weefselgebieden in gearchiveerde, in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Op massaspectrometrie (MS) gebaseerde proteomics maakt uitgebreide proteoomanalyse mogelijk in een breed scala aan biologische monsters, waaronder cellen, weefsels en lichaamsvloeistoffen. Formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefselsecties, die vaak worden gebruikt voor archivering op lange termijn, zijn naar voren gekomen als waardevolle bronnen voor proteomische studies. Naast hun opslagvoordelen kunnen onderzoekers interessegebieden (ROI's) isoleren van normale weefselgebieden door samen te werken met pathologen. Ondanks dit potentieel ontbreekt nog steeds een gestroomlijnde aanpak voor proteomische experimenten die ROI-isolatie, proteomische monstervoorbereiding en MS-analyse omvat. In dit protocol wordt een geïntegreerde workflow gepresenteerd die macrodissectie van ROI's, monstervoorbereiding op basis van suspensietrapping en MS-analyse met hoge doorvoer combineert. Door deze benadering werden de ROI's van de FFPE-weefsels van patiënten, bestaande uit goedaardige sereuze cystische neoplasmata (SCN) en precancereuze intraductale papillaire mucineuze neoplasmata (IPMN) gediagnosticeerd door pathologen, gemacrodisseceerd, verzameld en geanalyseerd, wat resulteerde in een hoge proteoomdekking. Bovendien werden moleculaire verschillen tussen de twee verschillende cystische neoplasmata van de pancreas met succes geïdentificeerd, wat de toepasbaarheid van deze benadering aantoont voor het bevorderen van proteomisch onderzoek met FFPE-weefsels.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Decennialang zijn chirurgisch weggesneden menselijke weefsels gearchiveerd als formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) blokken. Deze weefselblokken behouden in eerste instantie de driedimensionale (3D) structuur die in paraffine is ingebed. De weefsels worden vervolgens gesneden met behulp van microtomen, op objectglaasjes gemonteerd en gekleurd - meestal met hematoxyline en eosine (HE) of immunohistochemie (IHC) - om histopathologische diagnose door ervaren pathologen te vergemakkelijken 1,2. FFPE-weefsels bieden duidelijke voordelen voor langdurige opslag vanwege de eiwitverknoping die wordt geïnduceerd door formaline, die de enzymatische en proteolytische activiteit stopt3. Omdat ze de constructie van grote, goed gearchiveerde monstersets ondersteunen, worden FFPE-weefsels beschouwd als een hoeksteen voor de ontdekking van biomarkers op verschillende gebieden, waaronder genomica 4,5,6,7.

Hun toepassing in op vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) gebaseerde proteomics heeft echter in het verleden voor uitdagingen gezorgd. Een belangrijke beperking is de door formaline geïnduceerde eiwitverknoping, die de tryptische vertering verstoort - een cruciale stap in de wereldwijde proteoomanalyse8. Bovendien maakt de kleine hoeveelheid eiwit die uit weefselglaasjes kan worden gehaald, conventionele monsterbereidingsmethoden vaak ongeschikt. Ondanks deze uitdagingen heeft de vooruitgang aangetoond dat eiwitverknopingen kunnen worden teruggedraaid door langdurige behandeling bij hoge temperatuur 9,10,11. Tegelijkertijd hebben monstervoorbereidingsmethoden die zijn geoptimaliseerd voor eiwitmonsters met een lage hoeveelheid het gebruik van FFPE-weefsels in proteomics-onderzoek uitgebreid 12,13,14,15.

Een belangrijk voordeel van het gebruik van FFPE-weefselglaasjes in proteomics ligt in hun vermogen om een regiospecifieke analyse mogelijk te maken. FFPE-objectglaasjes bevatten doorgaans zowel laesies als aangrenzend normaal weefsel (ANT). Het zonder onderscheid analyseren van het hele weefsel riskeert verstorende resultaten als gevolg van gemengde moleculaire handtekeningen. Daarentegen maakt het isoleren en analyseren van interessegebieden (ROI's) - laesies versus ANT - een nauwkeurigere karakterisering mogelijk van moleculaire kenmerken die specifiek zijn voor pathologische regio's. Bijgevolg zijn op FFPE gebaseerde benaderingen steeds populairder geworden in proteomics-studies 16,17,18,19,20. Ondanks hun groeiende toepassing blijft een gestroomlijnde workflow die het hele proteomische experiment stap voor stap beschrijft nog steeds schaars. Met name is er geen op video gebaseerd protocol gepubliceerd.

