Effecten van Shikonin op de HIF-1α/VEGF-signaleringsroute bij muizen met acuut longletsel veroorzaakt door sepsis

Samenvatting

Het protocol heeft tot doel de effectiviteit van shikonin te evalueren bij het verlichten van acuut longletsel veroorzaakt door sepsis bij muizen. Door zich te richten op de HIF-1α/VEGF-route, onderzoekt de studie hoe verschillende doses shikonine de overlevingskansen, longpathologie en expressie van ontstekingsmarkers beïnvloeden, en benadrukt het de potentiële therapeutische voordelen ervan.

Samenvatting

Sepsis veroorzaakt vaak acuut longletsel (ALI), een complicatie met een hoge mortaliteit. De HIF-1α/VEGF-route speelt een sleutelrol bij sepsis en shikonine, een natuurlijke verbinding met ontstekingsremmende eigenschappen, kan longbeschadiging verlichten door zich op deze route te richten. Balb/c-muizen werden willekeurig verdeeld in vier groepen: schijngroep, modelgroep, laaggedoseerde behandelingsgroep en hooggedoseerde behandelingsgroep. De schijngroep onderging een laparotomie zonder cecale ligatie en punctie (CLP), terwijl de modelgroep CLP onderging om sepsis-gerelateerd acuut longletsel te induceren. Na modellering kregen de behandelingsgroepen met een lage dosis en een hoge dosis shikonine via een maagsonde in doses van respectievelijk 12,5 mg/kg en 50 mg/kg, eenmaal daags gedurende 14 dagen. Het 7-daagse overlevingspercentage van de muizen werd gecontroleerd. Hematoxyline- en eosine (HE)-kleuring werd gebruikt om de pathologie van longweefsel te beoordelen, de gewichtsverhouding tussen nat en droog (W/D) van de long werd gemeten en er werd een westerse vlek uitgevoerd om de expressie van HIF-1α, VEGF, TNF-α en IL-6 in longweefsel te detecteren. Shikonin verbeterde de overlevingskans van septische muizen aanzienlijk, met het grootste effect waargenomen in de groep met hoge doses (p < 0,05). Vergeleken met de modelgroep waren de W/D-ratio van de longen en weefselbeschadiging in de met shikonin behandelde groepen significant verminderd op een dosisafhankelijke manier. Bovendien verlaagde shikonine de expressie van HIF-1α, VEGF, TNF-α en IL-6 aanzienlijk, waarbij de groep met de hoge dosis de meest uitgesproken vermindering vertoonde (p < 0,05). Shikonin verlicht acuut longletsel bij septische muizen, mogelijk door de expressie van HIF-1α te remmen en de productie van gerelateerde ontstekingsfactoren te verminderen.

Inleiding

Sepsis is een ernstige systemische ontstekingsreactie die wordt veroorzaakt door een infectie. ¹ Het leidt vaak tot disfunctie van meerdere organen en kan levensbedreigend worden naarmate de aandoening vordert. ² Ondanks het gebruik van therapieën zoals mechanische beademing en ondersteunende zorg blijven de sterftecijfers voor sepsis-geassocieerde ALI hoog, tot 30%-40%³. Deze behandelingen richten zich voornamelijk op symptomen in plaats van op de onderliggende oorzaken, waardoor hun algehele effectiviteit wordt beperkt. Daarom zou het identificeren van nieuwe therapeutische benaderingen die gericht zijn op de oorzaken van longbeschadiging de patiëntresultaten bij sepsis aanzienlijk kunnen verbeteren.

Recente studies hebben hypoxie-induceerbare factor-1α (HIF-1α) geïdentificeerd als een kritische regulator in de progressie van door sepsis geïnduceerde ALI ^4,5. HIF-1α hoopt zich op in longweefsel tijdens sepsis en stimuleert de expressie van stroomafwaartse genen die ontstekingen en weefselbeschadiging verergeren⁶. Dit proces draagt aanzienlijk bij aan de verergering van longschade. Daarom biedt het richten op de HIF-1α-signaleringsroute een veelbelovende benadering voor het verminderen van de inflammatoire en hypoxische reacties die worden gezien bij door sepsis geïnduceerde ALI.

