Methodenartikel

Generatie en karakterisering van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten zonder fragiel X-boodschapperribonucleoproteïne

DOI:

10.3791/68081

⸱

6 juni 2025

 ,  ,  ,  , 
1Centre for High Impact Neuroscience and Translational Applications, TCG Centres for Research and Education in Science and Technology, 2Centre for Brain Development and Repair, 3National Centre for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research, 4Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een protocol dat de differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen tot functionele voorhersenspecifieke astrocyten mogelijk maakt. Dit maakt onderzoek mogelijk naar de rol van gliacellen in de pathogenese van neurologische ontwikkelingsstoornissen, zoals het Fragiele X-syndroom, en modellering van andere hersenaandoeningen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het fragiele X-syndroom (FXS), een belangrijke erfelijke oorzaak van autismespectrumstoornis en verstandelijke beperking, is uitgebreid bestudeerd met behulp van knaagdiermodellen. Meer recentelijk zijn van menselijke stamcellen afgeleide modelsystemen ook gebruikt om mechanistische inzichten te verwerven in de pathofysiologie van FXS. Deze studies hebben zich echter bijna uitsluitend gericht op neuronen. Verder, ondanks groeiend bewijs voor een sleutelrol van glia in de neuronale functie bij gezondheid en ziekte, is er weinig bekend over hoe menselijke astrocyten worden beïnvloed door FXS.

Daarom hebben we in deze studie met succes een protocol ontwikkeld dat de belangrijkste spatiotemporele mijlpalen van de hersenontwikkeling vastlegt en ook aansluit bij het proces van gliogenese. Samen biedt dit een nuttig kader voor het bestuderen van neurologische ontwikkelingsstoornissen. Eerst hebben we de door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen gemodelleerd in de neuro-ectodermale lijn met dubbele onderdrukker van moeders tegen decapentaplegische (SMAD) remming en kleine moleculen. Vervolgens gebruikten we specifieke groeifactoren en cytokinen om controle- (CTRL) en FXS-patiëntafgeleide astrocytische voorlopercellen (APC's) te genereren. Behandeling van APC's met ciliaire neurotrofe factor, een differentiërend cytokine, reguleerde en dreef de voorlopercellen naar astrocytische rijping, wat resulteerde in voorhersenspecifieke gliale fibrillaire zure eiwitexpressie astrocyten.

We ontdekten dat deze astrocyten functioneel zijn, zoals blijkt uit hun calciumrespons op ATP-toepassing, en ze vertonen een ontregeld glycolytisch en mitochondriaal metabolisme in FXS. Samen bieden deze bevindingen een nuttig experimenteel platform van menselijke oorsprong voor het onderzoek naar celautonome en niet-celautonome gevolgen van veranderingen in de astrocytische functie veroorzaakt door neurologische ontwikkelingsstoornissen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fragiele X-syndroom (FXS), een veel voorkomende erfelijke vorm van verstandelijke beperking en autismespectrumstoornis (ASS), wordt veroorzaakt door het ontbreken van fragiele X-boodschapper ribonucleoproteïne (FMRP) geproduceerd door het fragiele X-boodschapper ribonucleoproteïne 1 (FMR1) gen (OMIM: #300624, https://www.omim.org/entry/300624). FMRP speelt een rol bij de regulatie van mRNA-translatie, de vorming en het transport van mRNA-korrels en microRNA-gemedieerde regulatie van genexpressie1. Verlies van FMRP heeft dus niet alleen invloed op de ontwikkeling van de hersenen, maar ook op de volwassen hersenfunctie. Zowel mRNA-transcriptieniveaus van FMR1 als immunokleuring voor FMRP in de hersenen hebben een hoge neuronale expressie laten zien, naast significante expressie in gliacellen en2. Een overgrote meerderheid van eerdere studies in diermodellen van FXS richtte zich echter voornamelijk op neuronen en afwijkingen in hun functie. Bijgevolg is er weinig bekend over de rol van glia in FXS3. Traditioneel beschouwd als "passieve ondersteunende" cellen4, is er steeds meer bewijs dat astrocyten van cruciaal belang zijn bij het bemiddelen van een breed scala aan neuronale functies 5,6, waaronder het bevorderen van synaptogenese7, verfijning van de ontwikkeling van neurale circuits8 en recycling van neurotransmitters9. Tegelijkertijd is er steeds meer bewijs voor de rol van astrocyten in de pathogenese van ziekten en zijn veel neurologische aandoeningen in verband gebracht met astrocytaire disfunctie10.

