Methodenartikel

CRISPR-epigenoombewerking in menselijke cellen met behulp van plasmide-DNA-transfectie en mRNA-nucleofectieafgifte

DOI:

10.3791/68089

⸱

30 mei 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, 2Chan Zuckerberg Biohub - San Francisco

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol beschrijft methoden voor geclusterde, regelmatig tussenliggende korte palindromale herhalingen (CRISPR)-gebaseerde epigenoombewerking in menselijke cellijnen met behulp van plasmide-DNA-transfectie en mRNA-nucleofectie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epigenetica verwijst naar chemische modificaties van histon-eiwitten en DNA die de expressie van genen kunnen reguleren. Het menselijk epigenoom wordt dynamisch veranderd tijdens celdifferentiatie en veroudering, en veel ziekten worden geassocieerd met afwijkende epigenoompatronen. Recente ontwikkelingen in CRISPR hebben geleid tot de ontwikkeling van programmeerbare tools om epigenetische modificaties op gerichte genomische loci te bewerken, waardoor epigenetische modificaties in menselijke cellen nauwkeurig kunnen worden herschreven. Op CRISPR gebaseerde epigenoomeditors vertrouwen op katalytisch dood Cas9 in combinatie met epigenetische modificatoren die uiteindelijk resulteren in geprogrammeerde onderdrukking of activering van gerichte genen in het genoom van zoogdieren. In tegenstelling tot traditionele genoombewerkingsmethoden, vereist epigenoombewerking geen DNA-breuken of veranderingen in de sequentie van het menselijk genoom en dient het dus als een veiliger alternatief om genexpressie te beheersen. In dit protocol belichten we twee verschillende methoden om dCas9-gemedieerde epigenoombewerking uit te voeren in menselijke cellijnen met behulp van plasmide-DNA-transfecties en nucleofectie van mRNA's die coderen voor CRISPR-epigenoomeditors. We demonstreren programmeerbare epigenoombewerking om genen tijdelijk te onderdrukken met behulp van CRISPR-interferentie (CRISPRi) en om genen wekenlang duurzaam uit te schakelen met behulp van CRISPRoff, een fusie van dCas9 met het KRAB-domein en de novo DNA-methyltransferasecomplex. We bieden ook richtlijnen voor kwantitatieve methoden om succesvolle epigenoombewerking van doelgenen te meten en belangrijke overwegingen over welke epigenoombewerkingstool moet worden gebruikt, afhankelijk van experimentele criteria.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel de genomische inhoud van elke cel in ons lichaam bijna identiek is, verschilt het transcriptieprofiel van elk celtype sterk. Epigenetische modificaties op DNA en histon-eiwitten zijn belangrijke regulatoren van transcriptionele expressie. Transcriptioneel actieve euchromatine wordt gekenmerkt door duidelijke epigenetische kenmerken in vergelijking met compact, transcriptioneel inactief heterochromatine. Heterochromatische regio's worden bijvoorbeeld gedefinieerd door repressieve histonmodificaties, waaronder trimethylering op lysine 9 van histon 3 (H3K9me3), trimethylering op lysine 27 van histon H3 (H3K27me3) en DNA-methylering op cytosines naast guanines (CpG) bij genpromotors1. Genomische regio's met actieve genexpressie worden doorgaans gedefinieerd door histonacetylering en trimethylering op lysine 4 van histon 3 (H3K4me3)1.

De revolutie van Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) heeft een schat aan hulpmiddelen gegenereerd die geprogrammeerde verandering van genomische sequenties mogelijk maken. CRISPR-technologie is gebaseerd op een prokaryotisch afweermechanisme dat in staat is nucleïnezuren te splitsen op programmeerbare doelsequenties. CRISPR-nucleasen 2,3,4, basiseditors 5,6 en prime-editors 7,8 kunnen de DNA-sequentie van zoogdiergenomen veranderen door DNA-knippen en repareren van deze breuken. Hoewel ze effectief zijn, kunnen deze strategieën DNA-breuken veroorzaken op off-target locaties 9,10 en grootschalige genomische structurele mutaties 11,12,13,14,15. Alternatieve op CRISPR gebaseerde tools maken hanteerbare modulatie van genactivering en -onderdrukking mogelijk zonder de onderliggende DNA-sequentie te veranderen. Deze tools maken gebruik van een nucleasedeficiënt Cas9 (dCas9), waardoor DNA-binding mogelijk is op doellocaties die worden gedicteerd door de sgRNA-sequentie, in combinatie met effectoreiwitten die het chromatinelandschap veranderen 16,17,18. Effectoreiwitten, zoals epigenetische schrijvers, lezers en gummen, kunnen direct worden gefuseerd met dCas9 of worden gerekruteerd door een peptidesteiger die is gefuseerd met dCas9, zoals SunTag, of een RNA-steiger op het sgRNA, zoals het MS2-MCP-systeem 16,17,18. Voorbeelden van programmeerbare transcriptiecontroletools zijn CRISPR-activering (CRISPRa)19,20,21 en CRISPR-interferentie (CRISPRi)22,23. CRISPRa werkt door de transcriptiemachine direct te rekruteren, waardoor de transcriptionele genexpressie van het doelwit toeneemt19. Daarentegen onderdrukt CRISPRi transcriptie door H3K9me3 vast te stellen, een repressieve epigenetische markering22.

Vooruitgang in het bewerken van epigenoom heeft een breed gebruik van deze tools in verschillende wetenschappelijke gebieden mogelijk gemaakt. Fusies van verschillende effectordomeinen en eiwitten hebben de toolkit van beschikbare epigenoomeditors uitgebreid 18,24,25,26,27,28,29,30. Bovendien worden epigenoomeditors gebruikt om de rol van epigenetische modificaties 31,32,33,34,35,36, effectoren 37,38,39 en effectormutaties 28,40,41 te ontcijferen in genregulatie. In het bijzonder worden CRISPRi en CRISPRa gebruikt in functionele genomica-schermen voor een verscheidenheid aan biologische processen, waaronder celoverleving42 en cellot 43,44,45,46,47. Bovendien heeft epigenoombewerking therapeutisch potentieel voor ex vivo celmanipulatie en in vivo therapieën18.