In deze studie werd een robuuste LC-MS-gebaseerde proteomics-workflow opgezet die is afgestemd op de nauwkeurige profilering van moleculaire veranderingen binnen laesiespecifieke regio's. Met behulp van FFPE-weefsels gediagnosticeerd door twee pathologen, werden de ROI's van goedaardige sereuze cystische neoplasmata (SCN) en precancereuze intraductale papillaire mucineuze neoplasmata (IPMN) gemacrodisseceerd, verzameld en geanalyseerd. Het protocol omvat een macrodissectie van ROI's, monstervoorbereiding op basis van suspensievallen die is geoptimaliseerd voor minimale eiwitinput, en data-onafhankelijke acquisitie (DIA)-MS-analyse met een smal bereik. Deze methode maakte de identificatie mogelijk van meer dan 9.000 eiwitten uit weefselgebieden van ongeveer 1 cm², waarbij verschillende proteomische handtekeningen geassocieerd met SCN en IPMN werden ontcijferd.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie is beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Review Board van het Seoul National University Hospital (IRB nr. 1904-114-1028). Alle deelnemers gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan het onderzoek. Gedetailleerde informatie over alle materialen die in dit protocol worden gebruikt, wordt weergegeven in de materiaaltabel.

1. FFPE-weefselantigeeninzameling voor de voorbereiding van de proteomics-steekproef

OPMERKING: Zorg ervoor dat de scalpels en alle materialen, zoals de gebruikte tube, steriel zijn om kruisbesmetting te voorkomen. Protocollen van dit onderzoek kunnen worden aangepast voor elk FFPE-weefsel met kleine aanpassingen op basis van de laboratoriumopstelling.

  1. Snijd 10 μm FFPE-weefselsecties uit hele FFPE-weefselblokken en plaats ze op glazen objectglaasjes.
    OPMERKING: In deze studie werd FFPE-weefsel van de menselijke pancreascyste (twee verschillende soorten cystisch weefsel - SCN en IPMN) gebruikt voor de voorbereiding van proteomics-monsters.
  2. Verwijder paraffinewas van FFPE-weefsel (deparaffinize) met twee wasbeurten in xyleen met de nodige voorzichtigheid: één gedurende 5 minuten en één gedurende 2 minuten.
  3. Rehydrateer het weefsel door een seriële wasbeurt met een gradueel ethanolmengsel: 3 minuten elk in 100%, 85%, 70% en 50% ethanol, gevolgd door een spoeling in gedeïoniseerd water.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat xyleen en ethanol worden behandeld in een chemische zuurkast.

2. FFPE-weefseleiwitextractie

  1. Bereid een HE- of IHC-gekleurd weefselglaasje voor waarop ROI wordt aangegeven door pathologen.
  2. Plaats het niet-gekleurde weefselglaasje en het kleurde-tissueglaasje met de achterkant naar elkaar toe en lijn ze op één lijn. Zorg ervoor dat de ROI wordt waargenomen door de glasplaatje.
  3. Verwijder niet-interessante weefselgebieden met behulp van de scalpel.
    OPMERKING: Als het aangrenzende normale weefsel moet worden geanalyseerd, verzamel ze dan in de andere buisjes.
  4. Schraap de ROI's van het weefsel naar het midden van de dia met behulp van het scalpel en breng ze over in de schone 1,5 ml eiwitarme bindbuisjes.
  5. Voeg 180 μL natriumdodecylsulfaat (SDS) lysisbuffer (5 % SDS, 2 mM tris (2-carboxyethyl)fosfine) [TCEP], 300 mM pH 8,5 Tris-HCl in gedeïoniseerd water) toe aan elke buis.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het volume lysisbuffer voldoende is om het weefsel tijdens sonicatie op te lossen en om de geëxtraheerde eiwitten te suspenderen. Onvoldoende buffer kan leiden tot onvolledige weefsellysis, terwijl een te hoge buffer het eiwitlysaat kan verdunnen.
  6. Voer sondesonicatie uit met een amplitude van 20%, waarbij 10 cycli van 5 s aan en 5 s uit worden toegepast.
  7. Incubeer de monsters gedurende 3,5 uur bij 100 °C met 1.000 x g.
    OPMERKING: Voer tijdens de incubatie elk uur gedurende 1 minuut watersonicatie van de monsters uit voor een efficiënte eiwitextractie.
  8. Koel het monster na incubatie gedurende 10 minuten af bij kamertemperatuur (RT). Centrifugeer de monsters bij 16.000 x g gedurende 10 minuten bij RT om weefselresten van het supernatant te scheiden.
  9. Verzamel het bovenstaande in een schone, gelabelde tube en bewaar deze bij -80 °C tot verder gebruik.