Hoewel veel van het eerdere werk met diermodellen van FXS gericht was op het identificeren en valideren van verschillende moleculaire doelen in neuronen voor de behandeling van FXS, hebben deze preklinische bevindingen niet altijd geleid tot succesvolle klinische resultaten. Verder onderstrepen tegenslagen in recente klinische onderzoeken ook de noodzaak van op mensen gebaseerde modelsystemen. Modellen van neurologische aandoeningen op basis van hersencellen afkomstig van menselijke stamcellen bieden een krachtige strategie om deze kloof te overbruggen tussen mechanistische inzichten uit dierstudies en beperkt succes met klinische resultaten voor patiënten. Slechts een handvol van deze onderzoeken heeft zich echter gericht op astrocyten en ook dat meestal op astrocyten die van spinale oorsprong waren. Dit is op zijn beurt relevant in het licht van studies die aantonen dat de structuur en functie van astrocyten variëren tussen hersengebieden11,12. Een beter begrip van door ziekte veroorzaakte veranderingen in menselijke astrocyten moet dus ook rekening houden met deze hersenregio-specifieke verschillen in astrocyten. Modellen van neurologische ontwikkelingsstoornissen die gebruik maken van astrocyten afkomstig van menselijke stamcellen die specifiek zijn voor de voorhersenen, blijven echter relatief onderbelicht13. Om deze hiaten aan te pakken, beschrijven we protocollen voor het genereren van voorhersenspecifieke astrocyten uit van de patiënt afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) die FXS-mutaties dragen; Verder laten we zien dat astrocyten functioneel zijn en een veranderd metabolisme vertonen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten met door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) (Tabel 1) werden uitgevoerd na het verkrijgen van de juiste institutionele wettelijke goedkeuringen. Figuur 1A vertegenwoordigt het volledige differentiatieprotocol van hiPSC's naar rijpe voorhersenspecifieke astrocyten.