Hier beschrijven we methoden voor het toepassen van twee op dCas9 gebaseerde epigenoomeditors voor programmeerbare transcriptionele onderdrukking in menselijke cellijnen: CRISPRi22 en CRISPRoff48. CRISPRi is een fusie van dCas9 naar het repressieve KRAB-domein uit een zinkvingereiwit zoals ZNF10 (KOX1) en ZIM322,23. Wanneer CRISPRi gericht is op een specifieke genpromotor, rekruteert het KRAB-domein een H3K9me3-schrijver, SETDB1, om het doelgen te onderdrukken (Figuur 1A). Wanneer CRISPRi tijdelijk tot expressie wordt gebracht, wordt het gevestigde H3K9me3 op de doellocus niet gehandhaafd en wordt de genexpressie na verloop van tijd hersteld32,48. Om stabiele knockdowns uit te voeren met behulp van CRISPRi, zoals in functionele genomica-toepassingen, is constitutieve expressie van CRISPRi in de cellen samen met het sgRNA essentieel. Onlangs is CRISPRoff ontworpen om erfelijke epigenoombewerking te programmeren48. CRISPRoff is een enkelvoudige eiwitfusie van dCas9 naar het KRAB-domein en de novo DNA-methyltransferasecomplex, DNMT3A en DNMT3L. Een voorbijgaande puls van CRISPRoff in menselijke cellen programmeert de afzetting van H3K9me3 en DNA-methylering op de doelgenen, wat leidt tot langdurige onderdrukking van doelgenen door het behoud van DNA-methylering en H3K9me3 (Figuur 1B)48. Bovendien kunnen epigenoombewerkingen worden teruggedraaid. Een gen dat bijvoorbeeld stabiel tot zwijgen wordt gebracht door CRISPRoff, kan worden gereactiveerd door TET1-dCas9, dat enzymatisch de DNA-methylatiemarkeringen op doelloci49 kan verwijderen.

Dit protocol beschrijft twee toedieningsmethoden voor de voorbijgaande expressie van epigenoomeditors: plasmide-DNA-transfectie en mRNA-nucleofectie. Daarnaast schetsen we hoe flowcytometrie kan worden gebruikt om de werkzaamheid van epigenoombewerking te beoordelen bij twee endogene genen, CLTA en CD55. Deze methoden kunnen worden aangepast en toegepast op andere experimenten met het bewerken van epigenoom met behulp van extra editors of kunnen worden gebruikt om verschillende genen aan te pakken.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schema van het epigenoombewerkingsmechanisme en de workflow van CRISPRi en CRISPRoff. (A) Lineaire schema's van het sgRNA-transgen en de CRISPRi-epigenoomeditor. De toevoeging van CRISPRi en sgRNA maakt de toevoeging van de repressieve H3K9me3-histonmarkering mogelijk om de doellocus tot zwijgen te brengen. Het hoogste niveau van uitschakeling wordt vroeg na toevoeging van CRISPRi bereikt en het gendoelwit wordt over het algemeen na een paar passages gereactiveerd. (B) Lineaire schema's van het sgRNA-transgen en de CRISPRoff-epigenoomeditor. De toevoeging van CRISPRoff aan cellen die zich richten op een interessant gen leidt tot de toevoeging van repressief H3K9me3 samen met DNA-methylering op CpG-plaatsen om het doelgen uit te schakelen. Silencing door CRISPRoff is erfelijk - het hoge niveau van silencing wordt vroeg tijdens de transfectie bereikt en houdt aan over meerdere celdelingen. (C) Overzicht van tijdlijn voor epigenoombewerking via transfectiemethode. Op dag 0 worden de cellen geplateerd voor transfectie. Op dag 1 kunnen de editor en het gidsplasmide via transfectie in de cellen worden geïntroduceerd. Op dag 3 worden de cellen beoordeeld op BFP-expressie via flowcytometrie. Het percentage BFP wordt gebruikt als een normaliserende factor om de uiteindelijke uitschakelingswerkzaamheid van het experiment voor elke aandoening te bepalen. Vanaf dag 6 worden de cellen geanalyseerd om de verslaggever van interesse tot zwijgen te brengen, aangezien het hoogste niveau van uitschakeling op deze dag zal worden bereikt. (D) Het overzicht van de transfectiemethode waarin de epigenoomredacteur en de plasmiden van sgRNA aan cellen op een druppelsgewijze manier worden toegevoegd. (E) Overzicht van de tijdlijn voor epigenoombewerking via de nucleofectiemethoden. In dit protocol is mRNA nucleofectie in de cellen op dag 0. De cellen worden beoordeeld op uitschakeling op dag 3 na de nucleofectie met behulp van flowcytometrie-analyse. (F) Overzicht van het nucleofectieprotocol. De juiste hoeveelheden cellen en mRNA worden gemengd en toegevoegd aan nucleofectorcuvetten. Als het sgRNA door nucleofectie wordt geïntroduceerd, kan het ook aan dit mengsel worden toegevoegd. De cuvetten worden in de nucleofector geplaatst en de juiste pulscodes worden gebruikt om het mRNA in cellen te introduceren. Na de nucleofectie worden de cellen geplateerd en later gepasseerd voor analyse. (G) Vergelijking tussen plasmidetransfectie en mRNA-nucleofectiestrategieën voor epigenoombewerking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Aanvullend bestand 1 bevat details over het sgRNA-ontwerp, het klonen en het genereren van cellijnen van onze representatieve gegevens. In het gedeelte met representatieve resultaten worden ook suggesties voor controles gegeven.