3. Eiwitkwantificering van FFPE-weefsellysaat

OPMERKING: De meeste stappen van de bicinchoninezuurtest voor eiwitkwantificering zijn gebaseerd op de instructies van de fabrikant met kleine wijzigingen. Het wordt aanbevolen om reagentia te bereiden volgens de richtlijnen van de fabrikant.

  1. Bereid runderserumalbumine (BSA) in verschillende concentraties door de stamoplossing (2 mg/ml BSA) serieel te verdunnen. Verdun de monsters zo nodig met een verdunningsfactor 20 of 40.
  2. Bereid het gedeïoniseerde water voor als de blanco en de SDS-lysisbuffer als monstercontrole.
  3. Pipetteer 9 μL standaarden, blanco, monstercontrole en monsters naar het midden van de microplaatput.
  4. Voeg 4 μL compatibiliteitsreagensoplossing toe aan het monster in elk putje.
  5. Dek het bord af en meng op een bordschudder op gemiddelde snelheid gedurende 1 min. Incubeer de plaat vervolgens gedurende 15 minuten bij 37 °C.
  6. Voeg aan elk putje 260 μl van het BCA-werkreagens toe en incubeer de plaat vervolgens gedurende 30 minuten bij 37 °C.
  7. Koel de plaat 3 minuten af op RT.
  8. Meet de absorptie van de putten bij 562 nm op een plaatlezer.
  9. Trek de extinctiewaarde van 562 nm van de blanco af van die van alle monsters en de monstercontrole.
  10. Trek verder de extinctiewaarde van 562 nm van de blanco afgetrokken monstercontrole af van die van alle monsters.
  11. Teken en gebruik de standaardcurve om de eiwitconcentratie van elk monster te bepalen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de geschatte 200-250 μg eiwitten worden geëxtraheerd uit drie glasplaatjes van FFPE-weefsels, elk met een oppervlakte van ongeveer 1 cm2.

4. Acetonprecipitatie van eiwit

OPMERKING: Zorg ervoor dat in totaal 100-300 μg eiwit wordt gebruikt voor acetonprecipitatie en eiwitvertering op basis van suspensievang.

  1. Plaats het eiwitmonster (overeenkomend met 100-300 μg) in een acetoncompatibele buis.
  2. Voeg -20 °C aceton in een volume dat vijfmaal het monstervolume is toe aan de buis.
  3. Incubeer het mengsel gedurende 18 uur bij -20 °C.
  4. Centrifugeer de buis op 16.000 x g gedurende 15 min.
  5. Gooi het bovenstaande voorzichtig weg zonder de eiwitkorrel te verstoren.
  6. Voeg 500 μL -20 °C aceton toe en herhaal de stappen 4.4-4.5.
  7. Laat het monster aan de lucht drogen.

5. Eiwitvertering op basis van suspensievang

OPMERKING: De procedure voor de eiwitvertering op basis van suspensievangfilters is met kleine wijzigingen aangepast aan de instructies van de fabrikant.