1. Onderhoud en uitbreiding van hiPSC's

  1. Een dag voor het plateren van de iPSC's een schaal met 6 putjes insmeren met 1:60 verdunde Matrigel (een extracellulaire matrix [ECM]) in Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) en bewaren bij 2-8 °C.
    OPMERKING: Bewaar met Matrigel gecoate gerechten niet >5 dagen bij 2-8 °C, omdat dit na verloop van tijd eiwitafbraak in de ECM kan veroorzaken. Om uitdroging van de schaal te voorkomen, brengt u minimaal 1 ml 1:60 verdunde Matrigel per putje van een gerecht met 6 putjes aan en verdeelt u het gelijkmatig over de schaal. Bij gebruik op dezelfde dag bewaar de plaat dan gedurende 1 uur in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C en 5% CO2 .
  2. Verwijder op de dag van het kweken van de hiPSC's het coatingmateriaal en voeg 1 ml volledig Essential 8-medium (E8 basaal medium met Essential 8-supplement) samen met de ROCK-remmer toe in 1x eindconcentratie en bewaar het schaaltje in een incubator van 37 °C en 5% CO2 voordat u de hiPSC's toevoegt.
  3. Resuspendeer de hiPSC's in volledig E8-medium samen met de ROCK-remmer in 1x de eindconcentratie voor een betere hechting van de kolonies.
    OPMERKING: Bereid geen grote hoeveelheden kweekmedium voor. Bereid slechts 3-4 dagen voor maximaal 3-4 dagen en bewaar bij 2-8 °C.
  4. Vul de volgende dag het volledige E8-medium aan zonder de ROCK-remmer totdat de cellen voor 80% samenvloeien (ongeveer 4-5 dagen).
  5. Wanneer ze 80% samenvloeiing bereiken, maak je de kolonies enzymatisch los.
    1. Om de iPSC's te laten passeren, verwijdert u de gebruikte media uit de schaal en voegt u 1 ml per putje voorverwarmd (37 °C) mengsel van collagenase (2 mg/ml) en dispase (1 mg/ml) toe in een verhouding van 1:1 en incubeer bij 37 °C gedurende meer dan 20-30 minuten om de iPSC-kolonies te laten optillen.
      LET OP: Laat de vaat niet langer dan 20-30 minuten op 37 °C staan; Na deze periode zullen de kolonies uiteenvallen en zullen cellen afsterven.
  6. Wanneer de kolonies beginnen op te tillen, haalt u de schalen uit de incubator en neutraliseert u de enzymactiviteit door 2 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) toe te voegen.
  7. Schraap de kolonies af met DPBS en vang de suspensie op in een conische buis van 15 ml met behulp van een serologische pipet van 10 ml met brede boring.
  8. Tritrieer de suspensie voorzichtig 2-3x om de kolonies te breken met behulp van een serologische pipet van 10 ml en laat de kolonies tot rust komen.
    OPMERKING: Maak van de kolonies geen enkele cellen; Dit kan ertoe leiden dat de cellen niet aan het schaaltje hechten en meer celdood veroorzaken. Laat ze verder niet als grote kolonies achter; Dit zal later leiden tot meer gedifferentieerde kolonies.
  9. Zodra de kolonies tot rust zijn gekomen (ongeveer na 2 minuten), zuigt u het DPBS-enzymmengsel op en laat u ongeveer 1 ml in de buis.
  10. Voeg 2 ml DPBS toe aan de buis, meng de kolonies door te tikken en laat ze bezinken. Herhaal dit 2x om al het resterende enzym uit de kolonies te verwijderen. Verwijder zoveel mogelijk supernatant na de2e wasbeurt, suspendeer de kolonies opnieuw in 1 ml volledig E8 Medium en serveer ze in een vers bereide schaal zoals vermeld in de stappen 1.2-1.3.
  11. Als alternatief kunt u een deel van de kolonies cryopreserveren met 10% dimethylsulfoxide (DMSO) als cryoprotectieve oplossing voor toekomstige uitbreiding en gebruik.
    1. Bereid cryopreservatiemedium vers door 90% compleet E8-medium en 10% DMSO als cryoprotectieve oplossing te mengen en plaats het tot gebruik op 2-8 °C.
  12. Volg stap 1.5-1.10 om te cryopreserveren.
  13. Tijdens stap 1.10, na de2e wasbeurt, laat u de kolonies bezinken en verwijdert u het supernatant. Voeg aan de kolonies 1 ml vers bereid koud cryopreservatiemedium toe en breng over naar cryovials.
    OPMERKING: Nadat u het cryopreservatiemedium aan de kolonies hebt toegevoegd, brengt u de inhoud snel over naar cryovials. Uitstel kan resulteren in een lager opwekkingspercentage, aangezien DMSO een cryoprotectant is die cellen kan beschadigen.
  14. Verplaats de cryovials onmiddellijk naar een cryobox en bewaar ze een nacht in een vriezer van -80 °C.
  15. Verplaats de volgende dag alle cryovials naar een tank met vloeibare stikstof (LN2-tank ) voor toekomstig gebruik.
    OPMERKING: hiPSC's moeten routinematig worden gekaryotypeerd met behulp van G-banding (aanvullende figuur S1) voor eventuele afwijkingen, gekarakteriseerd met behulp van immunocytochemie voor pluripotentie (figuur 1B) en getest op mycoplasma.
    1. Om hiPSC's te karakteriseren met behulp van immunocytochemie, plaatst u de kolonies op 1:60 Matrigel-gecoate, geautoclaveerde 13 mm glazen dekglaasjes. Zodra ze 40% samenvloeien, wast u de cellen met PBS-T (PBS-0,1% Tween 20), fixeert u met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten, permeabiliseert u met 0,3% Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten en blokkeert u met 3% runderserumalbumine (BSA) in PBS gedurende 1 uur om niet-specifieke binding te voorkomen.
    2. Incubeer na het blokkeren de culturen met primaire antilichamen gedurende 1 uur en was vervolgens 3x met PBS-T gedurende elk 5 minuten, gevolgd door overeenkomstige secundaire antilichamen (Materiaaltabel) in het donker gedurende 1 uur.
    3. Monteer de dekglaasjes op glazen dia's met montagemedium en verkrijg beelden door confocale laserscanning bij 405 nm, 488 nm, 561 nm en 633 nm. Leg afbeeldingen vast met 512 x 512 pixels; stel de Z-stapgrootte in op 0.5 μm met 1 luchtige eenheid met een pinhole-diameter.