1. Transfectie van epigenoomeditor-expressie plasmiden in HEK293T cellen

OPMERKING: Dit protocol beschrijft de afgifte van CRISPR-coderende plasmiden aan HEK293T cellen. We hebben cellen gemanipuleerd om een sgRNA (Addgene 217306) tot expressie te brengen dat gericht is op het promotorgebied van CLTA, een niet-essentieel gen dat endogeen is gelabeld met GFP. De CLTA-GFP HEK 293T-cellen zijn afkomstig uit een eerdere studie50. In dit voorbeeld worden de epigenoomeditors direct aan een blauw fluorescerend eiwit (BFP) gefuseerd, wat ons in staat stelt de transfectie-efficiëntie te kwantificeren en een nauwkeurige evaluatie van experimentele omstandigheden verzekert. De doeltreffendheid van de aanpak wordt aangetoond door het uitschakelen van CLTA-GFP, dat kwantitatief kan worden gemeten op eiwitniveau in afzonderlijke cellen met behulp van flowcytometrie.

  1. Celcultuur
    1. Behoud HEK293T cellen in DMEM met een hoog glucosegehalte met 10% FBS en 1x penicilline-streptomycine-glutamine. Passeer de cellen elke 2-3 dagen en zorg ervoor dat ze op een samenvloeiing van 60%-70% blijven.
      OPMERKING: Om optimale transfectieefficiency te verzekeren, is het kritiek om celconfluency onder 70% te handhaven, die dagelijks onder een microscoop kan worden gecontroleerd.
  2. Dag 0: Zaaien HEK293T cellen voor transfectie
    1. De dag vóór transfectie, tel cellen met een geautomatiseerde celteller die trypanblauwe levende/dode kleuring gebruikt en zaad ~1.5 x 104 levende cellen per put in een plaat met 96 putjes. Houd het uiteindelijke volume van elk putje op 200 μL. Cellen zouden de volgende dag een samenvloeiing van 60%-70% moeten bereiken.
      OPMERKING: Dit kan ook efficiënt worden uitgevoerd in platen met 24 of 6 putjes. Zie Tabel 1 voor celaantallen en DNA-hoeveelheid voor transfectie.
  3. Dag 1: Transfectie van CRISPRoff- en CRISPRi-plasmiden naar HEK29T-cellen
    1. Aliquot 150 ng van het epigenoomeditorplasmide (Addgene 167981) voor elk putje in een totaal volume van 3 μL. Deze plasmideverdunningen kunnen worden bereid in PCR-stripbuisjes.
      OPMERKING: Als de epigenoomeditor en het sgRNA-plasmide samen worden getransfecteerd, raden we aan om een molaire verhouding van 3:4 van editor:sgRNA-plasmiden te proberen. De verhouding moet mogelijk worden geoptimaliseerd om de hoogste efficiëntie van epigenoombewerking te verkrijgen.
    2. Verwarm het transfectiereagens en het minimale essentiële medium voor op kamertemperatuur ongeveer 30-60 minuten voorafgaand aan transfectie. Meng 0,6 μL transfectiereans en 20 μL minimaal essentieel medium per putje en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
      OPMERKING: Een hoofdmengeling van transfectiereagens en minimaal essentieel medium kan worden gemaakt als het uitvoeren van veelvoudige transfecties.
    3. Voeg 20,6 μL van het transfectiereagens en het minimale essentiële mediummengsel toe aan elke PCR-stripbuis die 3 μL plasmide-DNA bevat. Laat 15 minuten op kamertemperatuur staan.
    4. Voeg het mengsel langzaam toe aan de plaat met gezaaide cellen en tik zachtjes op de plaat om het mengsel te verspreiden. Neem een niet-getransfecteerde controle op om een goede basislijn te bieden voor vergelijking in stroomafwaartse analyses.
      OPMERKING: Wanneer het toevoegen van het transfectiemengsel aan gezaaide cellen, is het essentieel om dit druppelsgewijs en voorzichtig te doen om verstoring te minimaliseren, aangezien dit de transfectieefficiency nadelig kan beïnvloeden.
  4. Dag 2: Controleer het succes van de transfectie
    1. Onderzoek cellen onder een microscoop bij 10X vergroting om te bepalen of zij BFP positief zijn, aangezien dit succesvolle transfectie aangeeft. Zorg ervoor dat de cellen niet worden gestoord tijdens het observatieproces.
  5. Dag 3: Splits de plaat met 96 putjes en beoordeel de transfectie-efficiëntie met behulp van de BFP-marker
    OPMERKING: Een succesvolle transfectie zou minstens 30% van de cellen als positief BFP moeten opleveren. Met dCas9, CRISPRi en CRISPRoff detecteren we echter doorgaans meer dan 60% BFP-positieve cellen twee dagen na transfectie. De efficiency van de transfectie is negatief gecorreleerd met plasmidegrootte, zodat kunnen de verschillende epigenoomredacteuren verschillende transfectieefficiency opleveren.
    1. Verwarm trypsine en DMEM met 10% FBS en 1x penicilline-streptomycine-glutamine voor gebruik ongeveer 30-60 minuten voor op kamertemperatuur.
    2. Zuig media uit de putten op; Pas op dat u geen cellen verwijdert die aan de onderkant vastzitten. Voeg 50 μL trypsine per putje toe. Incubeer gedurende 2-3 minuten bij 37 °C.
      OPMERKING: Het is niet ongebruikelijk om sommige zwevende cellen waar te nemen, vooral na transfectie met CRISPRoff. Onze hypothese is dat deze celdood te wijten is aan toxiciteit van DNMT3A-3L overexpressie.
    3. Rem trypsine door 150 μL volledige DMEM per putje toe te voegen. Pipetteer op en neer om cellen te resusseren en cellen te splitsen voor samenvloeiing op dag 5 (~20 μL celmengsel in 200 μL media van een plaat met 96 putjes).
    4. Gebruik 50 μL geresuspendeerde cellen voor flowcytometrie om de transfectie-efficiëntie te beoordelen.