  1. Bereid de lysisbuffer voor suspensievang voor (5 % SDS, 5 mM TCEP, 50 mM pH 8,5 TEAB in gedeïoniseerd water).
  2. Voeg 40 μL van de buffer toe aan de monsterbuis en draai grondig om de aan de lucht gedroogde eiwitpellet op te lossen.
  3. Incubeer het monster bij 100 °C en schud het gedurende 35 minuten bij 1.000 x g .
  4. Voeg 10 μL van het alkylerende reagens (100 mM chlooracetamide [CAA] in 100 mM pH 8,5 Tetraethylammoniumbromide [TEAB]) toe aan het monster.
  5. Incubeer bij RT met schudden bij 300 x g gedurende 1 uur.
  6. Bereid voorzichtig een zuurteregelaar (10% trifluorazijnzuur [TFA] in gedeïoniseerd water) voor. Zorg ervoor dat TFA, een sterk zuur, wordt behandeld in een chemische zuurkast.
  7. Voeg 5 μL zuurteregelaar toe aan het monster om een eindconcentratie van 1% TFA te bereiken (eindmonstervolume: 55 μL).
  8. Controleer de pH van het monster met pH-papier. Zorg ervoor dat de pH lager is dan 1.
  9. Voeg 350 μL bindings-/wasbuffer-1 (0,1 M pH 8,5 TEAB in 90% MeOH) toe aan het monster om eiwitten op te vangen.
    OPMERKING: Vermijd vortexing en centrifugatie tijdens het insluiten van eiwitten (stap 5.9) om monsterverlies te voorkomen. Voldoende hoeveelheden eiwit zorgen voor de vorming van zichtbare colloïdale eiwitdeeltjes met een doorschijnend uiterlijk.
  10. Plaats de suspensievangkolom in een buis van 2 ml en breng het volledige monster, met inbegrip van het onoplosbare materiaal, over in de suspensievangkolom.
  11. Centrifugeer de kolom op 4.000 x g gedurende 50 s om eiwitten op te vangen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat alle monsters door de kolom gaan; Als dit niet het geval is, herhaal dan de centrifugatie totdat de filtratie is voltooid.
  12. Voeg 400 μL van de wasbuffer-2 (50 % CHCl3/50 % MeOH) toe aan de kolom, centrifugeer op 4000 x g gedurende 50 s en gooi de doorstroom weg.
  13. Herhaal stap 5.12 drie keer.
  14. Voeg 400 μL van de buffer-1 toe, centrifugeer bij 4000 x g gedurende 50 s en gooi de doorstroom weg.
  15. Herhaal stap 5.14 drie keer.
  16. Centrifugeer bij 4000 x g gedurende 1,25 minuten om de volledige doorgang van buffer-1 te garanderen.
  17. Breng de suspensievangkolom over in een nieuwe monsterbuis voor enzymatische vertering.
  18. Voeg 125 μL digestiebuffer (0,16 μg/μL trypsine/Lys-C in 50 mM pH 8,5 TEAB) toe aan de suspendenvangkolom en sluit deze af om verdamping te voorkomen.
    OPMERKING: De trypsine/Lys-C-verhouding moet 1:10 (gewicht/gewicht) zijn. Zorg voor minimaal 10 μg trypsine/Lys-C voor een effectieve spijsvertering.
  19. Incubeer gedurende 18 uur bij 37 °C zonder te schudden.
  20. Bereid de volgende elutiebuffers voor: buffer-1 (50 mM pH 8,5 TEAB in gedeïoniseerd water), buffer-2 (0,2% FA in gedeïoniseerd water) en buffer-3 (50% acetonitril [ACN] in gedeïoniseerd water).
  21. Voeg 80 μL elutiebuffer-1 toe aan de suspensievangkolom en centrifugeer bij 4000 x g gedurende 1,25 min.
  22. Herhaal stap 5.20 met 80 μL elutie buffer-2 en buffer-3.
  23. Verzamel geëlueerde peptiden en breng ze over naar een schone, nieuwe buis.

6. Kwantificering van peptiden

OPMERKING: De meeste stappen van de kwantitatieve colorimetrische peptidetest zijn met kleine wijzigingen aangepast aan de instructies van de fabrikant. Het wordt aanbevolen om reagentia te bereiden volgens de richtlijnen van de fabrikant.