2. Generatie en karakterisering van astrocytische voorlopercellen (APC's)

  1. Til de hiPSC's enzymatisch op zoals vermeld in stap 1.5-1.10 en plaats ze op een niet-klevende suspensiecultuurschaal (100 mm) met chemisch gedefinieerd medium14 met 50% Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), 50% Ham's F-12 Nutrient Mix (F12), 5 mg/ml BSA, 1% chemisch gedefinieerd lipidenconcentraat (CD-lipide), 450 μM monothioglycerol, 7 μg/ml insuline, 15 μg/ml transferrine, 1% penicilline-streptomycine aangevuld met mitogenen in de voorhersenen N-acetylcysteïne (1 mM), LDN-193189 (0,1 μM) en SB431542 (10 μM) gedurende 7 dagen.
    OPMERKING: Kleinmolecuulremmers SB431542 en LDN-193189 (LDN) zijn remmers van botmorfogenetisch eiwit en transformerende groeifactor-bèta-signaleringsroutes.
    Vanaf dit moment werd het medium eens in de 2 dagen of volgens het maandag/woensdag/vrijdag-protocol bijgevuld.
  2. Plaats de celsuspensie op een orbitale schudder bij 40 tpm gedurende 7 dagen onder normoxische omstandigheden om de ontwikkeling van corticosferen te bevorderen (Figuur 1A).
  3. Breng op dag 8 de corticosferen over naar een celproliferatiemedium dat geavanceerde DMEM/F12 bevat met 1% antibiotica-antimycoticum, 1% N2-supplement, 1% glutaminesubstituut, 0,1% B27-supplement en 2,5 ng/ml basisbasis fibroblastgroeifactor (bFGF) gedurende 7 dagen.
  4. Induceer de bolletjes voor gliaspecificatie door ze gedurende 2 weken te onderwerpen aan gliaverrijkingsmedium dat geavanceerde DMEM/F12 bevat met 1% antibioticum-antimycoticum, 1% N2, 1% glutaminesubstituut, 0,1% B27-supplement, 20 ng/ml epidermale groeifactor (EGF), bFGF-H (20 ng/ml bFGF-5 mg/ml heparine) om vroege gliosferen te krijgen (Figuur 1A).
  5. Vervang bFGF-H voor rijping van vroege gliosferen door 20 ng/ml leukemieremmende factor (LIF) en houd de bollen gedurende 4 weken in stand.
  6. Na 4 weken in het rijpingsmedium de bolletjes gedurende langere tijd in het gliaalverrijkingsmedium houden. Om aggregatie en verlies van levensvatbaarheid te voorkomen, worden de gliosferen om de 2 weken mechanisch gehakt met behulp van een steriel industrieel mes en wordt het hele medium vervangen door DNase I om DNA-fragmenten te verwijderen die zijn gegenereerd door hakken.
  7. Dissocieer de gliosferen in monolagen van APC's met behulp van een papaïnedissociatiekit en plaat op een met celcultuur behandelde hechtende schaal met 1:80 verdunning van Matrigel-coating.
  8. Propageer de APC's in gliaverrijkingsmedium tot 80% confluent en passeer ze enzymatisch met behulp van het enzymcelloslatingsmedium (zie de materiaaltabel).
  9. Naar passage:
    1. Verwijder de gebruikte media en verzamel deze op in een conische buis. Voeg aan de cellen het enzymcelloslatingsmedium toe en wacht 1-2 minuten. Zodra de cellen beginnen los te komen, voegt u de gebruikte media toe om de enzymactiviteit te neutraliseren.
    2. Vang de celsuspensie op en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 800 x ɡ .
    3. Zuig de supernatant op, suspendeer de cellen in gliaverrijkingsmedium en plaats ongeveer 1 x 106 cellen/putje op een 1:80 Matrigel-gecoate schaal met 6 putjes.
  10. Voor cryopreservatie:
    1. Resuspendeer de cellen in een koud mengsel van 90% corticosfeerproliferatiemedium (zonder bFGF) en 10% cryoprotectant. Breng de geresuspendeerde cellen over in cryovials.
    2. Verplaats de cryovials onmiddellijk naar een cryobox en bewaar ze een nacht in de vriezer van -80 °C.
    3. Verplaats de volgende dag alle cryovials naar een tank met vloeibare stikstof (LN2-tank ) voor toekomstig gebruik.
      OPMERKING: APC's werden gecryopreserveerd met 10% DMSO tot passage nummer 6.
  11. Karakteriseer de gedissocieerde APC's door immunokleuring (zoals vermeld in de stappen 1.15.1-1.15.3) met vimentine- en nucleaire factor IA (NFIA)-markers (Figuur 1C,D) (zie de tabel met materialen voor verdunningen).
  12. Om de regionale specificiteit van de voorhersenen van hiPSC-afgeleide APC's te bevestigen, test u de cellen op een voorhersenmarker zoals menselijke forkhead box G1 (hFOXG1) (positief) en achterhersenmarker zoals humane Homeobox B4 (hHOXB4) (negatief) met behulp van real-time qPCR (Figuur 1E,F).
    OPMERKING: De primersequenties die voor deze experimenten zijn gebruikt, zijn vermeld in aanvullende tabel S1.