2. Nucleofectie van epigenoom-editor mRNA in K-562-cellen

OPMERKING: In dit gedeelte wordt het proces beschreven van het nucleofecteren van CRISPRoff-mRNA in K-562-cellen. Voor de eenvoud hebben we de K-562-cellen vooraf ontworpen om constitutief een sgRNA tot expressie te brengen dat zich richt op de promotor van het CD55-endogene gen (Addgene 217306). Het rechtstreeks toedienen van CRISPRoff-mRNA aan de cellen heeft het potentieel om de cellulaire toxiciteit die gepaard gaat met op plasmide-DNA gebaseerde benaderingen te verminderen, terwijl nog steeds een vergelijkbare werkzaamheid van gen-uitschakeling wordt bereikt. Bovendien kan nucleofectie worden gebruikt om epigenoomeditorconstructies te introduceren in cellijnen die moeilijk efficiënt te transfecteren zijn, zoals K-562's.

  1. Celcultuur
    1. Voorafgaand aan de nucleofectie moeten K-562-cellen in een kolf met RPMI met 10% FBS en 1x penicilline-streptomycine-glutamine worden bewaard. Passage de cellen elke dag en zorg ervoor dat ze op een samenvloeiing van 60%-70% blijven.
    2. Op de dag van nucleofectie, ontdooi en draai voorzichtig CRISPRoff mRNA in een steriele RNase-vrije microcentrifugebuis en bewaar het mRNA op ijs. Gebruik 2 μg mRNA per 2,0 x 105 cellen in elk putje van een stripnucleocuvette. Zorg ervoor dat het mRNA-volume niet groter is dan 10% van het totale nucleofectievolume (22 μL).
      OPMERKING: Nucleofectie kan ook worden uitgevoerd in grotere cuvetten met meer cellen en mRNA. We raden aan om de hoeveelheid mRNA te schalen in verhouding tot het aantal cellen dat u gaat toevoegen. Bij het uitvoeren van een nucleofectie in een grote cuvet op 1 x 106 cellen, raden we bijvoorbeeld aan om 10 μg mRNA te gebruiken, met een totaal nucleofectievolume van 100 μL. Bovendien kan de dosering van het mRNA worden geoptimaliseerd om een hoge bewerkingsefficiëntie te garanderen. We gebruiken vaak 2-5 μg editor-mRNA voor elke 2,0 x 105 cellen voor efficiënte resultaten. Vrije nucleotiden die niet zijn opgenomen tijdens de mRNA-synthese moeten vóór kwantificering worden verwijderd.
    3. Bereid de nucleofectieoplossing volgens de instructies van de fabrikant en verwarm deze gedurende 15 minuten vóór de nucleofectie tot kamertemperatuur.
      OPMERKING: De nucleofectoroplossing kan verschillen of moet worden geoptimaliseerd voor verschillende celtypen.
    4. Oogst en tel K-562-cellen met behulp van een geautomatiseerde cellenteller met trypanblauwe levend/dode kleuring. Voor nucleofectie in een stripcuvet, aliquot ~2,0 x 105 cellen per monster in een steriele microcentrifugebuis.
    5. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi het bovenstaande vervolgens weg. Was de cellen 1x met PBS op kamertemperatuur op 500 x g gedurende 5 minuten en gooi het bovenstaande vervolgens weg.
    6. Bereken de hoeveelheid nucleofectoroplossing om cellen in te suspenderen door het mRNA-volume af te trekken van 22 μL. Resuspendeer de cellen in de juiste hoeveelheid nucleofectoroplossing.
    7. Voeg de celoplossing toe aan 2 μg CRISPRoff-mRNA (volume bepaald in stap 2.1.2) en breng de oplossing over naar een cuvet, waarbij u ervoor zorgt dat er geen belletjes ontstaan, omdat dit de efficiëntie van de nucleofectie in gevaar kan brengen. Tik zachtjes op de nucleocuvette om ervoor te zorgen dat de cellen zich op de bodem bevinden.
    8. Nucleofecteer de cellen met behulp van het 4D-Nucleofector-systeem met de juiste pulscode. De FF-120-code wordt aanbevolen voor K-562-cellen.
      OPMERKING: De pulscode moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor verschillende celtypen. Overleg met de fabrikant of er aanvullende optimalisatie nodig is.
    9. Voeg na de nucleofectie 80 μL RPMI-media toe aan elk klein nucleocuvetteputje en laat de cellen 15 minuten op 37 °C staan.
    10. Breng de celsuspensie over in een putje van een plaat met 24 putjes die 400 μl voorverwarmde RPMI-media (klein nucleocuvette) bevat.
      OPMERKING: Na nucleofectie zijn cellen bijzonder kwetsbaar en moeten ze voorzichtig van de nucleocuvette naar de kweekputten worden overgebracht.
    11. Na dag 2 na nucleofectie: volg het kleuringsprotocol voor oppervlaktemarkers met CD55-antilichaam zoals beschreven in sectie 3 en meet de fluorescentie van CD55 APC op een flowcytometer om de werkzaamheid van het epigenoombewerking te testen.
      OPMERKING: Om het succes van de nucleofectie te testen, raden we aan om een nucleofectie uit te voeren met GFP of mCherry-mRNA. Voer twee dagen na de nucleofectie flowcytometrie van deze cellen uit om succesvolle nucleofectie te bevestigen. Over het algemeen detecteren we 90% tot 100% van deze cellen die GFP of mCherry tot expressie brengen. Een alternatief is het uitvoeren van een nucleofectie met CRISPRi-mRNA, waarvan bekend is dat het veel doelgenen krachtig tot zwijgen brengt. Bij het uitvoeren van flowcytometrie op dag 2 moeten met CRISPRi behandelde monsters in meer dan 90% van de cellen uitschakeling van het doelgen vertonen.

3. Kleuring van de oppervlaktemarkering

OPMERKING: In dit gedeelte wordt ingegaan op het kwantificeren van de niveaus van CD55-eiwit na bewerking van het epigenoom in K-562-cellen. We kwantificeren de afname van CD55-expressie in afzonderlijke cellen met behulp van antilichaamkleuring en flowcytometrie (zie sectie 4 hieronder) om de CRISPRoff-gemedieerde knockdown-efficiëntie te evalueren. Aanvullende technieken, waaronder reverse transcription, kwantitatieve PCR of western blotting, kunnen ook worden gebruikt om het niveau van knockdown op zowel transcriptie- als eiwitniveau te bevestigen.