  1. Bereid een reeks standaarden voor door de stamoplossing van de standaard (1 mg/ml) serieel te verdunnen. Verdun de monsters zo nodig met een verdunningsfactor 4 of 5.
  2. Bereid het gedeïoniseerde water voor als de blanco en een mengsel van elutiebuffer-1, buffer-2 en buffer-3 in gelijke verhoudingen als monstercontrole.
  3. Plaats 20 μL standaarden, blanco, monstercontrole en monsters in het midden van elke microplaatput.
  4. Voeg 180 μL van het werkende reagens toe aan elk putje en meng de plaat grondig op een plaatschudder gedurende 1 min.
  5. Dek de plaat af en incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij 37 °C.
  6. Laat de plaat 3 minuten afkoelen op RT.
  7. Meet de absorptie van de putten bij 480 nm met behulp van een plaatlezer.
  8. Trek de absorptiewaarde van 480 nm van de blanco af van die van alle monsters en de monstercontrole.
  9. Trek verder de absorptiewaarde van 480 nm van de blanco afgetrokken monstercontrole af van die van alle monsters.
  10. Teken en gebruik de standaardcurve om de peptideconcentratie voor elk monster te berekenen.

7. Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie analyse

  1. Na peptidekwantificering 20 μg peptiden lyofiliseren.
  2. Los peptiden gedurende 10 minuten op in 40 μl waterige buffer (3 % ACN in 0,1 % mierenzuur [FA] water) in een sonicatiebad. De resulterende peptideconcentratie zal 0,5 μg/μL zijn.
  3. Centrifugeer het monster gedurende 60 minuten op 16.000 x g en breng de monsters over in flesjes voor MS-analyse.
  4. Injecteer 2 μL van elk monster met behulp van de autosampler van het nano LC-MS/MS-systeem.
  5. Scheid peptiden op een kolom met omgekeerde fase (kolom van 0,075 mm ID x 150 mm, gevuld met 3 μm C18-materiaal, met een gradiënt van 127 minuten van 5%-35% acetonitril bij 100 nL/min. Ioniseer de peptiden via een nanospray-ionenbron en breng ze over naar een op orbitrap gebaseerde massaspectrometer.
  6. Analyseer peptiden met behulp van een data-onafhankelijke acquisitiemethode met een smal bereik21.
  7. Pas de volgende MS-parameterinstelling toe: MS m/z-bereik: 495-745, resolutiedoel: 15000, AGC-doel: 3 x 10E6, maximale injectietijd: auto, MS/MS-venster: Door de gebruiker gedefinieerd (aanvullend bestand 1), resolutiedoel: 45000, AGC-doel 3 x 10E6, maximale injectietijd: auto, HCD-botsingsenergie: 22%, 26%, 30%.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een eerste kwaliteitscontrole van het instrument uit te voeren door standaardmonsters te analyseren vóór de analyse. Gebruik de MS-data-acquisitiesoftware om parameters te configureren (zie Materiaaltabel).

8. Gegevensanalyse voor het zoeken naar proteomics

OPMERKING: Voor proteomisch zoeken naar onbewerkte MS-gegevens werden open-sourcetools gebruikt om het LC-MS-gegevensformaat te converteren en proteoomonderzoek uit te voeren (zie Materiaaltabel). De parameters die worden gebruikt voor de gegevensanalyse worden gedetailleerd beschreven in aanvullend bestand 2. Raadpleeg de koppeling in de materiaaltabel voor basisgebruiksinstructies voor opensource-hulpprogramma's.

  1. Verborgen de onbewerkte MS/MS-spectrumbestanden (*.raw) verkregen van de LC-MS naar het *.mzML-formaat met behulp van open-source software.
  2. Gebruik de in formaat geconverteerde RAW-bestanden (*.mzML) als invoer voor een open-sourcezoekmachine om het proteoomonderzoek uit te voeren.
  3. Start proteomisch zoeken op basis van de parameters die zijn gespecificeerd in aanvullend bestand 2.

9. Statistische analyse

OPMERKING: Voor statistische analyse om differentieel tot expressie gebrachte eiwitten te identificeren, werd een open-source tool gebruikt om univariate analyse uit te voeren (bijv. Student's t-test; zie Materiaaltabel). Het wordt aanbevolen om de basisgebruiksinstructies voor de open-sourcetool te raadplegen via de link in de materiaaltabel.