3. Generatie en karakterisering van een homogene populatie van voorhersenspecifieke astrocyten

  1. Differentiatie van astrocyten van APC's
    1. Gebruik het astrocytaire differentiatiemedium (ADM) gedurende 14 dagen om APC's te differentiëren in astrocyten. Astrocytisch differentiatiemedium bevat Neurobasaal, 1% Antibioticum-Antimycoticum, 1% glutaminevervanger, 1% N2-supplement, 0,2% B27-supplement, 1% niet-essentieel aminozuurmedium (NEAA) en 10 ng/ml ciliaire neurotrofe factor (CNTF).
    2. Bevestig de astrocytaire identiteit door immunokleuring te gebruiken (zoals vermeld in de stappen 1.15.1-1.15.3.) met gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) en S100β-expressiemarkers (Figuur 2A,B).
  2. De novo eiwitsynthese in APC's en astrocyten
    1. Onderhoud hiPSC-afgeleide APC's en astrocyten van de voorhersenen op steriele geautoclaveerde glazen dekglaasjes van 13 mm en immunokleuring deze zoals vermeld in de stappen 1.15.1-1.15.3.
    2. Gebruik voor de novo eiwitsynthese de fluorescerende niet-canonieke aminozuurlabeling (FUNCAT)-methode, kort uitgelegd in de stappen 3.2.3-3.2.6 (Figuur 3A).
    3. Om een tekort aan methionine te voorkomen, verwijdert u het groeimedium uit de culturen en vervangt u het door methionine- en cysteïnevrij medium gemengd met 1 mM L-azidohomoalanine (AHA) gedurende 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2.
    4. Was de culturen met PBS-T, fixeer met 4% paraformaldehyde gedurende 10 min, permeabiliseer met 0,3% Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten en blokkeer met 3% BSA in PBS gedurende 1 uur om niet-specifieke binding te voorkomen.
    5. Incubeer de culturen in het donker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met een Click-celchemiereactiemix en Alkyne Alexa Fluor 647, gevolgd door primaire antilichamen gedurende 1 uur en overeenkomstige secundaire antilichamen (Materiaaltabel) gedurende 1 uur (Figuur 3B).
    6. Monteer de dekglaasjes op glazen dia's met montagemedium en gebruik ze voor verdere beeldanalyse.
      1. Verkrijg afbeeldingen door confocale laserscanning bij 405 nm, 488 nm, 561 nm en 633 nm.
      2. Leg afbeeldingen vast met 512 x 512 pixels; stel de Z-stapgrootte in op 0.5 μm met 1 luchtige eenheid met een pinhole-diameter.
      3. Houd de microscopie- en beeldvormingsparameters op een constante instelling voor alle celtypen. Leg afbeeldingen vast voor elke biologische replicaat in dezelfde sessie.
      4. Voer intensiteitsmetingen uit met behulp van standaard beeldanalysesoftware (bijv. Fiji of Imaris). Gebruik in Imaris de SURFACES-module om volumetrische metingen te verkrijgen van cellichamen die positief zijn voor fluorescerend niet-canoniek aminozuurlabelgen (FUNCAT)-signaal met Vimentin (APC's) en GFAP (astrocyten) die het voxelbereik beperken (250-350) om puin te verwijderen.
        OPMERKING: Onderhoud de parameters voor alle biologische replicaten voor beide celtypen.
  3. Adenosine 5′-trifosfaat (ATP)-geïnduceerde oscillerende calciumgolven
    1. Plaat astrocyten op een schaaltje met glazen bodem (35 mm) op 5 × 103 cellen/schaaltje om de cellulaire respons op ATP te meten.
    2. Laat de cellen 24 uur aan de glasbodem hechten, was ze 3x met HBSS (20 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glucose, 1 mM MgCl2, pH = 7,3) zonder calcium, en incubeer in een kweekmedium met 5 μM verhouding metrische kleurstof Fura-2AM en 0,02% Pluronics F127 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Fura-2AM is een licht- en temperatuurgevoelige chemische stof; bewaren bij -20 °C.