  1. Tel cellen met behulp van een geautomatiseerde cellenteller en voeg ongeveer 5,0 x 105 tot 1,0 x 106 cellen toe aan een microcentrifugebuis en centrifugeer de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten.
    OPMERKING: Er kunnen meer of minder cellen worden gebruikt voor kleuring, maar het kan nodig zijn om de concentratie van antilichamen dienovereenkomstig te schalen.
  2. Gooi het bovenstaande weg en zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort, voeg 500 μL PBS toe en suspendeer de pellet voorzichtig.
  3. Centrifugeer de cellen opnieuw op 500 x g gedurende 5 min. Gooi het bovenstaande weg en voeg het antilichaam toe in de gewenste concentratie verdund in PBS. Gebruik voor CD55-kleuring 1 μL gezuiverde anti-menselijke CD55 (0,5 mg/ml voorraad) in 49 μL PBS.
  4. Piket de cellen voorzichtig en laat ze 25 minuten incuberen op een donkere plaats bij kamertemperatuur. Draai de cellen na de incubatie opnieuw 5 minuten op 500 x g en gooi het supernatant weg.
  5. Resuspendeer de pellet met 500 μL PBS om overtollig antilichaam weg te spoelen. Centrifugeer de cellen gedurende 500 minuten bij 500 x g en gooi de PBS-supernatant weg. Resuspendeer in 100 μl tot 200 μl verse PBS en voeg toe aan een plaat met 96 putjes voor flowcytometrieanalyse.

4. Flowcytometrie

OPMERKING: Dit protocol is geschreven voor het gebruik van een BD FACSymphony A1 Cell Analyzer. De details kunnen variëren, afhankelijk van de flowcytometer die u gebruikt. We raden u aan de gebruikershandleiding van de machine die u gebruikt te raadplegen voor specifieke details.

  1. Voordat u de cytometrie inschakelt, moet u controleren of de afvalcontainer niet vol is en of er voldoende omhulselvloeistof is. Zet de hoofdschakelaar (groen) aan die zich in de buurt van de omhulselvloeistof bevindt.
  2. Zet de plaatlezer aan met de achterschakelaar. Schakel vervolgens de machine in met de groene knop aan de rechterkant en zorg ervoor dat de machine is ingesteld op de 96-wells plaatlezerfunctie.
  3. Zet de computer aan en log in. Open de software en log in met uw gebruikersnaam en wachtwoord.
  4. Stel het experiment in. Maak een nieuw experiment door Experiment > Nieuw experiment te selecteren. Wijzig de naam van het experiment door te dubbelklikken op de huidige naam.
  5. Voeg een plaat toe door op Experiment > nieuwe plaat te klikken. Selecteer het putformaat dat u wilt gebruiken. Om specifieke putten toe te voegen om uit te voeren, klikt u op de locatie van de put in de plaat en klikt u vervolgens op de blauwe spuit (de put moet nu blauw zijn gemarkeerd). Selecteer indien nodig meerdere putjes tegelijk om toe te voegen.
  6. Voeg specifieke namen toe aan elke put door met de rechtermuisknop op Specimen aan de rechterkant van de plaatweergave te klikken. Selecteer vervolgens Experimentele lay-out. Dit opent een pagina met alle putten die je hebt geselecteerd. Om de putten een andere naam te geven, klikt u eenmaal en typt u de gewenste naam in. Klik op OK als u klaar bent.
  7. Voeg grafieken en de juiste poorten toe aan het experiment op het globale werkblad. We raden aan om eerst het voorwaartse spreidingsgebied (FSC-A) versus het zijverstrooiingsgebied (SSC-A) uit te zetten. Maak vervolgens een willekeurige poort voor actieve cellen die later kunnen worden verfijnd door op de Polygoon Tool te klikken.
  8. Klik met de rechtermuisknop op deze poort en klik op Inzoomen. Hiermee wordt een nieuwe plot gemaakt die alleen cellen van die live celpoort weergeeft.
  9. Verander de as van deze nieuwe grafiek in FSC-A ten opzichte van voorwaartse verstrooiingshoogte (FSC-H) en maak een poort voor afzonderlijke cellen.
    1. Als het sgRNA in cellen constitutief tot expressie wordt gebracht, en het lentivirus codeert ook voor een fluorescerend eiwit, boor dan in op deze enkele celpoort en voer verdere gating uit voor expressie van dat eiwit als een proxy voor sgRNA-expressie (bijvoorbeeld: PE-CF594-A versus FSC-A).
  10. Klik op de laatste installatiepoort (voor afzonderlijke cellen of voor cellen die sgRNA tot expressie brengen) met de rechtermuisknop en selecteer Inzoomen. Maak een poort voor het testen van de expressie van het reportergen (bijvoorbeeld: BB515-A versus FSC-A).
    1. Als u getransfecteerde cellen gebruikt en een methode hebt voor het testen van de transfectie-efficiëntie, zoals BFP-expressie, klikt u met de rechtermuisknop op de Reporter Expression Plot en klikt u op Dupliceren. Verander de assen in BV421-A versus FSC-A. Maak een willekeurige poort voor BFP-positieve cellen.
  11. Verwijder alle parameters die niet in gebruik zijn op het tabblad Parameters van het cytometerscherm.
  12. Als u de machine wilt instellen en klaar wilt maken voor gebruik, klikt u op Uitvoeren op het bedieningspaneel van de flowcytometer. De knop moet groen lijken. Ga in de software naar HTS in het bovenpaneel en vervolgens Prime. Als u klaar bent, voegt u de plaat toe en zorgt u ervoor dat deze goed in de machine staat en dat het deksel ERAF is.
  13. Om uit te voeren, selecteert u alle put(ten) die u wilt uitvoeren en zorgt u ervoor dat de bedieningselementen op de juiste manier zijn ingesteld. Selecteer goed door te dubbelklikken, wijzig het monstervolume in 10 μL en klik op Gegevens ophalen in het acquisitiedashboard. Hiermee wordt de steekproef uitgevoerd, maar worden de gegevens niet geregistreerd. Terwijl dit monster wordt uitgevoerd, past u de laservoltages indien nodig. Verander bovendien de poorten.
    OPMERKING: We raden aan om een monster uit te voeren dat negatief is voor alle kleuren die worden gemeten en een monster dat positief is voor alle kleuren om er zeker van te zijn dat de laserparameters en gating goed zijn.
  14. Nadat u de laserinstellingen hebt gecontroleerd, klikt u op de Samples in het plaatpaneel en controleert u of de lopende waarden naar wens zijn ingesteld.
  15. Klik op Plaat uitvoeren om in het acquisitiedashboard uit te voeren en gegevens van alle putten vast te leggen. Als u klaar bent, maakt u de machine schoon door de plaat te verwijderen.
  16. Voeg aan een nieuwe plaat met 96 putjes 10% bleekmiddel toe aan de bovenste vier rijen en H2O aan de vier putjes eronder. Ga naar HTS > Clean. Als u klaar bent, sluit u het programma en schakelt u de knoppen uit in de omgekeerde volgorde waarin ze door afval op de groene zijknop > plaatlezer > groene schakelaar zijn ingeschakeld.
  17. Voeg 20% bleekmiddel toe aan de plaat met 96 putjes met cellen en gooi weg.