  1. Importeer de lijst met geïdentificeerde eiwitten (*.txt) in de opensourcetool.
  2. Categoriseer voorbeelden in groepen. Voor dit onderzoek zijn twee groepen aangewezen: SCN en IPMN.
  3. Voer Log2-transformatie van de abundantiewaarden uit om de gegevensverdeling aan te passen aan de normale verdeling.
  4. Pas een filterstap toe om eiwitten met ontbrekende waarden te verwijderen. In deze studie waren minimaal twee geldige waarden in elke groep vereist voor opname.
  5. Waardeer ontbrekende waarden met behulp van een op normale distributie gebaseerde benadering om een uitgebreide lijst van gekwantificeerde eiwitten te genereren voor daaropvolgende univariate analyse.
  6. Voer een t-toets voor studenten uit om differentieel tot expressie gebrachte eiwitten tussen de twee groepen te identificeren. In deze studie werd Benjamini-Hochberg false discovery rate (FDR) correctie toegepast.
  7. Extraheer de differentieel tot expressie gebrachte eiwitten die aan de volgende criteria voldoen: Benjamini-Hochberg FDR < 0,05 en |fold- change| ≥ 2.

10. Bio-informatica analyse

OPMERKING: Er werd een commerciële bio-informaticatool gebruikt voor de analyse van oververtegenwoordiging (bijv. Ingenuity-routeanalyse, zie Materiaaltabel). Voordat u dit hulpmiddel gebruikt, is het raadzaam de instructies van de fabrikant te raadplegen.

  1. Importeer de lijst met DEP's (*.txt) in de commerciële tool.
  2. Start een kernanalyse om een oververtegenwoordigingsanalyse uit te voeren.
  3. Exporteer significante canonieke routes verrijkt met behulp van de DEP's met behulp van de Fisher's exact-test (aangepaste p-waarde < 0,05). Identificeer interessante paden die relevant zijn voor het onderzoek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gevestigde proteomics-monstervoorbereiding op basis van suspensie-insluitingsfilters, gecombineerd met labelvrije kwantificering met behulp van single-shot data-onafhankelijke acquisitie, werd toegepast op cystische FFPE-weefsels van de alvleesklier (Figuur 1). Nauwkeurige ROI-isolatie tijdens de verwerking van FFPE-weefsels werd bereikt over verschillende cystische FFPE-weefsels van de pancreas (Figuur 2A), wat resulteerde i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst een snelle en efficiënte proteomics-methode die gebruikmaakt van ROI's geïsoleerd uit FFPE-weefselsecties die op glasplaatjes zijn gemonteerd voor pathologische diagnose. Wanneer chirurgische ingreep voordelig is, worden solide neoplasmata zoals kanker en cysten operatief gereseceerd en bewaard voor pathologische evaluatie. Voor langdurige opslag worden weefsels gefixeerd in formaline en ingebed in paraffine (FFPE). FFPE-weefselblokken worden vervolgens doorgesneden ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflict te verklaren