In de zoektocht naar effectievere behandelingen heeft de Traditionele Chinese Geneeskunde (TCM) waardevolle inzichten opgeleverd ^7,8. Shikonin is een anthrachinonverbinding die wordt gewonnen uit Lithospermum erythrorhizon⁷. Het vertoont opmerkelijke ontstekingsremmende⁹-, antibacteriële¹⁰- en antitumoreffecten¹¹. Shikonin kan longbeschadiging veroorzaakt door lipopolysaccharide (LPS) verlichten, wat wijst op de mogelijke therapeutische rol ervan bij longaandoeningen¹². Tegelijkertijd hebben sommige onderzoeken ook gesuggereerd dat shikonine oxidatieve schade veroorzaakt door sepsis kan verlichten door het mononucleaire macrofaagsysteem te reguleren, waarbij pro-inflammatoire en ontstekingsremmende reacties in evenwicht worden gebracht. De mechanismen achter de beschermende effecten van shikonin bij door sepsis geïnduceerde ALI worden echter niet volledig begrepen. Dit vertegenwoordigt een kritieke lacune in het huidige onderzoek.

In deze studie willen we de beschermende effecten van shikonine onderzoeken in een muismodel van sepsis-geïnduceerde ALI met behulp van cecale ligatie en punctie (CLP). CLP-technologie speelt een belangrijke rol in het onderzoek naar sepsis, omdat het complexe systemische ontstekingsreacties en disfunctie van meerdere organen kan simuleren, waardoor het geschikt is voor het evalueren van de effectiviteit van nieuwe behandelingsstrategieën. CLP-technologie is relatief klinisch relevanter in vergelijking met traditionele LPS-injectiemethoden: het simuleert de systemische ontstekingsreactie veroorzaakt door translocatie van de darmmicrobiota, die dichter bij het pathologische proces van klinische sepsis ligt. Het kan worden beoordeeld en gecontroleerd: door de ligatielengte en perforatiegrootte aan te passen, kan de ernst van de ziekte worden gecontroleerd en is het geschikt voor de gehele studie van sepsis. Bovendien kan het vergelijkbare dynamische veranderingen in multi-orgaandisfunctie en cytokinerespons simuleren. Door de rol van shikonine bij het moduleren van de HIF-1α/VEGF-signaleringsroute te onderzoeken, hopen we inzicht te krijgen in nieuwe therapeutische strategieën die de onderliggende mechanismen van sepsis-gerelateerde longbeschadiging aanpakken, waardoor de klinische resultaten mogelijk worden verbeterd.

Protocol

Het protocol kreeg goedkeuring van het Wenzhou Medical University Experimental Animal Center. Mannelijke C57Bl/6-muizen (5-6 maanden oud; 20-25 g) werden gebruikt in de huidige studie. De details van de belangrijkste reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van het sepsis-muismodel