5. Gegevensanalyse

OPMERKING: Deze methode schetst gatingstrategieën en gegevensverwerking om epigenoombewerking te kwantificeren door middel van flowcytometrie. De gating-strategie wordt visueel weergegeven naast voorbeeldplots die zijn gegenereerd op basis van de gegevensanalyse in Figuur 2 en Figuur 3.

  1. FlowJo gating opstelling
    1. Laad alle FSC-bestanden op FlowJo door ze naar een nieuw werkblad te slepen en neer te zetten.
    2. Klik op Alle voorbeelden om te beginnen met het maken van poorten. Dit zorgt ervoor dat de gates gemakkelijk op alle monsters kunnen worden aangebracht.
    3. Open een controlemonster (zoals niet-getransfecteerd of niet-nucleofectie) door te dubbelklikken op dat bestand.
    4. Maak een poort voor Live Cells in een FSC-A versus SSC-A-plot met behulp van de polygoontool. In de lijst met alle voorbeelden wordt nu een tabblad Actieve cellen weergegeven onder de naam van het voorbeeld. Klik met de rechtermuisknop op deze poort en selecteer Analyse kopiëren naar groep om deze poort op alle monsters toe te passen (Afbeelding 2A, Afbeelding 3A).
    5. Dubbelklik op de poort van de live-cellen om in te zoomen op de live-cellen. Verander de assen in FSC-A versus FSC-H (Figuur 2B, Figuur 3B).
    6. Teken een veelhoek om alleen voor afzonderlijke cellen te poorten. Breng deze poort aan op alle monsters zoals gedaan in sectie 4 (Figuur 2B, Figuur 3B).
      OPMERKING: Als een sgRNA-construct constitutief tot expressie wordt gebracht met een fluorescerende reporter, voer dan verdere gating uit op deze kleur, zodat de analyse zich alleen richt op cellen die het sgRNA tot expressie brengen. Een voorbeeld hiervan is het creëren van een poort voor mCherry-positieve cellen (PE-CF594-A versus FSC-A) als de cellen een sgRNA van de pLG1-ruggengraat bevatten (Figuur 2C, Figuur 3C).
    7. Dubbelklik op de poort voor de laatste instelling (enkele cellen of cellen die de hulplijn uitdrukken).
    8. Als het uitvoeren van een plasmidetransfectie en de epigenoomredacteur codeert voor een BFP-fusie, dan maak dan een poort voor BFP positieve cellen (voorbeeld: BV421-A versus FSC-A) voor de Dag 2 monsters (Figuur 2D).
    9. Maak een poort voor reporter-expressie (bijvoorbeeld: BB515-A versus FSC-A naar poort voor GFP-negatieve cellen) en pas deze poort toe op alle monsters (Afbeelding 2E, Afbeelding 3D).
  2. Transfectie analyse
    1. Nadat u de poortinstelling hebt uitgevoerd, klikt u op Tabeleditor in het bovenste paneel. Sleep populaties voor analyse (voorbeelden: BFP positief, GFP negatief).
    2. Klik in het deelvenster van de tabeleditor op Tabel maken. Kopieer deze gegevens naar een werkblad om normalisatieberekeningen uit te voeren.
  3. Gegevensverwerking
    1. Trek het aantal negatieve cellen van de reporter (bijvoorbeeld: GFP-negatief) in de controlesteekproef af van alle andere steekproeven. Er kan enige achtergronddemping van de verslaggever zijn, dus dit verwijdert deze achtergrondruis uit de gegevens.
    2. Alle waarden worden genormaliseerd naar het percentage BFP-positieve cellen (succesvol getransfecteerde cellen) gemeten op dag 2. Om deze normalisatie uit te voeren, neemt u de waarde, deelt u deze door het percentage BFP-positieve cellen op dag 2 en vermenigvuldigt u met 100. Deze berekening levert de genormaliseerde waarde van de transfectieefficiency van de bewerkte cellen op. De gegevens zijn nu klaar om te worden uitgezet. We raden lijngrafieken aan over een tijdsverloop voor het bewerken van het epigenoom, zoals weergegeven in Figuur 2F.
  4. Nucleofectie analyse
    1. Nadat u de poortinstelling hebt uitgevoerd, klikt u op Tabeleditor in het bovenste paneel. Populaties slepen voor analyse (voorbeelden: APC-negatief).
    2. Klik in het deelvenster van de tabeleditor op Tabel maken. Kopieer deze gegevens naar een spreadsheeteditor om normalisatieberekeningen uit te voeren.
  5. Gegevensverwerking
    1. Trek het aantal negatieve cellen van de reporter (bijvoorbeeld: APC-negatief) in de controlesteekproef af van alle andere steekproeven. Er kan enige achtergronddemping van de verslaggever zijn, dus dit verwijdert deze achtergrondruis uit de gegevens. De gegevens zijn nu klaar om te worden uitgezet. We raden lijngrafieken aan over een tijdsverloop voor het bewerken van het epigenoom.
      OPMERKING: Statistieken kunnen worden gebruikt om verschillen in uitschakeling tussen twee verschillende epigenoomeditors te kwantificeren. We raden aan om alle transfectie- en nucleofectie-experimenten in technische drievouden uit te voeren om statistische analyses uit te voeren. Bij het weergeven van lijngrafieken van demping in de tijd, zet u de standaarddeviatie van technische replicaten uit. T-testen van studenten op specifieke tijdstippen kunnen worden uitgevoerd om het uitschakelen tussen twee epigenoomeditors te vergelijken. Monsters moeten worden behandeld als ongepaard met ongelijke variantie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor alle experimenten met het bewerken van epigenoom zijn de juiste controles van cruciaal belang om de efficiëntie van het bewerken van het epigenoom te beoordelen. We raden aan om een controle-sgRNA te gebruiken, die zich niet richt op een sequentie in het menselijk genoom. Het gebruik van een niet-targeting-gidscontrole geeft het vertrouwen dat veranderingen op de doelloci worden veroorzaakt door de epigenoomeditor die naar die site wordt geleid in plaats van alleen door overexpressi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft twee verschillende voorbijgaande toedieningsmethoden voor CRISPR-epigenoomeditors: plasmide-DNA-transfectie en mRNA-nucleofectie. Beide technieken hebben unieke voordelen, nadelen en algemene overwegingen (Figuur 1F).