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle figuren in dit artikel zijn gemaakt met BioRender (http://www.biorender.com). Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Research Foundation of Korea (NRF) (Grant No. RS-2023-00253403 en RS-2024-00454407).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1% FA in ACN (LC-MS grade)Fisher ChemicalLS120-212
0.1% FA in Water (LC-MS grade)Fisher ChemicalLS118-4
0.5M TCEPThermo Scientific77720
10% SDSInvitrogen2679093
1M TEAB (pH 8.5)Sigma-Aldrich102545001
1M Tris-cl (pH 8.5)BIOSOLUTIONBTO21
A-14C centrifugeSatorious167709
Acetone (HPLC grade)Fisher ScientificA949-4
ACN (HPLC grade)J.T.Baker9017-88
CHCl3 (HPLC grade)Thermo Scientific022920.k2
CR paperADVANTEC70406001
DIA-NN ver 1.9 Open source https://github.com/vdemichev/DiaNNProteomics Search Engine 
EPOCH2 microplate readerAgilent 2106208
EthanolMERCKK50505283 836
FA (LC-MS grade)Fisher ChemicalA117-50
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)QIAGEN830018Bioinformatics tool
Lyophilizer (SRF110R+vaper trap)Thermo ScientificSRF-110-115
MeOH (HPLC grade)MERCKUN1230
Microplate BCA protein Assay kit-Reducing Agent CompatibleThermo Scientific23252
MSConvert Open source http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtmlMS data transformation software
Orbitrap Exploris 480Thermo ScientificMA10813CMS
PepMAP RSLC C18 separation column Thermo ScientificES903
PerseusOpen sourcehttps://cox-labs.github.io/coxdocs/perseus_instructions.htmlStatistical tool
PIERCE chloroacetamide No-Weigh FormatThermo ScientificA39270
PIERCE Quantitative colorimetric peptide AssayThermo Scientific23275
Plate shaker Green SSerikerVS-202D
Probe sonicatorVibraCellTMVCX750
Protein LoBind Tube 1.5 mLEppendorf22431081
QSP 10 µL pipette TipThermo ScientificTLR102RS-Q
QSP 300 µL pipette TipThermo ScientificTLR106RS-Q
ScalpelBard-Parker372615
S-Trap: Rapid Universal MS sample PrepPROTIFICO2-mini-40
SureSTART Vial 0.2 mLThermo Scientific6pk1655
TFASigma-Aldrich102614284
ThermoMixer CEppendorf5382
Trypsin/Lys-C (LC-MS grade)PromegaV5073
Vanquish NEOThermo Scientific8348249LC
Water (HPLC grade)HoneywellAH365-4
Xcalibur ver 4.7Thermo Scientific30966MS data acquisition software
XyleneSigma-Aldrich102033629