    3. Was na de incubatie 2x met kweekmedium en vervang door 2 mM Ca2+ met HBSS en beeld de cellen af met een snelheid van 2 FPS met behulp van een 60x olieobjectief (1,35 NA) in een omgekeerde microscoop die focusdrift compenseert.
    4. Registreer ATP-geïnduceerde calciumresponsen door badtoepassing van ATP bij de uiteindelijke concentratie van 5 mM bij 25es (Figuur 4A).
    5. Teken interessegebieden rond elke cel met behulp van Fiji/ImageJ en bereken de F340/F380-verhouding over alle tijdstippen (Figuur 4B).
  4. Metabole tests van cellen
    OPMERKING: Het zuurstofverbruik (OCR) en de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) van levende cellen werden gemeten volgens het protocol van de fabrikant (zie de materiaaltabel).
    1. Laat de astrocyten een dag voor de test zich hechten aan de microtiterplaat (1,5 × 104 zaaidichtheid) in CNTF-medium en incuberen bij 37 °C met 5% CO2.
    2. Voor de glycolyse stresstest:
      1. Vervang het celkweekmedium door een basismedium aangevuld met 2 mM glutamine (pH aangepast op 7,4) en incubeer gedurende 1 uur in een kamer zonder CO2 bij 37 °C.
        OPMERKING: De pH moet worden aangepast in een waterbad van 37 °C.
      2. Plaats de patroonplaat in het instrument om de sensor te kalibreren. Vervang na de kalibratie de patroonplaat door de celkweekplaat met een eindconcentratie van de volgende kitcomponenten: 10 mM glucose, 1 μM oligomycine en 50 mM 2-deoxyglucose (2-DG) (Figuur 5A).
      3. Aan het einde van de test lyseer je de cellen en schat je het totale eiwitgehalte.
    3. Voor de mitochondrionstresstest:
      1. Vervang het CNTF-medium door een basismedium aangevuld met 2 mM glutamine, 1 mM pyruvaat, 10 mM glucose (pH aangepast aan 7,4) in een waterbad bij 37 °C.
      2. Incubeer de plaat gedurende 1 uur in een kamer die geen CO2 -plichtig is bij 37 °C. Plaats ondertussen de patroonplaat in het instrument om de sensor te kalibreren.
      3. Vervang na de kalibratie de patroonplaat door de celkweekplaat met een eindconcentratie van de volgende kitcomponenten: 1.5 μM oligomycine, 1 μM carbonylcyanide-4 (trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP) en 0.5 μM rotenon/antimycine A (Figuur 5C).
      4. Aan het einde van de test lyseer je de cellen en schat je het totale eiwitgehalte.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Humaan geïnduceerde pluripotente stamcelkolonies (hiPSC) werden in stand gehouden met behulp van in de handel verkrijgbaar gedefinieerd medium en immunogekleurd voor pluripotentiemarkers, Oct4 en Nanog (Figuur 1B). FXS- en CTRL-APC's vertoonden vergelijkbare hoogverrijkte proporties van cellen die immunopositief zijn voor vimentin en NFIA (Figuur 1C,D). We ontdekten dat APC's afg...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een methode om menselijke iPSC-afgeleide astrocyten te genereren die dienen als een testplatform voor het karakteriseren van functionele veranderingen geïnduceerd door FXS. Deze astrocyten zijn functioneel levensvatbaar in cultuur en vertonen verschillende eigenschappen, zoals blijkt uit een reeks metingen die in deze studie zijn uitgevoerd. Een cruciale stap in dit protocol is de initiële conversie van iPSC's naar corticosferen met behulp van de enzymatische lifting-...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken prof. Sumantra Chattarji voor intramurale fondsen. We danken Prof. Gaiti Hasan voor toegang tot de calciumbeeldvorming, Central Imaging and Flow Facility-National Centre for Biological Sciences, Padmanabh Singh en Prangya Hota voor proeflezen en suggesties, en het Labmate Asia-team voor hun hulp bij het uitvoeren van Seahorse XF-testen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-ThioglycerolSigma-AldrichM6145