De transfectie van DNA van het plasmide leidt tot robuuste epigenoomredacteurexpressie, en wij nemen een BFP-fusie binnen de epigenoomredacteurconstructen op die de opsporing en kwantificering...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.K.N. is een uitvinder van patenten met betrekking tot de CRISPRoff/on-technologieën, ingediend door The Regents of the University of California.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken de leden van het Nuñez-lab, in het bijzonder Rithu Pattali en Izaiah Ornelas, voor het ontwikkelen en optimaliseren van de protocollen die in dit manuscript worden beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4D-NucleofectorLonzaAAF-1003
96-well tissue culture platesCorning3596
96-well U-bottom PlateCorning351177
APC anti-human CD55 AntibodyBioLegend311312
BD FACSymphony A1 Flow CytometerBD Biosciences
BleachWaxie11003428432
CentrifugeEppendorf5425
Countess Automated Cell CounterThermo ScientificCountess 3
CRISPRoff transfection plasmidAddgene 167981
Diluent 2 Hematology Reagent for Flow Cytometry (Sheath fluid)Thermo Scientific23-029-361
DMEM, High GlucoseThermo Scientific11965118
DPBSGibco14-190-250
Eppendorf tubesThomas scientific1159M35
FBSAvantor Seradigm89510-186
Lonza Walkersville SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit LFisher ScientificNC0281111
mMESSAGE mMACHINE™ T7 ULTRA Transcription KitThermo FisherAM1345
Opti-MEMGibco31985070
PCR strip tubesUSA Scientific 1402-4700
Penicillin-Streptomycin-GlutamineGibco10378016
pLG1 sgRNA expression plasmidAddgene 217306
RPMI 1640Gibco22-400-105
SF Cell Line 96-well Nucleofector® KitLonzaV4SC-2096
Tissue culture incubatorPHCbiMCO-170AICUVDL-PA
TransIT-LTI transfection reagentMirusMIR 2306
Trypsin-EDTA (0.25%)Gibco25200114