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Maldegem, F., et al. Effects of processing delay, formalin fixation, and immunohistochemistry on RNA recovery from formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Diagn Mol Pathol. 17 (1), 51-58 (2008).
  2. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. J Histochem Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).
  3. Fraenkel-Conrat, H., Olcott, H. S. The reaction of formaldehyde with proteins; cross-linking between amino and primary amide or guanidyl groups. J Am Chem Soc. 70 (8), 2673-2684 (1948).
  4. Basyuni, S., et al. Large-scale analysis of whole genome sequencing data from formalin-fixed paraffin-embedded cancer specimens demonstrates preservation of clinical utility. Nat Commun. 15 (1), 7731(2024).
  5. Gracia Villacampa, E., et al. Genome-wide spatial expression profiling in formalin-fixed tissues. Cell Genomics. 1 (3), 100065(2021).
  6. Zhang, X., et al. Characterization of the genomic landscape in large-scale Chinese patients with pancreatic cancer. EBioMedicine. 77, 103897(2022).
  7. Ren, Z., Ordway, B., Lin, P. -H. Archival FFPE blocks: the gift that keeps giving. Innov. 5 (1), 100532(2024).
  8. Magdeldin, S., Yamamoto, T. Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).
  9. Soni, R. K. Protocol for deep proteomic profiling of formalin-fixed paraffin-embedded specimens using a spectral library-free approach. STAR Protoc. 4 (3), 102381(2023).
  10. Gustafsson, O. J. R., Arentz, G., Hoffmann, P. Proteomic developments in the analysis of formalin-fixed tissue. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1854 (6), 559-580 (2015).
  11. O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
  12. Ye, X., et al. Integrated proteomics sample preparation and fractionation: method development and applications. TrAC Trends Anal Chem. 120, 115667(2019).
  13. Nwosu, A. J., et al. In-depth mass spectrometry-based proteomics of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues with a spatial resolution of 50-200 µm. J Proteome Res. 21 (9), 2237-2245 (2022).
  14. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. J Pathol. 251 (1), 100-112 (2020).
  15. Makhmut, A., et al. A framework for ultra-low-input spatial tissue proteomics. Cell Syst. 14 (11), 1002-1014.e5 (2023).
  16. Shin, D., et al. Identification of TUBB2A by quantitative proteomic analysis as a novel biomarker for the prediction of distant metastatic breast cancer. Clin Proteomics. 17 (1), 16(2020).
  17. Lee, H., et al. Dual oxidase 2 (DUOX2) as a proteomic biomarker for predicting treatment response to chemoradiation therapy for locally advanced rectal cancer: using high-throughput proteomic analysis and machine learning algorithm. Int J Mol Sci. 23 (21), 12923(2022).
  18. Tüshaus, J., et al. Towards routine proteome profiling of FFPE tissue: insights from a 1,220-case pan-cancer study. EMBO J. 44 (1), 304-329 (2024).
  19. Schweizer, L., et al. Quantitative multiorgan proteomics of fatal COVID-19 uncovers tissue-specific effects beyond inflammation. EMBO Mol Med. 15 (9), e17459(2023).
  20. Kobayashi, G., et al. Proteomic profiling of FFPE specimens: discovery of HNRNPA2/B1 and STT3B as biomarkers for determining formalin fixation durations. J Proteomics. 301, 105196(2024).
  21. Kawashima, Y., et al. Single-shot 10k proteome approach: over 10,000 protein identifications by data-independent acquisition-based single-shot proteomics with ion mobility spectrometry. J Proteome Res. 21 (6), 1418-1427 (2022).
  22. Li, W., et al. Identification and prognostic analysis of biomarkers to predict the progression of pancreatic cancer patients. Mol Med. 28 (1), 43(2022).
  23. Martinelli, P., et al. GATA6 regulates EMT and tumour dissemination, and is a marker of response to adjuvant chemotherapy in pancreatic cancer. Gut. 66 (9), 1665-1676 (2017).
  24. Racu, M. -L., et al. Smad4 positive pancreatic ductal adenocarcinomas are associated with better outcomes in patients receiving FOLFIRINOX-based neoadjuvant therapy. Cancers. 15 (15), 3765(2023).
  25. Roy, L. D., et al. MUC1 enhances invasiveness of pancreatic cancer cells by inducing epithelial to mesenchymal transition. Oncogene. 30 (12), 1449-1459 (2011).
  26. Shi, H., Tsang, Y., Yang, Y. Identification of CEACAM5 as a stemness-related inhibitory immune checkpoint in pancreatic cancer. BMC Cancer. 22 (1), 1291(2022).
  27. Waters, A. M., Der, C. J. KRAS: the critical driver and therapeutic target for pancreatic cancer. Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (9), a031435(2018).
  28. Yao, H., et al. Glypican-3 and KRT19 are markers associating with metastasis and poor prognosis of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Biomark. 17 (4), 397-404 (2016).
  29. Zhan, L., Chen, L., Chen, Z. Knockdown of FUT3 disrupts the proliferation, migration, tumorigenesis and TGFβ induced EMT in pancreatic cancer cells. Oncol Lett. 16 (1), 924-930 (2018).
  30. Frohlich, K., Furrer, R., Schori, C., Handschin, C., Schmidt, A. Robust, precise, and deep proteome profiling using a small mass range and narrow window data-independent-acquisition scheme. J Proteome Res. 23 (3), 1028-1038 (2024).
  31. Li, K. W., Gonzalez-Lozano, M. A., Koopmans, F., Smit, A. B. Recent developments in data independent acquisition (DIA) mass spectrometry: application of quantitative analysis of the brain proteome. Front Mol Neurosci. 13, 564446(2020).
  32. Searle, B. C., et al. Chromatogram libraries improve peptide detection and quantification by data independent acquisition mass spectrometry. Nat Commun. 9 (1), 5128(2018).
  33. Prakash, J., Shaked, Y. The interplay between extracellular matrix remodeling and cancer therapeutics. Cancer Discov. 14 (8), 1375-1388 (2024).
  34. Perez, V. M., Kearney, J. F., Yeh, J. J. The PDAC extracellular matrix: a review of the ECM protein composition, tumor cell interaction, and therapeutic strategies. Front Oncol. 11, 751311(2021).
  35. Ferrara, B., et al. The extracellular matrix in pancreatic cancer: description of a complex network and promising therapeutic options. Cancers. 13 (17), 4442(2021).
  36. Weniger, M., Honselmann, K. C., Liss, A. S. The extracellular matrix and pancreatic cancer: a complex relationship. Cancers. 10 (9), 316(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass Spectrometry ProteomicsFFPE TissueRegion Of InterestSuspension TrappingProtein DigestionPancreatic NeoplasmsData Independent AcquisitionPeptide QuantificationLiquid ChromatographyBioinformatics Analysis

Related Articles