Accutase oplossingSigma-AldrichA6964Enzyme celdetacheringsmedium 
Adenosine 5'-trifosfaat magnesiumzoutSigma-AldrichA9187
Advanced DMEM/F-12ThermoFisher Scientific12634010
Antibiotic-Antimycotic (100x)ThermoFisher Scientific15240062
B-27 Supplement (50x), serumvrijThermoFisher Scientific17504044
Bovine Serum AlbumineSigma-AldrichA9418
Chemisch gedefinieerd lipidconcentraatThermoFisher Scientific11905031
Collageenase, Type IV, poederThermoFisher Scientific17104019
Deoxyribonuclease IWorthington Biochemical CorporationLK003170
DimethylsulfoxideSigma-AldrichD2650
Dispase II, poederThermoFisher Scientific17105041
DPBS, geen calcium, geen magnesiumThermoFisher Scientific14190144
Essential 8 MediumThermoFisher ScientificA1517001
FXS1, FXS2 Coriell Institute of Medical Research GM07072, GM05848FXS-patiëntcellen
GlutaMAX-supplementThermoFisher Scientific35050061glutamine-substituut
Ham's F-12 voedingsmengselThermoFisher Scientific11765054
Gezond controlecellen Cedars-Sinai Medical Center ND30625gezonde controlecellen 
Heparine natriumzout uit varkens darmmucosaSigma-AldrichH3149
IMDMThermoFisher Scientific12440053
Insulin, humaanRoche11376497001
LDN 193189 Stratech ScientificS2618-SEL
Leukemieremmend factor humaanSigma-AldrichL5283
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) basaal membraanmatrixCorning354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)ThermoFisher Scientific11140050
Muis FGF-basic (FGF-2/bFGF) recombinant eiwitPeprotech450-33
Mr. Frosty vriescontainerThermoFisher Scientific5100-0001cryobox
N-2 Supplement (100x)ThermoFisher Scientific17502048
N-Acetyl-L-cysteïneSigma-AldrichA9165
Neurobasal MediumThermoFisher Scientific21103049
Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic TubesThermoFisher Scientific377267
Nunc Cell-Culture Treated 6 wells schaalThermoFisher Scientific140675
Papaine dissociatie systeemWorthington Biochemical CorporationLK003150
Penicilline-StreptomycineThermoFisher Scientific15140122
Recombinant humaan CNTF-eiwit, CF R&D Systems257-NT-010
Recombinant humaan EGF-eiwit, CFR&D Systems236-EG-01M
RevitaCell-supplement (100x)ThermoFisher ScientificA2644501
SB431542Tocris1614
Seahorse XFe24 Analyzer Agilent Technologies
Seahorse XF Cell Mito Stress Test KitAgilent Technologies103015-100
Seahorse XF Glycolysis Stress Test KitAgilent Technologies103020-100
Weefselkweek schotels-100 cmBiostar LifetechTCD000100
TransferrineRoche10652202001
VWR Scherpe messenVWR International55411-050
Antilichamen 
Primair antilichaamBedrijfCatalogusnummerVerdunning
Oct4 (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279Verdunning: 1:250
Secundair antilichaam: Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 568
NanogR & D SystemsAF1997Verdunning: 1:100
Secundair antilichaam: Donkey anti-Goat IgG, Alexa Fluor 488
VimentinAbcamAb5733Verdunning: 1:500
Secundair antilichaam: Goat anti-Chicken IgY, Alexa Fluor 488
NFIAAbcamAb41851Verdunning: 1:500
Secundair antilichaam: Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568
GFAP-cy3SigmaC9205Verdunning: 1:500
Secundair antilichaam: NA
GFAPDAKOZ0334Verdunning: 1:500
Secundair antilichaam: Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568
S100βDAKOIR504Verdunning: 1:500
Secundair antilichaam: Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488
Anti-Nuclei Antilichaam, clone 235-1Merck MilliporeMAB1281Verdunning: 1:1000
Secundair antilichaam: Goat anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 555
Secundaire antilichamen Verdunning
Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific A110041:1000
Donkey anti-Goat IgG,