1. Huismuizen onder een constante temperatuur van 25 °C, 50% luchtvochtigheid en een licht/donkercyclus van 12 uur.
2. Verdeel de muizen na een acclimatisatieperiode van 7 dagen willekeurig in vier groepen: schijngroep, modelgroep, behandelingsgroep met lage dosis en behandelingsgroep met hoge dosis, met 20 muizen in elke groep.
3. Op basis van referenties uit een eerdere studie¹³, behandel de groep met een lage dosis met een concentratie van 12,5 mg/kg purpurine gedurende 14 dagen, en de groep met de hoge dosis met een concentratie van 50 mg/kg gedurende 14 dagen. Voer voor de groep met schijnchirurgie laparotomie, blindedarmtractie, -reductie en -sluiting uit zonder ligatie of punctie, en behandel met dezelfde dosis fysiologische zoutoplossing gedurende 14 dagen. De experimentele stappen voor de sepsisgroep zijn als volgt.
4. Na een nacht vasten (water was toegestaan), verdoofd de muizen met natriumpentobarbital (40-80 mg/kg) onder steriele omstandigheden gedurende het hele proces. Breng dierenartszalf aan op de ogen om uitdroging onder narcose te voorkomen.
5. Controleer de juiste verdoving als vertraging van de ademhalingsfrequentie, afname van spierspanning en geen duidelijke stressreactie bij het lichtjes afklemmen van de onderste ledematen met een hemostatische tang.
6. Desinfectie uitvoeren met 75% ethanol, 3x. Maak een longitudinale incisie van ongeveer 1 cm in het midden links van de buik van de muis en snijd de huid, fascia en spieren in lagen open om de buikholte bloot te leggen.
7. Gebruik een oogheelkundige tang met stompe punt in beide handen om voorzichtig de buikholte te verkennen, de blindedarm van de muis te lokaliseren en te bevrijden, en deze op een afstand van ongeveer 1 cm van het einde van de blindedarm te binden.
8. Gebruik een naald van 21 G om het uiteinde van de blindedarm te doorboren en te binden, knijp voorzichtig een kleine hoeveelheid darminhoud uit de prikplaats met behulp van een oogheelkundige tang met stompe punt en haal deze vervolgens in de blindedarm.
9. Voer onderhuidse vloeistofreanimatie uit met 1 ml 0,9% natriumchlorideoplossing. Laat het dier niet zonder toezicht achter totdat het weer voldoende bij bewustzijn is om de sternale lighouding te behouden. We merken op dat het dier dat een operatie heeft ondergaan, pas wordt teruggebracht naar het gezelschap van andere dieren als het volledig hersteld is.
10. Dien na 7 dagen CLP-modellering overmatige anesthesie toe voor euthanasie.
    OPMERKING: Vanwege de mogelijke irriterende effecten van purpurin op de huid, de luchtwegen en het spijsverteringskanaal, evenals de hoge toxiciteit voor in het water levende organismen, milieuvervuiling, dient u tijdens het experiment persoonlijke bescherming te gebruiken.