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kimura, H. Histone modifications for human epigenome analysis. Journal of Human Genetics. 58 (7), 439-445 (2013).
  2. Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  3. Esvelt, K. M., Mali, P., Braff, J. L., Moosburner, M., Yaung, S. J., Church, G. M. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature Methods. 10 (11), 1116-1121 (2013).
  4. Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (39), 15644-15649 (2013).
  5. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  6. Gaudelli, N. M., et al. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).
  7. Anzalone, A. V., et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).
  8. Anzalone, A. V., et al. Programmable deletion, replacement, integration and inversion of large DNA sequences with twin prime editing. Nature Biotechnology. 40 (5), 731-740 (2022).
  9. Zhang, X. -H., Tee, L. Y., Wang, X. -G., Huang, Q. -S., Yang, S. -H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4, e264(2015).
  10. Lin, Y., et al. CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences. Nucleic Acids Research. 42 (11), 7473-7485 (2014).
  11. Adikusuma, F., et al. Large deletions induced by Cas9 cleavage. Nature. 560 (7717), E8-E9 (2018).
  12. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  13. Cullot, G., et al. CRISPR-Cas9 genome editing induces megabase-scale chromosomal truncations. Nature Communications. 10 (1), 1136(2019).
  14. Fiumara, M., et al. Genotoxic effects of base and prime editing in human hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 42 (6), 877-891 (2024).
  15. Tsuchida, C. A., et al. Mitigation of chromosome loss in clinical CRISPR-Cas9-engineered T cells. Cell. 186 (21), 4567-4582.e20 (2023).
  16. Nakamura, M., Gao, Y., Dominguez, A. A., Qi, L. S. CRISPR technologies for precise epigenome editing. Nature Cell Biology. 23 (1), 11-22 (2021).
  17. Villiger, L., Joung, J., Koblan, L., Weissman, J., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S. CRISPR technologies for genome, epigenome and transcriptome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 25 (6), 464-487 (2024).
  18. McCutcheon, S. R., Rohm, D., Iglesias, N., Gersbach, C. A. Epigenome editing technologies for discovery and medicine. Nature Biotechnology. 42 (8), 1199-1217 (2024).
  19. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  20. Maeder, M. L., Linder, S. J., Cascio, V. M., Fu, Y., Ho, Q. H., Joung, J. K. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
  21. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A Protein-Tagging System for Signal Amplification in Gene Expression and Fluorescence Imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
  22. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  23. Alerasool, N., Segal, D., Lee, H., Taipale, M. An efficient KRAB domain for CRISPRi applications in human cells. Nature Methods. 17 (11), 1093-1096 (2020).
  24. Nakamura, M., Gao, Y., Dominguez, A. A., Qi, L. S. CRISPR technologies for precise epigenome editing. Nature Cell Biology. 23 (1), 11-22 (2021).
  25. Tycko, J., et al. High-Throughput Discovery and Characterization of Human Transcriptional Effectors. Cell. 183 (7), 2020-2035.e16 (2020).
  26. Alerasool, N., Leng, H., Lin, Z. -Y., Gingras, A. -C., Taipale, M. Identification and functional characterization of transcriptional activators in human cells. Molecular Cell. 82 (3), 677-695.e7 (2022).
  27. Ludwig, C. H., et al. High-throughput discovery and characterization of viral transcriptional effectors in human cells. Cell Systems. 14 (6), 482-500.e8 (2023).
  28. DelRosso, N., et al. Large-scale mapping and mutagenesis of human transcriptional effector domains. Nature. 616 (7956), 365-372 (2023).
  29. Tycko, J., et al. Development of compact transcriptional effectors using high-throughput measurements in diverse contexts. Nature Biotechnology. , (2024).
  30. Wilson, C. M., et al. Combinatorial effector targeting (COMET) for transcriptional modulation and locus-specific biochemistry. , (2024).
  31. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247.e17 (2016).
  32. Bintu, L., et al. Dynamics of epigenetic regulation at the single-cell level. Science. 351 (6274), 720-724 (2016).
  33. Hilton, I. B., et al. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nature Biotechnology. 33 (5), 510-517 (2015).
  34. Cano-Rodriguez, D., et al. Writing of H3K4Me3 overcomes epigenetic silencing in a sustained but context-dependent manner. Nature Communications. 7 (1), 12284(2016).
  35. O'Geen, H., et al. dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression. Nucleic Acids Research. 45 (17), 9901-9916 (2017).
  36. O'Geen, H., et al. Ezh2-dCas9 and KRAB-dCas9 enable engineering of epigenetic memory in a context-dependent manner. Epigenetics & Chromatin. 12 (1), 26(2019).
  37. Kim, J. -M., et al. Cooperation between SMYD3 and PC4 drives a distinct transcriptional program in cancer cells. Nucleic Acids Research. 43 (18), 8868-8883 (2015).
  38. Kearns, N. A., et al. Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion. Nature Methods. 12 (5), 401-403 (2015).
  39. Li, K., et al. Interrogation of enhancer function by enhancer-targeting CRISPR epigenetic editing. Nature Communications. 11 (1), 485(2020).
  40. Stepper, P., et al. Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L methyltransferase. Nucleic Acids Research. 45 (4), 1703-1713 (2017).
  41. Valbuena, R., et al. Prediction and design of transcriptional repressor domains with large-scale mutational scans and deep learning. , (2024).
  42. Horlbeck, M. A., et al. Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and activation. eLife. 5, e19760(2016).
  43. Liu, Y., et al. CRISPR Activation Screens Systematically Identify Factors that Drive Neuronal Fate and Reprogramming. Cell Stem Cell. 23 (5), 758-771.e8 (2018).
  44. Black, J. B., et al. Master Regulators and Cofactors of Human Neuronal Cell Fate Specification Identified by CRISPR Gene Activation Screens. Cell Reports. 33 (9), 108460(2020).
  45. Yang, J., et al. Genome-Scale CRISPRa Screen Identifies Novel Factors for Cellular Reprogramming. Stem Cell Reports. 12 (4), 757-771 (2019).
  46. Chakraborty, S., Ji, H., Kabadi, A. M., Gersbach, C. A., Christoforou, N., Leong, K. W. A CRISPR/Cas9-Based System for Reprogramming Cell Lineage Specification. Stem Cell Reports. 3 (6), 940-947 (2014).
  47. Black, J. B., et al. Targeted Epigenetic Remodeling of Endogenous Loci by CRISPR/Cas9-Based Transcriptional Activators Directly Converts Fibroblasts to Neuronal Cells. Cell Stem Cell. 19 (3), 406-414 (2016).
  48. Nuñez, J. K., et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 184 (9), 2503-2519.e17 (2021).
  49. Xu, X., et al. A CRISPR-based approach for targeted DNA demethylation. Cell Discovery. 2 (1), 16009(2016).
  50. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (25), (2016).
  51. Pattali, R. K., Ornelas, I. J., Nguyen, C. D., Xu, D., Divekar, N. S., Nuñez, J. K. CRISPRoff epigenetic editing for programmable gene silencing in human cells without DNA breaks. , (2024).
  52. Moon, H. C., Herschl, M. H., Pawluk, A., Konermann, S., Hsu, P. D. A combinatorial domain screening platform reveals epigenetic effector interactions for transcriptional perturbation. , (2024).
  53. Cappelluti, M. A., et al. Durable and efficient gene silencing in vivo by hit-and-run epigenome editing. Nature. 627 (8003), 416-423 (2024).
  54. Naumann, E. N., et al. rainwide silencing of prion protein by AAV-mediated delivery of an engineered compact epigenetic editor. Science. 384 (6703), ado7082(2024).
  55. Tremblay, F., et al. A potent epigenetic editor targeting human PCSK9 for durable reduction of low-density lipoprotein cholesterol levels. Nature Medicine. 31 (4), 1329-1338 (2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

dCas9 fusiegenrepressieCRISPRoff systeemCRISPRi silencingflowcytometriehumane cellijnenchromatinemodulatie

Gerelateerde artikelen