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Molecular of fragile X syndrome: A twenty-year perspective. Annu Rev Pathol. 7, 219-245 (2012).
  2. Wang, H., et al. Developmentally-programmed FMRP expression in oligodendrocytes: A potential role of FMRP in regulating translation in oligodendroglia progenitors. Hum Mol Genet. 13 (1), 79-89 (2004).
  3. Pacey, L. K. K., Doering, L. C. Developmental expression of FMRP in the astrocyte lineage: Implications for fragile X syndrome. Glia. 55 (15), 1601-1609 (2007).
  4. Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
  5. Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
  6. Khakh, B. S., McCarthy, K. D. Astrocyte calcium signaling: From observations to functions and the challenges therein. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (4), a020404(2015).
  7. Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
  8. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  9. Rothstein, J. D., et al. Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate. Neuron. 16 (3), 675-686 (1996).
  10. Almad, A., Maragakis, N. J. A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease. Nat Rev Neurol. 14 (6), 351-362 (2018).
  11. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: An underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 20 (5), 588-594 (2010).
  12. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14 (5), 311-321 (2013).
  13. Bradley, R. A., et al. Regionally specified human pluripotent stem cell-derived astrocytes exhibit different molecular signatures and functional properties. Development. 146 (13), dev170910(2019).
  14. Das Sharma, S., et al. Astrocytes mediate cell non-autonomous correction of aberrant firing in human FXS neurons. Cell Rep. 42 (4), 112344(2023).
  15. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  16. Hu, X., et al. The JAK/STAT signaling pathway: from bench to clinic. Sig Transduct Target Ther. 6, 402(2021).
  17. Baser, A., et al. Onset of differentiation is post-transcriptionally controlled in adult neural stem cells. Nature. 566 (7742), 100-104 (2019).
  18. Pal, R., Bhattacharya, A. Modelling protein synthesis as a biomarker in fragile x syndrome patient-derived cells. Brain Sci. 9 (3), 1-12 (2019).
  19. Gross, C., Bassell, G. J. Excess protein synthesis in FXS patient lymphoblastoid cells can be rescued with a p110β-selective inhibitor. J Mol Med. 18 (3), 336-345 (2012).
  20. Kumari, D., et al. Identification of fragile X syndrome specific molecular markers in human fibroblasts: A useful model to test the efficacy of therapeutic drugs. Hum Mutat. 35 (12), 1485-1494 (2014).
  21. Jacquemont, S., et al. Protein synthesis levels are increased in a subset of individuals with fragile X syndrome. Hum Mol Genet. 27 (12), 2039-2051 (2018).
  22. Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24 (39), 8606-8620 (2004).
  23. Schmunk, G., Boubion, B. J., Smith, I. F., Parker, I., Gargus, J. J. Shared functional defect in IP3R-mediated calcium signaling in diverse monogenic autism syndromes. Transl Psychiatry. 5 (9), e643-e710 (2015).
  24. Peteri, U. K., et al. Generation of the human pluripotent stem-cell-derived astrocyte model with forebrain identity. Brain Sci. 11 (2), 209(2021).
  25. Alvarez-Mora, M. I., et al. Impaired mitochondrial function and dynamics in the pathogenesis of FXTAS. Mol Neurobiol. 54 (9), 6896-6902 (2017).
  26. Giulivi, C., et al. Mitochondrial dysfunction in autism. JAMA. 304 (21), 2389-2396 (2010).
  27. Anitha, A., et al. Brain region-specific altered expression and association of mitochondria-related genes in autism. Mol Autism. 3 (1), 12(2012).
  28. Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Front Neurosci. 11, 737(2018).
  29. Yao, J., et al. Mitochondrial bioenergetic deficit precedes Alzheimer's pathology in female mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (34), 14670-14675 (2009).
  30. Sonntag, K. C., et al. Late-onset Alzheimer's disease is associated with inherent changes in bioenergetics profiles. Sci Rep. 7 (1), 14038(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fragile X SyndromeInduced Pluripotent Stem CellsAstrocyte Progenitor CellsAstrocyte DifferentiationGlial Enrichment MediumCalcium ImagingGlycolytic MetabolismMitochondrial RespirationImmunostaining MarkersNeurodevelopmental Disorders

Gerelateerde artikelen