2. Beoordeling van diermodellen

1. Observatie van de overleving van muizen
   1. Voer de behandeling van dieren uit zoals hierboven beschreven. Noteer het sterftecijfer binnen 1 week na modellering voor statistische analyse. Sommige muizen sterven zonder sepsis vóór euthanasie, terwijl CLP-modelmuizen een bepaald sterftecijfer hebben (Tabel 1).
   2. Meting van de nat-droogverhouding van de long
      1. Verdoof de muizen na 24 uur modelleren opnieuw volgens de stappen 1.4-1.5.
      2. Maak een longitudinale incisie van ongeveer 1 cm aan de linkerkant van de middellijn van het sleutelbeen van de muis en verwijder de huid-, fascia- en spierlagen om de borstholte bloot te leggen met een chirurgische schaar en een tang.
      3. Verwijder de linkerlong en laat de oppervlaktevloeistof weglopen. Meet het natte gewicht af en droog het vervolgens in een oven van 80 °C gedurende 72 uur tot een constant gewicht om het droge gewicht te verkrijgen.
      4. Bereken het longwatergehalte als:
         Longwatergehalte = (Nat gewicht - Droog gewicht) / Nat gewicht x 100%.
   3. Histopathologische vergelijking van longweefsel
      1. Verzamel op gespecificeerde tijdstippen de linkerlong zoals hierboven beschreven in stap 2.2. Fixeer de long in 10% neutraal formaldehyde, sluit deze in in paraffine en snijd deze in op een dikte van 5 μm.
      2. Ontwax de long in xyleen, 2x, gedurende 5-10 minuten per keer. Voer seriematige ethanolrehydratatie uit met 100%, 95%, 85% en 75%, gedurende 3 minuten per gradiënt. Week 2 minuten in gedestilleerd water.
      3. Bevlek met ongeveer 100 ml hematoxylineoplossing gedurende 10 minuten en spoel vervolgens af met gedestilleerd water om eventuele drijvende kleur te verwijderen.
      4. Voeg ongeveer 70 ml van de differentiatieoplossing toe en laat 30 s weken. Week vervolgens 2x in kraanwater, telkens 3-5 minuten.
      5. Voeg ongeveer 100 ml eosinekleurstofoplossing druppelsgewijs toe gedurende 2 minuten. Giet overtollige kleurstofoplossing weg en dehydrateer snel zoals hieronder beschreven.
      6. Voer uitdroging, transparantie en afdichting uit zoals hieronder beschreven.
         1. Week monsters in gradiënt-ethanol: 75%, 85%, 95% en 100% ethanol (I) gedurende elk 2-3 s. Week 1 minuut in 100% ethanol (II) en week telkens 2x 1 minuut in xyleen. Druppel met een rietje of druppelaar neutrale kauwgom op het oppervlak van weefselplakjes en verdeel het zo gelijkmatig mogelijk om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Verzegel en observeer onder een microscoop op 400x.
      7. Selecteer 10 willekeurige velden per longsectie. Vraag een patholoog om pathologische veranderingen zoals alveolair oedeem, bloeding en neutrofieleninfiltratie te scoren van 0 (normaal) tot 4 (ernstige schade). Gebruik de totaalscore voor evaluatie.
   4. Western blotting
      1. Extraheer nucleaire eiwitten uit longweefsel volgens de instructies van de nucleaire eiwitextractiekit en meet de eiwitconcentratie met behulp van de BCA-methode volgens de instructies van de fabrikant.
      2. Bereid eiwitlaadmonsters voor met 50 μg eiwit per monster. Bereid SDS-PAGE scheidingsgel (10%) en stapelgel (3%). Voer elektroforese uit bij 80 V gedurende 45 minuten en breng vervolgens het eiwit over naar het PVDF-membraan bij 110 V gedurende 60 minuten nadat de monsters de scheidingsgel zijn binnengegaan.
      3. Breng eiwitten over naar een membraan en blokkeer gedurende 60 minuten. Incubeer met primaire antilichamen (zie Materiaaltabel, 1:1000) 's nachts bij 4 °C, gevolgd door incubatie van secundair antilichaam (zie Materiaaltabel, 1:1000) bij 37 °C gedurende 2 uur.
      4. Was het membraan met TBST en gebruik ECL voor visualisatie. Voeg in een donkere kamer de voorbereide reagentia toe aan een PVDF-membraan en voer schud- en fluorescentiebeeldvorming uit. ECL-reagentia interageren met biomoleculen op het membraan en produceren sterke chemoluminescentiereacties, die worden geregistreerd door fluorescentiebeeldvormingsinstrumenten.
      5. Analyseer de grijswaardenwaarde van eiwitbanden met behulp van een beeldanalysesysteem, Band Quantification Method (voor gedetailleerde informatie over het systeem dat wordt gebruikt voor het analyseren van banddensitometrie, zie NIH-afbeelding).
   5. Statistische analyse
      1. Gebruik SPSS 26.0 voor statistische analyse. Gebruik eenrichtings-ANOVA om de gemiddelden van meerdere groepen te vergelijken, en LSD-t-tests voor paarsgewijze vergelijkingen. Beschouw een p-waarde < 0,05 als statistisch significant.

Resultaten

Om het therapeutisch potentieel van shikonin te beoordelen, evalueerden we eerst het effect ervan op de overleving bij septische muizen gedurende een periode van 7 dagen. Behandeling met shikonine verbeterde de overlevingskansen op een dosisafhankelijke manier (Figuur 1).

Gezien het wijdverbreide voorkomen van longbeschadiging bij sepsis, hebben we ook longoedeem bij muizen beoordeeld. Longoedeem werd geëvalueerd ...

Discussie

Als het gouden standaardmodel voor onderzoek naar sepsis is het CLP-model een belangrijke stap in dit experiment, omdat CLP de complexiteit van menselijke sepsis beter nabootst dan veel andere modellen. Sepsis-geassocieerde ALI blijft een kritieke klinische uitdaging vanwege de hoge sterftecijfers en de beperkte effectiviteit van de huidige behandelingen^14,15. Onze studie toont voor het eerst aan dat shikonine de overleving bij s...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
H&E stain kit staining kit	Solaibao Technology	G1120HE
Laag-temperatuur centrifuge	Sigma	3K15
Microplate Reader	Bio-Rad	Model 680
konijn monoklonaal VEGF-receptor1 antilichaam	Abcam	ab238632
konijn polyklonaal HIF-1α antilichaam	Abcam	ab51608
SDS-PAGE elektroforese systeem	Bio-Rad	MINI Protean2
Shikonin	MedChemExpress	HY-N0822